KROMATOGRAFI  LAPIS  TIPIS  

TLC  

Persiapan  KLT  

Proses  spo/ng  dan  developing  

Spot  detec7on  

Prepara7ve  TLC  

Bagaimana  mengecek  Senyawa  yang  terpisah  di  KLT?    1.  Dengan  penyinaran  lampu  UV  

(254  dan  366  nm)  2.  Dengan  reaksi  pewarnaan  

2008  was  the  year  where  I  became  an  amino  acid  chemist  and  as  a  consequence  the  Ninhydrin  Stain  has  become  my  new  friend.  Many  of  the  amino  acids  I  handle  these  days  are  not  UV  ac7ve  but  fortunately  the  Ninhydrin  Stain  is  great  for  visualising  free  amines  and  primary  amines.  Most  of  my  amines  are  BOC-­‐protected  but  they  s7ll  develop  nicely  with  ninhydrin  because  the  BOC  group  is  cleaved  upon  treatment  with  the  stain.   AWer  treatment  with  a  heat  gun  Ninhydrin  

Stain  tends  to  give  brightly  coloured  pink  to  purple  spots  as  shown  above.  The  spots  can  fade  rather  fast  so  record  the  result  immediately.  In  the  past  I  have  been  using  a  Ninhydrin  Stain  that  didn't  contain  water,  however  adding  a  bit  of  water  seems  to  improve  the  result  a  fair  bit  

Ninhydrin  Stain  Recipe  100  ml  container  0.2  g  Ninhydrin  0.5  ml  Ace7c  acid  100  ml  n-­‐Butanol  4.5  ml  Water  

Phosphomolydic  acid  (PMA)  Stain  Recipe  100  ml  container  100  ml  Ethanol  10  g  Phosphomolybdic  acid,  H3[P(Mo3O10)4]  ·∙  xH2O  

PMA  Stain  is  a  highly  versa7le  general  stain  for  developing  TLC  plates.  The  stain  is  easily  prepared  by  dissolving  10  wt.  %  phosphomolybdic  acid  in  ethanol.  More  PMA  can  be  used  however  as  stains  go  PMA  is  rela7vely  expensive.  

TLCs  developed  with  PMA  stain  upon  hea7ng  give  green/dark  green/dark  blue  spots  on  a  yellow/green  background  (see  picture).  

 Hanessian's  Stain  

Don't  you  just  love  that  feeling  when  you  are  checking  your  reac7on  mixture  by  TLC  and  no  maeer  which  stain  you  use  nothing  appears  on  the  plate.  If  your  compound  also  isn't  UV  ac7ve  you've  got  a  real  problem.  Well  the  good  news  is  that  there  is  one  stain  that  will  do  the  job  for  you  -­‐  Hanessian's  Stain!  Hanessian's  stain  is  an  excellent  mul7-­‐purpose  stain  that  when  used  the  right  way  usually  gives  blue  spots  (TLC  plate  A).  Since  it  is  a  water  based  stain  it  requires  vigorous  hea7ng  for  development.  However,  if  you  overdo  it  the  en7re  plate  goes  dark  blue  (TLC  plate  B).  

Hanessian's  Stain  Recipe  1  100  ml  container  90  ml  Water  5  g  Ammonium  molybdate,  (NH4)6Mo7O24-­‐4H20  1  g  Cerium  sulfate,  Ce(SO4)2  10  ml  Concentrated  sulfuric  acid  -­‐  Hanessian's  Stain  Recipe  2  100  ml  container  90  ml  Water  2.5  g  Ammonium  molybdate,  (NH4)6Mo7O24-­‐4H20  1  g  Cerium  ammonium  sulfate,  Ce(NH4)4(SO4)4-­‐2H2O  10  ml  Concentrated  sulfuric  acid  

Vanillin  Stain  Recipe:  100  ml  container  6  g  Vanillin  1.5  ml  Conc.  sulfuric  acid  95  ml  96%  Ethanol  

Add  the  vanillin  to  your  container  followed  by  ethanol  to  give  a  clear  solu7on.  Carefully  add  the  sulfuric  acid.  The  final  product  is  a  clear  colourless  solu7on.  However,  aWer  some  dipping  of  plates  it  will  quickly  become  a  clear  yellow  solu7on  (see  picture  above).  How  to  use  the  vanillin  stain:  Run  your  TLC  and  let  it  dry.  If  you  want  to  check  for  UV  ac7vity  you  should  do  so  now  and  not  later.  Dip  the  TLC  plate  in  your  vanillin  stain  and  heat  it  using  a  heat  gun  (gently  at  first  so  that  you  don't  spray  the  stuff  all  over  your  hood)  un7l  coloured  spots  appear.  Remember  to  put  the  lid  back  on  7ghtly  otherwise  it'll  dry  out.  To  the  leW  there's  a  picture  of  a  TLC  plate  that  I  developed  today  using  the  vanillin  stain.  

This  is  my  favourite  all  purpose  stain  and  aWer  a  quick  look  under  the  UV  lamp  this  is  my  next  stop.  It  virtually  always  works  well  to  give  spots  in  a  wide  variety  of  colours  which  can  be  handy  for  spo/ng  what  your  aWer  when  you  have  mul7ple  spots  

Kromatografi  kolom