Penentuan Kadar Curcuminoid Total

Tujuan : Menetapkan kadar curcuminoid total dalam ekstrak etanol/air Curcuma domestica atau Curcuma XanthorrhizaAlat

1. Cawan timbang2. Spatel atau sudip

3. Batang pengaduk

4. Timbangan analitik

5. Pipet volume 3,0 ml; 2,0 ml; 1,0 ml

6. Labu ukur 5,0 ml (8)7. Microwave

8. Milipore dan filter holder atau corong dan kertas saring

9. Micropipet

10. Camag TLC Autosampler Linomat 5

11. Plat Silica gel NP 60 F254 Merck

12. Automatic development chamber 2 (ADC 2)

13. Scanner 3

14. Visualizer

Bahan

1. Ekstrak ethanol 96% kunyit/temulawak

2. Ekstrak ethanol 70% kunyit/temulawak

3. Ekstrak ethanol 50% kunyit/temulawak

4. Ekstrak air kunyit/temulawak

5. Methanol

6. Air

7. Etil asetat

Prosedur KerjaA. Menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan

B. Menimbang Ekstrak

1. Bersihkan dan keringkan cawan timbang. Bersihkan timbangan dengan kuas. Nyalakan timbangan, pastikan kaca penutup timbangan dalam keadaan tertutup2. Tunggu hingga angka yang ditunjukkan dalam timbangan menunjukkan angka yang stabil. Tekan tare3. Pastikan angka dalam layar menunjukkan angka 0,0000 g

4. Buka kaca penutup, masukkan cawan timbangan yang telah bersih dan kering dengan menggunakan pinset, tutup kaca penutup timbangan5. Tunggu angka dalam layar menunjukkan angka yang stabil. Kemudian catat angka yang tertera, angka itu merupakan berat cawan timbang kosong, misalkan X gram

6. Buka kaca penutup timbangan, ambil cawan dengan pinset, turunkan dari timbangan. Masukkan ekstrak kira-kira 25 mg ke dalam cawan timbang dengan spatel logam secara hati-hati untuk ekstrak etanol 96%, 70%, 50% kunyit/temulawak. Untuk ekstrak air kunyit/temulawak, masukkan ekstrak kira kira 20 mg.7. Letakkan kembali cawan timbang yang telah terisi ekstrak ke dalam timbangan dengan pinset. Tutup kaca penutup. Timbang ekstrak sebanyak 25 mg + 0,025 (24,975 25,025 mg) untuk ekstrak etanol 96%, 70%, 50% kunyit/temulawak. Untuk ekstrak air kunyit/temulawak, timbang ekstrak sebanyak 20 mg 0,020 (19,980 20,020 mg).8. Tunggu hingga layar menunjukkan angka yang stabil, catat angka yang tertera misal Y gram9. Berat ekstrak yang ditimbang adalah (Y-X) gram10. Buka kaca penutup, ambil cawan timbang dengan pinset.11. Siapkan methanol dalam Beaker glass 50 mL.12. Ukur methanol 3,0 ml dengan pipet volume 3,0 ml. Tambahkan ke cawan timbang yang berisi ekstrak etanol 96% dan 70% kunyit/temulawak sebagian, tuang ke labu ukur dengan hati-hati. Tambahkan methanol sisa ke cawan lalu tuang dengan hati-hati ke labu ukur. Hal serupa juga dilakukan pada ekstrak etanol 70% kunyit / temulawak. Untuk ekstrak etanol 50% dan ekstrak air kunyit/temulawak, ukur air 2,0 ml dengan pipet volume 2,0 ml, tambahkan ke cawan timbang yang berisi ekstrak etanol 50% atau ekstrak air kunyit/temulawak, aduk lalu tuang ke labu ukur dengan hati-hati. Tambahkan methanol 1,0 ml yang telah diukur dengan pipet ukur 1,0 ml ke cawan timbang untuk membilas sisa ekstrak yang mungkin tertinggal. Hal serupa juga dilakukan untuk ekstrak air kunyit / temulawak.13. Sampel yang sudah di dalam labu ukur diekstraksi dengan menggunakan microwave. Masukkan labu ukur yang berisi sampel ke dalam microwave. Putar power ke arah 10%, atur waktu 5 detik. Lakukan ekstraksi selama 5 detik sebanyak 4 kali.14. Sampel yang telah diekstraksi dengan microwave, ditambahkan dengan methanol ad 5,0 ml. Kocok labu ukur untuk menghomogenkan.

C. Pengenceran Sampel

1. Setelah itu, sampel disaring dengan filter holder, hasil saringan dimasukkan ke dalam vial.

2. Untuk ekstrak etanol 96% dan 70% dilakukan pengenceran 5 kali. Ambil ekstrak dari vial sebanyak 1,0 ml dengan pipet volume 1,0 ml, masukkan ke dalam labu ukur 5,0 ml. Tambahkan metanol ad tepat tanda.

3. Ekstrak etanol 50% kunyit / temulawak dan ekstrak air kunyit / temulawak tidak dilakukan pengenceran.D. Pembuatan Larutan Standart

1. Bersihkan dan keringkan cawan timbang. Bersihkan timbangan dengan kuas. Nyalakan timbangan, pastikan kaca penutup timbangan dalam keadaan tertutup

2. Tunggu hingga angka yang ditunjukkan dalam timbangan menunjukkan angka yang stabil. Tekan tare

3. Pastikan angka dalam layar menunjukkan angka 0,0000 g

4. Buka kaca penutup, masukkan cawan timbangan yang telah bersih dan kering dengan menggunakan pinset, tutup kaca penutup timbangan

5. Tunggu angka dalam layar menunjukkan angka yang stabil. Kemudian catat angka yang tertera, angka itu merupakan berat cawan timbang kosong, misalkan X gram

6. Buka kaca penutup timbangan, ambil cawan dengan pinset, turunkan dari timbangan. Masukkan standart curcuminoid kira-kira 25 mg dengan spatel logam secara hati-hati.

7. Letakkan kembali cawan timbang dengan standart curcuminoid itu ke dalam timbangan dengan pinset. Tutup kaca penutup. Timbang standart sebanyak 25 mg + 0,025 (24,975 25,025 mg).

8. Tunggu hingga layar menunjukkan angka yang stabil, catat angka yang tertera misal Y gram

9. Berat ekstrak yang ditimbang adalah (Y-X) gram10. Buka kaca penutup, ambil cawan timbang dengan pinset.

11. Siapkan methanol dalam Beaker glass 50 mL.12. Tambahkan kira-kira 3 ml methanol ke dalam cawan timbang, lalu tuang ke labu ukur 5,0 ml. Tambahkan methanol ad tepat tanda. Kocok dengan membolak-balikkan labu ukur untuk menghomogenkan.13. Dilakukan pengenceran hingga 30 ppm dengan cara memipet 30 l larutan standar curcuminoid dengan micropipet, masukkan ke dalam labu ukur 5,0 ml. Tambahkan metanol ke dalam labu ukur ad tepat tanda. Kocok dengan membolak-balikkan labu ukur untuk menghomogenkan. Tuangkan ke dalam vial.E. Penotolan Sampel dan StandarSampel dan standar ditotolkan pada plate silica gel (NP, 60 F254, Merck) berukuran 20 cm menggunakan Camag TLC Automatic Sampler Linomat 5 dengan kondisi :Sampel Ekstrak etanol 96%

1,0 lTrack 1,2,3

Sampel Ekstrak etanol 70%3,0 lTrack 4,5,6

Sampel Ekstrak etanol 50%3,0 lTrack 12,13,14

Sampel Esktrak air50,0 lTrack 15,16,17

Standar Curcuminoid 2,0 lTrack 7

Standar Curcuminoid 2,5 lTrack 8

Standar Curcuminoid3,0 lTrack 9

Standar Curcuminoid3,5 lTrack 10

Standar Curcuminoid4,0 lTrack 11

Band Length

: 7 mmBatas Kanan Kiri: 1 cm

Batas Atas Bawah: 1 cm

Jarak Antar Totolan: 2 mm

E. Proses Eluasi : 1. Pembuatan Eluen

a) Perbandingan Etil Asetat : Metanol : Air = 35 : 0,8 : 0,5. Ukur Etil Asetat 70 ml dengan gelas ukur, ukur Metanol 1,6 ml dengan gelas ukur, dan ukur air 1 ml dengan gelas ukur (isi gelas ukur dengan air sebanyak 5 ml, kemudian ambil 1 ml dengan pipet tetes). b) Masukkan ketiga bahan tersebut ke dalam labu Erlenmeyer tertutup. Goyangkan sampai tercampur homogen. 2. Proses penjenuhan chambera) Masukkan kertas saring ke dalam chamber development hingga mengelilingi dinding chamber.Sisakan sedikit celah untuk mengamati proses eluasi.b) Tuang eluen ke chamber development, jangan melebihi batas bawah penotolan (untuk memastikan agar eluen tidak melebihi batas bawah penotolan, letakkan plate di samping chamber development untuk melihat batasnya, kemudian tuang eluen ke dalam chamber development). Tutup rapat chamber development.c) Biarkan chamber development jenuh (chamber development jenuh ditandai dengan terbasahinya seluruh bagian kertas saring). 3. Setelah chamber jenuh, masukkan plate yang telah ditotoli sampel dan standar, kemudian tutup chamber dan proses eluasi dimulai. Hentikan proses eluasi ketika eluen telah mencapai batas atas plate silica gel.

4. Keluarkan plate dari chamber development kemudian keringkan di lemari asam.D. Analisis dengan Visualizer.

Plate di scan menggunakan Camag Visualizer dengan lampu UV pada panjang gelombang 366 nm dan 254 nm. Akan diperoleh % luas area untuk menghitung kadar curcuminoid total.

E. Analisis dengan Scanner 3.

Plate di scan menggunakan scanner 3 untuk mendapatkan profil spectra pada lambda 200 500 nm, tentukan lambda max. setelah diperoleh lambda max, plate di scan pada lambda max untuk menentukan peak purity dan peak identity.F. Presisi

Dihitung kadar sampel dari hasil data luas area dari sanning . Luas area pada noda dimasukkan ke dalam persamaan regresi dari larutan standart. Lalu diukur presisinya dengan menghitung RSD dengan rumus :

RSD = SD/rata-rata x 100%

Standart presisi menurut USP untuk penentuan kadar (kategori 1) adalah < 2%.

G. AkurasiKeterangan:

Warna MERAH = hasil editan Widyaphiana (Mohon koreksinya)

Warna UNGU = berdasarkan diskusi tadi, masih belum fix karena kita tidak tahu sebenarnya harus seperti apa. (Mari dipikirkan bersama, tolong saran dan idenya ya!)