BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1. Desain Penelitian

Penelitian dilaksanakan dengan metode Eksperimental laboratorium,

menggunakan desain true eksperimental dengan kontrol (post test only Control

Group Design). Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui manfaat dari

pemberian ekstrak Cinnamomum burmanni terhadap profil lipid pada hewan coba

tikus putih (rattus norvegicus) jantan hiperglikemia yang telah diinduksi aloksan.

Penelitian dilakukan secara in vivo pada hewan coba tikus strain winstar

jantan. Untuk membuat model tikus diabetes, tikus di injeksi dengan bahan kimia

diabetogen, yakni aloksan. Kemudian hewan coba kelompok eksperimen diterapi

dengan suplementasi ekstrak kayu manis (Cinnamomum burmanni) per oral

selama 14 hari (akut). Pada akhir penelitian dilakukan pengukuran kadar TG dan

LDL pada kelompok kontrol dan eksperimen (post test).

4.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Biokimia Universitas Islam

Malang, Laboratorium Biomolekuler Universitas Brawijaya, dan Laboratorium

Faal Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya pada bulan Desember 2010

hingga Februari 2011.

4.3. Metode Pengambilan Sampel

Metode pengambilan sampel yang digunakan adalah teknik Probability

Sampling berupa Simple Random Sampling. Cara menentukan estimasi jumlah

sampel yang dibutuhkan dihitung berdasarkan Federe (1963) dalam Sastrosupadi

20

21

(1977) yang menyatakan bahwa hubungan antara perlakuan dan banyaknya

ulangan adalah sebagai berikut :

(t-1) (n-1) = 15

t = banyaknya perlakuan

n = banyaknya ulangan

Jika jumlah perlakuan dalam penelitian ini = 5, maka jumlah ulangan adalah

4n = 19, sehingga n = 4,75 5. Dengan demikian jumlah sampel yang digunakan

dalam penelitian ini minimal 25 ekor tikus. Mempertimbangkan terjadinya

eksklusi yang dilakukan setelah hewan coba di induksi aloksan, maka jumlah

tikus yang digunakan sebanyak 40 ekor. Sehingga jumlah sampel yang

dibutuhkan dapat terpenuhi.

4.4. Alat dan Bahan Penelitian

4.4.1. Hewan coba

Penelitian ini menggunakan hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) jantan

strain wistar sebanyak 40 ekor yang diperoleh dari Laboratorium Biomolekuler

Universitas Brawijaya. Umur hewan coba berkisar 2,5 – 3 bulan dengan berat

badan 180 – 250. Tikus albino sering digunakan sebagai binatang coba pada

berbagai penelitian karena mempunyai sensitifitas terhadap obat yang sangat

tinggi dan tahan terhadap kondisi laboratorium (Farris & Griffith, 1971).

Berdasarkan hal-hal tersebut diatas, maka pada penelitian ini digunakan tikus

Strain wistar sebagai binatang coba.

22

4.4.2. Alat dan bahan untuk pemeliharaan hewan coba

1. Kandang tikus

2. Penutup kandang

3. Botol air

4. Timbangan BB tikus

5. Pakan tikus standar

6. Aquades untuk minum

4.4.3. Alat dan Bahan Induksi Aloksan

1. Timbangan digital

2. Beker glass

3. Pipet

4. Tabung ukur

5. Spuit 1 cc

6. Jarum suntik

7. Batang pengaduk

8. Aloksan Monohidrat (A7413-10G) (Sigma Aldrich)

9. Normal Saline 0,9 %

10. Glukosa 10 %

11. Glukosa 5 %

4.4.4. Alat dan Bahan Untuk Ekstraksi

1. Kertas filter

2. Timbangan digital

3. Beker glass

4. Pipet volume

5. Tabung ukur

6. Alumnium foil

7. Batang pengaduk

8. Kayu manis yang telah dihaluskan

9. Aquades

4.4.5. Alat dan Bahan Pemeriksaan Glukosa Darah

1. Glukometer

2. Strip Glukometer

3. Jarum suntik

4. Kapas alkohol

5. Betadine

6. Darah ujung ekor tikus

4.4.6. Alat dan Bahan Perlakuan

1. Sonde

2. Spuit 1 cc

3. Handscoen

4. Ekstrak kayu manis

23

4.4.7. Alat dan Bahan Pembedahan

1. Spuit

2. Gunting

3. Tempat organ

4. Pinset

5. Pengait jaringan

6. Handscoon

4.4.8. Alat dan Bahan Pemeriksaan SOD

1. EDTA ( etilen diamin tetra asetat )

2. PBS ( phosphat buffer saline )

3. H2O

4. Xantin

5. Xantin oksidase

6. NBT ( Nitroblue tetrazolium )

7. Pankreas tikus

8. Kertas label

9. Tempat organ

4.4.9. Alat dan Bahan Pemeriksaan MDA

1. TCA 100%

2. HCI 1N

3. Na-thio 1%

4. Pankreas tikus

24

5. Kertas label

6. Tempat organ

4.5. Tahapan Penelitian

4.5.1. Adaptasi dan Pengelompokan Hewan Coba

Tikus akan diadaptasikan didalam kandang hewan coba di laboratorium

Biomolekuler Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya selama 14 hari, dan diberikan

makan dan minum sesuai standar.

1. Kelompok 1 (kontrol negatif) : Hewan coba diberikan diet normal tanpa

perlakuan induksi aloksan dan pemberian ekstrak kayu manis

2. Kelompok 2 (kontrol positif) : Hewan coba di induksi aloksan

3. Kelompok 3: Hewan coba di induksi aloksan + ekstrak kayu manis 0,5 ml

4. Kelompok 4: Hewan coba di induksi aloksan + ekstrak kayu manis 1 ml

5. Kelompok 5 : Hewan coba di induksi aloksan + ekstrak kayu manis 2 ml

4.5.2. Pemeliharaan hewan coba

Seluruh hewan coba dipelihara dalam kandang Laboratorium Biomolekuler

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Masing – masing kandang berisi 5 ekor

tikus. Pembersihan kandang dan penggantian sekam dilakukan setiap satu hari sekali

untuk mencegah terjadinya infeksi sekunder dari urine tikus yang mengandung glukosa.

4.5.3. Preparasi Ekstrak Kayu manis (Cinnamomum burmannii)

Kayu manis (Cinnamomum burmannii) yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan

hingga menjadi serbuk kayu manis. Serbuk kayu manis didapat dari Balai Materia

Medica Malang.

25

4.5.4. Proses Ekstraksi Kayu Manis

Sebanyak 10 gram serbuk kayu manis dilarutkan dalam 100 ml air. Kemudian

disimpan dalam waterbath pada suhu 60ºC selama 2 jam. Larutan yang didapat disaring

dengan kertas saring. Ekstrak yang didapatkan kemudian didilusi dengan air dengan

perbandingan 1:10.

Gambar 4.1 : Proses Ekstraksi Kayu Manis

4.5.5. Prosedur Induksi Diabetes

Tikus dipuasakan selama 16-18 jam, namun diberi minum secara bebas. Kemudian

diinjeksi dengan aloksan 150 mg/kgBB yang dilarutkan dalam Normal Saline 0,9 %,

secara intraperitoneal. Setelah 6 jam induksi aloksan, dilakukan injeksi glukosa 10 %

26

sebanyak 4 cc secara intraperitoneal. Air minum diganti dengan larutan glukosa 5 %

pada tempat minum tikus selam 24 jam pasca induksi aloksan. Setelah 72 jam induksi

aloksan, glukosa darah diukur dengan glukometer. Kriteria inklusi adalah tikus dengan

glukosa darah > 180 mg/dl.

Gambar 4.2 : Prosedur Induksi Diabetes

4.5.6. Proses Perlakuan

Sampel dibagi menjadi 5 kelompok masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor

tikus.

1. Kelompok 1 (kontrol negatif) : Tidak diberi perlakuan apa pun.

2. Kelompok 2 (kontrol positif) : Induksi aloksan tanpa ekstrak kayu manis.

3. Kelompok 3 : Induksi aloksan + ekstrak kayu manis 0,5 ml.

4. Kelompok 4 : Induksi aloksan + ekstrak kayu manis 1 ml.

5. Kelompok 5 : Induksi aloksan + ekstrak kayu manis 2 ml.

27

Ekstrak kayu manis diberikan secara oral (sonde) setelah 72 jam pasca induksi aloksan

(hari ke-4) sampai hari ke-18.

4.5.7. Pemeriksaan Glukosa Darah

Dalam penelitian ini, pemeriksaan kadar gula darah pada tikus dilakukan secara

acak atau GDA. Pada hari ke-0 dan hari ke-3 dilakukan pengukuran glukosa darah.

Pemeriksaan glukosa darah pada hari ke-0 dilakukan untuk mengukur kadar glukosa

darah awal, sedangkan pengukuran pada hari ke-3 dilakukan untuk mengetahui efek

hiperglikemik dari aloksan.

Pengukuran dilakukan dengan cara ujung ekor tikus didesinfeksi dengan alkohol,

kemudian ditusuk dengan jarum, selanjunya darah yang menetes dikenakan pada strip

glukometer. Kadar glukosa darah dinyatakan dalam mg/dl. Menurut Kusumawati

(2004), kadar glukosa darah tikus dalam keadaan normal adalah 50-135 mg/dl. Kadar

glukosa darah tikus pada hari ke-3 yang mencapai > 180 mg/dl dinyatakan mengalami

diabetes melitus. Kemudian dilakukan pemberian suplementasi ekstrak kayu manis

selama 14 hari.

4.5.8. Pembunuhan dan Pengambilan Organ Pankreas Hewan Coba

1. Letakkan kapas yang telah diberi eter ke dalam toples besar. Eter berfungsi untuk

membius tikus.

2. Masukkan tikus kedalam toples besar lalu ditutup.

3. Diamkan beberapa saat hingga tikus lemas dan pingsan.

4. Keluarkan tikus dari toples, kemudian baringkan tikus di papan bedah.

28

5. Dengan keadaan tetap di bius menggunakan eter secara inhalasi, ambil organ

pankreasnya.

6. Bungkus organ pancreas dengan kertas alumunium foil.

7. Simpan organ pankreas pada suhu dingin.

4.5.9 Pemeriksaan SOD dan MDA pankreas tikus

a. Pemeriksaan SOD pankreas tikus

Preparasi jaringan pankreas 200 mg, tambahkan 2 cc PBS, dihomogenasi. 0,2 cc

homogenat, ditambahkan berturut-turut EDTA 200 L, NBT 100 L, xanthine oxidase

100 L, dan buffer fosfat 1cc. Inkubasi pada temperatur 380C selama 30 menit.

Kemudian sentrifus dan ambil supernatan. Tambahkan buffer fosfat hingga 3 cc.

Kemudian kadar SOD dibaca dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 580

nm.

b. Pemeriksaan MDA pankreas tikus

Preparasi jaringan pankreas 200 mg jaringan pankreas dipresipitasi dengan TCA

100%. Sedimen ditambahkan 0,25 HCL 0,1 N dan 0,1 larutan sodium barbituric acid

10% dan panaskan dalam air mendidih selama 25 menit. Sentrifus dan ambil

supernatan, bila masih keruh maka harus difilter. Siap diperiksa menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 531,6 nm. Penentuan kadar dilakukan

dengan menggunakan kurva baku.

4.6. Analisa Data

Proses pengambilan data pada penelitian ini dilakukan secara bertahap yakni

29

1. Melakukan pengelompokan sampel terlebih dahulu dengan memberikan label

menjadi 5 kelompok. Setiap kelompok ada 5 sampel. Kemudian melakukan

penimbangan dan mencatat berat sampel setiap kelompok.

2. Pada adaptasi selama 14 hari, dilakukan pengamatan kondisi sampel kemudian

menimbang dan mencatat berat sampel setiap kelompok.

3. Dilakukan pembedahan sampel setiap kelompok, kemudian mengambil jaringan

pankreas sampel setiap kelompok untuk dilakukan pemeriksaan kadar SOD dan

MDA.

4. Sebelum dilakukan pemeriksaan, jaringan pankreas sampel setiap kelompok terlebih

dahulu di potong sebagian kemudian ditimbang dan mencatat beratnya.

5. Selanjutnya melakukan pemeriksaan kadar SOD dan MDA sampel setiap kelompok

yang sudah diberikan label.

6. Setelah pemeriksaan selesai, maka akan didapatkan data kadar SOD dan MDA

sampel setiap kelompok.

Setelah data selesai diperoleh, dilakukan pengecekan kelengkapan data. Setelah data

lengkap, kemudian melakukan entry data ke dalam software SPSS versi 17.0.

Selanjutnya mengecek frekuensi distribusi, homogenitas, dan normalitas distribusi data

menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov 1 sample dan uji Saphiro wilk. Untuk menarik

kesimpulan dari hipotesis yang telah disebutkan, maka dilakukan pengujian hipotesis.

Karena kelompok sampel pada penelitian lebih dari 2 kelompok, maka dapat dilakukan

uji beda statistik Kruskal-Wallis H atau uji Analysis of Variance (ANOVA). Jika data

tidak terdistribusi dengan normal dan homogen, maka dilakukan uji statistik Kruskal-

Wallis H. Namun, jika data terdistribusi dengan normal dan homogen, maka dilakukan

30

uji statistik ANOVA yang dilanjutkan dengan post hoc tests menggunakan uji LSD

(Least Significant Difference) untuk mengetahui perbadingan antar perlakuan. Hasil

dikatakan bermakna bila p ≤ 0,05.

4.7. Desain Penelitian

4.7.1. Diagram Alur Penelitian

31

32

4.7.2. Jadwal Penelitian

No. Kegiatan Minggu

ke-1

Minggu

ke-2

Minggu

ke-3

Minggu

ke-4

Minggu

ke-5

1.Pembelian alat, bahan, dan

hewan coba

2. Adaptasi hewan coba

3. Pemeriksaan Glukosa Darah

4. Induksi aloksan

5. Pemberian ekstrak kayu

manis

6.

Pembunuhan hewan coba,

pengambilan sampel

pankreas, dan pemeriksaan

SOD dan MDA hepar

7. Tabulasi dan analisa data

8. Penulisan laporan dan

pembahasan

9. Penerbitan artikel

33