BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini terdiri atas dua bagian yaitu penelitian laboratorium dan

penelitian lapangan. Penelitian laboratorium dilaksanakan di Laboratoriurn

Mikologi Turnbuhan Jurusan Hama 8 Penyakit Tumbuhan lnstitut Pertanian

Bogor, Puslitbang Biologi LIP1 Cibinong. Laboratorium Biokimia Unit Penelitian

Bioteknologi Perkebunan Bogor, dan Laboratorium Proteksi Balai Penelitian

Marihat Pernatangsiantar. Sedangkan penelitian lapangan dilakukan di kebun

kelapa sawit Aek Pancur rnilik Pusat Penelitian Kelapa Sawit Medan, kebun

kelapa sawit Bukit Maradja P.T. Tolan Tiga Indonesia (SIPEF), kebun kelapa

sawit Marihat, Gunung Bayu. Pasir Mandoge, dan Dolok Sinurnbah rnilik PTP

Nusantara IV, kebun kelapa sawit Opir milik PTP Nusantara VI Padang, kebun

kelapa sawit Bekri milik PTP Nusantara VII Bandar Larnpung, dan kebun kelapa

sawit Bojong Datar rnilik PTP Nusantara VIII. Penelitian dilaksanakan dari bulan

Agustus 1999 sampai bulan Oktober 2001.

Bahan dan Alat

Bahan dan alat utarna yang digunakan dalam penelitian ini adalah: lsolat

G. boninense asal Sei Pancur Surnatera Utara, Medium Martin Agar, PDA

(Potato Dextrose Agar), NA (Nutrient Agar), medium untuk idenfikasi bakteri,

bahan kirnia untuk preparasi Scanning Electron Microscope (SEM), bahan kirnia

untuk uji dan elektroforesis enzim kitinase dan glukanase. bahan kimia untuk

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), serbuk gergaji, kayu dan akar

karet, dan bibit kelapa sawit. Sedangkan alat utarna yang digunakan adalah

cawan petri, rnikropipet. milipore. mikroskop, .nikroskop elektron tipe scanning

tipe JSM-5000 Lv, spektrofotorneter, apnratus elektroforesis, dan rnesin

Polymerase Chain Reaction (PCR). Bahan dan alat secara detail akan

disebutkan pada metode masing-masing tahap percobaan.

Percobaan 1. Status Terkini Penyakit Busuk Pangkal Batang d i

Indonesia dan Keragaman Populasi Agens Biokontrol

pada Berbagai Ekologi Kebun Kelapa Sawit

Metodologi

1. Suwei Kejadian Penyakit d i Lapangan

Penelitian ini dilakukan dengan metode survei mengenai kejadian

penyakit (disease incidence) serta pengambilan sampel tanah pada kebun

kelapa sawit di Sumatera Utara (kebun Marihat, Gunung Bayu. Pasir Mandoge,

Bukit Maradja. Dolok Sinurnbah, dan Aek Pancur), di Sumatera Barat (kebun

Ophir), di Lampung (kebun Bekri), dan di Banten (kebun Bojong Datar) serta

pengambilan sampel tanah rhizosfer pada masing-masing lokasi tersebut.

Pemilihan lokasi kebun tersebut dilakukan berdasarkan generasi tanaman, urnur

tanaman, status penyakit pertanaman kelapa sawit, dan geografi. Kejadian

penyakit pada masing-masing kebun diamati dengan rnenghitung jurnlah

tanarnan kelapa sawit rnati karena Ganodenna pada petak-petak pengarnatan

seluas 1 ha, kernudian dibagi dengan jumlah tanaman yang diamati. Pada setiap

btok diambil 5 petak pengamatan, dengan sistem diagonal, sebagai ulangan.

Kategori umur tanaman yang digunakan adalah tanarnan belum menghasilkan

(TBM). tanaman menghasilkan (TM) , dan tanaman tua yang akan dirernajakan

(T). Daerah yang diamati terdiri atas daerah penanaman baru dan perernajaan

generasi I, 11, Ill, dan IV. Untuk generasi I dibedakan lagi berdasarkan tanaman

28

sebelumnya yaitu teh, kopi, karet, kakao, dan hutan. Kategori serangan

Ganoderma dikelompokkan menjadi tanarnan sehat dan sakit. Dengan dernikian

ada 35 kelornpok sampel ekologi kebun kelapa sawit yang berbeda.

Metode sampling yang digunakan adalah sisternatik diagonal dengan

mengambil 5 petak pengamatan masing-masing seluas 1 ha pada blok kebun

sampel dengan luas 25 - 50 ha. Pada masing-masing petak pengamatan

diarnbil tanah rhizosfer dari 15 tanaman sakit (jika ada) dan 15 tanaman sehat .

Tanah diambil dengan bor tanah sebanyak 10 g dengan kedalarnan 40 cm.

Sampel tanah dikumpulkan pada kantong plastik dan disimpan di lernari es,

kemudian selanjutnya diisolasi cendawan dan bakteri yang ada.

2. lsolasi Ganoderma boninense

lsolat G. boninense yang digunakan pada penelitian ini berasal dari

isolasi tubuh buah Ganodenna asal Kebun Sei Pancur di Sumatera Utara.

Tubuh buah Ganodenna didisinfeksi dengan menggunakan alkohol 90% dengan

cara mengoleskan tissu yang telah dibasahi dengan alkohol 90%, kemudian

dipotong-potong rnenjadi sekitar 1 cm2 dan ditumbuhkan pada medium PDA.

Setelah miselium tumbuh, selanjutnya dimurnikan.

3. Koleksi cendawan dan bakteri kandidat agens biokontrol

lsolasi cendawan agens antagonis dilakukan dengan metode

pengenceran sampel tanah dan penanarnan pada medium Martin Agar +

chloramphenicol di dalam cawan petri (Johnson & Curl 1972). Satu gram tanah

sampel disuspensikan ke dalam 9 rnl air destilata steril dan dihomogenkan

selama 15 menit (pengenceran 10 -I), diambil I ml suspensi tanah 10 -' dan

dicampur dengan 9 ml air destilata steril ( pengenceran 10 -'). Selanjutnya dibuat

seri pengenceran sampai 10 -' dan dari seri pengenceran terakhir 0,25 ml

dituangkan secara merata ke medium Martin Agar + chloramphenicol dalam

cawan petri. Cendawan yang muncul diarnati dan dihitung kepadatan

populasinya setelah 1 minggu. Masing-masing jenis cendawan yang turnbuh,

kemudian dimurnikan dan diidentifikasi.

Kandidat antagonis dari golongan bakteri yang ada juga diisolasi dengan

rnetode pengenceran seperti pada isolasi cendawan tetapi menggunakan

medium Nutrient Agar (NA) dengan seri pengenceran 10 -7. Dari tiap sampel

tanah diambil 2 sampel bakteri yang menunjukkan morfologi yang berbeda,

kecuali ada beberapa bakteri yang menunjukkan lebih dari dua morfologi yang

berbeda.

4. Uji keefektifan penghambatan kandidat agens biokontrol

Metode yang digunakan adalah metode uji ganda. Setiap kandidat agens

biokontrol baik cendawan maupun bakteri ditumbuhkan pada media PDA secara

bersamaan dengan G. boninense. masing-masing dengan jarak 3 cm dari tepi

cawan petri berdiameter 9 cm. Ganodema ditumbuhkan 48 jam lebih dahulu

daripada kandidat agens biokontrol. Keefektifan pengharnbatan suatu kandidat

agens biokontrol dievaluasi dengan mengamati persentase penghambatan

terhadap Ganoderma pada 4 hari setelah penanarnan kandidat agen biokontrol

tersebut dan dihitung dengan rumus sebagai berikut:

keterangan:

KP = keefektifan penghambatan, a = panjang jari-jari koloni G. boninense ke arah tanpa agen biokontrol. b = panjang jari-jari koloni G. boninense ke arah agen biokontrol

30

5. ldentifikasi dan Analisis Data

Cendawan diidentifikasi di bawah mikroskop dengan melihat penciri hifa

dan percabangan pernbentukan konidium atau spora serta bentuk konidiumnya

sendiri. Dalam penelitian ini digunakan kunci determinasi Rifai , (1969);

Domsch et a/. (1 993). dan Watanabe (1 994).

ldentifikasi bakteri dilakukan melalui uji pertumbuhan pada medium

spesifik dan uji sifat bikomia. ldentifikasi ini hanya dilakukan sampai tingkat

genus. Uji pertumbuhan kotoni dilakukan pada medium YDC, King's B, dan

Tioglikolat. Sedangkan uji sifat biokimia meliputi uji gram, katalase, dan

oksidatif.

Uji gram, satu jarum ooze yang berumur 24 jam diletakkan di atas gelas

benda dan dicampur dengan KOH 3%. Selanjutnya dengan jarum ooze diaduk

sampai merata, dan jarurn diangkat. Apabila campuran bakteri tersebut

terangkat maka sifat bakteri ini gram negatif dan sebaliknya apabila tidak

terangkat maka sifat bakteri adalah gram positif.

Uji tumbuh pada YDC, bakteri ditumbuhkan pada medium YDC dan

diinkubasikan selama 7 hari. Selanjutnya diarnati warna koloni bakteri yaitu

putih atau kuning.

Uji tumbuh pada King's 8, bakteri yang akan diuji diturnbuhkan pada

medium King's B dan diamati setelah 24 jam. Selanjutnya media dilihat di bawah

lampu UV, apakah fluoresen atau tidak.

Uji Katalase, isolat bakteri yang berumur 24 jam diinfestasikan pada

media Nutrient Broth (NB) dan diinkubasikan selama 24 jam. Selanjutnya kultur

bakteri ditambah H202 3% sebanyak 1 ml dan diamati busa putih yang nampak.

3 1

Uji Oksidatif-Fermentatif, medium NA ditambah dengan larutan glukosa

dan selanjutnya diinokulasikan 1 ooze bakteri uji. Tabung reaksi ditutup dengan

kapas dan yang lain ditutup dengan parafin cair. Peubah yang diamati adalah

perubahan warna dari hijau menjadi kuning pada tabung yang ditutup kapas.

Uji anaerob pada media Tioglikolat, isolat bakteri agens biokontrol

ditumbuhkan pada medium tioglikolat, dan sebagai pembanding isolat juga

ditumbuhkan pada medium (NB). Peubah yang diamati adalah pertumbuhan

bakteri. Apabila bakteri tidak turnbuh pada medium ini rnaka bakteri ini bersifat

aerob.

lndeks keragaman dan kemerataan cendawan agens biokontrol pada

masing-masing ekologi kebun kelapa sawit selanjutnya dianalisis dengan formula

indeks keragaman (H). Untuk menentukan tingkat kemerataan spesies tiap

ekosistem digunakan indeks kemerataan (E) (Begon et a/. 1986 & Magurran

1987). Formula yang digunakan stfgvebagai berikut:

S

H = - C Pi I n Pi

i= 7

H = indeks keragaman spesies ; Pi = proporsi tiap spesies ; s = spesies

E = lndeks kemerataan spesies ; S = jurnlah spesies

Hasil dan Pembahasan

1. Kejadian penyakit (disease incidence) di lapangan

Sebagai pembanding kejadian penyakit busuk pangkal batang pada

berbagai generasi dipilih daerah perkebunan kelapa sawit di Sumatera Utara.

Berdasarkan fakta di Sumatera Utara dijumpai generasi kebun kelapa sawit dari

generasi 1 sampai dengan generasi 4. Kejadian penyakit busuk pangkal batang

pada masing-masing generasi dapat dilihat pada Garnbar 2.

1 2 3 4 G e n e r a s i k e l a p a sawi t

Gambar 2. Kejadian penyakit busuk pangkal batang pada berbagai generasi tanaman kelapa sawit di Sumatera Utara pada tahun 1999

Gambar 2, menunjukkan bahwa pada perkebunan yang telah banyak

mengalami tanam ulang, kejadian penyakit BPB akan semakin meningkat.

Kejadian penyakit BPB pada generasi 4 stadia TBM (1 1%) lebih besar daripada

generasi 3, 2, dan 1 (7, 4, dan 0%). Kecenderungan ini juga ditunjukkan pada

TM dan tanaman tua. Pada TM, kejadian penyakit pada generasi 1 masih

sebesar 3% kemudian bertarnbah besar pada generasi 2 dan 3 yang masing-

masing menjadi 6% dan 10%. Dernikian juga untuk tanaman tua, perkembangan

penyakit rnenjadi lebih besar. Pada generasi 3, kejadian penyakit sudah

mencapai 59% yang pada generasi 1 dan 2 rnasih sebesar 14% dan 12%. Pada

perkebunan kelapa sawit generasi ke-4 hanya dijurnpai stadia TBM dan belum

ada yang rnencapai TM ataupun tanaman tua. Kejadian penyakit BPB di atas

secara statistika menunjukkan beda nyata antar generasi perkebunan, stadia

tanaman, dan daerah (Tabel 1).

Tabel 1. Analisis statistika perbedaan kejadian penyakit BPB pada berbagai generasi, stadia tanarnan, dan lokasi pertanarnan kelapa sawit di Indonesia

Generasi Tanaman Kejadian Penyakit (96)

Surnut Sumbar Lampung Banten

I TBM 0 0 TM 3 1 1 T 14

Rata-rata 5.67 c II TBM 4

TM 6 T 12

Rata-rata 7.33 c Ill TBM 7

TM 16 T 59 63

Rata-rata 27.33 a IV TBM 11 20

TM - T -

Rata-rata 11

Keterangan: - = tidak ditemukan ; angka yang diikuti oleh huruf yang sarna menunjukkan tidak beda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT

Apabila kejadian penyakit BPB dibandingkan berdasarkan urnur tanarnan,

rnaka kejadian penyakit di tanaman tua akan lebih besaf daripada di TM maupun

TBM. Dernikian juga untuk TM akan rnempunyai kejadian penyakit yang lebih

besar daripada kejadian penyakit pada TBM. Hasil ini konsisten untuk semua

generasi perkebunan kelapa sawit. Sebagai contoh pada generasi 3, kejadian

penyakit pada tanarnan tua sebesar 59% yang lebih besar daripada kejadian

penyakit pada TM (16%) dan pada TBM (7%). Hal ini dapat terjadi karena

terjadi akurnulasi surnber inokulum Ganodenna sp., sernakin banyak generasi

dan sernakin tua urnur tanaman berarti sumber inokulurn akan semakin banyak

34

pula. Sumber inokulurn dapat berupa akar atau pangkal batang yang terinfeksi

maupun tubuh buah G. boninense.

Kejadian penyakit BPB juga dipengaruhi oleh lokasi kebun. Kejadian

penyakit BPB di Surnatera Utara dan Larnpung lebih besar daripada daerah

lainnya seperti di Sumatera Barat ataupun di Banten. Kejadian penyakit di

daerah Banten dan Surnatera Barat adalah sarna yang masing-masing masih

sebesar 1%. Kecilnya kejadian penyakit di kedua daerah ini karena perkebunan

kelapa sawit rnasih pada generasi 1. Hal ini sangat berbeda untuk daerah

Sumatera Utara dan Lampung yang mernpunyai kejadian penyakit sangat tinggi

Pada generasi 1, di Surnatera Utara kejadian penyakit BPB sebesar 3%,

sedangkan untuk generasi 3 di Sumatera Utara dan Larnpung kejadian penyakit

BPB masing-masing sebesar 59 dan 63%. Hal ini disebabkan kepadatan

populasi cendawan agens biokontrol misalnya T. harzianum di Larnpung lebih

sedikit daripada di Surnatera Utara. Kepadatan populasi T. hatzianum di

Surnatera Utara sebesar 4 x lo4 per g tanah, sedangkan di Lampung sebesar 1,3

x lo4 per g tanah. lndeks kelimpahan, keragarnan, dan kernerataan rnasing-

rnasing daerah ini berbeda. Di Surnatera Utara ketiga indeks tersebut sangat

rendah yaitu bertururut-turut 0.04 . 0.06 , dan 0.05, yang apabila dibandingkan

dengan daerah Surnatera Barat dan Banten relatif lebih rendah. Di Sumatera

Barat rnempunyai indeks kelirnpahan, keragaman, dan kemerataan agens

biokontrol masing-masing sebesar 0.23 , 0.34 , dan 0.23, sedangkan di Banten

masing-masing sebesar 0.23 , 0.39 , dan 0.23. Rendahnya indeks kelimpahan,

keragarnan, dan kernerataan agens biokontrol juga disebabkan oleh teknik

budidaya. Daerah yang sudah banyak mengalarni tanam ulang akan

rnemperoleh perlakuan herbisida yang lebih banyak pula. Herb~sida akan

35

mempengaruhi mikroflora di dalarn rhizosfer kelapa sawit. Penyebab lain adalah

perbedaan iklim makro masing-masing daerah tersebut. Lampung mempunyai

jumlah bulan kering 2-3 per tahun sedangkan di Surnatera Utara jumlah bulan

kering tidak ditemukan.

2. lsolasi Ganoderma boninense

isolat G. boninense telah berhasil diisolasi dari tubuh buah yang berasal

dari kebun Sei Pancur. lsolat G. boninense ini selanjutnya digunakan untuk uji

daya penghambatan cendawan kandidat agens biokontrol.

3. Koleksi cendawan dan bakteri kandidat agens biokontrol

Cendawan yang berhasil diisolasi dari rhizosfer kelapa sawit berbagai

lokasi sebanyak 140 isolat yang terdiri atas 18 isolat T. harzianum, 5 isolat T.

viride, 4 isolat Gliocladium viride. 28 isolat A. flavus, 4 isolat A. niger, 13 isolat A.

furnigatus, 14 isolat Penicillium citrinum, 4 isolat Rhizopus sp., 6 isolat P.

chrysogenum, 12 isolat P. commune, dan 32 isolat P. funiculosum. Mayoritas

isolat-isolat tersebut merupakan kandidat agens biokontrol. Oleh karena itu

dapat disimpulkan bahwa medium Martin Agar cukup selektif untuk rnenseleksi

kandidat cendawan biokontrol yang terdiri atas 5 genus dan 11 spesies.

Sebenarnya dalarn tanah sendiri terdapat ribuan cendawan baik yang bersifat

saprofitik maupun yang bersifat patogenik. Mayoritas agens biokontrol yang

pernah dilaporkan terdiri atas 4 genus yaitu Trichoderma, Gliocladium,

Aspergillus, dan Penicillium. Dari kegiatan koleksi cendawan kandidat agens

biokontrol ini dapat diketahui indeks keragaman dan kepadatan populasi

cendawan pada masing-masing sarnpel. Pada masing-masing lokasi kebun

tersebut rnempunyai indeks keragaman cendawan yang berbeda-beda. lndeks

keragaman cendawan ini dihitung setelah kultur berumur 1 rninggu. Kepadatan

populasi masing-masing spesies pada masing-masing ekologi kebun kelapa

sawit harnpir sama yaitu berkisar antara l o 4 sampai l o5 cfutg tanah. Populasi

terendah ditemui pada spesies P. chrysogenum sebesar 1.3 x lo4 cfutg tanah,

sedangkan populasi tertinggi dijurnpai pada spesies T. harzianum yang berasal

dari kebun TM yang sehat di Sumatera Barat (2,2 x l o 6 cfulg tanah), A. nigerdari

Larnpung kebun tanarnan tua sakit generasi 111 (2.5 x l o6 cfulg tanah). P. citrinum

dari Surnatera Utara kebun bekas kopi tanarnan sehat (2.2 x 10' cfulg tanah),

dan P. citrinum dari Surnatera Utara kebun bekas teh ( 3,8 x l o6 cfulg tanah).

Jenis cendawan yang rnendorninasi pun berbeda-beda untuk masing-

rnasing lokasi kebun. Di Banten lebih didorninasi oleh P. citrinum dan A. flavus (

6.7 x 105/g tanah dan 4,4 x 105/g tanah). Perkebunan kelapa sawit di Larnpung

dan Sumatera Barat didorninasi oleh T. harzianum dengan kepadatan populasi

masing-masing 5,4 x 1O41g tanah dan 2,2 x 106/g tanah, sedangkan di Surnatera

Utara cendawan yang mendorninasi tergantung pada daerahnya masing-masing.

Misalnya untuk daerah Surnut Sehat II TM didominasi oleh T. viride. Untuk lokasi

yang lain dapat dilihat pada Larnpiran 1.

Bakteri yang berhasil diisolasi dari 35 sarnpel adalah terdiri atas tiga jenis

yang masih berdasarkan warna koloni yaitu putih, putih susu, dan merah muda

dengan jurnlah total 72 isolat. Isolat-isotat ini tidak diidentifikasi sernua dan yang

akan diidentifikasi adalah yang rnarnpu sebagai agens biokontrol terhadap G.

boninense. Populasi bakteri dari masing-masing sampel ekologi kebun kelapa

sawit harnpir sama yaitu rata-rata 2,8 x 10' dulg tanah. Populasi bakteri

tertingggi dijumpai pada sampel dari Sumatera Barat kebun tanaman

menghasilkan sehat dengan populasi 4,6 x 10'' cfulg tanah. Sedangkan

populasi terendah berasal dari kebun TM yang sakit di Sumatera Utara generasi

IV dengan populasi sebesar 14 x l o 7 cfulg tanah.

4. Uji keefektifan penghambatan kandidat agens biokontrol

Tidak semua koleksi agens biokontrol baik cendawan maupun bakteri dapat

digunakan sebagai agens biokontrol terhadap G. boninense. Berdasarkan uji

metode ganda diperoleh agens biokontrol sebanyak 30 buah yang terdiri atas 26

cendawan dan 4 bakteri. Kriteria pemilihan agens biokontrol berdasarkan besar

daya penghambatan maupun mernatikan terhadap koloni G. boninense. Kriteria

pemilihan untuk cendawan dan bakteri tidak sama. Hal ini disebabkan oleh sifat

pertumbuhan bakteri yang tidak meluas pada media padat. Cendawan yang

dianggap agens biokontrol adalah yang mempunyai daya pengharnbatan > 80%.

sedangkan untuk bakteri sebesar 40% atau lebih. Agens biokontrol yang

diperoleh selanjutnya dapat dilihat pada Tabel 2 . lsolat yang menjadi agens

biokontrol adalah T. harzianum isolat 1, 9. 1 1 . 21, 26, 29, 34, 39, 45. 58, 88, 91,

95. 107, 112, 11 9,131; Gliocladium viride isolat : 44, 98, 105, 136; dan T. viride

nor 70, 82,102, 123, 138. lsolat yang mempunyai keefektifan penghambatan

yang paling tinggi (97,8%) adalah isolat T. hamianum yang berasal dari kebun

Sumut Sakit Ill TM. lsolat ini secara statistik tidak berbeda nyata dengan isolat T.

harzianum-10 (96%) asal Sumut Sakit TBM IV, T. harzianum-88 (94.6%) asal

Sumut Sehat II TBM, T. hamianum-91 (96.7%) asal Sumut Sakit II TBM, T.

harzianum-107 (96.1%) asal Sumut Sakit II T, dan T. harzianum-1 19 (94.5%)

asal Sumut sehat Ill TBM, sedangkan isolat agen biokontrol yang paling rendah

(83,896) yaitu T. harzianum yang berasal dari kebun Sumatera Barat Sakit TM.

Agens biokontrol yang diperoleh didorninasi oleh spesies T. harzianum. Hal ini

disebabkan T. harzianum mempunyai habitat pada daerah yang mempunyai

kelembapan tinggi dan hangat seperti Indonesia.

Tabel 2. Populasi dan taraf penghambatan agens biokontrol terhadap G. boninense dari berbagai lokasi kebun

NO. lsolat

T. hamianurn-1 T. hamianurn-9 T hamianurn-I 7 T. hamianurn-27 T. hamianurn-26 T. harzianurn-29 T. hamianurn-34 T. hamianurn-39 T. harzianurn-45 T. harzianurn-58 T. harzianurn-88 T. hamianurn-91 T. hamianurn-95 T. harzianurn-107 T. hamianurn-I 72 T hamianurn-1 19 T. harzianurn-I37 G. viride-44 G. viride-98 G. viride- 105 G. viride-136 T. viride-70 T. viride- 82 T. viride-102 T. viride-123 T. vir~de-738 Bacillus sp.-10 Pseudornonas fluorescen- I P. fluorescen-58 P . fluorescen-63

Populasi tiap gram tanah

1.3 x lo4 5,4 lo4 1.7 x lo5 5.3 x lo4 1.3 x lo4 2.2 x 10" 3.5 x lo5 2.3 x lo5 4.0 x lo4 1,3 x lo4 < , 3 lo4 1.3 x lo4 1,5 x lo5 4.1 x lo5 2.7 x lo4 4.0 x lo4 4.0 lo4 6,7 x lo4 1.3 lo4 1.3 lo4 4.0 x lo4 8,4 x lo5 1.3 x lo4 2.4 x lo5 4.0 x lo4 6.7 lo4 5.6 x 10' 1.8 x 10'

Pengham- batan (%)

85.6 jk 92.0 defg

83.8 k 91 , I efg 87.0 hijk

84,O k 87,7 hij

93.0 bcdef 96,O abc

92.6 cdef 94.6 abcd

96.7 a 93,O bcdef

96,l ab 92.7 bcdef 94.5 abcde

97.8 a 92,O defg

87,6 hij 85,9 ijk 84,O k 84.0 k

90,O fgh 89.1 ghi 90,O fgh

92.1 defg 54.2 1

49,6 m

Lokasi Kebun

Banten Sehat TBM Banten Sehat TM Banten Sakit TM

Lampung Sehat T Ill Lampung Sakit T Ill Sumbar Sehat TM l Sumbar Sakit TM I

Sumut Sehat TBM IV Sumut Sakit TBM IV

Sumut Hutan Sehat T Sumut Sehat II TBM Sumut Sakit II TBM Sumut Sehat II TM

Sumut Sakit II T Sumut Sehat Ill TBM

Sumut Ill TBM Sumut Sakit Ill TM

Sumut Sakit TBM IV Sumut Sakit II TM Surnut Sehat II T Sumut Sehat Ill T

Surnut Teh Sehat TBM Surnut Karet Sehat T

Sumut Sehat II T Surnut Sehat Ill TM

Sumut Sakit 111 T Larnpung Sakit TBM IV

Banten Sehat TBM I

Sumut Sakit II T Sumut Sakit Ill TBM

Keterangan: angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT

Sumut, Sumbar. Lampung, dan Banten mempunyai curah hujan yang relatif

tinggi dan kelembapan nisbi yang tinggi dengan jumlah bulan kering yang sangat

39

kecil. Lampung dan Banten mempunyai jumlah bulan kering 2 -3 bulan,

sedangkan Sumut dan Sumbar tidak mempunyai bulan kering setiap tahunnya.

Populasi cendawan agens biokontrol yang paling tinggi ( 2. 2 x 10" per g

tanah) adalah isolat T. harzianum-29 yang berasal dari Sumatera Barat Sehat I

TM. Rata-rata populasi agens biokontrol ini dibandingkan dengan populasi

cendawan lain tergolong rendah, sebagian besar mempunyai populasi 1,3 x lo4

per g tanah.

Sedangkan dari bakteri hanya diperoleh 4 kandidat agens biokontrol

yang mampu dengan baik menekan G. boninense. Sebagian besar mempunyai

daya penghambatan yang sangat kecil. bahkan ada yang tidak mempunyai daya

peng-hambatan sama sekali. Daya penghambatan tertinggi ditemui pada isolat

Bacillus sp. yang berasal dari sampel Lampung dengan nilai daya penghambatan

sebesar 54.2%. Daya penghambatan bakteri agens biokontrol yang lain berkisar

antara 40-50%. lndeks keragaman, kepadatan populasi, dan nilai keefektifan

penghambatan cendawan dan bakteri secara lengkap disajikan dalam Lampiran

1 dan 2.

5. Hubungan antara indeks kelimpahan, keragaman, dan kemerataan agens

biokontrol dengan penyakit BPS

Peubah yang penting kaitannya dengan kejadian penyakit BPB adalah

kelimpahan, keragaman, dan kemerataan agens biokontrol pada suatu ekologi

kebun kelapa sawit. Berdasarkan informasi variable tersebut dapat dilihat peran

agens biokontrol dalam menekan G. boninense. lndeks kelimpahan, keragaman,

dan kemerataan agens biokontrol pada rhizosfer kelapa sawit sehat mempunyai

kecenderungan yang lebih tinggi daripada rhizosfer kelapa sawit sakit yang

terjadi pada generasi 1 , 2 dan 3, baik stadia tanaman TBM, TM, ataupun T.

Tabel 3. lndeks kelirnpahan, keragaman, dan kernerataan agens biokontrol pada berbagai generasi, stadia tanaman, dan daerah kelapa sawit

Genera Stadia lndeks kelimpahan, keragarnan, dan kemerataan agens biokontrol si Tana Sumut Sumbar Lampung Banten

man Sehat Sakit Sehat Sakit Sehat Sakit Sehat Sakit I TBM 0.08 0.00 0.20 - - -

0.12 0.00 0.32 0.08 0.00 0.20

TM 0.00 0.00 0.25 0.20 0.20 0.25 0.00 0.00 0.35 0.32 0.32 0.35 0.00 0.00 0.25 0.20 0.20 0.25

T 0.18 0.00 0.23 0.00 0.18 0.00

I I TBM 0.33 0.25 0.37 0.35 0.34 0.25

TM 0.33 0.25 0.37 0.35 0.34 0.25

T 0.40 0.25 0.37 0.35 - ~ -

0.23 0.25 111 TBM 0.14 0.20

0.28 0.32

0.35 0.37 0.51 034

IV TBM 0.17 0.33

Pada generasi 3 tanarnan tua dan generasi ke-4 di Sumatera Utara indeks

kelirnpahan, keragaman, dan kernerataan agens biokontrol relatif tidak berbeda.

Hal ini juga terjadi pada ketiga daerah lainnya yaitu Surnbar, Lampung, dan

Banten. Hal ini berarti pada taraf tersebut agens biokontrol belum mempengaruhi

kejadian penyakit BPB. Nilai kelirnpahan sebesar 0.25, keragaman sebesar 0,3

dan kemerataan sebesar 0,2 masih terlalu kecil untuk menekan penyakit BPB.

Hasil ini lain untuk bakteri di dalam rhizosfer kelapa sawit. Populasi bakteri

pada tanaman sehat lebih sedikit dibandingkan pada tanaman sakit. Pada

tanaman yang sakit bakteri akan lebih cepat multiplikasi dan mengkolonisasi

daerah tersebut. Tetapi jumlah bakteri yang besar ini tidak mempengaruhi

kejadian BPB, karena telah diketahui sebagian besar bakteri ini bukan

merupakan agens biokontrol atau patogen dan bahkan sering kalah bersaing

dengan G. boninense.

Generasi perkebunan kelapa sawit rnernpengaruhi indeks kelimpahan,

keragaman, dan kemerataan agens biokontrol di dalam rhizosfer. Secara umum

pada generasi 1 ketiga peubah di atas mempunyai nilai yang paling rendah yang

kemudian naik dan akhirnya turun pada generasi 4. Pada generasi pertama

masih terjadi peralihan perubahan dari ekosistem hutan yang stabil ke ekosistem

monokultur yang tidak stabil. Akibatnya populasi agens biokontrol untuk

sementara akan relatif rendah. Pada generasi keempat, indeks kelimpahan.

keragaman, dan kemerataan agens biokontrol sudah sangat rendah. Hal ini

disebabkan oleh sudah semakin banyaknya perlakuan herbisida pada lahan

yang akan rnengakibatkan turunnya indeks keragaman rnikroorganisrne di dalarn

tanah. Hasil ini berkorelasi positif dengan kejadian penyakit BPB yaitu pada

generasi keempat kejadian penyakit BPB lebih tinggi daripada penyakit BPB di

generasi sebelumnya.

Sejarah penanaman kelapa sawit juga akan rnempengaruhi kelimpahan.

keragaman, dan kemerataan agens biokontrol. Kebun kelapa sawit yang berasal

dari hutan dan kebun teh akan rnempunyai indeks kelirnpahan, keragarnan, dan

kernerataan agens biokontrol yang lebih tinggi dibandingkan yang berasal dari

kebun kakao, kopi, dan karet. Rhizosfer kelapa sawit bekas hutan dan kebun

teh rnernpunyai indeks kelirnpahan, keragarnan. dan kernerataan agens

biokontrol yang lebih tinggi dan berbeda nyata dibandingkan bekas kebun

kakao, karet, dan kopi. Pada bekas tanarnan hutan dan teh rnempunyai bahan

organik yang lebih tinggi dari hasil pengguguran daun serta perbedaan eksudat

akar yang dihasilkan. Perbedaan secara statistik dapat dilihat pada Tabel 4

Tabel 4. Perbandingan indeks kelirnpahan, keragarnan, dan kerneratan agens biokontrol pada rhizosfer bekas hutan, kakao, teh. karet dan kopi di Surnatera Utara

Jenis Ekologi lndeks f ndeks lndeks Jurnlah Kebun Kelimpahan Keragaman Kernerataan bakteri

Kelapa Sawit cendawan cendawan cendawan (XIO') aaens aaens aaens

bioiontrol bioiontrol biocontrol Bekas Hutan 0.11 b 0.12 b 0.11 b 1540 a Bekas Kakao 0.00 c 0.00 c 0.00 c 92 c Bekas Teh 0.25 a 0.35 a 0.25 a 329 b

Bekas Karet 0.07b 0.11 b 0.07 b 126 c Bekas Kopi 0.00 c 0.00 c 0.00 c 38 d

Keterangan: angka yang diikuti oleh huruf yang sarna pada kolom yang sarna rnenunjukkan tidak beda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT

Pada kebun kelapa sawit bekas hutan juga rnempunyai jurnlah bakteri

yang sangat tinggi bila dibandingkan dengan kebun kelapa sawit bekas kebun

teh, kakao, kopi, dan karet. Pada ekologi kebun kelapa sawit bekas hutan

rnernpunyai eksudat akar yang lebih berrnacarn-macam, karena masih banyak

jenis sumber inokulum bagi mikroorganisrne dan ada sarnpai penanarnan kelapa

sawit tersebut. Berbeda dengan bekas kebun teh, kakao, kopi, dan karet yang

banyak ditanarn secara rnonokultur.

43

Distribusi daerah penanaman kelapa sawit rnemberikan pengaruh pada

populasi agens biokontrol. lndeks kelirnpahan, keragarnan,dan kernerataan

cendawan agens biokontrol di Banten dan Surnatera Barat lebih tinggi daripada

di Surnatera Utara (Tabel 3). Ketinggian kebun tidak terlalu berpengaruh sebab

penyakit ini banyak ditemui di daerah pantai rnaupun daerah pedalaman.

Laporan awal rnenyebutkan bahwa penyakit BPB banyak terjadi di daerah pantai

(Khairudin 1990), tetapi laporan terakhir menyebutkan bahwa BPB banyak terjadi

di daerah pantai rnaupun daerah yang jauh dari pantai. Demikian juga untuk

jenis tanah, laporan awal menyatakan bahwa penyakit BPB jarang diternukan di

tanah gambut dan serangan berat banyak terjadi pada tanah laterit. Namun

sekarang, serangan Ganoderma dapat terjadi pada semua jenis tanah antara

lain: podsolik, hidromotfik, alluvial, dan tanah gambut.

Faktor yang mempengaruhi populasi Trichodenna dan Gliocladium adalah

porositas tanah, pH tanah, dan sifat kimia tanah lainnya. lndeks kelimpahan

Trichoderma pada berbagai jenis tanah tergantung pada kemarnpuan

mendegradasi bahan organik, keaktifan bermetabolisme, dan resistensi terhadap

rnikrobia lain. Perbedaan indeks kelirnpahan, keragarnan, dan kerneratan agens

biokontrol sangat dipengaruhi iklim daerah setempat. lklirn di daerah Sumatera

Utara. Sumatera Barat. Larnpung, dan Banten masing-masing berbeda.

Trichoderma spp. dan Gliocladium spp. adalah spesies yang tersebar luas

di seluruh dunia (Domsch et a/. 1993), hampir pada semua jenis tanah dan selain

habitat alaminya. Kedua cendawan ini banyak ditemukan di daerah yang banyak

bahan organiknya. Trichoderma kelihatannya sebagai rnikroorganisme

sekunder, karena banyak ditemukan pada bahan organik yang telah melapuk.

Tabel 5. Perbedaan ekologi pertanarnan kelapa sawit di Surnut. Sumbar, Larnpung, dan Banten

Anasir Sumut Surnbar Larnpung Banten

Curah Hujan 1600 - 2700 2400 1800 2100 rnrnl tahun rnrnltahun mmltahun rnrn/tahun

Jumlah Bulan tidak ada tidak ada 2-3 bulan 2-3 bulan Kering Ketinggian 160-369 rn 160 dpl 50 dpl 60 dpl

dPl Jenis Tanah Podsolik Andosol Alluvial dan Latosol

Coklat podsolik Kuning, Podsolik Coklat,

Podsolik Merah Kuning

pH tanah 5.5 - 6,O 4-6 5.5 6.1 Kandungan 1% (20%) (2%) (4 %) Bahan Organik

Salah satu sifat yang rnernpengaruhi perturnbuhan Trichoderma dan

Gliocladium adalah fungistasis. Konidia Trichoderma relatif sensitif terhadap

fungistasis, dan banyak terjadi pada tanah netral sarnpai alkalin dibanding tanah

asam. Penarnbahan bahan organik secara terpisah atau secara penuh akan

rnengubah fungistasis itu. Keadaan fungistasis juga dipengaruhi jenis dan

ukuran propagul Trichoderma. Konidia lebih sensitif terhadap fungistasis

daripada klarnidospora yang besar dan hifa. Tetapi fungistasis itu sendiri

merupakan rnekanisrne alarniah sebagian besar cendawan untuk bertahan

hidup. Dalarn kondisi fungistatik Trichoderma rnarnpu bertahan selama 20 tahun.

Oleh karena itu, surnber energi dan penarnbahan bahan organik lain dipertukan

untuk rnengurangi fungistasis.

lndeks kelirnpahan, keragarnan, dan kernerataan agens biokontrol sangat

dipengaruhi oleh sifat tisik dan kirniawi tanah. Oleh karena itu sebelum

45

rnelakukan introduksi agens biokontrol perlu dikaji terlebih dahulu faktor ekologi

di daerah tersebut yang rnernpengaruhi pertumbuhan agens biokontrol dan

mekanisrne antagonisme. Hasil identifikasi rnenyimpulkan bahwa cendawan

agens biokontrol terdiri atas Trichoderma hamianurn, Trichoderma viride, dan

Gliocladium viride. Trichoderma harzianum mernpunyai ciri utarna koloni hijau

gelap dengan konidiofor dan percabangan fialid relatif teratur tanpa

perpanjangan hifa steril dengan konidia halus berbentuk globose dengan ukuran

2.8 - 3.2 x 2.5 - 2. 8 pm. Trichoderma viride rnernpunyai konidia kasar dengan

ukuran 3.6 - 4.8 x 3.5 - 4.5 pm. Sedangkan Gliocladium viride rnernpunyai ciri

utama koloni turnbuh dengan cepat seperti Trichoderma dengan massa konidia

turnbuh secara halus dengan warna hijau gelap, serta fialid turnbuh secara

konvergen (Gambar 3). Sedangkan hasil uji identifikasi bakteri disarnpaikan

pada Tabel 6. Berdasarkan hasil penciri pada Tabel 6 tersebut, maka dapat

disirnpulkan bahwa bakteri kandidat agens biokontrol adalah Bacillus sp. dan

Pseudornonas fluorescens.

Gam bar 3. Morfologi Trichoderrna harzianurn, Trichoderma viride, dan Gliocladium viride

Tabel 6. Hasil identifikasi isolat bakteri kandidat agens biokontrol terhadap G. boninense

No. Tipe Uji Nomor lsolat Bakteri 1 10 58 63 -

1. Gram -4 - 2. YDC 3. King's B + 4. Katalase *

5. Oksidatif- *

Fermentatif 6. Anaerob *

Hasil Pseudornonas Bacillus Pseudornonas Pseudomonas floorescen sp. fluorescen fluorescen

Asal Banten Sehat Lampung Surnut Sakit II Sumut Sakit TBM ~ a k i t - T Ill TBM

TBM 1V

Keterangan: + = positif; - = negatif ; ' = tidak diuji

Kesimpulan

Dari penelitian ini dapat disirnpulkan sebagai berikut:

1. Penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit saat ini rnenjadi penyakit yang

sangat penting dan yang paling rnerugikan di perkebunan kelapa sawit

dengan kejadian penyakit rneningkat sejalan dengan generasi perkebunan

kelapa sawit dengan kejadian penyakit pada tanaman kelapa sawit belurn

menghasilkan (TBM) generasi keempat sebesar 11 %.

2. lndeks kelirnpahan, keragaman, dan kemerataan agens biokontrol

dipengaruhi oleh stadia , generasi, sejarah perkebunan dan lokasi kelapa

sawit yang secara alarniah saat ini rnasih sangat rendah sehingga tidak

mampu menghambat perkernbangan penyakit BPB.

3. Cendawan agens biokontrol yang diperoleh adalah sebanyak 26 isolat yaitu

17 isolat T. harzianurn , 4 isolat Gliocladiurn viride, dan 5 isolat T. viride serta

4 isolat bakteri agens biokontrol yang terdiri atas 1 isolat Bacillus sp. dan 3

isolat Pseudomonas fluorescen.

Percobaan 2 : Analisa keragarnan genetik agens biokontrol terhadap Ganoderma boninense dengan RAPD

Metodologi

Persiapan Kultur Agens Biokontrol

Sernua isolat agens biokontrol ditumbuhkan pada medium PDA selarna 4

hari dan selanjutnya koloni dengan diameter 0,5 cm dipindahkan pada medium

PD secara aseptis. lnkubasi dilakukan pada suhu ruangan dan selalu dalarn

posisi digoyang. Panen miseliurn dilakukan setelah kultur berumur 4 hari.

Ekstraksi DNA

Sebanyak 0,5 gram miseliurn digerus dengan N, cair (dengan

penambahan PVPP) sampai rnenjadi tepung, kernudian dimasukkan ke dalarn

tabung berisi 1 ml bufer ekstrak (2% CTAB, 100 mM Tris-HCI pH 8.0, 1,4 M NaCl

20 rnM EDTA, 1 % 2-merkaptoetanol) yang telah dipanaskan sarnpai suhu 65°C.

Campuran ini dinkubasi selama 30 rnenit pada suhu tersebut di atas, sarnbil

sekali-sekali dikocok. Selanjutnya ditarnbahkan 1 rnl campuran kloroforrn :

isoamilalkohol (24 : 1) dan disentrifus selama 5 menit pada kecepatan 11.000

rpm. Supernatan dipindahkan ke dalarn tabung, disentrifus kembali selarna 5

menit pada 1.1.000 rprn, cairan dibuang dan pelet dikeringkan. Kernudian

dilakukan pencucian dengan alkohol 70%. DNA yang diperoleh dilarutkan

dengan 0.5 ml TE (10 mM Tris-HCI pH 8,O. 1 mM EDTA). RNA dihilangkan

dengan menarnbahkan RNAse (10 pglml) ke dalarn tiap 0,5 ml DNA, diinkubasi

pada suhu 37°C selama I jam. Setelah itu ditambahkan etanol absolut 1 ml,

diaduk perlahan, diinkubasi pada suhu 4°C minimal 0.5 jam, dan disentrifus

selarna 5 rnenit pada 11000 rpm. Supernatannya dibuang, pelet dicuci dengan

etanol 70% dingin sebanyak 500 pl. Setelah itu pelet dikeringkan, dilarutkan

49

dengan 300 p1 TE, disimpan pada suhu -20°C. Kualitas DNA agens biokontrol

diuji dengan rnelakukan pernotongan dengan enzim restriksi EcoRI.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Pada awal penelitian ini dilakukan penapisan primer. Penapisan primer

dilakukan pada 3 isolat Trichoderma harzianurn. Trichoderrna viride, dan

Gliocladium viride dengan 20 primer uji. Selanjutnya, primer yang marnpu

menghasilkan pita DNA polimorfis paling banyak akan digunakan dalam proses

amplifikasi DNA ke-26 agens biokontrol.

Carnpuran reaksi dalam PCR (Ix) adalah 2,5 pI bufer 10 x, 2,5 pI 2 mM

dNTPs, 2.5 pl 1,25 mM MgCI,, 1 p1 10 pmol primer. 0.2 p1 5 u n i W Taq

polymerase (Promega) dan akuades 14,3 pl. Selanjutnya campuran master itu

dipipet, dimasukkan ke tabung eppendorf yang steril serta ditarnbahkan 2 p1 (50

ng) DNA sampel kemudian dihornogenkan. Langkah selanjutnya adalah

amplifikasi dalam mesin PCR (Perkin Elmer) dengan program : Denaturasi ( t =

94'C, 2 menit) 45 siklus pada (t =94'C, 1 menit ; t =36OC, 1 menit ; t = 72'C, 2

menit), dan ekstensi akhir (t = 72OC, 4 menit).

Kernudian masing-masing sampel dielektroforesis pada gel agarose

1.4%. Sebanyak 25 pl hasil amplifikasi ditambah 5 yl loading buffer

dielektroforesis pada gel dengan masing-masing sumuran sebanyak 20 p1.

Elektroforesis dilakukan pada voltase 50 volt selama 1 jam 15 menit .

Selanjutnya gel direndarn dalarn 0,5 yglml ethidium bromide selama 30 rnenit,

latu direndam dalarn akuades selama 10 menit. Kemudian hasil elektroforesis

divisuafisasi di bawah sinar UV dan difoto dengan film instan Polaroid 667.

Analisis Data

Penentuan skor marka DNA hasil RAPD dilakukan menurut kriteria

pernbentukan rnarka dari ke-26 agens biokontrol. Bila marka terbentuk diberi

skor 1 sedangkan rnarka yang tidak terbentuk diberi skor 0. Profil pita DNA

diterjernahkan ke dalam data biner dengan ketentuan nilai no1 (0) untuk tidak ada

pita dan satu (1) untuk adanya pita DNA pada satu posisi yang sarna dari isolat-

isolat yang dibandingkan. Pengelornpokan data rnatrik dan pernbuatan

dendogram dilakukan rnenggunakan rnetode UPGMA (Unweighted Pair-Group

Method Arithmetic) rnelalui program NTSYS (Numerical Taxonomy and

Multivariate System) versi 2.12.

Hasil dan Pembahasan

Ekstraksi DNA dilakukan untuk rnernperoleh DNA dengan kualitas dan

kuantitas yang rnernenuhi syarat untuk pelaksanaan RAPD. Uji kuantitas dan

kualitas tersebut dilakukan ckngan proses elektroforesis. Terbentuknya pita DNA

yang tebal rnenunjukkan kuantitas dan kualitas DNA yang cukup bagus (Garnbar

4a). Uji kualitas hasil ekstraksi DNA yang kedua adalah dengan pernotongan

DNA dengan EcoRI. Bila DNA terpotong-potong sehingga terbentuk

penarnpakan smear DNA (Garnbar 4b), rnenunjukkan bahwa DNA hasil

ekstraksi mernpunyai kualitas yang bagus, bebas dari kontaminan yang

rnenghalangi reaksi enzirn restriksi. Metode pernurnian yang tepat sangat

dibutuhkan terutarna untuk mendapatkan kualitas DNA yang tinggi dengan cara

yang rnudah dan cepat, serta penggunaan biaya yang relatif tidak mahal .

Keberhasilan dalam ekstraksi DNA diukur dari jurnlah DNA yang dihasilkan,

kondisinya (berat rnolekul dan warna), serta kernarnpuannya berligase.

Keterangan: 1 - 26 = nomor isolat agens biokontrol a = DNA total b = DNA dipotong dengan EcoRl

Gambar 4. Uji kuantitas dan kualitas hasil ekstraksi DNA dari 26 cendawan biokontrol

Tidak semua primer yang dicoba pada penapisan primer menghasilkan

pita DNA polirnorfik yang banyak, bahkan ada yang tidak rnenghasilkan pita

sama sekali yaitu OPD 06, OPD 09, dan OPD 16. Primer yang dipilih untuk uji

kekerabatan agens biokontrol adalah yang rnempunyai pita DNA polimorfik yang

banyak yaitu OPN 16 (AAG CGA CCTG), OPE 14 (TGC GGC TGAG), dan OPD

03 (GTC GCC GTCA). Ketiga primer itu masing-masing rnenghasilkan pita DNA

polimorfik sebanyak 14. 13, dan 11 (Tabel 7 ) .

Tabel 7 . Jurnlah pita polirnorfik hasil arnplifikasi DNA (T. harzianum, T. viride. dan G. viride) pada penapisan 20 primer

No. Primer Jumlah Pita No. Primer Jumlah Pita Poltmorfik Polimorfik

1 OPA 02 5 11 OPD 09 0 2 OPA 04 7 12 OPD 16 0 3 OPA 11 8 13 OPE 34 I 1 J - -

4 OPA 16 7 14 OPH 04 10 5 OPB 14 2 15 OPK 04 5 6 OPC 07 3 16 OPN 06 6 7 OPC 13 3 17 OPN 08 6 8 OPD 03 13 J 18 OPN 15 4 9 OPD 06 0 19 OPN 16 14 J

10 OPD 08 9 20 OPW 15 5

Ketiga primer terpilih yaitu OPN 16. OPE 14, dan OPD 03 digunakan

untuk rnengamplifikasi ke-26 agens biokontrol.

Gambar 5 . Hasit amplifikasi DNA 26 agens biokontrol dengan primer OPD 03, OPE 14, dan OPN 16

Pita DNA polimorfik yang ada pada gambar 5 selanjutnya dinilai skornya dan

dimasukkan dalam program NTSYS. Hasilnya berupa dendogram marka RAPD

hubungan kekerabatan agens biokontrol (Gambar 6).

Tingkat Kesamaan

Keterangan: Th: T. harzianurn; Gv: G. viride; Tv: T. viride; B: Banten; SU: Sumatera Utara; SB: Sumatera Barat; LP: Lampung; 1,2,3 : asal generasi kelapa sawit

Garnbar 6. Dendogram hubungan kekerabatan 26 cendawan agens biokontrol

54

Pada Garnbar 6 terlihat bahwa ketiga spesies cendawan agens biokontrol

masing-masing mengelompok rnenjadi tiga kelornpok besar. Hal ini berarti

pengelompokkan berdasarkan rnorfologi konidia dan percabangan fialospora

sejalan dengan pengelompokkan rnarka RAPD. Tetapi yang rnenarik adalah T.

hamianurn lebih dekat ke G. viride daripada ke T. viride. Hasil ini mungkin akan

berbeda jika rnenggunakan marka RAPD lain yang belurn dirnasukkan ke dalarn

NTSYS. Marka yang berhasil terarnplifikasi adalah masih belurn merupakan

rnarka spesifik untuk masing-masing spesies, karena RAPD menggunakan

primer yang bersifat random sehingga akan mengarnplifikasi sekuen apa saja

yang kornplernen. Masing-masing isolat pada T.halzianorn, T. viride, dan G.

vjride tidak ada yang identik sama atau mernpunyai keragaman genetik yang

tinggi. T. harzianum isolat dari Banten /Jawa Barat tidak rnengelornpok pada

kelompok yang sarna. lsolat T. harzianum nornor 1 justru dekat dengan T.

harzianurn isolat dari Sumatera Barat (nornor 7) dan isolat nornor 2 lebih dekat

ke T. harzianum dari Sumatera Utara (nomor 11). Dernikian juga isolat dari

Sumatera Utara mernpunyai keragaman genetik yang tinggi, masing-masing

isolat berjarak genetik tidak berdekatan. Sedangkan T. viride dan G. viride

rnernpunyai keragaman genetik yang cukup besar pula.

Trichoderma spp., rnempunyai ukuran genorn bervariasi dari 31 - 39 Mb

dan jumlah krornosom dari 3 - 7 (Golrnan et a/. 1998). Besarnya variasi genetik

dapat dijelaskan melalui variasi jumlah krornosom dan besarnya ukuran. Hal ini

banyak terjadi pada cendawan imperfekti yang tidak rnengalarni meiosis

sehingga kromosom dalam keadaan berpasangan rnenjadi tidak penting

(Harrnan et al. 1993). Keragaman genetik juga akibat campur tangan rnanusia

dengan transfer gen secara artifisial (Mach & Zeilinger 1998). Variasi genetik

dalarn Trichoderma terjadi karena mutasi, plastisitas krornosom, penyusunan

kernbali krornosorn, dan perubahan kromosom akibat plasrnid dan transposon

(Harrnan et a/. 1998). Rekombinasi aseksual secara alamiah terjadi pada

Trichoderma melalui anastomosis yang diikuti heterokaryosis. Dalam

heterokaryosis masing-masing sel dapat mernpunyai ekstrakromosornal yang

berbeda misalnya genorn rnitokondria, genom plasrnid, dan invetron. Akibatnya

komposisi sel baru yang terbentuk sangat berbeda dengan induknya atau disebut

rnuncul strain baru.

Sernua sel Trichoderma dan Gliocladium bersifat polinukleus. dengan

beberapa sel mengandung jumlah copy inti sef yang sangat banyak. Meskipun

ada beberapa konidia bersifat uninukleus (Toyama et a/. 1984). Sifat

polinukleus ini, jelas akan mengakibatkan derajat kernunculan sifat baru yang

sangat besar apabila terjadi heterokaryosis. Mutasi yang sering mengakibatkan

perubahan sifat genetik adalah akibat sinar UV. Teknik ini sering digunakan

untuk rnendapatkan strain yang mempunyai sporulasi yang tinggi. Mekanisme

lain yang terjadi pada Trichoderma yang rnengakibatkan variasi genetik adalah

paraseksualisme ( Burnett 1970 & Migheli et a/. 1995). Dalam proses

paraseksual terjadi fusi (karyogami) antara dua sel yang tidak sarna melalui

anastomosis. Akibatnya akan dihasilkan talus dengan nukleus yang heterokaryon

yang terdiri atas kedua induknya. Kedua nukleus heterokaryon selanjutnya

mernbentuk diploid rekombinan, yang hasilnya adalah nukleus diploid hetrozigot

dan talus dengan homokaryon diploid mengalarni sorting out. Pada mekanisme

paraseksual terjadi pindah silang pada waktu mengalami pembelahan mitosis

yang mengakibatkan perubahan struktur kromosom. Pada waktu pembentukan

fase haploid terbentuklah strain baru dengan rekornbinan yang baru.

56

Mekanisrne variasi genetik terbaru dari Trichoderma adalah akibat peran

rnanusia yaitu dengan fusi protoplas atau penernbakan gen ke Trichoderma

(Mach & Zeilinger 1998). Gen yang telah berhasil ditransfer ke Trichoderma

adalah gen hygB yang akan rnengekspresikan sifat tahan terhadap antibiotik

higromycin.

lrnplikasi dari variasi genetik yang besar pada Trichoderma dan

Gliocladium ialah pada kemarnpuan adaptasi ekologi dan kebugaran, serta

keefektifan pengendalian hayatinya. lmplikasi positif dari sifat ini kernarnpuan

adaptasi Trichoderma yang sangat besar yang dibuktikan rnarnpu hidup pada

daerah-daerah yang sangat ekstrern yaitu kondisi basah dan kering Kedua

cendawan ini akan tahan terhadap perlakuan kirniawi misalnya herbisida.

Contohnya ada strain baru Trichoderma yang tahan terhadap antibiotik

higromycin. lrnplikasi negatifnya adalah apabila yang berubah rnengakibatkan

perubahan kernarnpuannya sebagai agens biokontrol, rnisalnya rnenjadi tidak

rnarnpu rnenghasilkan enzirn kitinase dan glukanase.

Kesimpulan

Cendawan agens biokontrol terhadap G. boninense yang berupa T.

harzianum, T. vin.de, dan G. viride mernpunyai indeks keragarnan yang rendah

tetapi berdasarkan rnarka RAPD dapat dikelornpokkan rnenjadi tiga kelornpok

besar dengan variasi genetik yang besar.

Percobaan 3 : Mekanisme antagonisme agens bikontrol terhadap

G. boninense

A. Mekanisme mikoparasitik agens biokontrol dengan

Scanning Electron Microscope (SEM)

Metodologi

Persiapan kultur

lsolat G. boninense ditumbuhkan pada cawan petri dengan medium PDA,

dengan posisi 2 cm dari tepi petri. Setelah biakan patogen berumur 4 hari

ditumbuhkan kandidat agens biokontrol, dengan posisi berlawanan dari G.

boniense. Kultur diinkubasikan pada suhu 2g°C, dan dihentikan setelah terjadi

interaksi antara agens biokontrol dan G. boninense. lnteraksi ditandai dengan

berternunya kedua hifa uji atau adanya zone penghambatan antara pertemuan

kedua koloni. Daerah pertemuan antara kedua hifa atau daerah dipotong

sebesar 1 x 1 cm2. Pada potongan sampel ini akan terikut agens biokontrol dan

G. boninense.

Fiksasi

Potongan sampel bersih dimasukkan ke dalam larutan glutaraldehyde 2,5%

selama 2 jam pada suhu 4°C. Volume larutan glutaraldehyde yang digunakan

sebanyak 30 kali volume sampel. Setelah prefiksasi, sampel mendapat

perlakuan fiksasi akhir yaitu direndam dalam asarn tannic 2% selama 6 jam pada

suhu 4OC. Sarnpel dicuci dengan bufer 0.2 M sodium cacodylate pH 8,2 selarna

15 menit pada suhu 4'C. Pencucian diulangi sebanyak 4 kali. Selanjutnya

sampel dicuci dengan larutan 1% 0 ~ 0 4 selama 2 jam pada suhu 4°C. Terakhir

sampel dicuci dengan air destilata selama 15 menit pada suhu 4°C dan diulangi

satu kali.

58

Dehidrasi

Selanjutnya sarnpel didehidrasi secara bertahap yaitu pertama sarnpel

dirnasukkan pada 50% alkohol selarna 5 menit pada suhu 4OC dan diulang 4 kali.

Setelah selesai sarnpel dimasukkan ke dalarn 75% alkohol pada suhu 4°C

selama 20 rnenit, yang dilanjutkan pada 85% alkohol selarna 20 rnenit pada suhu

4OC. Sampel kemudian dirnasukkan ke dalam 95% alkohol selarna 20 rnenit

pada suhu karnar. Akhirnya sarnpel dimasukkan pada alkohol absolut selarna 10

rnenit pada suhu ruang dan diulang 2 kali.

Pengeringan kering t-Butanol

Sarnpel direndam di dalam t-butanol selama 10 menit pada suhu kamar

dengan volume cukup terendarn dan diulang 2 kali. Kernudian difreezer pada

suhu -ZO°C sarnpai t-butanolnya hilang yang biasanya mernbutuhkan waktu 30

menit. Selanjutnya sarnpel di diletakkan pada vacuum chamber selama 2 jam.

Pelapisan logarn

Sampel yang sudah kering selanjutnya diletakkan pada ternpat spesimen

pada elektron rnikroskop dengan melekatkan double selotipe. Sampel

diletakkan pada vacuum chamber untuk menghilangkan ion. Sampel dilapisi

dengan carnpuran ernas dan platina dengan ketebalan kurang dari 10 nrn.

Spesirnen diarnbil dari ternpat vacuum chamber dan selanjutnya diobservasi

pada scanning electron microscope (SEM) tipe JSM-5000.

Hasil dan Pernbahasan

lnteraksi antara hifa agens biokontrol dan G. boninense dapat dilihat

dengan jelas menggunakan elektron rnikroskop tipe SEM. lnteraksi rnasing-

masing spesies dapat dilihat pada masing-masing garnbar berikut ini.

Gambar 7. Mikoparasitik T. harzianurn terhadap G. Boninense

Pada Gambar 7 terlihat bahwa interaksi antara hifa T. harzianum tidak

sernua mampu mendesak rniselium G. boninense sehingga akan terbentuk zona

pembatas antara kedua hifa tersebut. Tetapi ada beberapa hifa yang mampu

melewati zona pernbatas tersebut dan melakukan penetrasi pada organ calon

tubuh buah G. boninense. Pada gambar terlihat beberapa hifa T. hamianurn

melilit calon organ G. boninense. lnteraksi antara T. vifl'de dan G. boninense

dapat dilihat pada Gambar 8.

Garnbar 8. Mikoparasitik T. viride terhadap G. boninense

lnteraksi antara T. viride terhadap G. boninense sedikit berbeda dengan T.

harzianurn terhadap G. boninense. Zona kosong hampir tidak ada dan harnpir

semua sisi koloni T. viride yang berlawanan dengan G. boninense mampu

menempel dan rnendesak miseliurn G. boninense, meskipun sedikit yang

mengalami overlapping. Tetapi parasitasinya hampir sama yaitu hifa T. viride

marnpu menetrasi primordia tubuh buah dan mengkolonisasinya. Dibandingkan

dengan T. harzianurn, parasitasi T. viride lebih kornpak terjadi sehingga hifa yang

memarasit akan lebih banyak. Mikoparasitik Gliocladium viride agak berbeda

dengan kedua agens biokontrol di atas. Gliocladium viride mampu rnelakukan

pertumbuhan di atas koloni G. boninense dan banyak rnelakukan pelilitan

(coiling) dan penetrasi pada miseliurn tersier G. boninense (Gambar 9).

Sedangkan mekanisme pengharnbatan agens biokontrol Bacillus sp. berbeda

dengan ketiga spesies cendawan agens biokontrol di atas. Penghambatan tidak

melalui hiperparasitik, tetapi melalui rnekanisme antibiosis dan lisis. Hifa G.

boninense yang rnengalami kerusakan dan pecah akibat antibiotik yang

dihasilkan Bacillus sp. dapat dilihat pada Garnbar 10.

Gambar 9. Mikoparasitik Gliocladium viride terhadap G. boninense

Sedangkan mekanisrne penghambatan agens biokontrol Bacillus sp.

berbeda dengan ketiga spesies cendawan agens biokontrol di atas.

Penghambatan tidak melalui hiperparasitik, tetapi melalui antibiosis dengan

mengeluarkan antibiotik. Hifa G. boninense yang rusak akibat antibiotik Bacillus

sp. dapat dilihat pada gambar 10.

Gambar 10. lnteraksi antara Bacillus sp. dengan G. boninense

Hifa G. boninense yang mengalarni kontak Langsung dengan antibiotik

akan mengalami kerusakan dan membran hifa menjadi pecah sehingga menjadi

tidak silindris lagi serta cairan sef akan keluar.

Mekanisme antagonisme Trichoderrna spp. dan Gliocladiurn spp. pada

patogen lain juga menunjukkan sebagai mikoparasit yang sangat aktif (Campbell

1989). Elad et a/. (1983) melaporkan bahwa T. harzianurn mampu memarasit

Sclerotiurn rolfsii dan Rhizoctonia solani. Hifa dari T. harzianurn membel it dan

melubangi hifa cendawan Sclerotiurn rolfsii dan Rhizoctonia solani. Trichoderrna

banianurn dalam memarasit sklerosium S. rolfsii melalui kolonisasi lapisan luar

sklerosia (rind) dan selanjutnya melakukan penetrasi ke dalam bagian tengah

sklerosia (medulla). dan di dalarn, T, harzianurn melakukan pertumbuhan.

Yang terjadi pada sklerosium adalah sitoplasma mengalarni aggregasi dan

selanjutnya vakuola pecah. (Benhamou & Chet 1996). Pertemuan T. harzianurn

62

dengan S. rolfsii rnelalui senyawa yang ada pada S. rolfsii yaitu lektin. Dengan

adanya senyawa tersebut T. harzianum akan mengenal secara spesifik patogen

yang akan diparasit (Barak eta/. 1985). Bersamaan dengan proses mikoparasitik

terjadi pula produksi antibiotik volatil pyrone dan enzirn pendegradasi dinding sel

hifa inang yaitu enzirn kitinase dan glukanase. Apabila inangnya rnengandung

selulosa, cendawan ini juga akan rnengeluarkan enzirn selulase (Jeffries &

Young 1994).

Proses rnikoparasitik terdiri atas ernpat tahap yaitu (1) perturnbuhan

kemotropis. Kemotropis di sini adalah kemotropis positif yaitu pertumbuhan yang

menuju stimulus kirnia, (2) pengenalan (rekognisi). Rekognisi antara Trichoderma

dengan patogen tanaman bersifat spesifik. Lektin rnerupakan bahan kirnia yang

berperan penting dalam pengenalan Trichoderma terhadap Rhizoctonia solani

dan Sclerotium rolfsii. Galaktosa pada dinding sel Trichoderma akan rnudah

berasosiasi dengan lektin yang ada pada Rhizoctonia. Spesifitas beberapa isolat

Trjchoderma terhadap S. rolfsii sangat ditentukan oleh agglutinin yang diproduksi

S. rolfsii. Sernakin banyak agglutinin yang diproduksi akan semakin banyak pula

konidia Trichoderma yang terlekat olehnya. Lektin ini adalah protein dengan

berat molekul 55 dan 60 kDa., (3). Perlekatan dan pelilitan. Setelah terjadi

proses rekognisi, selanjutnya Trichoderma akan rnembentuk organ seperti

cantolan atau organ seperti appresorium. Pada tingkatan yang lebih lanjut

Trichoderma selanjutnya akan rnelilit hifa patogen sasaran. (4) Lisis. Proses

yang terakhir adalah degradasi dinding sel patogen. Untuk keperluan ini

Trjchoderma rnengeluarkan enzim kitinase dan glukanase. Hal ini disebabkan

komponen utama dinding sel patogen khususnya cendawan terdiri atas kitin dan

glukan.

B. Uji bioasai ekstrak kasar agens biokontrol

Metodologi

Media yang digunakan untuk rnemproduksi antibiotik kasar dari agens

biokontrol adalah medium Potato Dektrosa (PD) lo%, Malt Extract (ME) 1 %, dan

Martin cair modifikasi ( 1 g KH,PO,; 0,5 g MgS0,.7H20; 5 g pepton; 10 g

dektrose; 3,3 ml Rose Bengal 1%; chloramphenicol 30 mg; dan 1000 rnl air

destilata). lnokulurn berupa isolat (dengan pelubang gabus) pada medium yang

berdiarneter 0.5 cm dimasukkan dalam erlenmeyer dengan medium uji secara

aseptis kemudian diinkubasikan pada suhu kamar. Selama diinkubasi . kultur

masing-masing isolat digoyang dengan mesin shaker.

Kultur dipanen setiap 3 hari sekali selama 5 kali sebanyak 30 rnl pada

masing-masing pengambilan dan dilakukan secara aseptis dengan

menggunakan jarum suntik. Selanjutnya suspensi disentrifugasi dengan

kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan disaring dengan milipore

berukuran 0.22 prn yang dipasang pada syringe Tipe KS13. Hasil saringan

diteteskan pada kertas saring Whatman 41 steril yang dipotong dengan diameter

Icm.

Kertas Whatman yang mengandung suspensi diletakkan pada cawan

petri yang sudah ditumbuhkan G. boninense umur 6 hari. Dengan demikian

akan terbentuk dual culture antara G. boninense dan kertas saring Whatman

tersebut. Kultur diamati setiap hari dengan melihat adanya zone bening antara

G. boninense dan kertas Whatrnan.

Hasil dan Pembahasan

Ekstrak kasar agens biokontrol ini masih merupakan campuran antara

antibiotik dan enzirn. Kerusakan akibat antibiotik biasanya ditandai dengan

rusaknya membran sel, sedangkan akibat enzim biasanya berupa lisisnya sel.

Mekanisme antibiosis pada ke-26 isolat agens biokontrol sangat rendah yang

ditandai hampir semua iso[at tidak menunjukkan adanya zone bening antara G.

boninense dan kertas Whatrnan. Yang menunjukkan gejala antibiosis hanya

satu isolat yaitu T. viride (nomor 23). Itu pun hanya pada hari ke-15 kultur Malt

Extract. Produksi antibiotik oleh cendawan sangat dipengaruhi oleh medium

yang digunakan dan waktu munculnya antibiotik sangat sulit diprediksi. Antibiotik

merupakan suatu metabolit sekunder saja dan sebagai pertahanan pasif suatu

mikroorganisme.

Pada medium Potato Dextrose dan Martin semua isolat tidak

memproduksi antibiotik. Ini disebabkan oleh sumber C pada kedua medium ini

masih sangat kurang atau pada kedua medium ini pertumbuhan Trichoderma

dan Gliocladium tidak terganggu sehingga tidak perlu mengeluarkan antibiotik.

Dernikian juga untuk medium Malt Extract, secara umum juga tidak mendorong

produksi antibiotik. hanya isolat T. viride (No. 23 ) yang rnempunyai aktivitas

penghambatan dengan membentuk zone bening (Garnbar 11). Oleh karena itu,

peristiwa ini dapat diduga karena aktivitas antibiotik yang diproduksi isolat

tersebut. Pada hari ke-15 isolat T. viride sudah terganggu perturnbuhannya

sehingga perlu mengeluarkan antibiotik. Semakin tua umur kultur semakin besar

pula peluang untuk rnenghasilkan antibiotik. Pada Gambar 11. no. 3 dan 4

terlihat adanya zone bening yang menandakan adanya sifat antibiosis.

K ~ ~ : 1 T i i k ad8 antibW8, T.

vrircle pada medium PD umur 15 hari

2. Tidak adE antibiods. T. viride pada medium

d Martin u m r 15 hari 3. Ada antibiosis. T. w'ride

pada medium ME u m r 15 hasi

4. Ada antibiosis. T. viride pad8 medium ME u m r 15 hari

a. Zone bening pada 1 h* sePelah Mtibiotik dilel8kkan

b. Zonebening patla5 hali setel& antibiotik diletakkan

Gambar 11. Antibiosis T. viride isolat m r 23 Whadap 6. boninense pada medium ME yang diproduksi pads hari ke-15

Zone bening mi barukuran hanya sekitar 2 mm. Telah lama dilaporkan

bahvm GIiocLsdium dan Tkhodemra menghasilkan antibiotik. hWabaM salrunder

yang be r s i antifungal yang sangat terkenal dari Trichodenna dan GIiocIadium

adalah glidoksin, virklin, glhirin (Howell 8 Stipanovic 1083) dan 6n9enliC2H-

pymrk2one (Claydon d el. 1987). Selain itu Trichodenna juga menghasilkan

trichodemin. Spesies yang lain, khususnya T. viride menghadlkan suzukaciII'm,

alamethiciie, dm dermadine (U-21903) (Dennis 8 Webster 1971a).

Srrmkadllin dan alamUmne . . adalah jenis entibiotik jmis p e w , sedangkan

antibiolik dermadine j8nim asam mmobssik tidak jenuh. SuzukacHlin dan

ahm4hkii mengandung asam glutemat atau glutamin. w i n . glisin, alanin,

valin, dan leusin. Sedangkan di elamethiiineterdap&tambahan 2metiCalanin.

Tidak sema Trid,odema menghasilkan antiMotik den dalam spesies yang

66

sarna juga belum tentu menghasilkan antibiotik, dari penelitian Dennis & Webster

(1971b) dari 9 isolat T. harzianum yang diuji hanya 3 yang menunjukkan sifat

antibiosis. Dengan menggunakan ekstraksi kloroform dan ethanol telah berhasil

diisolasi antibiotik dari Trichoderma dan berbeda dengan gliotoksin dan viridin

berdasarkan nilai Rf. Trichoderma dan Gliocladium juga rnenghasilkan antibiotik

volatile (Dennis 8 Webster 1971 b) . Antibiotik volatil yang biasa terdapat pada

cendawan adalah H2S, ethylene, acetyldehide, n-propanol, propionaldehyde,

isobutanol, n-butiraldehid, ethil asetat, isobutil asetat, dan aseton. Claydon et a/.

(1987) berhasil rnengisolasi antibiotik volatite dari T. harzianum yang termasuk

dalarn akilpirone.

Dari Trichoderma dan Gliocladium telah berhasil diisolasi sebanyak 123

metabolit sekunder yang bersifat antimikrobial (Sivasithanparam & Ghisalberti

1998).

Penggunaan antibiotik secara alamiah di alam sangat sulit

didemontrasikan. Hal ini disebabkan antibiotik diproduksi sangat melirnpah di

medium kaya, khususnya yang rnenyebabkan pertumbuhan vegetatif tidak

seimbang. Di dalam tanah, jika sumber C dan N sangat terbatas maka

mikroorganisrne biasanya dalam keadaan dorman dan tidak memproduksi

antibiotik. Padahal faktor lingkungan sangat berpengaruh langsung terhadap

produksi antibiotik oleh Trichoderma dan Gliocladium. Produksi gliotoksin dari T.

virens terbaik dengan menggunakan sumber karbon dan nitrogen dari glukosa

dan fenilalanin dengan perbandingan 18:l ; 31:l ; dan 42:l. Secara umum,

produksi antibiotik ini sangat dipengaruhi rasio C : N. Semakin tinggi rasio C : N

akan mernacu produksi. Produksi antibiotik relatif sangat membutuhkan

sumber karbon yang sangat banyak (Baker & Dickman 1993) dan dipengaruhi

67

oleh matriks tanah dan reaksj tanah . Eksudat akar dan bahan yang diabsorpsi

akar menghambat pembentukan antibiotik, sedangkan pemberian bahan organik

akan memacu produksi antibiotik. Selain sumber karbon dan nitrogen, pH juga

berpengaruh pada produks~ antibiotik. Penelitian Wiendling menyatakan bahwa

gliotoksin diproduksi lebih tinggi pada pH 3,5 daripada 6,5. Disamping itu faktor

lain yang berpengaruh adalah suhu. Gliotoksin diproduksi rnelimpah pada suhu

21- 28 OC sedangkan pada suhu 3-18 "C akan terhambat.

Kemungkinan kedua adalah antibiotik yang terbentuk akan terikat oleh

lempung dan koloid organik sehingga konsentrasi yang berpengaruh terhadap

mikroorganisme lain akan semakin rendah. Disamping itu antibiotik yang

terbentuk akan cepat terdegradasi oleh enzim di dalam tanah. dan rusak oleh

sinar ultra violet.

Dengan demikian banyak yang harus diperhatikan sebelum mekanisme

penghambatan antibiosis ini diterapkan secara efektif di lapangan. Semua yang

disebutkan di atas adalah hambatan penggunaan sifat antibiosis sebagai salah

satu strategi pengendalian hayati penyakit tumbuhan.

C. Analisis enzim kitinase dan glukanase cendawan biokontrol

a. Optimasi produksi enzim kitinase dan glukanase

lsolat yang digunakan untuk uji optimasi kitinase dan glukanase adalah

isolat T. harzianum nomor 2. Cendawan ini ditumbuhkan pada cawan petri yang

mengandung medium PDA. Setelah berumur 4 hari, lempengan medium

dengan isolat dipotong bulat berdiameter 0,5 mm dengan bor gabus dan

dipindahkan pada medium optimasi. Medium yang digunakan untuk optimasi

enzim ini adalah sebagai berikut:

1. Potato Dextrose (PD); 400 g kentang, 20 g dekstrosa, dan 1000 rnl air

destilata

2. PD + 1 % kitin

3. Malt Extract (ME) 1 %; 10 g malt ekstrak dalarn 1000 ml air destilata

4. ME + 1% kitin

5. Medium Richard (R) ; 10 g KNO,, 5 g KH2P04, 2.5 g MgS04.7H20, 2 rng

Fe C13, 1% PVPP. 350 rnl V8 juice, dan 1000 rnl air destilata. pH akhir

adalah 6.0.

6. R + 1 % kitin

7. R + 3% kitin

8. R + 5% kitin

Volume masing-masing medium adalah 250 rnl. Pernanenan ekstrak

dilakukan pada hari ke-2, 4, 6 dan 8. Ekstrak kasar diambil dengan syringe

steril sebanyak 2 rnl dan disirnpan pada -20°C sebelurn digunakan pada uji

aktivitas kitinase dan glukanase.

Sebanyak 32 sarnpel dilakukan pengujian aktivitas enzim kitinase dan

glukanase sebagai berikut:

Uji aktivitas kitinase. Sarnpel sebanyak 400 y1 ditarnbah dengan 234 pl

kitin kernudian ditambah bufer enzirn natriurn asetat 50 mM pH 4.5 sehingga

rnencapai volume 1,5 rnl. Sampel dibuat dalam bentuk duplo, yang satu

diinkubasi selama 0 jam dan yang lain diinkubasikan selarna 2 jam pada suhu

37 C. N -asetil glukosamin yang terbentuk oleh aktivitas enzirn kitinase

diukur dengan menambahkan 0,2 ml0. 2 M K2B407 dan dipanaskan di dalam

air mendidih selarna 3 rnenit kemudian didinginkan dan ditarnbahkan 2 rnl p-

DABD 3.3% lalu divorteks dan didiamkan seIarnaq5 rnenit hingga terjadi

perubahan warna rnenjadi rnerah rnuda konstan. Kemudian sarnpel dibaca

absorbansinya pada panjang gelombang 544 nrn.

Uji glukanase. Sampel sebanyak 100 p1 dimasukkan dalarn tabung

eppendorf ukuran 1,5 ml, kemudian ditarnbahkan 375 pl laminarin 2 mglrnl.

Selanjutnya ditambahkan bufer enzirn kalium asetat 50 mM pH 5 sarnpai

volume total rnenjadi 1.5 ml. Setiap sarnpel dibuat dalam bentuk duplo, yang

satu diinkubasikan pada 0 jam dan yang lain dalam waktu 2 jam pada suhu

37 OC. Setelah selesai diinkubasi, sarnpel diarnbil sebanyak 1 rnl dan

ditarnbahkan 1 rnl akuades, kernudian ditarnbahkan larutan DNS ( 1 g DNS,

0.2 g fenol, 0,05 g Na,SO, ditarutkan dalam NaOH 2%) kemudian divorteks.

Selanjutnya dipanaskan pada air rnendidih selama 15 menit dan didinginkan

selarna 20 rnenit. Absorbansi sarnpel dibaca dengan spektrofotorneter pada

panjang gelornbang 575 nm.

Pernbuatan kurva standar untuk enzirn kitinase. glukanase, dan

penentuan total protein dengan rnetode Lowry telah dilakukan di Unit

Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Bogor. Dengan dernikian tinggal

rnenggunakan standar yang sudah ada.

Perhitungan aktivitas enzim. Aktivitas enzim kitinase dan glukanase

dihitung dengan formula:

A Abs x ( Standar N-asetilglukosamin) x FP Aktivitas enzim =

A x t x Abs standar

A Abs = selisih absorbansi antara inkubasi 0 dan 2 jam

FP = faktor pengenceran ; A = volume sarnpel ; t = waktu inkubasi (detik)

70

b. Aktivitas enzim kitinase dan glukanase agens biokontrol

Masing-masing 26 isolat cendawan agens biokontrol ditumbuhkan

pada medium PD . Ekstrak kasar enzim dipanen dengan syringe steril

sebanyak 5 ml pada hari kedua dan sarnpel disimpan pada suhu -20 " C.

Selanjutnya sernua isolat ( 26 isolat ) diuji aktivitas enzim kitinase dan

glukanase dengan metode yang telah disebutkan pada bagian optimasi

enzim.

c. Karakterisasi enzim kitinase dan glukanase agens biokontrol

Untuk karakterisasi dipilih tiga spesies agens biokontrol yang ada

yaitu Trichoderma harzianum (isolat nomor 6), Gliocladium viride (isolat

nomor 9), dan Trichoderma viride (isolat nomor 23). Karakterisasi meliputi

aktivitas enzim kitinase dan glukanase setelah dimurnikan dengan amonium

sulfat dan dialisa. Ekstrak kasar yang diperoleh selanjutnya ditambah

amonium sulfat sebanyak 80%-nya. Penambahan amonium sulfat dilakukan

secara perlahan-lahan dan diaduk sampai rnerata dan selanjutnya disimpan

pada suhu 4OC selama 2 jam. Filtrat enzim dipisahkan dengan sentrifugasi

5000 rpm selama 10 menit dan selanjutnya disirnpan dalam bufer kalium

asetat pH 4.5. Hasil yang diperoleh dari pengendapan amoniurn sulfat

selanjutnya dimasukkan dalarn membran dialisa dan dirnasukkan dalam

bufer enzim selarna semalarn pada suhu 4°C. Ekstrak kasar enzirn, hasil

pengendapan amonium sulfat, dan hasil dialisa selanjutnya diuji aktivitas

kitinase dan glukanase. Disamping itu juga diukur total protein rnasing-

masing dengan metode Lowry. Untuk pengukuran total protein diperlukan

pereaksi A (Na2C03 6% dalam 0,2 M NaOH), pereaksi B (1.5% CuSO, dalam

3% sodium sitrat), pereaksi C = pereaksi A : pereaksi B = 50:1, dan pereaksi

D = pereaksi Folin Ciocalteus : aquades = 3:l. Sarnpel sebanyak 30 pl

dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditarnbahkan bufer ekstrak sehingga

volume akhir 1.6 rnl. Pereaksi C dirnasukkan ke tiap tabung reaksi sebanyak

600 pl serta divorteks dan didiarnkan selarna 10 rnenit. Sebanyak 200 pl

pereaksi D dirnasukkan dan didiamkan selarna 30 rnenit. Absorbansi dibaca

pada panjang gelombang 750 nrn dan konsentrasi protein ditentukan

berdasarkan kuwa standar. Sampel ekstrak kasar, pernurnian dengan

amoniurn sulfat, dan pemurnian dengan dialisa diukur aktivitas enzirn kitinase

dan glukanase dengan rnetode yang telah disebutkan pada optirnasi enzim

kitnase dan glukanase.

Hasil dari pemurnian dengan dialisa selanjutnya dikarakterisasi

berat rnolekul enzim kitinase yang ada dan spesifitasnya pada tiga substrat

kitin. Langkah pertama adalah pernbuatan separating gel 12 % Akrilarnide (

6,7 ml DH20, 5 rnl Tris - HCI 1.5 M pH 8,8, 0,2 ml SDS lo%, 8 rnl Akrilarnide,

0 , l APS lo%, dan 0,015 rnl Terned ) dan dirnasukkan dalam cetakan

aparatus elektroforesis. Setelah beku ditarnbahkan stacking gel 4,5% (5,9 rnl

DH20, 2,5 rnl Tris-HCI 1,5 M, pH 6.8, 0,l rnl SDS 1096, 1,5 rnl Akrilarnide,

0,05 rnl APS 10%. dan 0.0? Terned). Cetakkan surnuran dipasang dan

apabila sudah rnernbeku dilepas secara perlahan-lahan. Sarnpel dicarnpur

dengan loading bufer dengan perbandingan 1 :3 (tanpa pemanasan),

kernudian elektroforesis dijalankan dengan arus 150 volt sampai pewarna

rnencapai ujung gel. Elektroforesis ini dikerjakan dalam bentuk duplo, yang

satu diwarnai dengan perak nitrat dan yang lain diwarnai dengan substrat

kitin fluoresen. Sampel yang satu di rendarn selama 1 jam di dalam larutan

fiksatif (160 ml ethanol, 40 rnl asam asetat, dan 200 rnl H,O) dan selanjutnya

dicuci 2 x 30 rnenit dengan larutan methanol : H20 (I:?). Pewarnaan dengan

perak nitrat dilakukan selama 15 menit dan setelah selesai dicuci dengan

H20 sebanyak 5 x 2 menit. Gel direlevasi untuk memunculkan warna dengan

direndam dalam larutan 2.5 ml asam sitrat 1% + 0,27 formaldehide + 500 ml

H20 selama 5 menit. Setelah muncul warna selanjutnya difoto untuk

digunakan selanjutnya. Sampel gel yang lain diwarnai dengan substrat k~tin

fluoresen . Gel diinkubasi dalam larutan 1% Triton (v/v) pada suhu 4OC

selarna 2 jam dan sambil digoyang. Selanjutnya dapat diinkubasikan pada

substrat kitin fluoresen pada suhu kamar selama 15 rnenit. Substrat yang

digunakan adalah substrat dirner ( 4-methylumbelliferyl-p-D-glucosamine),

trimer (4-methylumbelliferyl-B-D-N,N' ), dan tetramer (4-rnethylumbelliferyI-p-

D-N,N',N). Pita yang berfluoresensi dapat dilihat dibawah sinar UV dan

difoto.

d. Pengaruh pemberian kitin pada daya penghambatan agens

biokontrol secara in vitro

Semua isolat agens biokontrol diturnbuhkan secara dual culture terhadap

G. boninense pada dua medium yaitu PDA dan PDA + 1% kitin. Pengarnatan

dilakukan pada 6 hari setelah inokulasi agens biokontrol. Peubah yang diamati

adalah daya penghambatan pada medium PDA dan FDA + 1% kitin. Daya

penghambatan dihitung dengan formula:

keterangan: KP = keefektifan pengharnbatan ; a = panjang jari-jari koloni G. boninense ke arah tanpa agen biokontrol ; b = panjang jari-jari koloni G. bonhense ke arah agen biokontrol

Hasil dan Pembahasan

a. Optimasi produksi enzim kitinase dan glukanase

Produksi optimum kitinase dan glukanase sangat berbeda

berdasarkan medium kultur yang digunakan maupun waktu produksi.

Kitinase sangat baik diproduksi pada medium Richard (R) 1% kitin , yang

dibuktikan dengan paling tingginya aktivitas kitinase baik pada hari ke-2, ke-

4, ke-6 maupun ke-8 dibandingkan ketujuh perlakuan yang lain. Produksi

optimum sudah terjadi pada hari kedua, sedangkan pada hari-hari berikutnya

mempunyai nilai aktivitas yang hampir sama dengan hari kedua. Produksi

kitinase yang tinggi juga terjadi pada medium PD. Seperti pada medium R +

1% kitin, pada medium PD ini optimumasi terjadi pada hari kedua, kemudian

pada hari berikutnya sudah turun. Meskipun demikian produksi kitinase

masih di bawah medium R + 1% kitin. Hasil sangat kontras terjadi pada

medium R tanpa pemberian kitin , produksi kitinase cendawan agens

biokontrol sangat rendah dan menempati posisi yang paling rendah diantara

kedelapan perlakuan lainnya (Gambar 12.). Penelitian lain yang dilakukan

Harrnan etal. (1993) menunjukkan bahwa medium R + 1% kitin juga medium

yang paling optimum untuk produksi kitinase dengan waktu optimum pada

hari keempat. Sedangkan untuk produksi glukanase sangat berbeda dengan

hasil di atas, produksi tertinggi terjadi pada medium PD. Waktu yang

optimum untuk produksi glukanase pada medium ini juga terjadi pada hari

kedua. Pada hari-hari berikutnya produksi sudah sangat turun. Data yang

sangat menarik adatah produksi glukanase pada semua medium Richard,

sernua menunjukkan nilai yang sangat rendah dan baru naik sedikit pada hari

kedelapan (Gambar 13.) Medium Richard tidak cocok untuk produksi

glukanase, tetapi sangat cocok untuk produksi kitinase. Berdasarkan

produksi kedua enzim ini maka dipilih medium PD untuk produksi kedua

enzim pada penelitian berikutnya yang dipanen pada hari kedua.

Penambahan kitin pada medium R tidak selalu akan memacu

produksi kitinase. Ini dibuktikan bahwa produksi tercapai pada penambahan

1% kitin, sedangkan penambahan 3% dan 5% memberikan nilai aktivitas

yang lebih rendah daripada yang 1 %.

2 hari 4 hari 6 hari 8 hari

Umur Panen (hari)

Gambar 12. Optimasi enzim kitinase terjadi pada medium R + 1% kitin pada hari kedua

2 hari 4 hari 6 hari 8 hari

Umur Panen

Gambar 13. Optimasi enzim glukanase terjadi pada medium Potato Dextrose pada hari kedua

Ekspresi enzim kitinase bersifat indusibel. Produksi kitinase akan

tingggi bila medium turnbuh mengandung kitin sebagai satu-satunya sumber

karbon. lnduksi tidak terjadi apabila Trichoderma ditumbuhkan pada medium

yang mengandung glukosa dan beberapa gula sederhana lainnya (Harman et

a/. 1993). Mekanisme represi katabolik karbon bertanggungjawab terhadap

indusibel ekspresi endokitinase.

b. Aktivitas enzim kitinase dan glukanase agens biokontrol

Dari ke-26 isolat cendawan agens biokontrol yang d~peroleh

menunjukkan aktivitas kitinase dan glukanase yang berbeda. lsolat yang

mempunyai aktivitas kitinase tinggi belurn tentu rnernpunyai aktivitas

glukanase yang tinggi pula. Tetapi secara umum pada masing-masing isolat

rnempunyai aktlvitas glukanase yang tebih tinggi dibandingkan kitinase. Dari

aspek aktivitas enzim kitinase , agens biokontrol yang rnernpunyai aktivitas

relatif tinggi adalah Gliocladium viride isolat nornor 9 dan 19 dan Trichoderma

viride isolat nomor 13 dan 23. Sedangkan isolat yang lain rnernpunyai

aktivitas kitinase yang relatif rendah. Dari aspek aktivitas glukanase, agens

biokontrol yang rnempunyai aktivitas tinggi yaitu Trichoderma harzianum

isolat nomor 6, 7, I I, 20,22 ; Gliocladium viride isolat nomor 9; dan

Trichoderma viride isolat nomor 12, 13, 18, 23, dan 26 (Gambar 14.).

Disarnping nilai aktivitas ada peubah lain yang sangat penting yaitu nilai

absorbansi pada inkubasi 0 jam. Pada beberapa isolat menunjukkan nilai

yang sangat tinggi (Lampiran 7). Hal ini menunjukkan bahwa enzirn

glukanase sudah diproduksi dan bekerja pada medium kultur. Enzim

glukanase bekerja secara konstitutif yaitu ekspresi tanpa adanya indusibel.

0 Glukanase I Kltlnase 1

l 2 I

Nornor lsolat

Gambar 14. Aktivitas enzim kitinase dan glukanase 26 isolat cendawan agens biokontrol

Aktivitas kitinase dan glukanase tidak mempunyai korelasi yang

nyata dengan daya penghambatan secara in vitro. Kedua enzirn ini

mempunyai koefisien regresi yang sangat rendah yaitu y = -14,67x +

90.9 (r = -0.11) untuk kitinase dan y = -14x + 90,56 ( r = -0,Ol) untuk

glukanase.

c. Karakterisasi enzim kitinase dan glukanase agens biokontrol

Enzim kitinase dan glukanase dari T. harzianum, G. viride, dan T.

viride mempunyai aktivitas yang naik setelah dimurnikan dengan

pengendapan amonium sulfat 80% dan dialisa. Aktivitas kitinase dari T.

harzianum naik dari 0,0198 p rnot/ml/jarn menjadi 0.0864 y mol/ml/jam

(pengendapan amonium sulfat) dan 0,0896 p mol/ml/jam (dialisa),

sedangkan aktivitas glukanase naik dari 0,9594~ rnol/ml/jam menjadi

1,0982 p mol/ml/jam (pengendapan amonium sulfat) dan 1,0988 p

mollmlljam (dialisa). Aktivitas kitinase G. viride juga naik dari 0,1156 p

rnol/rnl/jam menjadi 0, 1673 p rnollml/jam (pengendapan amonium sulfat)

dan 0 , 1 8 9 6 ~ rnollml/jam, sedangkan aktivitas glukanasenya naik dari

0,7944 p mollrnlljarn menjadi 0,9682 p mol/ml/jarn (pengendapan

arnonium sulfat) dan 0,9836 p rnollrnlljam (dialisa). Dernikian juga untuk

T. viride aktivitas kitinase naik dari 0,1044 y rnollrnlljam rnenjadi 0,1486 p

rnollmlljam (pengendapan amoniurn sulfat) dan 0,1548 p mollmlljam

(dialisa), sedangkan aktivitas glukanase naik dari 0,7230 p rnollrnlljam

rnenjadi 0,9236 p mollrnlljarn (pengendapan arnonium sulfat) dan 0,9834

p mollmlljam (dialisa). Pernurnian dengan arnoniurn sulfat dan dialisa

rnenghasilkan derajat kemurnian yang rendah. Pada uji aktivitas kitinase,

arnoniurn sulfat rnenghasilkan kernurnian 4,4 X pada T. harzianum, 1,4

X pada T. viride, dan 1,4 X pada G. viride. Sedangkan dialisa

rnenghasilkan kernurnian 4.5 X pada T. harzianum, 1,5 X pada T. viride,

dan 1,4 X pada G. viride (Tabel 8). Pada pernurnian untuk aktivitas

glukanase rnemberikan hasil pernurnian yang lebih rendah lagi yaitu 1 ,I X

pada T. hamianurn, 1,3 X pada T. viride, dan 1,2 X pada G. viride pada

pernurnian arnoniurn sulfat. Sedangkan pernurnian dengan dialisa

memberikan hasil 1 , I X pada T. harzianum, 1,4 X pada T. viride, dan 1,2

X pada G. viride (Tabel 9).

Berat molekul enzirn kitinase yang dihasilkan ketiga agens

biokontrol agak berbeda. Berat molekul kitinase dari T. harzianurn adalah

80 kDa, T. viride sebesar 73 kDa, dan G. viride sebesar 66 kDa.

Spesifitas ketiga enzim kitinase ini adalah sama yaitu hanya rnarnpu

rnernotong substrat kitin berbentuk dirner, sedangkan untuk substrat

trimer dan tetramer ketiga enzim kitinase ini tidak marnpu (Garnbar 15).

Tabel 8. Aktivitas enzirn kitinase dengan berbagai pernurnian

lsolat Prosedur Aktivitas Volume Total Total Derajat Hasil spesifik (rnl) Protein aktivitas Kernurnian (56)

pmollml/jarn (mg) pmollmlljam (Kali lipat)

Trichoderma Ekstrak kasar 0.0198 138 56,28 1 ,I 1 1 100

harzianum Amonium.sulfat 0,0864 1.5 0.79 0,07 4.4 6.3

Dialisa 0,0896 1 0.35 0.03 4,5 2,7

Trichoderma Ekstrak kasar 0,1044 138 55.10 5.75 1 100 virjde

Amonium sulfat 0,1486 2 1,78 0.26 1,4 4.5

Dialisa 0,1548 1.5 1.76 0.27 1,s 4.7

Gliocladlum Ekstrak kasar 0,1156 138 78,44 9.07 t 100 viride Amonium sulfat 0,1673 1.5 1.73 0,29 1.4 3,2

Dialisa 0,1896 1 1.63 0.31 1.6 3.4

Tabel 9. Aktivitas enzirn glukanase dengan berbagai pernurnian

lsolat Prosedur Aktivitas Volume Total Total Derajat Hasjl spesifik (ml) Protein aktivitas Kemurnian (%)

pmollmlljam (mg) ~.tmollrnl/jarn (Kali lipat)

Trichoderma Ekstrak kasar 0,9594 138 56,28 54 1 100 hanianum Amonium.sulfat 1,0982 1.5 0.69 0,76 1 , l 1,41

Dialisa 1.0988 1 0.35 0,38 1 , l 0.70

Trichoderma Ekstrak kasar 0.7230 138 55.10 39.84 1 100 viride

Amonium.sulfat 0.9236 2 1,78 1,64 1,s 4,1

Dialisa 0.9834 1,5 1,76 1.73 1.4 4.3

Gliocladium Ekstrak kasar 0.7944 138 78.44 62.31 1 100 viride Amoniurn sulfat 0,9682 1.5 1.73 1,67 1.2 2,7

Dialisa 0,9836 1 1.63 1.60 1.2 2,6

Pewarnaan Substrat Substrat Substrat perak nitrat Dirner Trirner Tetramer

Keterangan: S = Standar ; Th = Trichoderma harzianum Tv = Trichoderrna viride; Gv = Gliocladium viride K = Kontrol positif

Gambar 15. Spesifikasi substrat kitin dari kitinase yang dihasilkan agens biokontrol

Lorito et a/. (1994) telah melakukan purifikasi dan karakterisasi

1,3-p-glukosidase dan N-Acetyi-p-glukosarnidase dari Trichoderma spp. 1,3-

p-giukosidase rnernpunyai berat molekul 78 KDa dan rnempunyai titik

isoelektrik 6,2 sedangkan N-Acetyl-p-glukosarnidase rnempunyai berat

rnoiekul 72 kDa dengan titik isoelektrik 4.6. T, hamianurn rnernpunyai enarn

jenis enzirn kitinase yaitu 2 jenis 1,4-p-Kglucosarninidase (EC 3.2.1.30)

(CHIT 102 dan CHlT 73) yang akan rnenghidrolisis kitin menjadi monomer

asetilglukosamine secara ekso. Sedangkan 4 yang lain adalah endokitinase

(EC 3.2.1.14) yang akan rnernotong secara acak benang kitin yaitu CHlT 52,

CHlT 42. CHlT 33, dan CHlT 31). Harman et a/. (1993) rnembagi enzim

kitinase dari Trichoderma menjadi 3 jenis yaitu endokitinase (EC 3.2.1.14),

kitin I ,4-p-kitobiosidase (kitobiosidase) dan p-N-asetilheksoaminidase (EC

3.2.1.52). Endokitinase memotong kitin dan oligomer kitin secara acak serta

melepaskan campuran produk akhir berberat molekul rendah dengan ukuran

yang bermacam-macam. Diasetilkitobiosa merupakan produk akhir yang

paling dominan dari hasil potongan endokitinase. Kitobiosidase merupakan

nama baru yang diusulkan Harman ef a/. (1993) yang mempunyai aktivitas

ekso. Enzim ini memotong kitin dan kitooligomer secara progresif dari ujung

non-tereduksi dan hanya melepaskan diasetilkitobiosa sebagai produk akhir.

Sedangkan P-N-aset~lheksoaminidase (EC 3.2.1.52) memotong kitin dan

kitooligomer secara progresif dari ujung non-tereduksi dan hanya

melepaskan monomer N-asetilglukosamin sebagai produk akhir. Apabila

dibandingkan dengan jenis enzim kitinase lain, endokitinase mempunyai

aktivitas dan antifungal yang paling tinggi, apalagi kalau dibandingkan enzim

kitinase dari tanaman, bakteri, atau cendawan lain (Lorito 1998).

Gliocladiurn virens dilaporkan juga menghasilkan enzim endokitinase,

1,4-p-chitobiosidase, dan N-Asetil-p-glukosamidase. Endokitinase yang

diperoleh telah dikarakterisasi dengan berat molekul 41 kDa dengan titik

isoelektrik 7,8 , serta bersama gliotoksin dapat menghambat B. cinerea

secara sinergistik (Di Pietro et a/. 1993). Dinding sel Ganodem~a boninense

mengandung kitin, oleh karena itu dinding sel ini akan terdegradasi oleh

beberapa enzim kitinase di atas yang dihasilkan oleh Trichoderma maupun

Gliocladiurn.

d. Pengaruh pemberian kitin pada daya pengharnbatan agens

biokontrol secara in vitro

Pemberian kitin pada substrat tidak selalu memberikan pengaruh

positif terhadap daya penghambatan koloni G. boninense. Hasil yang

dicapai ada yang menambah daya penghambatan dan bahkan ada yang

rnengharnbat daya penghambatan, seperti terlihat pada isolat T. hanianum

nornor 7 dan 20 (Tabel 10). Sebagian besar isolat tidak memberikan

pengaruh apa-apa. Hal ini disebabkan oleh jenis kitin penginduksinya tidak

cocok, dapat dijelaskan dari hasil percobaan sebelumnya, enzirn kitinase

hanya rnarnpu rnernotong yang berbentuk dirner tetapi tidak rnampu

rnemotong kitin yang trirner ataupun tetramer.

Tabel 10. Pengaruh pemberian kitin pada daya penghambatan agens biokontrol

No. Agens Biokontrol Perubahan No Agens Biokontrol Perubahan Daya Daya

Pengharnba Penghamb tan atan {Oh) ( % )

1 Trichoderma harzianum 0 14 Trichoderma 0 harzianum

2 Tnchoderma harzianum 0 15 Trichoderma 0 harzianum

3 Trichoderma harzianum 1 16 Trichoderma 0 harzianum

4 Trichoderma harzianum 0 17 Gliocladium viride 2 5 Trichoderma harzianum 0 18 Tricoderma viride 1 6 Trichoderma harzianum 0 19 Gliocladium viride 1 7 Trichoderma harzianum - 1 20 Trichoderma - 1

harzianum 8 Trichoderma harzianum 1 21 Trichoderma 1

harzianum 9 Gliocladium viride 3 22 Trichoderma 0

harzianum 10 Trichoderma harzianum 1 23 Trichoderma viride 2 1 1 Trichoderma harzianum 0 24 Trichoderma 1

hanianum 12 Trichoderma viride 1 25 Gliocladium viride 1 13 Trichoderma viride 0 26 Trichoderma vin'de 1

Kitin merupakan hornopolirner dari N-asetil-D-glukosamine yang

berikatan secara glikosidik p ( 1 3 4). Kitin sangat rnelimpah diternui di

biosfer, harnpir dapat ditemui di semua kingdom; protista, bakteri.

cendawan, tanaman, invertebrata, dan vertebrata terrnasuk manusia.

82

Rantai monomer-monomer kitin berasosiasi satu dengan yang lain

melalui ikatan hidrogen antara gugus N-H dari satu rantai dengan gugus

C=O pada rantai yang berdekatan. Jumlah ikatan hidrogen akan

menentukan ketidaklarutan kitin dalam pelarut air. Berdasarkan pola

penyusunan rantai polimernya, kitin fibril dibedakan menjadi tiga jenis

(Cabib 1987) yaitu a-kitin, p-kitin, dan y-kitin. Jenis yang banyak pada

cendawan dan antropoda adalah a-kitin. Kitin dan glukan merupakan

komponen utama dinding sel hampir semua jenis cendawan. Kandungan

kitin pada cendawan bewariasi dari 4 - 9 % berat kering . Spesies-

spesies Boletales, Agaricales, dan Russulales mempunyai kandungan

kitin yang tinggi pada tubuh buahnya yaitu 8-9% dari berat kering

totalnya, sedangkan G. lucidum mempunyai kandungan kitin 2,4 % dari

total berat keringnya (Rajarathnam etal. 1998).

Peran enzirn kitinase dalam mekanisme antagonisme ditunjukkan

dengan terekspresinya enzirn kitinase pada berbagai taraf. Elad et a/.

(1982) menemukan bahwa isolat Trichoderma memproduksi glukanase

dan kitinase jika ditumbuhkan pada miseliurn hidup dari Sclerotium rolfsii

di tanah. Selain dihasilkan di media dual culture , enzim kitinase CHIT 42

terekspresi selama mikoparasiti k T. hamianurn terhadap R. solani

(Carsolio et a/. 1994).

Peran enzim kitinase dalam mekanisme antagonisme adalah

pada mikoparasitik. lnteraksi mikoparasitik dengan cepat menginduksi

ekspresi kitinase beberapa jam setelah kontak antar miselium

Trichoderma dan cendawan patogen (Elad et a/. 1983 & Carsolio 1994).

Kitinase yang dihasilkan selama proses mikoparasitik T. harzianum

83

terhadap Sclemtium rolfsii sangat berbeda. Produksi enzirn kitinase dari

Trichoderma harzianum dipengaruhi jenis kitin yang ada pada patogen

yang dihadapinya. Pertama kali yang diproduksi adalah N-Acetyl-p-

glukosamidase dengan berat rnolekul 102 kDa jika pada kedua cendawan

di atas baru dilakukan dual culture. Setelah 12 jam terjadi kontak antar

miselium, terjadi ekspresi yang sangat kuat dari N-Asetil-p-glukosarnidase

dengan berat molekul 73 kDa. Hasil ini sangat berbeda jika T. hanianum

dihadapkan dengan R. solani, pada 12 jam setelah kontak antar

rniselium, enzim kitinase yang terekspresi adalah CHIT1 02 dengan berat

molekul 102 kDa dan diikuti ekspresi kitinase yang lain rneskipun dalam

jumlah yang sangat kecil yaitu enzim kitinase dengan berat rnolekul 52,

42, dan 33 kDa (Haran et a/. 1996). Enzirn kitinase juga bekerja sebelum

kontak dengan miselium patogen sasaran. Peristiwa ini terjadi pada T.

harzianum yang dihadapkan pada Fusarium oxysporum f.sp. radicis-

lycopersici (Cherif & Benhornou 1990). Dernikian juga pada peristiwa

rusaknya hifa F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici tidak han ya terjadi

pada hifa yang langsung kontak dengan T. harzianum. Miseliurn

cendawan patogen yang diotoklaf akan menginduksi kitinase (CHIT 42)

dan tidak terjadi pada Trichodema yang mempunyai mikoparasitik rendah

(Garcia et a/. 1994). T. hanianum yang mempunyai sifat antagonistik

tinggi adalah yang mempunyai aktivitas endokitinase yang tinggi pula

(Harman et a/., 1993). Endokitinase dari Trichoderma mampu

menghambat berbagai cendawan yang dinding selnya mengandung kitin

(Di Pietro et a/. 1993). Enzim kitinase yang diproduksi T. harzianum

rnarnpu menghambat perkecambahan spora, pertumbuhan hifa Bofryfis

cinerea, F. solani, Ustilago avenae,dan Uncinula necator (Lorito et a/.

1993). Dalarn aplikasinya enzirn kitinase dari T. harzianurn kornpatibel

dan sinergist~k dengan kitinase dari Enterobacter cloacae, tetapi tidak

kornpatibel dengan Pseudomonas spp. dalarn rnengharnbat Botryris

cinerea. Fusarium solani, dan Uncinula necator (Lorito et a/. 1993).

1. Mekanisme antagonisrne Trichoderma harzianurn, Trichoderma viride,

dan Gliocladium viride harnpir sarna yaitu sebagian besar rnelalui

mernarasit G. boninense dengan cara rnelilit hifa kernudian rnengeluarkan

enzim kitinase dan glukanase, serta antibiotik. Sedangkan Bacillus sp.

rnempunyai rnekanisme pengharnbatan terhadap G. boninense melalui

antibiosis.

2. Enzirn kitinase yang berperan dalarn rnekanisrne pengharnbatan agens

biokontrol terhadap G. boninense mernpunyai berat rnolekul 80 kDa untuk

T. hamianurn , 73 kDa untuk T. viride , dan 66 kDa untuk G. viride

dengan spesifitas yang sarna yaitu hanya rnernotong subtrat kitin dirner.

3. Agens biokontrol yang rnempunyai aktivitas enzirn kitinase tertinggi yaitu

G. viride isolat no. 9 dengan aktivitas 0.1 156 pmollrnlljarn sedangkan

yang mempunyai aktivitas enzirn glukanase tertinggi yaitu isolat T. viride

no. 18 dengan aktivitas 1.0886 pmollrnl/jam.

Percobaan 4: Efikasi agens biokontrol terhadap penyakit busuk pangkal

batang kelapa sawit dalam skala rumah kaca dan lapangan

A. Produksi massal sumber inokulum G. boninense

lsolasi Ganoderma boninense

Kultur murni G. boninense diisolasi dari jaringan tubuh buah yang tumbuh

pada tanaman sakit asal kebun Sei Pancur. Potongan kecil ( 5 x 5 x 5 mm)

jaringan tubuh buah rnuda, didisinfeksi dengan Chlorox (NaOCI) 1% selama 10

menit, dicuci dengan air steril sebanyak dua kali dengan selang waktu 5 menit.

Setelah ditiriskan pada kertas saring dan kernudian ditumbuhkan pada media

Potato Dextrose Agar (PDA) dalam petridish. Selanjutnya diinkubasikan pada

suhu kamar hingga membentuk hifa. Ujung hifa yang tumbuh kemudian

dipotong dan diturnbuhkan pada cawan yang baru. Setelah berurnur 7 hari kultur

dapat digunakan untuk kegiatan berikutnya.

Preparasi Substrat lnokulum

Substrat yang diuji untuk media tumbuh sumber inokulum ada 4 macarn

yaitu kayu karet, akar karet, serbuk gergaji, dan serbuk gergaji + PDA. Keempat

substrat dicuci dengan air steril dan masing-masing dimasukkan ke dalam plastik

polipropilen tahan panas (kapasitas 1 kg) yang diberi leher peraion dan tutup

kapas. Masing-masing substrat disterilkan degan otoklaf pada 138 Psi pada 121

" C selama 60 menit. Setelah dingin. masing-masing substrat diinfestasi dengan

isolat G. boninense yang berumur 7 hari. Substrat yang telah diinfestasi

selanjutnya diinkubasikan di laboratorium dengan suhu 30 O C. Untuk

mengetahui kolonisasi substrat oleh rniselium dilakukan pengukuran

pertumbuhan miselium tiap minggu. Potensi pembentukan tubuh buah juga

dievaluasi dengan rnenurnbuhkan G. boninense dalam erlenmeyer kapasitas 2

liter dengan media substrat uji dan mulut leher terbuka.

6. Uji in vivo agens biokontrol pada tubuh buah G. boninense

Serbuk gergaji kayu meranti digunakan sebagai substrat pertumbuhan

tubuh buah G. boninense yang dimasukkan ke dalam erlenmeyer kapasitas 2

liter. Pada bagian atas erlenmeyer tersebut ditutup dengan kapas dan

selanjutnya disterilisasi pada tekanan 138 Psi dengan suhu 121 O C selama 2

jam. Kemudian inokulum diinfestasi dengan G. boninense. Setelah 3 bulan

tubuh buah terbentuk kemudian diinokulasikan agens biokontrol pada substrat

PDA ( I 0 rnl) untuk masing-masing perlakuan. Perlakuan terdiri atas pemberian T.

hamianurn, T. viride, G. viride, Bacillus sp., dan kontrol PDA steril, masing-

masing perlakuan dengan 3 ulangan. Peubah yang diamati adalah skoring

persentase kematian tubuh buah setiap 2 minggu sekali selama 3 bulan.

Tabel 11. Kriteria Skoring kerusakan tubuh buah G. boninense

Skor Persentase Kernatian Jaringan (%) 0 0

C. Efikasi agens biokontrol d i dalarn rurnah kaca

Persiapan bahan tanaman

Bibit yang digunakan untuk uji efikasi ini berasal dari koleksi Pusat

Penelitian Kelapa Sawit yaitu persilangan B0909 T x BO 936 T, BO 906 T x BO

87

796 P, MI314 D x 3 0 932 T, 802581 D x 802581 D, BO 5462 D x BO 358

P,dan BO 5585 D x BO 5510 D. Kecambah keenam persilangan di atas ditanarn

pada polibeg berukuran diameter 9 crn @re-nursery) dengan posisi rnata tunas di

atas. Bibit ditumbuhkan pada tempat yang diberi naungan secukupnya hingga

umur 3 bulan dan siap dipindahkan ke polibeg besar (main-nursery).

Persiapan sumber inokulum dan uji patogenesitas

Medium yang digunakan untuk perbanyakan sumber inokulum patogen

merupakan medium terbaik hasil evaluasi substrat inokulum. lnokulum pada

substratnya berumur satu bulan diinokulasikan pada saat transplanting bibit dari

pre-nursery ke main-nursery. Tiap akar bibit kelapa sawit dirnasukkan ke

kantong palstik dan diikat, selanjutnya akar bibit main nursery ditimbun dengan

tanah.

Persiapan perlakuan agens biokontrol

Cendawan agens biokontrol diinfestasikan pada rnenir di dalam

erlenrneyer yang sebelumnya sudah disterilkan. Kemudian diinkubasikan

selarna 5 hari, selanjutnya diferrnentasikan dan dicarnpur dengan dedak halus

steril dengan proporsi akhir 10%. Sedangkan agens biokontrol berbentuk bakteri

diperbanyak pada medium Nutrient Broth dan langsung siap digunakan sebagai

agens biokontrol di polibeg.

Perlakuan kitin dipersiapkan dari kulit udang dibersihkan dengan air

sampai bersih. Hidrolisis dilakukan dengan penambahan asam sulfat pekat

dengan perbandingan volume 1 : 1 sambil diaduk. Setelah terhidrolisis, kitin

dicuci secara bertahap dengan menggunakan air. Pencucian dihentikan setelah

bau asam sulfat sudah tidak menyengat lagi. Pada tahap akhir kitin beserta air

dikeringkan di bawah sinar matahari hingga tertinggal kitin rnurni saja, kemudian

diatur pH -nya dengan penarnbahan NaOH sampai pH netral.

88

Percobaan disusun dengan Rancangan Percobaan faktorial dalam acak

kelornpok 6 x 5 x 2 x 2 dengan 3 ulangan. Faktor pertama yaitu jenis

persilangan kelapa sawit; V1 = T x T, V2 = T x P, V3 = D x T, V4 = D x D

selfing, V5 = D x P, V6 = D x D, faktor kedua adalah agens biokontrol: TO =

tanpa agens biokontrol, T I = Trichoderma harzianum, T2 = Gliocladiurn viride,

T3 = Bacillus sp, T4 = T. banianurn + G. viride + Bacillus sp, faktor ketiga adalah

inokulasi G. boninense yaitu GO = tanpa inokulasi G. boninese dan G1 = dengan

inokulasi G. boninense. sedangkan perlakuan keempat adalah pernberian

substrat kitin yaitu KO = tanpa kitin dan K1 = dengan kitin.

Pemberian agens biokontrol dan kitin dilakukan pada saat transplanting

yaitu pada saat bibit kelapa sawit umur 3 butan dipindah pada polibeg besar.

Jurnlah agens biokontrol yang diberikan sebanyak 10 g forrnulasi untuk

cendawan agens biokontrol sedangkan untuk bakteri sebanyak 10 ml. Pada

perlakuan T4 agens biokontrol diaplikasikan sebagai berikut; T harzianum dan

G. viride masing-masing 5 g, dan Bacillus sp. 5 ml. Kitin diberikan sebanyak 1 g

tiap polibeg. Kerapatan konidium T . harzianum dan G. viride adalah 4 x 10

konidium I ml sedangkan Bacillus sp. dengan kerapatan 7 x 10 cfutrnl.

Peubah yang diamati adalah kejadian penyakit BPB yang dilihat dari

gejala penyakit setiap bulan selama 1 tahun. lsolasi dilakukan dari jaringan

tanaman yang bergejala pada akhir pengarnatan. Peubah lain yang diamati yaitu

tingggi tanarnan, jumlah pelepah, vigor tanaman, dan perkembangan populasi

agens biokontrol setiap bulan. Perkembangan agens biokontrol diarnati dengan

rnengarnbil sampel tanah pada kedalarnan 20 cm sebanyak 1 g selanjutnya

diencerkan pada air steril 100 ml, yang kemudian dibuat seri pengenceran

sarnpai 10 -'. Cendawan agens biokontrol dihitung pada pengenceran 10 dan

89

penanaman pada medium Martin Agar + chlorarnphenicol, sedangkan bakteri

pengenceran 10 -' di medium Nutrient Agar.

D. Efikasi agens biokontrol di lapangan

Penelitian lapangan dilaksanakan di kebun kelapa sawit Sei Pancur

Sumatera Utara milik Pusat Penelitian Kelapa Sawit. Sebagai sumber inokulum

dipilih areal yang rnempunyai kejadian penyakit BPB > 50% dan pada setiap

lubang tanam dipastikan adanya G. boninense. Setiap satu sumber inokulum

tanarnan sakit di tanam bibit kelapa sawit perlakuan secara diagonal mengelilingi

sumber inokulum tersebut dengan jarak 2 m, sehingga setiap satu sumber

inokulum terdapat enam bibit kelapa sawit dengan perlakuan yang berbeda.

Perlakuan pertama adalah pemberian T. harzianum 500 g, perlakuan

kedua adalah pemberian T. harzianum 250 g, perlakuan ketiga adalah

pemberian G. viride sebanyak 500 g , perlakuan keempat adalah pemberian

Bacillus sp. sebanyak 500 ml, perlakuan 5 adalah perlakuan campuran T.

harzianum + G. viride + Bacillus sp. ( 250 g + 250 g + 250 ml), sedangkan

perlakuan 6 adalah kontrol. Percobaan ini menggunakan 2 persifangan yaitu D x

D dan D x P dengan masing-masing 10 ulangan. Perlakuan cendawan agens

biokontrol dalam formulasi dedak halus, sedangkan bakteri dalam medium

Nutrient Broth.

Pengamatan dilakukan setiap bulan dengan peubah yang diamati gejala

penyakit yang muncul dan perkembangan populasi agens biokontrol ke arah

sumber inokulum dan ke arah perlakuan yang lain dengan penambahan jarak

pengamatan setiap bulan adalah 20 cm selama 6 bulan dengan kedalaman 25

dan 50 cm. Perkembangan agens biokontrol diamati dengan mengambil sampel

tanah sebanyak 1 g selanjutnya diencerkan pada air steril 100 ml, yang

90

kamudian dibuat seri pengenceran sampai 10 -'. Candawn agens biokantml

dihitung pada 10 di mediirn Martin Agar + ch-icd sedangkan bakWi

pada 10 -' di medium Nutrient Agar.

A. Ploc)ukri nuwl sumber inakulum O bonlmnse

Miseliurn G. h i n e w tumkrh sangat baik pada substrat serbuk geqaji

dan serbuk gergaji + PDA. Koloniii s d u ~ h media hanya dibutuhkan waktu

&ma 1 bulan. Pertumbuhan kdoni paling beik pada substrat serbuk gergaji +

PDA. Pada minggu perterne saja sudah mencapai 4,5 cm, sedangkan pada

subsbai yang lain m i h turnbuh sangat lambat. Peftumbuhan yang agak =pet

pada serbuk gergaji. Hal hi dmbabkan deh adanyazat makanan tersedm yaitu

PDA. Pada substrat yang Lam yaitu kayu dan akar karet pertumbuhan sangat

lambat, karena substrat yang terlakr kerns sehingga mernbutuhkan waMu yang

cukup lama dan enzim degradasi yang cukup untuk memenuhi zat makanan

tersedia seperti karbon, asam amino dan asam lemak tersedia. Bahkan pada

minggu ketiga kayu dan akar karet sudah ditumbuhi jamur kontaminan sehingga

Ganodenna mati. Cendawan kontaminan yang paling dorninan adalah

Trichoderrna sp., Aspergillus sp., dan Pennicilliurn sp.

- Kayu Karet

--c Akar Karet

- h Serbuk Gergaji

+Serbuk Gergaji

Minggu

Gambar 17. Perkembangan panjang koloni G. boninense pada substrat yang berbeda

Keuntungan produksi massal sumber inokulum dengan serbuk gergaji +

FDA adalah dalam waktu yang singkat dapat diproduksi sumber inokulum yang

banyak untuk inokulasi pada bibit dan inokulum dapat dibagi menjadi sumber

inokulum dengan volume kecil sehingga mernudahkan pengaturan dosis dan

dapat digunakan sebagai sumber inokulum yang efisien. Ada tiga masalah

utarna pada skrining keiapa sawit terhadap BPB yaitu (1) mernbutuhkan waktu

yang lama untuk penyediaan sumber inokulum, (2) membutuhkan luasan

permukaan pertumbuhan inokulum yang besar, dan (3) teknik deteksi dini untuk

mengetahui tanaman tersebut sudah terinfeksi atau belum. Masalah ini telah

dicari solusinya oleh beberapa peneliti, mengevaluasi patogenesitas patogen

yang ditumbuhkan pada beberapa substrat. Navaratman 8 Chee (1965)

melaporkan bahwa 750 cm inokulum dapat menginfeksi bibit kelapa sawit.

Hashim et a1.(1991 b) juga melaporkan bahwa inokulum yang berupa balok kayu

karet 432 cm dapat menginfeksi bibit 6 bulan setelah inokulasi dan apabila

ukuran inokulum 216 cm dapat menginfeksi inang setelah 9 bulan. Penelitian

Utomo et a/. (1994) menunjukkan bahwa inokulum berupa kayu karet (panjang

10 cm dan diameter 10 cm) dapat menginfeksi bibit kelapa sawit pada 8 bulan

setelah inokulasi. Teknik-teknik ini memiliki beberapa kelemahan yaitu

membutuhkan waktu yang lama dalam menyiapkan sumber inokulum dan sangat

susah untuk skala yang sangat besar. Hashim et a/. (1 991a) melaporkan bahwa

G. boninense dapat tumbuh baik pada padi, serabut mesokarp kelapa sawit, dan

serbuk gergaji, namun masih perlu diuji dalam uji patogenesitas untuk

membuktikan keefektifannya.

B. Uji in vivo agens biokontrol pada tubuh buah G. boninense

Setiap agens biokontrol mempunyai kemampuan yang berbeda dalam

mematikan tubuh buah G. boninense. Kemampuan tercepat dan tertinggi

merusak tubuh buah dicapai oleh agens biokontrol G. viflde .

I 11 Ill IV v VI

Dua Mingguan

-T. hamianurn

--I--G. viride - k ,T. viride

U Bacillus sp

-Kontrol 1 Gambar 18. Perkembangan kerusakan tubuh buah G. boninense oleh

beberapa agens biokontrol secara in vivo

93

Dalam waktu tiga bulan G. viride sudah rnampu rnengakibatkan

kerusakan tubuh buah sebesar 40%, sedangkan untuk T. harzianum dan T. viride

rnempunyai kernarnpuan yang sarna yaitu rnarnpu rnengakibatkan kerusakan

sebesar 10% selarna waktu 3 bulan. Pada awalnya kemarnpuan pengharnbatan

kedua agens biokontrol ini agak berbeda, T. harzianum marnpu rnenirnbulkan

kerusakan lebih cepat daripada T. viride, tetapi setelah itu tidak rnarnpu

rnenarnbah persen penghambatan. Bacillus sp. tidak rnarnpu rnenirnbulkan

kerusakan pada tubuh buah G. boninense, terbukti hingga 3 bulan setelah

infestasi belum ada gejala kerusakan pada tubuh buah G. boninense

Kemarnpuan dalarn rnenghancurkan tubuh buah atau struktur tahan lain ini

sangat penting, karena di alarn G. boninense rnernpunyai alat pertahanan diri

yang disebut pseudosklerosia (Darmono, 1998) yang kemarnpuan bertahannya

harnpir sarna dengan tubuh buah.

C. Efikasi agens biokontrol di rumah kaca

Perkernbangan penyakit BPB pada uji di rurnah kaca rnasih sangat

larnbat. Gejala rnuncul pertarna kali (periode inkubasi) adalah tujuh bulan

setelah inokulasi dengan kejadian penyakit 2%. Perkembangan selanjutnya juga

sangat larnbat, pada bulan ke-I2 kejadian penyakit baru 14% (Garnbar 19). Dari

uji patogenesitas tersebut dapat disirnpulkan bahwa inokulurn yang berukuran

160 crn pada substrat serbuk gergaji +PDA dapat rnenyebabkan infeksi setelah

7 bulan inokulasi. Persentase bibit yang terserang rnasih sangat rendah. Hal ini

disebabkan substrat dalarn serbuk gergaji sangat rnudah terdekomposisi di

dalam tanah rneskipun ha1 ini diantisipasi dengan rnernasukkan dalarn kantong

plastik. Dengan demikjan food base-nya akan cepat hilang dan tidak cukup

untuk menirnbulkan penyakit. Meskipun teknik ini rnerniliki kelebihan dalarn

kecepatan dan penyediaan sumber inokulum yang banyak, tetapi juga

mernpunyai kelemahan dalam kualitas sumber inokulum. Food base dari G.

boninense cepat hancur sehingga G. boninense akan kehilangan daya

patogenesitasnya. Dengan demikian teknik ini perlu dikembangkan untuk

memperlama daya tahan sumber inokulum dalarn tanah dengan dipadatkan.

Bulan Pengamatan

Garnbar 19. Perkembangan kejadian penyakit BPB dalam uji patogensitas di rumah kaca

Kejadian penyakit BPB ini pun tidak merata pada semua jenis persilangan

kelapa sawit. Persilangan yang mempunyai kejadian penyakit tertinggi yaitu D x

D yang diselfing yaitu sebesar 6,11 % (Gambar 20). Sedangkan yang lain

berkisar dari 1 ,I 1 - 2,7a0/o, bahkan untuk persilangan T x T sarnpai bulan ke-12

belum ada kejadian penyakit BPB. Hal ini bukan berarti T x T ini tahan terhadap

BPB, karena di kebun kelapa sawit di lapangan persilangan ini dapat terserang

G. boninense juga. Dalam waktu satu tahun belum cukup bagi patogen untuk

menginfeksi persilangan T x T. Persilangan D x D selfing mempunyai kejadian

penyakit yang paling tinggi, karena dengan selfing maka peluang akan

terakumulasinya sifat kerentanan tersebut menjadi besar, sedangkan persilangan

yang lain tidak terjadi akumulasi atau bahkan pengurangan sifat kerentanan.

Klasifikasi kelapa sawit berdasarkan ketebalan cangkang tidak dapat

dijadikan pegangan dalarn menentukan ketahanan terhadap penyakit BPB,

sebab antara ketebalan cangkang dan ketahanan terhadap BPB rnerupakan dua

ha1 yang berbeda, tidak ada kaitan satu dengan yang lainnya. Mungkin sekali

terjadi dalarn satu persilangan ada beberapa kategori ketahanan, rnisalnya ada

yang rentan dan ada pula yang tahan.

= a .-

0 E L T X T T X P D X T D X D D X P D X D

Selfing bukan selfing

Jenis persilangan kelapa sawit

Gambar 20. Kejadian penyakit BPB berdasarkan tipe persilangan kelapa sawit

Secara statistika kejadian penyakit pada persilangan D x D selfing

berbeda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT dibandingkan dengan hasil

persilangan yang bukan selfing (Tabel 12).

Tabel 12. Persentase kematian bibit kelapa sawit 12 bulan setelah inokulasi

Persilangan Kejadian Tinggi Jumlah Vigor Penyakit Tanarnan Pelepah

Keterangan: angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolorn yang sarna rnenunjukkan tidak beda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT

Peubah vigor tanaman juga menujukkan hasil yang serupa. persilangan D

x D selfing menunjukkan vigor yang paling buruk. Vigor yang buruk ini berkaitan

dengan kerentanan terhadap G. boninense. Sedangkan peubah tinggi tanaman

dan jumlah pelepah tidak dapat dijadikan sebagai peubah yang menentukan

kerentanan inang terhadap BPB. Setiap persilangan mempunyai karakteristik

internal tinggi tanaman dan jumlah pelepah yang tidak terkait dengan kejadian

penyakit BPB. Persilangan T x P dan D x P mempunyai ketinggian tanaman

yang lebih dibandingkan persilangan yang lain

Pemberian agens biokontrol T. harzianum dan G. viride secara nyata

mampu menghambat kejadian penyakit BPB (Tabel 13). Kejadian penyakit BPB

hanya muncul di perlakuan kontrol, perlakuan Bacillus sp.. dan perlakuan

campuran. Kernampuan Bacillus sp. dalam menekan infeksi G. boninense lebih

rendah daripada kedua cendawan agens biokontrol. Hal ini terbukti dari setiap

yang mengandung perlakuan Bacillus sp., inang dapat terserang patogen G.

boninense. Pada perlakuan campuran, Bacillus sp. mampu berkornpetisi dengan

T. harzianum dan G. viride tetapi, Bacillus sp. ini kurang efektif menghambat

infeksi G. boninense.

Tabel 13. Pengaruh pemberian agens biokontrol terhadap kejadian penyakit BPB dan vigor kelapa sawit

Perlakuan Kejadian Vigor Tanaman Penyakit (%)

Kontrot (tanpa antagonis & patogen) 18,06 a 2.67 b T. hanianum 0,OO c 3,00 a G. viride 0,OO c 3,00 a Bacillus sp 9.72 b 2,71 b T. harzianum + G. viride + Bacillus sp 8,33 bc 2,82 b

Keterangan: angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT

Tanarnan kelapa sawit yang diperlakukan dengan T. harzianum dan G.

viride rnernpunyai tinggi tanarnan yang lebih tinggi dan beda nyata daripada

perlakuan kontrol dan perlakuan Bacillus sp. serta perlakuan carnpuran. Vigor

kelapa sawit pada perlakuan pernberian T. harzianum dan G. viride juga lebih

baik dan berbeda nyata daripada kontrol rnaupun dengan perlakuan Bacillus sp.

serta perlakuan carnpuran.

lnokulurn G. boninense yang digunakan pada percobaan ini cukup

virulen. Pada keernpat peubah yang digunakan yaitu kejadian penyakit, tinggi

tanarnan, jurnlah pelepah, dan vigor tanarnan rnenunjukkan beda nyata dengan

perlakuan kontrol (tanpa inokulasi G. boninense).

Tabel 14. Pengaruh pernberian G. boninense pada bibit kelapa sawit

Perlakuan Kejadian Tinggi Jurnlah Vigor Penyakit (%) Tanarnan (crn) Pelepah Daun Tanarnan

Tanpa 0.00 a 91.12 a l l . 3 4 a 2.93 a G. boninense Dengan 14,4 b 87,48 b 10,83 b 2,75 b G. boninense

Keterangan: angka yang diikuti oieh huruf yang sarna pada kolom yang sarna rnenunjukkan tidak beda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT

Pernberian penginduksi kitin dari kulit udang tidak rnernberikan pengaruh

nyata terhadap keberhasilan agens biokontrol rnenekan penyakit BPB. Kejadian

penyakit BPB pada perlakuan yang diberi kitin dan yang tidak diberi kitin tidak

berbeda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT (Larnpiran 14). Jenis kitin akan

mernpengaruhi ekspresi kitinase. Pernberian kttin akan rneningkatkan

kemarnpuan rnikoparasitik T. hamatum terhadap Pythium spp. tetapi tidak terjadi

peningkatan kernarnpuan tersebut jika yang ditarnbahkan dinding sel R. solani ,

apalagi pada perlakuan yang tanpa kitin. Pernberian tanah subur tidak

rnernpengaruhi kernarnpuan T. hamatum, serta pernberian selulosa akan

menurunkan kernarnpuan dan survival agens biokontrol di dalarn tanah (Harrnan

et a/. 1981). Dalarn formulasi pellet alginat T. harzianum sangat dipengaruhi oleh

suhu, sedangkan dedak berpengaruh setelah T. hamianum berurnur 14 harj

(Knudsen & Li Bin 1990).

Trichoderma harzianum, G. viride, dan Bacillus sp. masih marnpu

bertahan selama enam bulan, rneskipun terjadi penurunan populasi (Garnbar 21).

\ L-- -- -- 0 I 11 Ill IV v VI

- 'G vircde

B a c i l l u s sp.

Bacillus sp.(campuran) - 'T hnrz>annm + G viride (campuran) T harzianum + G. "!ride (kontrol)

B a c i l l u s sp. (kontrol)

Bulan Pengamatan

Keterangan: populasi cendawan dalarn 10 dan populasi bakteri dalarn 10 '

Garnbar 21. Persistensi agens biokontrol pada perlakuan di rurnah kaca

Populasi T. harzianum rnenurun rneskipun rnasih relatif tinggi yaitu

sekitar 10 1 g tanah karena sumber karbon rnasih tersedia. Sedangkan populasi

G. viride rnenurun lebih tajarn apabila dibandingkan dengan T. hamianum, tetapi

populasi dalarn waktu enarn bulan rnasih cukup tinggi pula. Kedua fenornena ini

juga terjadi pada perlakuan ca mpuran. Dinamika populasi Bacillus sp. tidak

rnenurun selama enarn bulan. Populasi awal Bacillus sp. pun di dalarn tanah

sudah cukup tinggi pula yang dapat dilihat pada perlakuan kontrol dengan

populasi yang tinggi pula. Tingginya populasi agens biokontrol disebabkan oleh

kondisi lingkungan yang terkontrol seperti tanah selalu disiram selain karena

99

faktor surnber karbon. Sedangkan populasi T. harzianum dan G. viride pada

perlakuan kontrol sangat rendah. lmplikasi dari sifat agens biokontrol yang

menurun populasinya ini adalah pada strategi aplikasi di lapangan yang perlu

diulang minimal setiap 6 bulan kecuali jika pada lahan tersebut cukp tersedia

bahan organik.

Trichoderma dan Gliocladium adalah cendawan yang sudah banyak

digunakan sebagai agens biokontrol untuk sejumlah patogen tular tanah seperti

Botrytis cinerea, Pythium ultimum, Fomes annosus, Amillaria sp., Fusarium

oxysporum, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, dan sebagainya.

Keberhasilannya sangat bervariasi, ada yang sukses dan tidak sedikit pula yang

rnengalarni kegagalan. Berdasarkan hasil percobaan di atas kedua cendawan

agens biokontrol ini sangat rnenjanjikan dalam pengendalian penyakit busuk

pangkal batang yang disebabkan G. boninense.

Disamping kemampuan sebagai pengendali hayati, pemberian T.

harrianum dan G. viride dapat rnemacu pertumbuhan kelapa sawit, yang nampak

dari tinggi tanarnan, jurnlah pelepah, dan vigor tanarnan kelapa sawit yang

sangat nyata lebih baik dibandingkan kontrol. Pemacuan perturnbuhan tanarnan

akibat pernberian Trichoderma juga terjadi pada tanaman lain, seperti pada

pernberian T. harrianum dan T. koningii akan mempengaruhj secara langsung

pertumbuhan tanarnan tornat dan ternbakau. Berat kering tanarnan tomat dan

ternbakau masing-masing naik sebesar 213-275% dan 259-318% setelah

berurnur 8 rninggu dengan perlakuan T. harzianum dan T. koningii. Kuantitas

dan kualitas rnikroflora selain T. harzianum dan T. koningii pada semua

perlakuan terrnasuk kontrol tidak berbeda nyata. Ini berarti bahwa T. harzianum

dan T. koningii memacu perturnbuhan tanaman ternbakau dan tomat (Windharn

et al. 1986).

D. Efikasi agens biokontrol d i lapangan

Untuk mengetahui keefektifan agens biokontrol terhadap penyakit busuk

pangkal batang kelapa sawit membutuhkan waktu yang sangat panjang. Hal ini

disebabkan kelapa sawit yang merupakan tanaman tahunan serta penyakit

busuk pangkal batang kelapa sawit mempunyai waktu inkubasi yang lama.

Gejala penyakit baru muncul pada bulan ketujuh, itupun baru satu tanaman

perlakuan ( lo%), kemudian pada satu tahun setelah aplikasi bertarnbah dua

tanaman yang terserang G. boninense yaitu perlakuan kontrol dan perlakuan

carnpuran. Gejala awal ditandai dengan menguningnya sebagian besar daun

sehingga tanaman tampak pucat dan pelepah menjadi lebih tegak daripada

pelepah sehat. Pada pangkal batang dekat pelepah terlihat gejala kecoklat-

coklatan yang semakin lama akan cepat menyebar ke atas, akhirnya tanaman

akan mengalami nekrosis pada seluruh pelepah dan tanaman rnati (Gambar 22).

Selain itu juga terbentuk tubuh buah G. boninense pada pangkal batang dekat

akar.

Lambatnya perkembangan penyakit BPB mengakibatkan rnasih sulitnya

pengambilan kesimpulan. Tetapi setidak-tidaknya dapat ditarik kesimpulan

sementara bahwa dengan jarak dua meter dari surnber inokulum kelapa sawit

sakit mampu menginfeksi tanaman baru selama 7 bulan dan perlakuan Bacillus

sp. kurang mampu mengharnbat infeksi G. boninense. Perlakuan dengan

Bacillus sp. dan perlakuan lain yang menggunakan Bacillus sp. (carnpuran) dapat

terserang G. boninense. Bacillus sp. marnpu berkompetisi dengan T. hari-anum

dan G. viride tetapi kurang mampu menahan infeksi G. boninense. Perlakuan T.

hanianum dan G. viride secara tunggal mampu menahan infeksi G. boninense

sampai waktu 1 tahun. Ini dibuktikan dengan tidak ada kejadian penyakit yang

rnunwl pad8 kedua perlakuan ini dan parlakuan kontrd sudah mulai tenrereng G.

Keterangen: a = gejala awl penyakit pada kontrol (I2 bulan) b = gejala awel penyakit pala perlakuen cempuran (1 2 bulan) c = gejala lanjut penyakit (mati nek#iis) pada pertakuan Badlus sp (12 bulan) d = tubuh buah pada perlakuan BacNlus sp. (7 b u h )

Gambar 22. Gejala penyekit bmuk pangkal batang kelapa sawit pada berbagai perlakuan agens Kokontml

Kebahsilan pengendalian heyeti sangst dipengaruhi dah kemempran

bartehan ageas biokontrol di dalam tanah. Smpai dengan 6 bulen. Z

himianurn masih dapat bertahan meskipun lebih rendah daripada kepadaten

pada waktu d i i i W k a n . ( Gambar 23). Pada gamber 23. terNhal bahrns pada

bulan pertame populasi T. hanienum sangat memot yang d i i b k e n dah

waktu adaptasi cendawen ini. Setelah bamasi baradeptssi T. hanianum mampu

mempetbanyak din dengan substrat yang ada. Popubi akan semekin menurun

102

sampai bulan ke-6 yaitu semakin habisnya substrat bagi T. harzianum yang akan

terdegradasi di dalam tanah. Hal yang sama terjadi pada G. viride dan

perlakuan campuran T. harzianum + G. viride, meskipun tidak terjadi penurunan

drastis pada bulan pertama, tetapi selama 6 bulan populasinya akan semakin

menurun (Gamar 24 dan Gambar 25).

bulan bulan bulan bulan bulan bulan bulan

Bulan Pengamatan

Gambar 23. Perkembangan populasi T. harzianum pada aplikasi di lapangan

cj 0 1 2 3 4 5 6 bulan bulan bulan bulan bulan bulan bulan

Bulan Pengarnatan

Gambar 24. Perkembangan populasi G. viride pada aplikasi di lapangan

0 bulan I bulan 2 bulan 3 bulan 4 bulan 5 bulan 6 bulan

Bulan Pengamatan

Gambar 25. Perkembangan populasi perlakuan campuran T. harzianum dan G. viride pada aplikasi di lapangan

Pada perlakuan dengan Bacillus sp. menujukkan hasil yang sangat

berbeda yaitu populasi bakteri relatif stabil. Bahkan pada bulan kedua

mempunyai populasi lebih tinggi daripada populasi awal (Gambar 26), tetapi

hasilnya justru pada perlakuan ini dapat terserang penyakit BPB, yang berarti

keberadaan bakteri yang melirnpah kurang mampu rnenahan infeksi G.

boninense.

0 1 2 3 4 5 6 bulan bulan bulan bulan bulan bulan bulan

Butan Pengamatan

Gambar 26. Perkembangan populasi Bacillus sp. pada aplikasi di lapangan

Populasi agens biokontrol T. harzianum dan G. viride pada perlakuan

campuran rnampu bertahan selama 6 bulan meskipun populasinya turun. Hal ini

jelas terlihat apabila dibandingkan dengan populasi kontrol yang masih lebih

banyak (Gambar 27). Pengetahuan tentang menurunnya populasi T. harzianum

dan G. viride sangat penting dalam strategi aplikasi agens biokontrol ini. Dengan

demikian pada suatu saat akan diperlukan aplikasi ulang.

0 'l 2 3 4 5 6 bulan bulan bulan bulan bulan bulan bulan

Bulan Pengamatan

Gambar 27. Perkembangan populasi agens biokontrol indegeneus pada perlakuan kontrol

Agens biokontrol T. hamianurn, G. viride, dan Bacillus sp. tidak

mengalami migrasi secara aktif mengikuti perkembangan akar kelapa

sawit. Populasi agens biokontrol hanya terkonsentrasi pada tempat

aplikasi, baik yang ke arah sumber inokulurn maupun ke arah perlakuan

lain. Populasi agens biokontrol pada jarak 20 crn, 40 cm, 60 cm, 80 cm,

dan 100 cm sudah sangat menurun (Gambar 28. 29, 30, dan 31).

Agens biokontrol yang terisolasi merupakan agens biokontrol indegenues

(asli) setempat.

-Kedalaman 25 c m ke arah sumber inokulum

-Kedalaman 50 c m ke arah sumber inokulum

-Kedalaman 25 c m ke arah perlakuan .-:-

Gambar 28. Populasi T. hamianurn pada kedalaman dan jarak yang berbeda dari tempat aplikasi

c m c m c m c m c m cm

Jarak pengambilan sampel dari bibi t kelapa sawit

.- p , 700

Kedalaman 25 cm ke arah sumber inokulum Kedalaman 50 cm ke arah sumber inokulum

-Kedalaman 25 cm ke arah perlakuan lain

10 crn 20 cm 40 om 60 cm 80 om 100 -Kedalaman 50 cm ke

arah perlakuan lain Jarak pengambilan sampel dari bibit kelapa

sawlt

,dl,,

-Kedalaman 50 c m arah perlakuan

lain

Gambar 29. Populasi G. viride pada kedalaman dan jarak yang berbeda dari tempat aplikasi

Jarak pengambi lan sampe l d a r i b ib i t ke lapa sawit

ke arah s u m b e r inokulum

-Kedalaman 50 cm ke arah sumber inokulum

-Kedalaman 25 cm ke arah per lakuan la in

-Kedalaman 50 cm k e arah per lakuan

Gambar 30. Populasi Bacillus sp. pada kedalaman dan jarak yang berbeda dari tempat aplikasi

106

Kedalaman 25 cm

Kedalaman 50 cm ke arah sumber

-Kedalaman 25 cm ke arah perlakuan

10 20 40 60 80 100

Jarak pengambilan sampel dari ke arah perlakuan

bibit ke la~a sawit

Garnbar 31. Populasi campuran T. harzianum dan G. viride.pada kedalarnan dan jarak yang berbeda dari ternpat aplikasi

Hasil dari beberapa perlakuan di atas sangat berbeda dengan kontrol.

Populasi agens biokontrol dari tempat bibit di tanarn sarnpai jarak 100 crn adalah

relatif sarna atau tidak ada perbedaan yang rnencolok (Gambar 32 dan 33).

-Kedalaman 25 cm ke arah sumber

-Kedalarnan 50 cm ke arah sumber

-Kedalaman 25 cm ke arah perlakuan

10 20 40 60 80 I 00

Jarak pengambilan sampel dari ke arah perlakuan bibit kelapa sawit

Garnbar 32. Populasi campuran T. harzianum dan G. viride.pada kontrol dengan kedalarnan dan jarak yang berbeda dari ternpat aplikasi

107

-Kedalaman 25 crn ke arah sumber inokulum

-Kedalaman 50 cm ke arah sumber inokulurn

-Kedalaman 25 crn ke arah perlakuan

I 0 20 40 60 80 100

Jarak pengambilan sampel dari ke arah perlakuan bibit kelapa sawit

Gambar 33. Populasi Bacillus sp. pada perlakuan kontrol di kedalaman dan jarak yang berbeda dari tempat aplikasi

Agens biokontrol lebih senang hidup di daerah yang lebih dekat dengan

permukaan tanah. Populasi agens biokontrol yang terisolasi pada kedalaman 25

cm lebih banyak daripada kedalaman tanah 50 cm.

Tidak semua Trichoderma mampu rnengkolonisasi rhizosfer suatu

tanaman. lsolat Tnchoderma sp. tipe liar tidak marnpu mengkolonisasi rhizosfer

timun, lobak, tomat, kacang, dan jagung sampai kedalaman 8 cm selarna 8 hari

(Ahmad & Baker 1987), tetapi rnutan yang tahan benomil marnpu rnengkolonisasi

rhizosfer tersebut. Kolonisasi rnutan Trichoderma ini sangat dipengaruhi oleh

benomil, pH tanah. dan temperatur. Kolonisasi sangat ditentukan oleh

kedalaman tanah. Pada hampir semua tanaman, populasi Trichoderma akan

menurun sejalan dengan kedalaman tanah. Populasi pada kedalam 1 cm jauh

lebih tinggi apabila dibandingkan dengan populasi pada kedalaman 8 cm.

Pemberian miselium muda agens biokontrol lebih baik daripada konidia. Konidia

setelah diberikan ke dalarn tanah akan cepat sekali menurun kepadatan

populasinya dalam waktu 9 minggu. Konidia ini sangat sensitif terhadap

fungistasis. Konidia tidak akan berkecambah rneskipun sudah berada di dedak,

108

sebaliknya miseliurn rnuda akan segera mengkolonisasi dengan cepat substrat

yang ada yaitu dedak. Aktivitas biologi rnetabolisrne agens biokontrol rnenjadi

sangat penting untuk keberhasilan mengkolonisasi substrat. Kernampuan

bertahannya Trichoderma sampai 36 rninggu di dalam tanah disebabkan adanya

struktur tahan dari cendawan ini yang berupa klamidospora. Papavizas (1981)

rnenyatakan bahwa T. harzianum tidak berkernbang di rhizosfer buncis dan kapri

yang benihnya diaplikasi dengan konidia T. harzianum. Bertambahnya populasi

T. harzianum hanya disebabkan adanya sumber karbon berupa akar, kulit biji,

dan kotiledon yang rnengalami degradasi alarniah dan populasi ini masih selalu

di bawah yang diaplikasikan langsung dengan populasi yang tinggi. Oleh karena

itu salah satu strategi untuk rnenaikkan keberhasilan adalah dengan rnernbuat

mutan yang kompeten rhizosfer, salah satunya dengan fusi protoplas atau rnutasi

spontan. Hasil studi rnenunjukkan perbedaan bahwa tipe parental hanya rnampu

hidup pada kedalarnan 3 crn sedangkan yang tipe rnutan kompeten rhizosfer

mampu hidup pada kedalarnan 8 cm. Strain yang lain yaitu 1295-22 rnampu

mengkolonisasi pada kedalarnan 22 crn. lsolat ini selain marnpu bertahan

selarna 8 bulan juga mernpunyai efek mernacu perturnbuhan jagung manis

sebesar 66% (Bjorkrnan et a/. 1998). Tipe mutan lain yang dilaporkan

mernpunyai kemampuan lebih daripada tipe liar adalah T-203 yang rnampu

melakukan penetrasi ke akar dan hidup di dalarn akar tanaman seperti rnikoriza ,

selain mernacu perturnbuhan tanarnan (Kleifeld & Chet 1992).

Untuk meningkatkan populasi agens biokontrol dalarn tanah perlu

distimulasi. Kepadatan populasi T. vin.de dan T. harzianurn dalarn tanah akan

naik sebesar 10 dan 10 pada 3 minggu pertama jika diberi stimulus berupa

rniseliurn preparasi yang terdiri atas dedak-pasir-dan air dengan perbandingan

1:1:2 (w/w/v) diinfestasikan dengan konidia kernudian diinkubasikan 1-3 hari.

Pada umur 8 hari preparasi seperti ini kemampuan stimulasi menjadi berkurang

dan pada umur 40 hari sudah tidak efektif lagi. Populasi T. harzianum akan

menurun setelah 18-36 minggu dan rnenjadi stabil pada populasi 10 - 10 " cful

g tanah. Pemberian miselium preparasi dalam jumlah sedikit 0,01 % dedak dan

10 ' - 10 propagul akan meningkatkan populasi rnenjadi 10 - 10 " cfu I g

tanah. Proliferasi terjadi di dalam tanah jika terjadi kontak yang kuat antara hifa

dengan dedak. Pemberian miselium preparasi ini akan meningkatkan aktivitas

metabolisme CO, agens biokontrol untuk mendegradasi bahan organik sebagai

bahan makanannya (Lewis & Papavizas 1984).

Kemampuan hidup Trichoderma juga dipengaruhi rnikroorganisme

kornpetitor lain yang hidup pada relung ekologis yang sarna. T. harnaturn

terhambat dan tidak mampu rnenekan penyakit damping-off Pythium kacang

setelah ditambahkan bakteri Pseudornonas. Trichodenna spp. dan bakteri

Pseudomonas refatif tidak kompatibel (Hubbard eta/ . 1983 & Kwok et a/. 1987).

Penyebab rnenurunnya Trichoderrna dan tidak mampu mengadakan proliferasi

disebabkan berkurangnya sumber nutrisi, keberadaan bahan toksik akibat

eksudat akar dan adanya kornpetitor yang berupa mikroorganisme lain.

Kesirnpulan

Dari percobaan efikasi agens biokontrol disimpulkan:

1. Pemberian kitin asal kulit udang tidak meningkatkan kemampuan

antagonisme agens biokontrol T. harzianum dan G. viride terhadap G.

boninense

2. Hingga satu tahun setelah ~nokulasi patogen, Trichoderma harzianum

dan G. viride mampu mengharnbat infeksi G. boninense (loo%),

sedangkan Bacillus sp. mempunyai kemampuan yang lebih rendah

(90.28%) dalam menghambat infeksi G. boninense.

3. Serbuk gergaji + PDA merupakan substrat yang paling baik untuk

produksi massal sumber inokulum G. boninense.

4. Waktu inkubasi infeksi G. boninense di lapangan secara alamiah pada

jarak 2 meter adalah 7 bulan

5. Sampai dengan waktu 6 bulan Trichodenna harzianum dan Gliocladium

viride masih mampu bertahan di dalam tanah dengan media dedak halus

sebagai sumber karbon

6. Trichoderma harzianum , Gliocladium vjrjde, dan Bacillus sp. tidak secara

aktif bermigrasi.

7 . Trichoderma hanianum dan Gliocladium viride mampu mencegah

penyakit busuk pangkal batang pada dosis 250 dan 500 g l lubang,

sedangkan Bacillus sp. kurang mampu mencegah infeksi G. boninense

sampai dengan umur satu tahun bibit kelapa sawit di lapangan yang

terinfestasi G. boninense.