TUGAS MATA KULIAH KULTUR JARINGAN

Kultur Teknik Fusi Protoplas

Oleh :

Dewi Ma’rufah H0106006

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2008

KULTUR FUSI PROTOPLAST

Pendahuluan

Salah satu cara untuk mengatasi masalah dalam pengembangan tanaman

unggul adalah dengan merakit varietas baru yang berproduksi tinggi dan tahan

terhadap hama, penyakit serta cekaman abiotik. Beberapa cara yang dapat

diterapkan untuk mendapatkan varietas baru antara lain melakukan persilangan

dengan spesies tertentu, melakukan mutasi buatan, penerapan metode transformasi

atau melakukan fusi protoplas (Sukmadjaja, 2007)

Istilah protoplasma pertama kali diperkenalkan oleh Hanstein pada tahun

1880, yang dimaksud dengan istilah tersebut adalah sel tumbuhan yang telah

dikupas bagian diding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh

dinding sel. Protoplas dapat dimanfaatkan untuk mendukung penelitian dasar

biologi tanaman dan merupakan sarana penting di bidang rekayasa genetik,

misalnya untuk hibridisasi somatik untuk meningkatkan kualitas tanaman

(Anonim, 2007)

Fusi protoplas dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh

genom dari spesies yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang

sama (inter-spesies), atau antargenus dari satu famili (inter-genus). Penggunaan

fusi protoplas memungkinkan diperolehnya hibrida-hibrida dengan tingkat

heterosigositas yang tinggi walaupun tingkat keberhasilannya sangat ditentukan

oleh genotipenya (Mollers et al. 1992). Teknologi fusi protoplas juga dapat

dilakukan untuk mendapatkan sifat-sifat tertentu seperti sifat ketahanan terhadap

hama dan penyakit serta cekaman abiotik (Purwito 1999).

Dengan demikian, tanaman hasil fusi dapat berupa tanaman dengan sifat-

sifat gabungan dari kedua tetuanya termasuk sifat-sifat yang tidak diharapkan

terutama berasal dari spesies liar. Oleh karena itu, untuk menghilangkan sifat-sifat

yang tidak diinginkan tersebut maka perlu dilakukan silang balik (back cross)

dengan tetua budi daya. Kemajuan pesat dalam penelitian produksi hibrida

somatik dan sibrida dalam transfer DNA tidak terlepas dari teknik isolasi, kultur

dan regenerasi protoplas menjadi tanaman. Untuk menunjang keberhasilan teknik

kultur dibutuhkan keahlian dan pengetahuan tentang teknik kultur protoplasma

guna mendukung teknik pencarian varietas baru berbagai jenis tanaman.

Isi

Prosedur Kultur Protoplasma

Kultur ptotoplasma dilakukan melalui secara bertahap mulai dari

persiapan eksplan dan isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman. Mutasi

protoplasma dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa mutagen ke dalam

media tanam atau dengan memperlakukan protoplasma dengan senyawa mutagen

tersebut. Silangan somatik dilakukan dengan cara penggabungan dua buah

protoplama segera setelah isolasi kemudian ditumbuhkan. Prosedur kultur

protoplasma secaraa umum adalah sebagai berikut:

1. Persiapan eksplan.

Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini

beragam, umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang

mempunyai umur fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari kecambah,

bibit, plantlet), pucuk adventif hasil pangkasan. Protoplasma dari sel jaringan

tersebut lebih mudah diisolasi protoplasmanya karena dinding selnya masih

sederhana dan hanya terdiri dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih

memiliki sel-sel parenchyma (dindingnya belum berlignin). Selain itu, ada

juga yang menggunakan jaringan yang telah dewasa, namun media untuk

isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya

telah berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel sekunder.

2. Sterilsasi eksplan.

Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu

dicuci kemudian disterilakan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 –

2 % selama 10 – 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan

tersebut selanjutnya dicuci dengan air steril (3 – 4 kali) untuk mencuci sisa

sodium hipoklorit pada eksplan.

3. Isolasi Protoplasma.

Istilah protoplasma pertama kali diperkenalkan oleh Hanstein pada tahun

1880, yang dimaksud dengan istilah tersebut adalah sel tumbuhan yang telah

dikupas bagian diding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus

oleh dinding sel. Isolasi protoplasma dapat dilakukan dengan dua cara:

Metode mekanikal.

Isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali

oleh Klercker pada tahun 1892. Isolasi protoplasma dilakukan dengan cara

mengupas dinding sel menggunakan alat bedah mikro. Metode ini telah

berhasil mengisolasi protoplasma dari daun Saintpaulia ionantha dan

dikulturkan hingga tumbuh kalus. Kelebihan dari metode ini adalah bila

sel yang digunakan mempunyai vakuola sel yang relatif besar sedangkan

kelemahannya adalah: 1) Keberhasilannya rendah; 2) Pekerjaan yang

membutuhkan tenaga banyak dan membosankan; 3) Viabilitas

protoplasma rendah, karena seng terjadi kerusakan protoplasma selama

proses pengupasan dinding sel.

Metode enzimatik

Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang

dapat mengahancurkan dinding sel. Enzym yang digunakan bervariasi

jenis dan konsentrasinya tergantung kondisi fisologis eksplan, terutama

umur jaringan yang erat kaitannya dengan komposisi dinding selnya.

Berikut dikemukanan perbandingan antara dinding sel primer dan

sekunder pada sel tumbuhan.

Enzym yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel tumbuhan

umumnya ada 3 yaitu: Cellulase untuk menghancurkan sellulose,

Hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose, Pectinase untuk

menghancurkan pektin.

Sedangkan alat yang digunakan untuk isolasi dan kultur ptotoplasma

adalah sebagai berikut :

Laminar air flow cabinet

Centrifuge

Inverted microscope

Gyratory shaker

Magnetic stirrer + hot plate

pH meter

Saringan stainless stell (lubang 60 - 70 m)

Bacterial filter

Nalgene filter unit 0,22 m

Millex filter unit 0,45 m

Spet dan jarum

Piset dg ujung runcing + pisau kultur

Pipet 5 ml berujung lebar

Pipet pastur 2 ml

Petri dish

Gelas beker

Parafilm/plastic wrapp

Bahan- bahan yang digunakan untuk isolasi protoplasma adalah sebagai

berikut:

Eksplan

Protoplasma yang telah berhasil diisolasi berasal dari organ-organ seperti:

daun, tangkai daun, pucuk, akar, buah, koleoptil, embrio dan mikrospora.

Diantara organ tersebut sel yang paling mudah dan bagus untuk diisolasi

protoplasmanya adalah berasal dari jaringan mesofil daun, karena: Bentuk

selnya relatif seragam, tidak perlu membunuh tanamannya, dinding sel

mudah terkelupas oleh enzim.

Ethanol 70 %

Larutan isolasi protoplasma

Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma

a. Jaringan tanaman seperti disterilkan terlebih dahulu dengan cara

merendamnya dalam alkohol 70% selama 30 detikm selanjutnya di rendam

kedalam larutan pemutih (misalnya bayklin) 20% yang ditambah beberapa

tetes Tween selama 15 menit. Selanjutnya daun tembakau tersebut dibilas

menggunakan aquadest steril sebanyak tiga kali.

b. Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan

urat daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing steril, untuk lebih

memudahkan isolasi protoplasmanya. Contoh campuran dan konsentrasi

enzym yang digunakan untuk isolasi protoplasma beragam dan tergantung

dari jenis jaringan yang digunakan sebagai eksplan, seperti:

1. Medium enzim untuk jaringan Akar

2 % rhozyme

2 % meicellase

0,03 % macerozyme R10

2. Medium enzim untuk daun Serealia

2 % cellulysin

0,2 % macerozyme R10

0,5 % hemicellullase

11 % mannitol

3. Medium enzim untuk Daun Tembakau:

0,5 % Onozuka R10 cellulase

0,1 % Onozuka R10 macerozyme R10

13,0 Mannitol

pH 5,8

Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma

dengan dinding selnya, Larutan enzim biasanya ditamhkan senyawa

osmoticum. Senyawa osmoticum yang dapat digunakan antara lain: Mannitol,

Sorbitol, Glukosa, Fruktosa, Galaktosa, Sukrosa.

Setelah dinding sel lepas, selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20 ml

larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam. Medium preplasmolisis untuk

setiap jenis eksplan berbeda, untuk tembakau medium preplasmolisis tersusun

atas medium isolasi protoplasma ditambah 13% mannitol.

Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut:

CaCl2.H2O 1480,0 mg/l

KH2PO4 27,2 mgl

KNO3 101,0 mg/l

MgSO4.7H2O 246,0 mg/l

CuSO4.5H2O 0,025 mg/l

KI 0,16 mg/l

pH 5,8

Eksplan dipindah larutam medium enzim (komposisi media ini juga

berbeda-beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan) untuk daun

tembakau komponennya dapat dilihat di atas. Eksplan dipindah ke tabung

steril dan dituangi medium enzim sebanyak 10 ml, lalu tabung ditutup dengan

aluminium foil steril dan diisolasi menggunakan parafilm atau plastik wrap.

Tabung berisi eksplan tersebut digoyang pada shaker dengan kecepatan 40

rpm selama semalam atau 4-16 jam.

4. Pemurnian protoplasma

Protoplasma dalam poin 5 disaring dengang filter steril, mess 63 µm,

masukkan ke dalam gelas piala volume 250 ml menggunakan pipet

pastuer.

Medium pencuci (MIP ditambah + 10 %) sebanyak 3 ml ditambahkan ke

dalam cawan petri yang berisi debris dari daun, digoyang perlahan dan

kombinasikandengan protoplas/ campuran enzim dalam gelas piala vol.

250 ml.

Protoplas yang diperoleh dicuci dengan medium pencuci dan saring.

Protoplas yang masih tercampur dengan larutan enzim disentrifuge dengan

kecepatan 50 x g selama 10 menit.

Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (medium flotasi) 10 ml

ditambah medium pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma

akan melayang-layang diantara medium flotasi (MIP + 20%) dan medium

pencuci.

Protoplasma yang melayang-layang dipindahkan ke dalam tabung

ditambah 10 ml medium pencuci, selanjutnya disentrifuge maka

protoplasma akan mengendap sebagai pelet.

Supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan diputar

lagi.

Supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml.

Kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap spesies

tanaman berbeda-beda seperti tembakau suspensi protoplas kerapatannya

50.000 sel/ ml dan 25000 sel/ ml untuk protoplasma petunia, protoplasma

tersebut dikulturkan dalam cawan petri steril.

Gambar protoplas padi setelah proses pemurnian dilakukan

5. Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma.

Untuk menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan

haemocitometer: jumlah sel / grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma

dilakukan dengan menggunakan senyawa flourescent seperti fluresein

diacetate (FDA). Medium kultur diambil 25 tetes selanjutnya ditambah 1 tetes

larutan pewarna FDA dan 1 tetes protoplasma suspensi tersebut agar protoplas

tercat dengan baik, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop. Protoplasma yang

mati berwarna merah dan yang viable tercat hijau.

6. Kultur protoplasma

Protoplasma yang hidup diambil dalam jumlah memadai (frekuensi

protoplas viable 100 – 200 sel) selanjutnya ditanam pada media yang telah

disediakan dan dikulturkan dan disimpan tempat gelap pada temperatur 28 oC

selama semalam. Kultur protoplasma dipindahkan pada cahaya rendah (10 –

20 µmol.detik-1

m-2

) dengan cahaya lampu putih yang dingin dan fotoperiode

16 jam, selama 2 hari. Kultur dipindahkan pada intensitas cahaya yang lebih

tinggi (50 – 75 µmol.detik-1

m-2

).

Media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media

media cair yang diletakkan dalam cawan petri kecil atau media padat media

padat (dengan pemadat agarose). Media yang digunakan untuk kultur

protoplasma jauh lebih kompleks dibandingkan dengan media untuk teknik

kultur lainnya, karena protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu

ditanam pada media awal yang diperkaya dengan osmotikum (misalnya

sorbitol atau mannitol) untuk: menghindari plasmolisis. Salah satu contoh

media kultur protoplasma tembakau.

Tabel 14. Formula media kultur protoplasma tembakau

Formula mg/l Formula mg/l Formula mg/l

Ca(H2PO4).H2) 100,000 H2BO3 3,00 Mannitol 100.000,00

CCl2.2H2O 50,000 KI 0,75 Inositol 100,00

KNO3 500,000 MnSO4.4H2O 13,20 Nicotinic acid 1,00

MgSO4.7H2O 50,000 Na2MoO4.2H2O 0,25 Pyridoxine-HCl 1,00

NaH2PO4.2H2O 170,000 ZnSO4.7H2O 2,00 Thiamine-HCl 10,00

(NH4)SO4 134,000 Sequestrene 330 28,00 2,4-D 0,10

CoCl2.6H2O 0,025 sucrose 10.000,00 NAA 1,00

CuSO4.5H2O 0,025 Glukose 18.000,00 BA 1,00

Catatan: pH: 5,8

Penanaman protoplama ke dalam media dilakukan dengan cara

mencampur protoplama dengan larutan agarose. Campuran disedot dengan

pipet pasteur steril kemudian diteteskan pada cawan petri steril (5 – 10 tetes

per petri). Cawan petri ditutup dengan parafilm selanjutnya kultur diletakkan

pada ruang kultur dengan suhu 25 C dan diberikan 16 jam penyinaran. Setiap

2 minggu ditambahkan media baru ke bagian tetesan protoplasma tersebut.

Teknik Kultur Protoplasma

Protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dengan dalam

medium agar semisolid dan liquid. Protoplasma sering dikulturkan dalam

media liquid untuk meregenerasi dinding sel terlebih dahulu, sebelum

dikulturkan ke media agar. Media semisolid agar, agar yang digunakan untuk

kultur protoplasma adalah khusus: yaitu gel agar lunak, salah satunya agarose.

Teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur, karena

mudah larut dan diserap, beberapa spesies, protoplasmanya tidak dapat

membelah dalam media agar, tekanan osmotik media direduksi secara efektif,

kerapatan sel-sel dapat direduksi setelah beberapa hari dikulturkan, kelemahan

dari teknik ini tidak boleh diisolasi dari turunan koloni tunggal yang berasal

dari sel induk satu. Teknik media liquid dapat dibedakan menjadi dua metode

a. Metode liquid tetes

Dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 µl, suspensi protoplasma

dalam media diteteskan pada cawan petri ukuran 60mx15m sebanyak 5-7

tetes. Cawan petri ditutup dan direkatkan dengan parafilm atau plastik wrap

selanjutnya diinkubasikan. Setiap 5-7 hari tambahkan medium segar baru

dengan cara meneteskan langsung pada tetesan suspensi protoplasma yang

telah mengalami pertumbuhan. Metode ini biasanya baik untuk keperluan

pengamatan dengan mikroskop. Kelemahan dari metode ini adalah tetesan-

tetesan suspensi menyatu menjadi satu tetesan di pusat.

b. Metode tetes menggantung

Dengan menggunakan pipiet volume 40-100 µl, suspensi protoplasma

diteteskan di dalam tutup cawan petri, selanjutnya cawan petri, ditutupdengan

menggunakan tutup yang telah ditetesi suspensi protoplasma, sehingga tetesan

suspensi tersebut akan menggantung di dalam tutup cawan petri tersebut.

Diagram prosedur fusi protoplas dari mesofil daun tembakau dan daun

plantlet kentang; A. Plantula kentang; B. Daun dari A dipotong-potong; C.

Potongan daun C diinkubasikan dalam medium plasmolisis selama 1-8 jam

selanjutnya diinkubasikan dalam medium enzym selama 4-16 jam; D1.

Protoplasma dalam C disaring dengang filter steril, mess 63 mikron ; D2.

Suspensi protoplasma disentrifuge; E. Pelet diresuspensi dalam medium

pengapung (flotation) 10 ml ditambah medium pencuci 1 ml selanjutnya

disentrifuge, protoplasma akan melayang-layang diantara medium flotasi dan

medium pencuci; F. Protoplasma diresuspensi lagi dengan medium CPW 13

M dengan kerapatan 1x 106 per mililiter; G. 1. Protoplasma diteteskan pada

tengah-tengah cawan petri steril ditambahkan dengan satu tetes minyak

mineral; 2. Tetesan tersebut ditutup menggunakan gelas penutup steril; 3.

Tambahkan 3 tetes dari setiap macam suspensi protoplasma; H. Protoplas

difusikan secara bertahap menggunakan medium fusagen PEG 22,5 dengan

cara meneteskannya sebanyak 6 tetes; I. Protoplasma dicuci dengan medium

pencuci Ca+ . Medium pencuci dicampur dengan medium kultur; J.

Protoplasma diinkubasikan di bawah sinar pada suhu 25o C; K. setelah 2-3

minggu koloni multiseluler diembeding dengan agarose; L. Koloni seluler

pada K ditanam pada medium MS basal (sumber: Trigiano & Gray, 2000).

Proses yang terjadi setelah kultur protoplas dilakukan

1. Fusi protoplas

Peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh

baik secara spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan.

a. Metode peleburan spontan

Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena

membran protoplas yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek

atau pecah yang dapat mengakibatkan peleburan protoplasma.

Biasanya terjadi pada protoplasma yang diisolasi dari kalus.

Perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya terjadi pada

protoplasma yang mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak

bernilai untuk perbaikan tanaman.

Gambar protoplast yang berhasil membentuk fusi

b. Metode pemacuan peleburan

Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya

agensia untuk memacu terjadinya peleburan protoplasma (dikenal

sebagai fusagen) yang berbeda jenis tanamannya. Larutan fusagen

contohnya:

Perlakuan dengan sodium nitrat: 5,5% sodium nitrat dalam larutan

10% sukrose dan kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu

35o

C selama 5 menit selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan

200 g selama 5 menit. Subernatan dibuang dan pelet disimpan

dalam water bath bersuhu 35o

C selama 30 menit. Pada beberapa

saat protoplasma akan terjadi peleburan. Agregat ditiangkan secara

hati-hati pada medium kultur yang telah ditambah 0,1% NaNO3.

Teknik ini akan dihasilkan dengan frekuensi rendah bila asal

protoplasmanya dari mesofil daun.

Perlakuan ion calsium padas pH tinggi . Teknik ini telah digunakan

pada protoplasma tembakau. Caranya protoplasma yang telah

diisolasi ditambahkan larutan fusagen berupa 0,5 M mannitol yang

berisi 0,05 M CaCl2.2H2O pada pH 10,5 selanjutnya disentrifuge

dengan kecepatan 50 g selama 3 menit. Selanjutnya tabung

sentrifuge disimpan dalam water bath bersuhu 37o

C selama 40-50

menit hingga protoplasma melebur.

Perlakuan polyethelene glycol (PEG). Dari sekian banyak metode

peleburan protoplasma, metode ini yang yang berhasil dengan baik

untuk melebur protoplasma. Suspensi protoplasma dilarutkan

dalam larutan PEG: 1 ml suspensi protoplasmadalam medium

kultur dicampur dengan 1 ml 28-56% PEG (1500-6000 MW).

Tabung digoyang selama 5 detik dan biarkan berhenti 10 menit.

Selanjutnya suspensi protoplasma tersebut dipindahkan dari larutan

PEG dengan cara mencucinya menggunakan medium kultur

sebanyak 2 kali. Hasil peleburan protoplasma ini berupa

pembentukan heterokarion dengan frekuensi yang tinggi,

sedangkan kebanyakan tipe sel sitoplasmik dengan pembentukan

hetekarion binukleat rendah.

2. Pembentukan Dinding Sel

Perkembangan protoplasma diawali dengan regenerasi atau

terbentuknya dinding sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus.

Pada beberapa spesies, protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi

melalui organogenesis atau embryogenesis.

3. Regenerasi Protoplasma

Regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian tanaman

lebih sulit dibandingkan dengan teknik kultur jaringan jaringan lain. Salah

satu teknik yang digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah

menggunakan sel-sel lain (sebagai perawat) sehingga tekniknya disebut

dengan teknik “Nurse Culture”. Untuk kultur satu protoplasma, “nurse

cells” diletakkan berdekatan dengan kultur protoplasmanya untuk

mendukung pertumbuhan dan perkembangan protoplasma. Teknik ini

pertama kali diperkenalkan oleh Muir dkk.

Tanaman yg dihasilkan dari kultur protoplasma bisa seragam atau

bervariasi, disebut “protoclonal variation”. Apabila dalam penanaman

protoplasma ditambahkan mutagen ke dalam media, maka hasil regenerasi

akan berupa generasi baru.

Produksi tunas dapat dilakukan pada media cair, umumnya ke dalam

media ditambahkan hormon pertumbuhan sitokinin (misalnya 0,5 M

BAP). Setelah tunas terbentuk cukup besar, tunas selanjutnya dalat

diakarkan. Salah satu contoh media pengakatran protoplasma adalah 1/2

MS + 3-aminopyridine (untuk tembakau) atau picloran (untuk tebu).

Plantlet yang cukup besar selanjutnya diaklimatisai kemudian ditanam di

lapangan.

Perlakuan peleburan elektro (elektrofusion). Protoplasma diletakkan di

dalam sel kultur yang kecil dan berisi elektrode yang berbeda

potensialnya, protoplasma diletakkan diantara barisan elektrode-

elektrode. Selanjutnya protoplasma diberi shok gelombang pendek

elektrik yang akan mengiduksi terjadinya peleburan protoplasma.

Dalam metode ini ada dua tahapan prosedur yang dimulai dengan

penggunaan AC dari intensitas rendah untuk suspensi protoplasma.

Kolektor dielektroforetik diatur 1,5 V dan 1 MHz dan konduktivitas

elektirk dari medium suspensi kurang dari 10-5

detik/cm efek sebuah

elektroforesis dijalankan akan membuat masing-masing sel

berbenturan sepanjang alur barisan elektrode. Tahap kedua injeksi

aliran listrik DC dengan intensitas tinggi (750-1000V/cm) dengan

waktu yang sangat singkat yaitu 20-50 µdetik menyebabkan membran

protoplasma robek dan akan menghasilkan peleburan yang selanjutnya

membran akan mengalami reorganisasi. Teknik fusielektro sangat

sederhana, cepat dan efisien. Sel-sel yang telah di fusikan secara

eletronik tidak menunjukkan respon yang sitotoxit. Namun metode ini

jarang digunakan.

Gambar protoplas yang sudah beregenerasi

Penutup

Kultur protoplasma atau bisa juga disebut kultur fusi protoplasma

mempunyai tujuan akhir penyatuan dua jenis sel tanaman dari spesies maupun

genus yang berbeda sehingga terbentuklah individu tanaman yang baru yang juga

mempunyai ekspresi sifat yang baru. Dari dasar inilah terlihat adanya peluang

untuk mendapatkan jenis-jenis / varietas-varietas yang unggul.

Kultur protoplas ini harus dilakukan dengan teliti memenuhi prosedur yang

berlaku. Urutan prosedur pada kultur protoplas ini adalah Persiapan eksplan,

sterilsasi eksplan. isolasi protoplasma, pemurnian protoplasma, perhitungan

konsentrasi dan test viabilitas protoplasma, kultur protoplasma.

Sedangkan proses yang terjadi pada saat protoplasma tersebut dikulturkan

antara lain fusi protoplast (penggabungan dua protoplast) dilanjutkan dengan

pembentukan dinding sel dan regenerasi sel sehingga dapat membentuk individu

baru.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2007. Kultur Protoplasma Dan Fusi Protoplasma. http://www.e-learning.unram.ac.id. Diakses tanggal 28 Oktober 2008.

Hapsari, C. 2003. Pengaruh Jenis Gula Medium Terhadap Perkembangan Awal

Protoplas Kacang Hijau (Vigna radiata (l.) Wilczek) Dengan Perlakuan

Awal Preplasmolisis. http://www.digilib.bi.itb.ac.id. Diakses tanggal 28

Oktober 2008.

Sukmadjaja, D., Novianti S., Endang G., Ika R., Tintin S. 2007. Teknik Isolasi

dan Kultur Protoplas Tanaman Padi http://biogen.litbang-deptan.go.id

Diakses tanggal 28 Oktober 2008.

Purwito, A. 1999. Fusi Protoplas Intra Dan Interspesies Pada Tanaman Kentang. Disertasi Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor