LAMPIRAN 1. Tabel Tekanan Darah untuk Anak Laki-laki

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 2. Tabel Tekanan Darah untuk Anak Perempuan

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 3. Lembar Penjelasan Subjek/Orang Tua

Yth Bapak/Ibu

Departemen Ilmu Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran USU dan divisi

Nefrologi Anak membuat suatu kerja sama tentang anak yang menderita

Sindrom Nefrotik dan anak yang sehat. Sindrom nefrotik adalah kumpulan

gejala yang terdiri atas bengkak (sembab) seluruh tubuh disertai dengan zat

putih telur dalam buang air kecil anak yaitu lebih dari +2 (>100 mg/dL) dan

kadar zat albumin dalam darah rendah (< 2,5 g /dL). Pemberian obat steroid

(golongan prednison) pada kasus sindrom nefrotik pada anak masih menjadi

terapi utama dalam mengatasi penyakit ini selama maksimal 4 minggu. Namun

dalam perjalanannya anak bisa tidak respon dengan obat prednison. Respon

terhadap prednison diamati dari jumlah albumin (zat putih telur) yang keluar

melalui buang air kecil pagi. Hal ini sering dihubungkan dengan faktor genetik

dan faktor lain seperti tekanan darah tinggi.

Pada anak yang sehat mengapa perlu juga diperiksa? Karena anak yang

sehat juga berisiko menjadi resisten terhadap pengobatan steroid (kalau

diperlukan misal apabila menderita alergi atau penyakit lain) sehingga sangat

bermanfaat menentukannya sejak dini.

Kerja sama ini berjudul POLIMORFISME GEN ALEL -173 C

MACROPHAGE MIGRATION INHIBITORY FACTOR DENGAN KADAR

ANGIOTENSIN II PLASMA DAN MIF SERUM SEBAGAI FAKTOR RISIKO

SINDROM NEFROTIK RESISTEN STEROID dan bertujuan mengetahui

hubungan polimorfisme gen MIF dengan kadar MIF dan angiotensin II pada

penderita sindrom nefrotik ataupun anak sehat.

Universitas Sumatera Utara

Pengambilan darah sebanyak 5 ml menimbulkan nyeri ringan dan relatif

tidak menimbulkan bahaya. Begitupun, kalau timbul nyeri yang berlebihan,

Bapak/Ibu dapat menghubungi peneliti. Pengambilan buang air kecil dilakukan

pada buang air kecil pertama/kedua pagi hari.

Partisipasi Bapak/Ibu/Adik bersifat suka rela dan tanpa paksaan. Setiap

data yang ada akan dirahasiakan dan digunakan untuk kepentingan

Bapak/Ibu/Adik. Untuk penelitian ini Bapak/Ibu/Adik tidak akan dikenakan biaya

apa pun.

Demikian penjelasan ini, apabila Bapak/Ibu masih belum

mengerti/mempunyai keluhan dapat menghubungi dr.Oke Rina Ramayani

dengan alamat Departemen Ilmu Kesehatan Anak Divisi Nefrologi RS H. Adam

Malik Jalan Bunga Lau No1 Medan, telepon 061-8361721 atau HP

08126553814.

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 4. Lembar Persetujuan Setelah Penjelasan Saya yang namanya tersebut di bawah ini :

Nama :

Umur :

Jenis kelamin :

Alamat :

bertindak sebagai orang tua/ wali dari anak:

Nama :

Umur :

Jenis kelamin :

Setelah mendapatkan keterangan dan penjelasan secara lengkap, maka

dengan penuh kesadaran dan tanpa paksaan saya menandatangani dan

menyatakan bersedia berpartisipasi pada penelitian ini. Bila saya ingin

mendapatkan penjelasan lebih lanjut, saya bisa mendapatkannya dari

dokter peneliti.

Medan, 2011

Dokter Peserta Penelitian

_________________________

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 5 Status Pemeriksaan

Nomor:

RS/No RM:

Tanggal:

1. Data pribadi

a. Nama :

b. Umur :

c. Suku/ras :

d. Alamat :

e. Jenis kelamin :

f. Berat badan (kg)/tinggi badan (cm):

g. Umur mulai menderita SN:

h. Diagnosis: a. SNRS: primer atau sekunder

b. SNSS

c. kontrol

i. Jumlah serangan: a. pertama

b. kambuh infrekuen

c. kambuh frekuen

j. Riwayat penggunaan obat :

2. Pemeriksaan umum

a. Tanda vital :

Tekanan darah sistol dan diastole: MAP :

Hipertensi / tidak

b. Fisik diagnostik :

3. Pemeriksaan darah : ureum creatninin LFG

4. Pemeriksaan urinalisis :

5. Pemeriksaan ELISA :

6. Pemeriksaan EIA :

7. Pemeriksaan PCR :

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 6. Persetujuan Komite Etik

Lampiran 7. Prosedur operasional standar polimorfisme gen -173 MIF

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 7. Prosedur Operasional Standar Pemeriksaan Polimorfisme -173 G Ke C Gen MIF

Tahap Prosedur operasional standar Isolasi DNA

1. Ambil darah 0.5 cc ke dalam tabung EDTA, disentrifugasi 3000 rpm 10-15 menit

2. Plasma dipisahkan dan diambil lekosit sebanyak 300 µL pada tabung eppendorf 1,5 ml lalu ditambah EL buffer 900 µL

3. Diinkubasi 10 menit lalu disentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit 4. Supernatan dibuang, diulangi sampai 5 kali hingga warna supernatan

jernih dan endapan sudah berwarna putih. Endapan divorteks 20 detik 5. Tambahkan 300 µL nuclei lysis solution dan dibolak balik 6. Tambahkan protein precipitation 100 µL, vorteks selama 20 detik 7. Sentrifugasi 13.000 rpm 3 menit lalu supernatant dipindah ke tabung

1,5 steril yang telah berisi 300 µL isopropanol, divorteks 3 detik 8. Sentrifugasi 13.000 rpm 1 menit hingga tampak pellet putih, lalu

supernatan dibuang, ditambah 70% etanol 300 µL, disentrifugasi 13.000 rpm 1 menit

9. Aspirasi etanol menggunakan pipet dan keringkan hingga 1 jam. 10. Tambahkan 100 µL DNA rehydration solution dan disimpan pada suhu 4

°C selama 1 malam. Beri identitas. Esoknya disimpan pada -20 °C. PCR 1. Pengenceran Primer MIF dilakukan dengan MIF-F ditambah 463 µL

buffer TE, juga MIF-R ditambah 430 µL buffer TE, lalu 20 µL masing masing ditambahkan 160 µL buffer TE.

2. Kedalam tabung PCR 0.2 µL diisi dengan: master mix 15 µL, ddH2O 11 µL, primer pengenceran 2 µL, isolat DNA 2 µL dan beri identitas. Sentrifugasi 13.000 rpm 3 menit

3. Kemudian dimasukkan ke alat thermocycle dengan kondisi suhu : - Hot start 0 menit 1 cycle 95 °C - Denaturasi 45 detik 95 °C - Annealing 45 detik 35 cycle 60 °C - Extension 45 detik 72 °C - Extension 7 menit 72 °C - Soaking 4 °C

4. Agar 2,5% dibuat dengan mencampur agarose 2,5 gram; TBE 0.5x,100 cc,dipanaskan,ditambah ETBR 2 µL. Agar dibiarkan di suhu kamar 2 jam

5. Agar dipindahkan ke alat elfo dan dibasahi dengan TBE 0,5 x hingga seluruhnya terbenam. Produk PCR dan marker diisi ke well 2 µL

6. Setelah itu dilakukan elektroforesis 100 mV selama 30 menit 7. Hasil produk PCR dilihat di bawah kamera ultra violet di posisi 366 bp.

Enzim restriksi

1. Restriksi dilakukan dengan mengisikan ke dalam tabung eppendorf 0.5 uL masing masing dd H2O 3,5 uL; Alu I 0,5 uL ; Buffer Tango 10x 1 uL; PCR product 5 uL. Lalu diinkubasi pada suhu 37 °C selama 16 jam (semalaman)

2. Keesokan harinya dibuat agar. Hasil restriksi dan marker diisikan ke well sebanyak 2 uL. Setelah itu dielektroforesis 100 mV selama 30 menit.

3. Dilihat hasil pita GC, CC dan GG di bawah kamera ultra violet Keterangan

EL:erytrocyte lysis

:

MIF-F:MIF forward MIF-R: MIF reverse TBE: Tris Boric EDTA

TE; Tris EDTA

ETBR: ethydium bromide

Alu I: Aluminium I GC: Guanin cytosin GG: Guanin guanin CC:cytosin cytosin

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 8. Prosedur Operasional Standar Pemeriksaan Angiotensin II Plasma

Tahap Prosedur operasional standar Penanganan sampel

1. Ambil darah 2 cc ke dalam tabung EDTA yang telah didinginkan 2-8°C, bolak balik hingga homogen

2. Sampel disentrifugasi 3500 rpm 15 menit pada suhu 4°C 3. Sampel dipisahkan dari serum dan masukkan plasma ke dalam 2

sampel cup @ 1 cc plasma (beri identitas) 4. Segera dibekukan dalam -20 °C, menunggu sampel lain

Protokol ekstraksi

1. Sampel plasma 500 µL ditambahkan 500 µL TFA 1%, disentrifugasi 4 °C 20 menit . Supernatan dipindah hati hati.

2. Column dipersiapkan: mencuci dengan methanol 0.5 ml selanjutnya 1 ml TFA 1% sebanyak 3 kali pada alat vakum

3. Sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam column dan biarkan melewatinya secara lambat (± 2 menit) lalu column dicuci 2 kali dengan 1 ml TFA 1%

4. Letakkan column ke tabung polypropylene 15 ml yang sudah dilabel lalu ditambahkan 1 ml 60% ACN, 1% TFA dan dispin 300-500 rpm hingga terelusi .

5. Tabung ditutup dengan parafilm, dilyophilisasi semalaman. 6. Rekonstitusi pellet dengan 250 µL assay buffer

Penanganan reagen

1. Dilusi 2.5 ml wash buffer konsentrat dengan 475 ml air destilata 2. Satu vial angiotensin II standar dicampur dengan 1 ml assay

buffer. Pengenceran standar konsentrasi angiotensin II dilakukan pada 6 tabung hingga menjadi 6 standar yaitu 10,0001000 250 62,515.63,9 pg/ml serta dilabel.

3. Streptavidin HRP konsentrat dilarutkan ke 250 µL air dan divorteks lalu diencerkan 1:1000 dalam assay buffer.

EIA Angiotensin II

1. Microplate dibuka dari kemasan 2. Assay buffer sebanyak 75 µL dipipet ke NSB well, dan

sebanyak 50 µL ke B0 (0 ng/mL) well 3. Standar 1 hingga 6 dipipet 50 µL ke well, juga sampel. 4. Angiotensin II antibody dipipet 25 µL ke setiap well kecuali NSB

dan B0 well 5. Microplate ditutup strip perekat dan diinkubasi 1 jam pada suhu

kamar (500 rpm). 6. Angiotensin II conjugate dipipet sebanyak 25 µL ke setiap well

kecuali B0 well, lalu diulangi langkah 5 7. Setiap well diaspirasi dan dicuci dengan wash buffer (400 µL).

Prosedur pencucian diulangi hingga 4 kali lalu dikeringkan. 8. Streptavidin HRP conjugate dipipet sebanyak 100 µL ke setiap

well kecuali B0, lalu langkah 8 dan 9 diulangi. 9. Substrate solution 100 µL ditambahkan ke well lalu diinkubasi

selama 30 menit pada suhu kamar dan dijauhkan dari cahaya 10. Stop solution 100 µL ditambahkan ke setiap well 11. Densitas optik dibaca pada panjang gelombang 450 nm 12. Kurva standar dibuat dengan memplot absorbans rata-rata

setiap standar pada aksis y dan konsentrasi pada aksis x. Keterangan

ACN : acetonide

:

TFA : trifloro acetic acid

NSB : non specific binding

HRP : horse reddish peroxidase

EDTA : ethylene diamine tetraacetate

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 9. Prosedur Operasional Standar Pemeriksaan MIF Serum

Tahap Prosedur operasional standar Penanganan sampel

1. Ambil darah 2 cc ke dalam tabung SST, bolak balik 5-10 kali hingga homogen

2. Diamkan selama 30-45 menit hingga darah beku 3. Segera disentrifugasi 3000 rpm 15 menit 4. Segera dipisahkan serum dan masukkan ke dalam 2 sampel cup @

0,3 cc serum (beri identitas) 5. Segera dibekukan dalam -20 °C, menunggu sampel lain 6. Pada waktu pemeriksaan, sampel diencerkan 10 x yaitu 50 µL sampel

ditambah 450 µL Calibrator Diluent RD5-20 (1x) Penanganan reagen

1. Semua reagen diletakkan pada suhu kamar sebelum digunakan 2. Calibrator Diluent RD5-20 pekat 20 mL diencerkan dengan 80

mL air destilata sehingga menjadi 100 mL Calibrator Diluent RD5-20 (1x)

3. Wash buffer pekat 20 mL diencerkan dengan air destilata sehingga menjadi 500 mL

4. Color reagen A dan B dicampur dengan volume yang sama dalam 15 menit sebelum digunakan da dijauhkan dari cahaya. Campuran substrate solution ini dibutuhkan 200 µL pada setiap well

5. MIF standar ditambahkan 1 mL air destilata sehingga menjadi larutan 100 ng/mL. Larutan dicampur merata dengan shaker, minimal 15 menit sebelum digunakan.

6. Pipet 900 µL Calibrator Diluent RD5-20 (1x) dan 100 µL MIF standar ke dalam tabung sehingga menjadi 10 ng/mL. Pipet 500 µL Calibrator Diluent RD5-20 (1x) ke dalam tabung lainnya sehingga menghasilkan pengenceran serial (5 2,5 1,25 0,625 0,3130,156 ng/mL).Campurkan setiap tabung secara merata sebelum perpindahan ke tabung lainnya. Tabung 10 ng/mL digunakan sebagai standar tinggi. Calibrator Diluent RD5-20 (1x) digunakan sebagai standar nol.

Sandwich ELISA

1. Microplate dibuka dari kemasan 2. Assay Diluent RD1-53 sebanyak 100 µL ditambahkan ke well 3. Standar, kontrol dan sampel sebanyak 50 µL ditambahkan ke

well lalu ditutup strip perekat. Microplate diinkubasi 2 jam di suhu kamar pada alat shaker.

4. Setiap well diaspirasi dan dicuci dengan wash buffer (400 µL). Prosedur pencucian diulangi hingga 4 kali lalu dikeringkan.

5. MIF conjugate 200 µL ditambahkan ke well lalu ditutup dengan strip perekat. Microplate diinkubasi 2 jam di suhu kamar pada alat shaker.

6. Pencucian diulangi seperti langkah 4. 7. Substrate solution 200 µL ditambahkan ke well lalu diinkubasi

selama 30 menit pada suhu kamar dan dijauhkan dari cahaya 8. Stop solution 50 µL ditambahkan ke setiap well sehingga terjadi

perubahan warna dari biru menjadi kuning. 9. Densitas optik setiap well ditentukan dalam 30 menit pada

panjang gelombang 450 nm 10. Kurva standar dibuat dengan memplot absorbans rata-rata

setiap standar pada aksis y dan konsentrasi pada aksis x.

Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 10. Daftar Riwayat Hidup

Nama Oke Rina Ramayani Tempat/tanggal lahir Medan, 1 Februari 1974 Alamat rumah Jl. Amaliun No 123 Medan NIP 19740201 200501 2 001 Putra / putri 1. Rasyid Ridha 2. Putri Ramayuli Riwayat pendidikan SD Bhayangkari Medan, tamat tahun 1985

SMP Negeri 1 Medan. tamat tahun 1988 SMA Negeri 1 Medan, tamat tahun 1991 Dokter umum FK USU, tamat tahun 1997 Dokter spesialis anak FK USU, tamat tahun 2005 CREED program 2007 Pendidikan tambahan Nefrologi Anak FK UI-RSCM

Riwayat pekerjaan Dokter Puskesmas Tg Morawa Deli Serdang 1998-2000 Dokter umum RS Malahayati, Kodya Medan 2000-2001 Dokter tim bencana RS Zainul Abidin Banda Aceh 2004 Dokter anak RS H.Adam Malik Medan 2005 - sekarang

Riwayat publikasi penelitian

1. Factors related to miss opportunities for immunization at urban and suburban primary health centres in Medan. Pediatr Indones.2007;47:21-26.(Author)

2. The efficacy of trimethoprim-sulfamethoxazole treatment in children with acute bloody diarrhea. Pediatr Indones. 2007;47:17-20.(Co-author)

3. Effect of classical music on reducing blood pressure in children.Pediatr Indones.2008;48:142-6.(Co author)

4. Comparison of diagnostic test for detecting proteinuria. Pediatr Indones.2011;51(1):17-21.(Co author)

5. Hubungan mikroalbuminuria dan latihan fisik terhadap tekanan darah anak obes. MKN.2011;44:12-5.(Author)

6. Luaran pasien anak dengan gagal ginjal terminal. Sari Pediatri 2013;14(5):277-82.(Author)

7. Frequency of disposable diaper changing and urinary tractinfection.Pediatr Indones.2013;53:70-5.(Co author)

8. Urine Gram stain and culture to diagnose urinary tract infection. Pediatr Indones.2013;53:121-4.(Co author)

9. Increased serum macrophage migration inhibitory factor concentrations as potential risk factors in steroid resistant nephrotic syndrome. JNT.doi: 10.4172/2161-0959.1000143 (Author)

Riwayat publikasi non penelitian

1. Sindrom nefrotik congenital (PIT IKA II-Batam Juli 2004) 2. Hematuria (dalam Buku Ragam Pediatrik Praktis 50

tahun Departemen Ilmu Kesehatan Anak FK USU,2009) 3. Penggunaan vitamin E pada sindrom nefrotik.Ibnu Sina

2010;5(2),11-3 4. Childhood hyperuricemia as risk factor of hypertension in

adulthood. Indones Biomed J.2012;4(1):12-6. 5. Renal manifestations in tuberous sclerosis patients: two

case reports. Pediatr Indones.2013;53:56-8.

Universitas Sumatera Utara

Universitas Sumatera Utara