ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM SELULASEOleh

MasfufatunDosen Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya

ABSTRAKCarboxy Methyl Cellulose (CMC) merupakan turunan selulosa yang mudah larut dalam air.

Oleh karena itu CMC mudah dihidrolisis menjadi gula-gula sederhana oleh enzim selulase. Bekicotadalah hewan lunak, mudah berkembang biak dan memanfaatkan selulosa sebagai sumber energinyaserta kandungan proteinnya cukup tinggi. Oleh karena itu bekicot dapat dijadikan sebagai sumberenzim selulase untuk menghidrolisis Carboxy Methyl Cellulose (CMC)

Peneltian ini bertujuan untuk isolasi enzim selulase dari bekicot, Achatina fulica danmenentukan karakterisasinya. Kadar Glukosa yang dihasilkan dari aktivitas enzim selulosa dianalisadengan menggunakan metode Semogy-Nelson,. Dari penelitian ini ternyata enzim selulase yangdiisolasi dari hepatopankreas bekicot, Achatina fulica memiliki aktivitas spesifik sebesar 2,85 U/mgprotein dan beraktivitas optimum pada suhu 50oCdan pH 5,16 serta memiliki memiliki parameterkinetik harga Vm sebesar 0,23mg/mL per menit dan Km sebesar 0,53 mg/mL. Bagian enzimselulosa mulai jenuh pada konsentrasi 4%.Kata kunci : Carboxy Methyl Cellulose, hidrolisis, selulase

ISOLATION AND CHARACTERIZATION cellulaseBy

MasfufatunLecturer Faculty of Medicine, University of Wijaya Kusuma Surabaya

ABSTRACTCarboxy Methyl Cellulose (CMC) is a derivative of cellulose soluble in water. Therefore, CMC easilyhydrolyzed into simple sugars by the enzyme cellulase. Snails are animals soft, easy to breed andutilize cellulose as a source of energy and protein content is high enough. Therefore, snails can beused as a source of cellulase enzyme to hydrolyze carboxy Methyl Cellulose (CMC)This research aims to isolate cellulase enzyme from the snail, Achatina fulica and determine itscharacterization. Glucose levels produced from cellulose enzyme activity were analyzed by using themethod Semogy-Nelson. From this research it turns out cellulase enzyme isolated fromhepatopankreas snail, Achatina fulica has a specific activity of 2.85 U / mg protein and activity50oCdan temperature optimum at pH 5.16 and have had kinetic parameters Vm price of 0.23 mg / mLper minute and Km is 0.53 mg / mL. Part enzyme cellulose getting fed at a concentration of 4%.Keywords: carboxy Methyl Cellulose, hydrolysis, cellulase

PendahuluanSelulosa merupakan biomolekul

yang paling banyak ditemukan di alamdan merupakan unsur utama penyusunkerangka tumbuhan. Diperkirakansekitar 1011 ton selulosa dibiosintesistiap tahun. Daun kering mengandung 10-20%selulosa; kayu 50% dan kapas90%(Kolman, 2001). Selama ini limbahpertanian maupun kehutanan, sepertijerami gandum maupun padi, tongkoljagung, bagas, kulit kacang dan lain-lainbelum dimanfaatkan secara optimal,padahal limbah-limbah tersebutmerupakan sumber energi yangpotensial. Kandungan selulosanya yangtinggi sehingga dapat dikonversi menjadigula-gula sederhana (gula pereduksi) dan

selanjutnya difermentasi menjadi etanololeh khamir atau bakteri.

Carboxy Methyl Cellulose(CMC) merupakan turunan selulosa,kopolimer dua unit β-D glukosa dan β-D-glukopiranosa 2-O-(karboksilmetil)-garam monosodium yang terikat melaluiikatan β-1,4-glikosidik. CMC memilikikelarutan lebih tinggi daripada selulosa,sehingga mudah dihidrolisis. HidrolisisCMC menjadi gula-gula sederhanadapat dilakukan dengan menggunakankatalis asam, enzim maupun mikrobaselulolitik. Beberapa penelitianmelaporkan bahwa proses hidrolisissecara enzimatis lebih menguntungkandaripada menggunakan asam. Selaintidak menimbulkan masalah korosi danberlangsung pada kondisi mild (pH 4,8

dan suhu 500C), ternyata proseshidrolisais secara enzimatismenghasilkan yield lebih tinggidaripada hidrolisis yang dikatalisis asam(Duff and Murray, 1996). Enzimselulase diproduksi oleh mikrobaselulolitik dari golongan bakteri danjamur. Permasalahan yang seringmuncul dalam penelitian adalah kurangtersedianya enzim selulase yang murahdan efisien. Salah satu alternatif untukmengatasi hal ini adalah denganmemanfaatkan bekicot sebagai sumberenzim selulase. Selama ini bekicotbanyak digunakan sebagai pakan ternakkarena kandungan proteinnya yangcukup tinggi (75 gram/100gram dagingbekicot). Silaban, R., 1999 menemukanmikroba selulolitik, Pseudomonasalcaligenes PaAf-18 di dalam tubuhbekicot. Mikroba selulolitik tersebutmemproduksi enzim selulase untukmencerna makanan (selulosa) dansebagian disimpan dalamhepatopankreas yang salurannyabermuara ke sistem pencernaan. Isolasienzim selulase dari hepatopankreasbekicot lebih mudah dilakukan daripadaisolasi dari bakteri atau jamur, yaknimelalui proses dekstruksi sel,homogenasi dan sentrifugasi.

Dalam melakukan kerjakatalitiknya, aktivitas enzim dipengaruhioleh beberapa faktor yaitu konsentrasisubstrat, pH, suhu, konsentrasi enzimdan waktu reaksi (Price, 1979). Diindustri pengungkapan sifat dankarakteristik suatu produk enzim sangatdiperlukan untuk efisiensi prosesproduksi dan lebih jauh akandifungsikan untuk memperoleh produkakhir yang berkualitas. Oleh karena itupenelitian ini bertujuan untuk isolasienzim selulase dari bekicot, Achatinafulica dan menentukan karakteristiknyayang meliputi kondisi suhu, pH,konsentrasi substrat dan parameterkinetik. Dari penelitian diharapkanglukosa sebagai hasil hidrolisis dapatdimanfaatkan sebagai bahan bakupembuatan etanol.

Bahan dan MetodeBahan-bahan utama yang

diperlukan dalam penelitian ini adalahbekicot, Achatina fulica sebagai sumberenzim , diperoleh dari perladangan

mayarakat Sidoarjo, dipilih yang besardan cangkangnya masih utuh. CarboxyMethyl Cellulose (CMC) sebagaisubstrat dalam proses hidrolisisdiperoleh dari laboratoriumMikrobiologi Jurusan Biologi FMIPAUniversitas Airlangga Surabaya.A. Isolasi Enzim Selulase dariHepatopankreas Bekicot, Achatinafulica

Sebanyak 35 gram hepatopankreasbekicot dihomogenisasi dengan 500ml1% NaCl dingin (pH=7) dalamwaringblender selama 3 menit pada suhu1-4oC. Homogenat yang diperolehkemudian disaring melalui kain padasuhu 2-4oC dan filtratnya disentrifugeselama 80 menit pada suhu 2oC dan 4200rpm dalam International RefrigeratedCentrifuge dengan rotor no. 840.Supernatan yang diperoleh merupakanpreparat enzim selulase selanjutnyadilakukan uji aktivitas dan kandunganproteinnya. (Soedigdo, dkk., 1980)

B. karakterisasi enzim selulase Menentukan kondisi optimum

aktivitas enzim selulasepH Optimum

pH optimum ditentukan dengancara sebagai berikut: disediakanbeberapa larutan CMC 2% dalam buferasetat dengan pH berbeda 4,5; 5,0; 5,16,5,25 dan 5,5. Masing-masing larutandiambil 40 ml dan dimasukkan ke dalamlabu erlenmeyer 100 ml yang berbeda.Ke dalam masing-masing labuerlenmeyer ditambahkan 10 ml larutanenzim kemudian diinkubasi pada suhuoptimum selama 1 jam dengankecepatan 160 rpm.. Reaksi dihentikandengan pemanasan selama 10 menit.Kadar Gula reduksi dalam hidrolisatselulosa ditentukan denganmenggunakan metode Semgy-Nelson.Suhu Optimum

Suhu optimum dilakukandengan cara sebagai berikut: Ke dalam 6buah labu erlenmeyer 100mldimasukkan masing-masing 40 ml CMC2% dalam larutan buffer asetat pH 5 danditambahkan 10 ml enzim selulase.Campuran dalam labu diinkubasi padasuhu berbeda (30oC, 40oC, 50oC dan60oC) dan kecepatan 160 rpm selama60 menit.. reaksi dihentikan denganpemanasan selama 10 menit. Kadar Gula

reduksi dalam hidrolisat CarbokxyMethyl Cellulose (CMC) ditentukandengan menggunakan metode Semgy-Nelson.Konsentrasi Susbstrat optimum

Konsentrasi substrat optimumditentukan dengan cara sebagai berikut:disediakan larutan CMC dalam larutanbuffer asetat pH 5 dengan konsentrasiyang berbeda dan dimasukkan ke dalamlabu erlenmeyer 100ml masing-masingsebanyak 40ml. Selanjutnyaditambahkan 10ml larutan enzim.Campuran diinkubasi pada suhu 500Cselama 1 jam. Sesudah reaksi enzimatikdihentikan dengan pemanasan,ditentukan kadar gula reduksinya denganmenggunakan metode Somogy-Nelson.

Menentukan Parameter KinetikReaksi Enzimatis

Parameter kinetik reaksienzimatis adalah laju reaksi maksimum(Vm ) dan tetapan Michaelis-Menten(Km), ditentukan dengan menggunakanpersamaan Michelis Menten ataupersamaan Lineweaver Burk. PersamaanMichelis Menten diperoleh denganmembuat kurva hubungan [S] dengan V,sedangkan persamaan Lineweaver Burkdiperoleh dengan membuat kurvahubungan 1/[S] dengan 1/V. Data lajureaksi (V) diperoleh dari percobaanoptimasi substrat.

C. Metode AnalisisUji aktivitas Selulase

Pada tabung reaksi betutupdiisi dengan 1,0ml larutan buffer asetatpH 4,8 dan 0,5ml larutan enzim dalambuffer asetat. Selanjutnya campurantersebut dipanaskan. Pada saat suhumencapai 50OC, ke dalam tabuing

tersebut dimasukkan kertas saringberukuran 1,0 x 6,0 cm ( 50 mg) laludiaduk (NB. Semua bagian kertas saringWhatman No 1 harus tercelup dalamcairan). Setelah 1 jam reaksi dihentikandengan pemanasan dalam air mendidihselama 10 menit dan selnjutnyadilakukan uji gula reduksi pada filtratntadengan menggunakan metode Somogy-Nelson. (Ghose,1987)Analisa Kadar Gula Reduksi

Pengambilan sampel dilakukandengan menggunakan pipet mikrosebanyak 200 l, dimasukkan secarakuantitatif ke dalam tabung ependorf.Kemudian disentrifugasi kecepatantinggi selama 5 menit. Dipisahkan antararesidu dan filtratnya. Filtrat ditentukankadar glukosanya dengan metodeSemogyi-Nelson.Absorbansi sampel (y)diekstrapolasikan pada persamaanregresi linier yang telah didapat, darikurva standar glukosa, sehingga setiapkadar glukosa dapat ditentukan..

Uji Kandungan Protein pada EnzimSelulase

Enzim selulase yang diisolasidari hepatopankreas bekicot ditrentukankadar proteinnya dengan cara sebagaiberikut: ke dalam tabung reaksi yangberisi 7 mL ekstrak kasar enzimditambahkan 3 ml reagen Bradford, laludiinkubasi selama 5 menit. Setelahwaktu inkubasi, absorbansi larutanenzim diukur pada panjang gelombangmaksimum 595 nm. Absorbansi yangdiperoleh diplotkan pada persamaanregresi linier kurva standar protein

D. Diagram Alir Percobaan

HASIL DAN PEMBAHASANA. Eksatraksi Enzim Selulase dari

Hepatopankreas Bekicot, Achatinafulica

Bekicot (Achatina fulica)memiliki ciri khas warna garis-garispada tempurung/cangkangnya tidakbegitu mencolok sebagaimana gambar4.1. Hewan ini menggantungkanhidupnya pada selulosa sebagai sumberenerginya. Oleh karena itu banyakditemukan mikroba selulitik di dalamsistem pencernaanya. Enzim selulasemerupakan enzim ekstrasellular yangdiproduksi di dalam sel mikrobaselulolitik dan kemudian dikeluarkandari sel masuk ke dalam sistempencernaan untuk mencerna selulase.Dengan demikian enzim selulasediisolasi dari hepatopankreas bekicot(Achatina fulica) yang bermuara padasistem pencernaan.

Sel hewan tidak memilikidinding sel sehingga proses isolasienzim berlangsung lebih mudah. Prosesisolasi enzim selulase darihepatopankreas melalui tahapandekstruksi sel yaitu pelepasan enzim darimatriks sel. Enzim selulase dipisahkandari matriks sel dengan cara merusakmembran sel melalui pengaturan tekananosmosa larutan diluar sel denganmenggunakan larutan NaCl danhomogenisasi dengan menggunakanwaringblender

(Palmer, 1995). Homogenatyang diperoleh dari proses dekstruksidisaring dan disentrifus dengan tujuanuntuk memisahkan enzim selulase darimatriks sel yang lain . Supernatan yangdiperoleh merupakan ekstrak kasarenzim selulase, berwarna coklatmuda(gambar 2) dan sebanyak 470 mL

dihomogenisasi dalam waringblender padasuhu 1 – 4oC selama 3 menit

35 g Hepatopankreas Bekicot 500 mL 1% NaCl dingin (pH=7)

Campuran

dicampur

homogenat

disentrifus dingin pada suhu 2°C, 4200 rpmselama 80 menit

Supernatanekstrak selulase

KarakterisasiUjiaktivitas

Residu

Residu

disaring

suspensi

dari 500 mL homogenat (35 gramhepatopankreas) dan pH 5,2. Selanjutnyaekstrak kasar tersebut diuji kadarproteinnya dengan menggunakan metodeBradford. Metode ini didasarkan pada

reaksi antara reagen Bradford denganprotein sehingga terbentuk senyawakompleks berwarna biru menurut reaksiberikut:

H+ (H3PO4)Coomassie Blue + Protein Kompleks berwarna biru

Larutan kompleks biru ini diukurabsorbansinya dengan menggunakanspektrofotometer pada panjanggelombang 595 nm. Semakin tinggiAbsorbansi yang terukur maka semakintinggi kadar proteinnya .Kandunganprotein dalam ekstrak kasar enzimselulase sebesar 1,72 mg per mL ekstrakenzim selulase. Kandungan protein inijauh lebih rendah dibandingkan hasilpenelitian yang dilaporkan Saryono(1991), bahwa enzim selulase yang

diekstrak dari bekicot (Achatina fulica)memiliki kandungan protein sebesar 4,4mg/mL ekstrak. Hal ini kemungkinankarena ekstrak enzim yang dihasilkanpada penelitian ini terlalu encer(gambar.2) dan tidak dilakukan prosespemekatan sebagaimana yang telahdilakukan Saryono (1991). Pemekatanekstrak enzim dilakukan melalui prosesliofilisasi dengan tujuan untukmengurangi pelarut pada kondisi suhu -87oC dan tekanan 1,3 bar.

Gambar 1. Bekicot, Achatina fulica Gambar 2. Ekstrak Kasar EnzimSelulase

Keberhasilan isolasi enzimselulase ditentukan melalui uji aktivitasenzim dengan menggunakan substratkertas saring whatman no 1. Aktivitasyang terukur merupakan aktivitasselulosa total (FP-ase). Kadar glukosasebagai hasil aktivitas enzim selulaseditentukan dengan metode Somogyi-Nelson. Metode ini didasarkan padareaksi reduksi tembaga (II) menjaditembaga (I) dalam larutan yangmengandung K-Na tartrat, yangkemudian oleh adanya reagenarsenomolibdat hasil ini membentuksenyawa kompleks berwarna biru.Larutan kompleks biru ini diukurabsorbansinya dengan menggunakanspektrofotometer pada panjanggelombang 540 nm. Ekstrak enzimselulase dari bekicot memiliki aktivitasselulase total (Filter Paper Ase) sebesar0,020 mol glukosa /mL substrat permenit atau 0,02 Unit dan aktivitasspesifik sebesar 0,023 Unit/mg protein.

1 Unit Aktivitas : banyaknyaenzim yang dapat menghasilkan 1 mol

glukosa per mililiter substrat tiap menitpada kondisi percobaan.

Hasil Aktivitas enzim selulaseini berbeda dengan hasil penelitian yangtelah dilaporkan Saryono (1991),bahwaaktivitas enzim selulase terhadapselulase ampas nanas mencapai 3,4mg/mL per menit dan aktivitas spesifiksebesar 0,7727 Unit/mg protein. Hal initerjadi karena Saryono (1991)melakukan tahap pemurnian terhadapekstrak enzim selulase setelah tahapliofilisasi. Pemurnian dilakukan melaluitahap fraksinasi dan dialisis dengantujuan untuk menghilangkan semuakomponen non protein yang masihtersisa dalam larutan.

Oleh karena itu perlu dilakukantahap liofilisasi dan pemurnian terlebihdahulu terhadap ekstrak kasar enzimselulase sebelum melakukan proseshidrolisis selulosa secara enzimatis.

B. Karakterisasi Enzim Selulase Penentuan Kondisi Optimum

Aktivitas Enzim Selulase

Aktivitas enzim dipengaruhioleh beberapa faktor, antara lain pH,temperatur dan konsentrasi substrat.Untuk mengetahui aktivitas optimum,maka dilakukan pengukuran aktivitasdengan kondisi yang bervariasi.pH Optimum

Enzim memiliki pH optimumyang karakteristik, yaitu pH yang dapatmenghasilkan aktivitas maksimal dalammengkatalisis suatu reaksi. PerubahanpH berpengaruh terhadap aktivitas enzimmelalui pengubahan struktur ataumuatan residu asam amino yangberfungsi dalam pengikatan substrat

pH yang bervariasi juga dapatmenyebabkan perubahan konformasienzim. Hal ini terjadi karena gugusbermuatan (-NH3

+ atau –COO-) yangjauh dari daerah terikatnya substrat, yangmungkin diperlukan untukmempertahankan struktur tersier, akanmengalami perubahan muatan pada pHyang berbeda. Hal ini akanmenyebabkan terganggunya ikatan ionikdan terputusnya folding maksimumenzim sehingga konformasi enzimberubah. Perubahan konformasi enzimakan menyebabkan aktivitas enzimmenjadi menurun.

Gambar 3. menunjukkan bahwaaktivitas optimum ekstrak kasar enzimselulase berlangsung pada pH optimum,yaitu pH 5,2 dengan aktivitas sebesar0,053 Unit dan aktivitas spesifik 0,003U/mg dengan kadar glukosa sebesar 0,57mg/mL susbtrat (28 mg glukosa/gCMC). pH optimum ini sesuai denganhasil penelitian yang telah dilaporkanSaryono(1999), bahwa aktivitasoptimum enzim selulase dalammenghidrolisis limbah nanasberlangsung pada pH 5,2. Enzimselulase masih bisa beraktivitas pada pHdiatas dan dibawah pH 5,2 tetapiaktivitasnya lebih rendah. Hal inikemungkinan karena terjadi perubahanmuatan gugus fungsi residu asam aminopada enzim, terutama asam amino jenisasam glutamat(Bhat, 1997). Disampingitu konformasi enzim dimungkinkanjuga telah mengalami perubahankonformasi (denaturasi) akibatperubahan pH yang bervariasi.

Gambar 3. Kurva Pengaruh pH terhadap Aktivitas Ekstrak Kasar EnzimSelulase

Temperatur OptimumPada temperatur optimum reaksi

enzimatis berlangsung paling cepatkarena aktivitas enzim maksimum.Peningkatan temperatur menyebabkanaktivitas ekstrak kasar enzim meningkat.Hal ini disebabkan oleh temperatur yangmakin tinggi akan meningkatkan energikinetik, sehingga menambah intensitastumbukan antara substrat dengan enzim.Pada temperatur optimum, tumbukan

antara enzim dan substrat sangat efektif,sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat makin mudah dan produk yangterbentuk meningkat. Di atas temperaturoptimum enzim akan mengalamidenaturasi dan kehilangan aktivitaskatalitiknya (inaktivasi). Prosesinaktivasi enzim pada temperatur yangsangat tinggi berlangsung melalui 2tahap yaitu diawali dengan pembukaanparsial struktur sekunder, tersier dan atau

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Aktiv

its S

pesi

fik S

elul

ase(

U/g)

4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6

pH

kuartener molekul enzim akibatputusnya ikatan-ikatan kovalen maupunikatan hidrofobik dan selanjutnya terjadi

perubahan struktur primer enzim karenaadanya kerusakan asam-asam aminotertentu oleh pemanasan.

Gambar 4. Kurva Pengaruh Temperatur terhadap Aktivitas Ekstrak KasarEnzim Selulase

Gambar 4 menunjukkan bahwaaktivitas optimum ekstrak kasar enzimselulase dicapai pada temperatur 50oC,dengan aktivitas 0,053 Unit (0,053 molglukosa/mL substrat per menit) danaktivitas spesifik 0,0031 U/mg dengankadar glukosa sebesar 56,77 mg/100mL(28,39 mg glukosa/g CMC). Temperaturoptimum ini sesuai dengan penelitianyang dilakukan oleh Sreenath (2002),yang melaporkan bahwa aktivitasoptimum enzim selulase dariTrichoderma viridae dan Aspergilusniger dalam menghidrolisis CarboxyMethyl Cellulose (CMC) berlangsungpada suhu 50oC. Kondisi ini berbedadengan hasil penelitian yang telahdilaporkan Saryono (1991) dan maisaroh(2009). Aktivitas optimum selulaseterhadap selulosa ampas nanasberlangsung pada temperatur optimum37oC (Saryono, 1991) sedangkanterhadap selulosa ampas tebu (bagas)pada temperatur 40oC (Maisaroh, 2009).Perbedaan temperatur optimum inikemungkinan karena Carboxy MethylCellulose (CMC) memiliki viskositasyang lebih tinggi dibandingkan selulosayang lain pada konsentrasi yang sama (2%), sehingga enzim selulosamembutuhkan energi yang cukup tinggiuntuk membentuk kompleks dengansubstrat Carboxy Methyl Cellulose(CMC). Oleh karena itu untukmemperoleh data yang akurat perludilakukan penelitian tentang pengaruh

variasi substrat terhadap temperaturoptimum aktivitas enzim selulase.

Konsentrasi Substrat OptimumKonsentrasi substrat merupakan

salah satu faktor yang dapatmempengaruhi aktivitas enzim. Gambar4.5. menunjukkan bahwa konsentrasisubstrat sebanding dengan aktivitasekstrak kasar enzim. Pada konsentrasisubstrat rendah, aktivitas ekstrak kasarenzim juga rendah, karena sisi aktifenzim hanya sedikit mengikat substrat,sehingga produk gula pereduksi yangdihasilkan juga sedikit. Demikian jugadengan konsentrasi substrat yang makintinggi, maka sisi aktif enzim akan makinbanyak mengikat substrat, sehinggaproduk glukosa yang dihasilkan jugamakin banyak. Penambahan substratlebih lanjut hanya sedikit meningkatkanaktivitas ekstrak kasar enzim, karenahampir semua enzim telah membentukkompleks enzim-substrat, sehingga tidakterdapat lagi sisi aktif enzim yang bebas.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Aktiv

itas

Spes

ifik

Selu

lase

(U/g

)

30 40 50 60

Temperatur ( oC)

Gambar 5. Kurva Hubungan Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas EkstrakKasar Selulase

Pada konsentrasi substrat di atas4% ternyata mulai terjadi penurunankecepatan reaksi enzimatis. Hal initerjadi karena semakin tinggi konsentrasiCarboxy Methyl Cellulose (CMC) makamakin tinggi viskositasnya sehinggaprobabilitas substrat berikatan dengansisi aktif enzim semakin kecil. Dengandemikian aktivitas optimum berlangsungpada konsentrasi substrat 4%. Data yangdiperoleh dari optimasi substrat inidigunakan untuk menentukan parameterkinetik enzim selulase yang meliputi Vm(Kecepatan Reaksi Maksimum) dan Km(Konstanta Michaelis- Menten)

Penentuan Parameter KinetikaReaksi Enzimatis

Vm merupakan kecepatanmaksimum yaitu kecepatan yangberangsur-angsur dicapai padakonsentrasi substrat tinggi (enzim telahjenuh dengan substrat) sedangkan Kmmerupakan konstanta yang menyatakan

konsentrasi substrat pada saat kecepatanreaksi mencapai setengah kali kecepatanmaksimum.

Harga Vm dan Km dapatditentukan dengan membuat grafikantara 1/V dengan 1/[S].

Persamaan Michaelis- Menten:

][][.SKm

SVV mm

Dapat dinyatakan sebagaiberikut:

][.][1

SVSKm

V m

atau

mm VSVKm

V1

][1.1

Dari persamaan di atas terlihatbahwa 1/V adalah fungsi dari 1/[S].Dengan demikian jika dibuat kurvahubungan antara 1/V dengan 1/[S], akanterbentuk garis lurus (gambar 6).

Gambar 6. Kurva Hubungan 1/V dengan 1/[S]

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5

[S]%

Akt

ivita

s sp

esifi

k Se

lula

se(U

/g)

y = 2.2857x + 4.2836R2 = 0.9927

050

100150200250

-20 0 20 40 60 80 100 120

1/[S]

1/V

Ekstrak kasar enzim selulaseyang diisolasi dari bekicot (Achatinafulica) memiliki harga Vm sebesar 0,002mg/mL per menit dan Km sebesar 0,005mg/mL. Parameter kinetik ini berbedadengan hasil penelitian yang telahdilaporkan Saryono (1991), bahwaenzim selulase dari bekicot denganmenggunakan substrat suspensi ampasnanas dalam buffer asetat pH 5,2mempunyai harga Km 0,014 mgglukosa/mL dan nilai Vm sebesar 0,025mg/mL/menit. Perbedaan nilai parameterkinetik ini dimungkinan karena substratyang digunakan berbeda. Setengahkecepatan maksimum enzim selulasedari bekicot (Achatina fulica) tercapaipada konsentrasi substrat CarboxyMethyl Cellulose (CMC) lebih tinggidibandingkan substrat ampas nanas.

KESIMPULAN DAN SARANKesimpulanDari penelitian yang telah dilakukanmaka dapat disimpulkan bahwa1. Enzim selulase yang diisolasi dari

bekicot (Achatina fulica) bekerjaoptimum pada pH 5,2, temperatur50oC, dan konsentrasi substrat 4%

2. Aktivitas enzim selulase dari bekicot(Achatina fulica) terhadap CarboxyMethyl Cellulose (CMC) sebesar0,02 mol/mL per menit (0,02 Unit)sedangkan kandungan proteinnya1,72 mg/mL enzim sehinggaaktivitas spesifiknya sebesar 0,023Unit/mg protein

3. Karakterisasi enzim selulase daribekicot dengan menggunakansubstrat CMC dalam buffer asetatpH 5,2 mempunyai harga Vmsebesar 0,23mg/mL per menit danKm sebesar 0,53 mg/mL

Saran1. untuk meningkatkan kandungan

protein dan aktivitas ekstrak kasarenzim selulase dari bekicot(Achatina fulica)maka perludilakukan tahapan liofilisasi danpemurnian.

2. perlu dilakukan penelitian lanjutmengenai pengaruh variasi substratterhadap temperatur optimumaktivitas enzim selulase..

DAFTAR PUSTAKA

Bhat, M.K., (1997), CelluloseDegrading Enzymes andTheir Potential IndustrialApplications, FoodMacromolecul ScienceDepartement, Institute pfFood Research.Biotechnology Advances.Vol.15. 583-620

Bradford MM, 1976. A Rapid andSensitive Method for theQuantitation of MicrogramQuantities of Protein Utilizingthe Principle of Protein-DyeBinding. Anal. Biochem. 72:248–254

Ghose, T.K., (1987), Measurement ofCellulase activities, Pure andApplied Chemistry, 59, 257-268

Indra, D., K.Ramalingam, and MaryBabu., (2005), Isolation,Purification andCharacterization ofCollagenase fromHepatopancreas of The SnailAchatian fulica, ComparativeBiochemistry and Physiology142, 1-7

Koolman, J. dan Rohm, K.(2001), AtlasBerwarna dan Teks Biokimia,Terjemahan Septelia, PenerbitHipokrates , Jakarta

Lee,Y.J., et al. (2008), “Purification andCharacterization of CellulaseProduced by Bacillusamyoliquefaciens DL-3Utilizing Rice Hull”,Bioresource Technology, vol.99 hal. 378–386

Soedigdo, P., L.S.Nio, A. Soekeni,R.C.Barnett, (1970), Cellulasefrom The Snail Achatinafulica (Fer), Physial Zoology,43,2,139-144

Soedigdo, P., Muliawati, M.Wirahadikusumah, (1980),Penuntun Praktikum BiokimiaDasar, edisi kedua,Departemen Kimia FMIPAITB, Bandung.

Silaban, Ramlan., (1999), EnzimSelulolitik pada BakteriPseudomonas alchaligenesPaAf-18, PhD Theses fromJBPTITBPP, Bandung

Sudarmadji, S., Haryono,B., Harsono.,(1984), Prosedur Analisauntuk Bahan Makanan danPertanian, Liberti,Yogyakarti

Duff, S.J.B., Murray, W.D., (1996),Bioconvertion of forestproducts industry wastecellulosics to fuel ethanol: areview. Bioresour. Technol.55, 1 – 33.