MIKROTEKNIK DAN

HISTOKIMIA

DR. ELYUSRAR A. JALAL Ph.D

MIKROTEKNIK

• Pengetahuan tentang struktur sel dan jaringan didapatkan dari hasil-hasil penelitian memakai berbagai cara

• Secara garis besar:– Obsevasi sel dan jaringan hidup– Penelitian melalui jaringan yang sudah mati– Isolasi komponen sel hidup dengan “differential

centrifugation method”

• Pada dasarnya:= analisa mikroskopis

Analisa Mikroskopis

• Dasar: – perbedaan intensitas cahaya/kontras gelap-terang dari

komponen jaringan

– Perbedaan panjang gelombang cahaya/perbedaan warna dari komponen2 jaringan

• Memerlukan alat dan metode untuk meningkatkan perbedaan/kontras antara satu komponen jaringan dari komponen jaringan lainnya– Mikroskop

– Pewarnaan jaringan

Mikroskop1. Mikroskop cahaya/ Light Microscope

• Memerlukan sediaan yang tipis, transparan

• Komponen jaringan dibedakan dengan pewarnaan

2. Dark-Field Microscope• Partikel terlihat terang pada latar belakang yang gelap

• Utk memperlihatkan treponema pallidum

3. Phase Contrast Microscope• Perbedaan refraksi dikonversikan menjadi perbedaan

intensitas gelap dan terang. Untuk observasi sel hidup

4. Interference Microscope• Dapat mengukur massa komponen jaringan dalam suatu unit

sediaan

5. Polarizing Microscope• Perbedaan tingkat anisotropi dari komponen jaringan

• Informasi tentang struktur pada tingkat molekular

6. Fluorescence Microscope• Sediaan disinari dengan ultra violet, perbedaan fluoresensi

dari komponen jaringan

7. Ultraviolet Microscope• Untuk melokalisir asam nukleat didalam sel, asam nukleat

menyerap sinar ultra violet lebih banyak

8. Electron Microscope• Pengganti cahaya dipakai electron beam

• Pembesaran lebih tinggi

• Transmission Electron Microscope (TEM)

• Scanning Electron Microscope (SEM)

Phase-contrast

TEM

Pembuatan sediaan mikroskopik

• Fiksasi

• Embedding

• Sectioning

• Staining

FIXATION

• Tujuan:– Secepatnya menghentikan proses kehidupan sel

• Menghentikan aktivitas enzim sel, mencegah proses autolysis sel, degenerasi post mortem

– Memelihara/mempertahankan struktur jaringan– Mencegah kerusakan jaringan karena aktivitas

bakteri atau mikro organisme lain

Fixative

1. Formaldehide

2. Glutaraldehide

3. Osmium tetroxide

Fixative mengakibatkan timbulnya ikatan

silang antara molekul protein jaringan

/ stabilisasi protein

Cara fiksasi

• Immersion fixation– Jaringan direndam didalam larutan fixative

• Perfusion fixation– Larutan fixative dimasukkan ke jaringan

melalui sistem sirkulasi darah

EMBEDDING

• Agar jaringan jaringan menjadi keras dan dapat dipotong menjadi sediaan mikroskopik (untuk sediaan mikroskop cahaya setebal 5-10µ)

• Embedding agents– Parafin cair (suhu 600C)– Celloidin

• Melalui proses dehidrasi dengan etanol, kemudian “clearing” dengan xylene

• Hasil: terbentuk “tissue block”

SECTIONING

• “Tissue block” dipotong menggunakan microtome, menghasilkan “tissue section”

• Tissue section diletakkan diatas kaca sediaan, melalui proses clearing dengan xylene, rehidrasi kemudian dimasukkan kedalam bak pewarnaan

• Frozen section, bila diperlukan sediaan histologi secara cepat, misalnya untuk mendiagnosa keganasan pada biopsi. Tanpa embedding, jaringan dibekukan dan dipotong dengan freezing microtome

Microtome

STAINING

• Bahan pewarnaan umumnya berupa larutan didalam air, tissue section lebih dulu harus dibebaskan dari parafin (dengan xylene) dan di rehidrasi

• Yang paling banyak dipakai adalah haematoxylin dan eosin (HE)

• Setelah staining, tissue section kembali di dehidrasi dan clearing, ditetesi mounting medium, kemudian ditutup dengan cover glass

Metode Histokimia

• Menentukan lokalisasi senyawa tertentu didalam sel dan jaringan pada sediaan histologi, memakai metode kimia atau fisika

• Memerlukan cara fiksasi dan pembuatan sediaan yang mempertahankan senyawa kimia didalam sel dan sekaligus struktur sel

• Memerlukan sediaan kontrol dalam interpretasi hasil untuk memastikan spesifisitas reaksi

RETICULOCYTE

Acidophilia dan Basophilia

• Metode standard, memakai pewarnaan yang bersifat asam dan basa

• Komponen jaringan tertentu lebih cenderung untuk mengikat zat warna asam (acidophilic), sedangkan komponen lain mengikat zat warna basa (basophilic)

• Membedakan berbagai komponen jaringan dengan perbedaan warna

Haematoxilin - Eosin

Metachromasia

• Komponen jaringan tertentu merubah warna, misalnya matriks tulang rawan diwarnai dengan biru toluidin, merubah warna biru menjadi ungu

• Perubahan warna itu disebut metachromasia• Pewarnaan yang dapat menimbulkan

metachomasia disebut zat warna metachromatik, seperti toluidin blue dan thionine

Periodic acid-Schiff (PAS)

• Untuk memperlihatkan molekul yang kaya karbohidrat, seperti glikogen dan glikoprotein

• Hasil adalah PAS positif dan PAS negatif

PAS positif

Feulgen method

• Untuk memperlihatkan DNA

• Komponen sel yang memberikan reaksi Feulgen positif adalah chromatin pada inti sel

DNA

Pewarnaan Sudan untuk lipid

• Pewarnaan Sudan mewarnai trigliserid

• Sudan red, biasa dipakai untuk mewarnai sel lemak

• Sudan black untuk mewarnai lapisan myelin dari serat saraf

Deteksi Enzym

• Lokalisasi enzym tertentu didalam sel dapat diketahui

• Memerlukan potong beku dari jaringan yang tidak difiksasi, memakai cryostat pada suhu –10 – 200 C

• Sediaan di inkubasi dengan substrat enzim, hasil reaksi akan merubah zat warna

Enzim alkali fosfatase

Ion Ca pada tulang rawan

Immunohistokimia

• Memakai antibodi spesifik untuk makro molekul tertentu didalam jaringan

• Antibody diberi label, – zat warna fluorescence– Enzym peroxidase– Ferritin dsb

• Lokalisasi reaksi antigen-antibodi dideteksi dengan melihat warna label

Immunofluorescence

ImmunohistokimiaPeroxidase labelled antibody

Peroxidase labelledAnti Lysozym