1

Percobaan:

Kultur Jaringan Tumbuhan (Nicotiana tabacum)

Oleh:

Dr. Erly Marwani, KK SBT-SITH

Teknik kultur jaringan tumbuhan telah lama dikenal dan dikembangkan sebagai

teknik untuk memelihara sel, jaringan dan organ tumbuhan pada medium buatan

secara aseptic dalam kondisi lingkungan terkontrol (dikenal juga sebagai teknik kultur

in vitro). Melalui teknik kultur jaringan, potongan jaringan dapat diinduksi menjadi kalus,

organ, embrio, bahkan dapat diregenerasi menjadi suatu tumbuhan sempurna.

Keberhasilan kultur jaringan tumbuhan ditentukan oleh factor fisika, kimia dan

biologi. Faktor fisika yang sangat berpengaruh adalah suhu dan cahaya. Factor kimia

adalah media nutrisi dan keasaman, sedangkan faktor biologi yang berpengaruh

meliputi kualitas eksplan dan terbebas dari pengaruh kontaminan (terutama

mikorganisme).

Media merupakan komponen terpenting dalam mencapai keberhasilan kultur

jaringan. Media nutrisi untuk kultur jaringan meliputi makro dan mikro nutrien, vitamin

(suplemen organic), sumber karbon (sukrosa) dan hormon tumbuh (zat pengatur

tumbuh). Komposisi dan konsentrasi elemen-elemen nutrisi untuk kultur jaringan telah

diformulasikan oleh beberapa peneliti seperti formula medium Murashige & Skoog,

Gamborg, dan Schenk & Hildebrandt. Bahan-bahan yang digunakan dalam formula

tersebut berupa komponen kimia tunggal atau yang telah digabungkan menjadi suatu

powder berisi campuran lengkap dari makro dan mikro nutrient dan vitamin. Formula

medium Mrashige dan Skoog dapat dilihat pada Tabel 1.

Kebutuhan makro dan mikro nutrient tersebut diatas dapat juga disediakan dari

sumber alternative seperti pupuk tanaman buatan yang tersedia di pasar bebas ,

sehingga lebih mudah diperoleh dan harganya relative murah. Kebtuhan vitamin dapat

disediakan dari vitamin/suplemen organic yang ada di pasaran, sedangkan kebutuhan

2

zat pengatur tumbuh dapat disediakan dari air kelapa (sebagai sumber sitokinin) dan

ekstrak buah seperti ektstrak buah pisang dll sebagai sumber zat pengatur tumbuh

lainnya.

Dalam percobaan ini sebagai model kultur jaringan tumbuhan akan dilakukan

regenerasi tanaman in vitro melalui organogenesis menggunakan sumber tanaman

Nicotiana tabacum pada medium Murashige dan Skoog (Tabel 1.) dengan penambahan

zpt pada Tabel 2. dan pada medium alternative dari campuran pupuk Growmore 32-10-

10 (sumber makro dan mikro nutrient), Vitastart B (sebagai sumber vitamin dan auksin

NAA) dan 10-20% air kelapa (sebagai sumber sitokinin), serta sukrosa 30% sebagai

sumber karbon..

Alat alat:

Elenmeyer, gelas piala, gelas ukur, botol kultur, batang pengaduk, pipet ukur, hot plate,

pH meter, scalpel + blade, pinset , cawan petri , lampu spiritus, clean bench, rak Kultur

Bahan :

Eksplan berupa daun tembakau, tapak dara, petunia ke 2 5

Medium komposisi Murashige dan skoog (1962) yang terdiri dari Makro dan Mikro

elemen , Suplemen organik, gula dan agar , seperti tertera pada Tabel 1.

Medium alternative dengan komponen kimia berupa :

- pupuk Growmore 32-10-10 ( 5 g/L)

- Vitastart B (2; 3; 4 ml/L)

- air kelapa (15 %)

- sukrosa 30%

Agen sterilisasi eksplan berupa NaClO 2.6% sedangkan untuk sterilisasi alat-alat

penanam digunakan alkohol

Alumunium foil digunakan untuk penutup botol kultur

Zat pengatur tumbuh berupa NAA (Naphtaleneacetic acid) dan BAP (Benzylamino

purine) dengan perbandingan konsentrasi tertera pada Tabel 2 .

Agar Swallow 8 g/L

3

Cara percobaan :

A. Pembuatan Medium MS:

1. Siapkan Media MS dalam gelas ukur sebanyak 1200 mL

2. Tambahkan 3% gula yang telah di larutkan dengan 100 ml akuades .

3. Bagi 1200 mL medium tersebut menjadi 12 bagian, masing-masing 100mL

4. Tambahkan larutan NAA dan BAP dari larutan stok sesuai dengan konsentrasi yang

diperlukan (Tabel 2. ) pada medium MS

5. Tentukan keasamam larutan 5.6 5.8 dengan menambahkan NaOH 1M atau HCl

1M yang diukur dengan PH meter .

6. Tambahkan agar Swallow 0,8% lalu didihkan diatas Hot Plate sambil diaduk .

7. Tuangklan larutan medium tersebut kedalam botol kultur 15 ml /botol.

8. Tutup botol dengan Alumunium foil .

9. Sterilisasi botol-botol tadi dengan otoklaf pada suhu 121 C tekanan 1.5 kg/cm

selama 15menit

B. Pembuatan Medium Alternatif:

Siapkan media alternative sebanyak 900 mL dengan mencampurkan 4,5 g

Growmore (32-10-10) + 135 mL air kelapa (tua) + 27 g gula putih

Bagi 900 mL media tersebut menjadi 3 bagian, masing-masing 300 mL.

Kedalam 300 mL media tersebut tambahkan Vitastart B masing-masing 2; 3; 4

ml/L

Selanjutnya lakukan langkah 5 9 seprti pada prosedur pembuatan medium MS

C. Sterlilisasi dan Penanaman eksplan :

1. Petiklah daun ke- 2 s/d 5 dari daun tembakau/tapak dara/petunia lalu cuci dengan

air mengalir

2. Daun-daun yang sudah bersih diletakan diatas cawan petri yang telah dilapisi kertas

saring .

3. Daun-daun tersebut direndam dalam larutan NaClO 1,7% (30% larutan Sunclyn) di

dalam Erlenmeyer selama 8-10 menit atau sampai pinggiran daun berwarna putih .

4

4. Daun-daun yang telah disterilkan tadi di bilas akuades steril 3 4 kali ulangan lalu

diletakan di atas cawan petri dilapisi kertas saring yang telah disterilisasi.

5. Daun-daun steril di potong-potong sebesar 1 x 1 cm dengan skalpel dan pinset

steril . Potongan daun tersebut ditanamkan pada medium dalam botol kultur dengan

posisi bagian bawah daun menghadap ke atas . Proses penanaman ini dilakukan di

ruang steril atau Clean bench yang di lengkapi nyala api dari lampu spiritus .

6. Kultur ditempatkan di rak kultur pada kondisi suhu ruangan dengan penerangan

lampu TLD 36 Watt terus menerus.

7. Diagram prosedur kultur in vitro dapat dilihat pada Gambar 1.

D. Pengamatan :

1. Lakukan pengamatan kultur setiap minggu selama 3 minggu dengan

memperhatikan diferensiasi yang terjadi pada setiap potongan jaringan.

2. Perhatiklan apakah terjadi pembentukan pucuk , akar atau kalus

3. Diskusikan dan simpulkan hasil pengamatan saudara di dalam kelas

5

Tabel 1. Komposisi kimia media nutrisi formula Murashige & Skoog (1962)

Bahan Konsentrasi ( mg/L )

Makro elemen

NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCL2.2H2O 400

MgSO4 . 7H2O 370

KH2PO4 170

Mikro elemen

KI 0.083

H3BO3 6.2

MnSO4 . 4H2O 22.3

ZnSO4 . 7H2O 8.6

Na2Mo04 . 2H2O 0.25

CuSO4 . 5H2O 0.025

CoCL2 . 6H2O 0.025

Na2 EDTA 37.3

FeSO4 . 7H2O 27.8

Suplemen organik

Inositol 100

Nicotinic - acid 0.5

Pyridoksin - HCL 0.5

Tiamin HCL 0.1

Glysin 2.0

Sukrosa (gula putih) 30.000

Agar Bacto 0.8

PH 5.6 5.8

6

Tabel 2 . Konsentrasi NAA dan BAP untuk Perkembangan Kultur Jaringan

NAA

BAP

0 0.01 M 0.1M 1.0 M

0.1M

1.0 M

5.0 M