abstrakSekarang jelas bahwa cacat mitokondria berhubungan dengan berbagai macam fenotipe klinis. Ini adalah hasil dari peran sentral mitokondria dalam produksi energi, reaktif homeostasis spesies oksigen, dan kematian sel. Proses ini saling tergantung dan dapat terjadi dalam berbagai kondisi menekankan, di antaranya tingkat oksigen yang rendah (hypoxia) tentu menonjol. Sel terkena hipoksia merespon akut dengan metabolit endogen dan protein segera mengatur jalur metabolik, tetapi jika kadar oksigen rendah berkepanjangan, sel mengaktifkan mekanisme beradaptasi, tombol utama menjadi faktor hipoksia-diinduksi 1 (HIF-1). Aktivasi faktor ini benar-benar terikat pada fungsi mitokondria, yang pada gilirannya berkaitan dengan tingkat oksigen. Oleh karena itu dalam hipoksia, mitokondria berperan sebagai [O2] sensor, menyampaikan sinyal ke HIF-1directly atau tidak langsung, dan berkontribusi terhadap potensi redoks sel, homeostasis ion, dan produksi energi. Meskipun selama dua dekade terakhir respon seluler terhadap tekanan oksigen rendah telah dipelajari secara ekstensif, mekanisme yang mendasari fungsi-fungsi ini masih terbatas. Di sini kita meninjau pengetahuan saat ini peran mitokondria dalam hipoksia, dengan fokus terutama pada peran mereka dalam energi sel dan reaktif oksigen spesies homeostasis dalam kaitannya dengan HIF-1 stabilisasi. Selain itu, kami membahas keterlibatan HIF-1 dan protein inhibitor dari F1F0 ATPase dalam autophagy mitokondria hipoksia diinduksi.1. PendahuluanSelama dua dekade terakhir fungsi mitokondria yang rusak terkait dengan hipoksia telah dipanggil dalam banyak gangguan kompleks yang beragam, seperti diabetes tipe 2 [1] dan [2], penyakit Alzheimer [3] dan [4], iskemia jantung / reperfusi cedera [5] dan [6], peradangan jaringan [7], dan kanker [8], [9], [10], [11] dan [12].The [O2] dalam buffer berair-air jenuh pada suhu 37 C adalah kira-kira. 200 uM [13]; Namun, mitokondria in vivo yang terkena jauh lebih rendah [O2] yang bervariasi dengan jaringan dan kondisi fisiologis. Dalam kondisi fisiologis, sebagian besar sel istirahat manusia mengalami beberapa tekanan oksigen 5%, namun [O2] yang terjadi antara lingkungan ekstraseluler dan mitokondria, di mana oksigen dikonsumsi oleh sitokrom c oksidase gradien, menghasilkan secara signifikan lebih rendah [O2] eksposisi mitokondria. Di bawah tingkat oksigen ini, sebagian besar jaringan mamalia yang terkena kondisi hipoksia [14]. Ini mungkin timbul dalam perkembangan normal, atau sebagai konsekuensi dari kondisi patofisiologi mana ada suplai oksigen berkurang karena insufisiensi pernapasan atau ke pembuluh darah yang rusak. Kondisi tersebut termasuk penyakit radang, diabetes, gangguan iskemik (serebral atau kardiovaskular), dan tumor padat. Mitokondria mengkonsumsi jumlah terbesar (beberapa 85-90%) oksigen dalam sel untuk memungkinkan fosforilasi oksidatif (OXPHOS), yang merupakan jalur metabolisme utama untuk produksi ATP. Oleh karena itu hipoksia akan menghambat jalur metabolisme ini, dan jika tingkat oksigen sangat rendah, ketersediaan ATP cukup mungkin mengakibatkan kematian sel [15].

Ketika sel-sel yang terkena suasana dengan konsentrasi oksigen berkurang, sel mudah "merespon" dengan menginduksi reaksi adaptif untuk kelangsungan hidup mereka melalui protein kinase AMP-activated (AMPK) jalur (lihat review baru-baru [16]) yang antara lain meningkatkan glikolisis didorong oleh peningkatan efisiensi katalitik dari beberapa enzim, termasuk-fosfofruktokinase 1 dan piruvat kinase (catatan, fluks oksidatif ini termodinamika diperbolehkan karena keduanya berkurang fosforilasi potensial [ATP] / ([ADP] [Pi]) dan redoks fisiologis negara sel). Namun, ini sangat efisien hanya dalam jangka pendek, karena itu sel menanggapi hipoksia berkepanjangan juga dengan stimulasi hipoksia-diinduksi faktor (HIFs: HIF-1 yang kebanyakan dipelajari), yang merupakan faktor transkripsi heterodimeric terdiri dari dan subunit, pertama dijelaskan oleh Semenza dan Wang [17]. HIFs ini di hadapan kadar oksigen hipoksia diaktifkan melalui mekanisme yang kompleks di mana tekanan oksigen sangat penting (lihat di bawah). Setelah itu HIFs mengikat elemen hipoksia-responsif, mengaktifkan transkripsi lebih dari dua ratus gen yang memungkinkan sel untuk beradaptasi dengan lingkungan hipoksia [18] dan [19].Beberapa ulasan yang sangat baik muncul dalam beberapa tahun terakhir menggambarkan berbagai perubahan yang disebabkan oleh kekurangan oksigen pada sel yang terisolasi dan jaringan hewan. Dalam model in vivo, peraturan terkoordinasi perfusi jaringan melalui molekul vasoaktif seperti nitrat oksida dan tindakan badan karotis cepat merespon perubahan kebutuhan oksigen [20], [21], [22], [23] dan [24] . Dalam sel terisolasi, hipoksia menginduksi perubahan metabolisme yang signifikan karena kedua variasi tingkat metabolit dan aktivasi / penghambatan enzim dan transporter; efek intraseluler yang paling penting yang disebabkan oleh jalur yang berbeda ahli dijelaskan di tempat lain (untuk review baru-baru, lihat [25], [26] dan [27]). Hal ini masuk akal untuk menduga bahwa jenis sel dan kedua tingkat keparahan dan durasi hipoksia dapat menentukan jalur diaktifkan / tertekan dan waktu mereka onset [3], [6], [10], [12], [23] dan [28]. Jalur ini akhirnya akan mengarah pada terjemahan preferensial protein kunci yang diperlukan untuk adaptasi dan kelangsungan hidup terhadap stres hipoksia. Meskipun dalam dua dekade terakhir, penemuan HIF-1 oleh Gregg Semenza et al. disediakan platform molekuler untuk menyelidiki mekanisme yang mendasari respon terhadap kekurangan oksigen, biologi molekuler dan seluler hipoksia masih harus benar-benar dijelaskan. Ulasan ini merangkum data eksperimen baru-baru ini berkaitan dengan struktur dan fungsi mitokondria adaptasi terhadap hipoksia dan mengevaluasi itu dalam terang parameter struktural dan fungsional utama mendefinisikan bioenergetika mitokondria. Karena mitokondria mengandung protein inhibitor, IF1, yang beraksi di F1F0 ATPase telah dianggap selama puluhan tahun sangat penting dalam hipoksia / iskemia, pemberitahuan khusus akan didedikasikan untuk menganalisis aspek molekul peraturan IF1 enzim dan peran yang mungkin dalam metabolisme perubahan yang disebabkan oleh kadar oksigen yang rendah dalam sel.

2. Mekanisme (s) HIF-1 aktivasi

HIF-1 terdiri dari HIF-1 subunit oksigen sensitif yang heterodimerizes dengan subunit HIF-1 untuk mengikat DNA. Dalam ketegangan O2 tinggi, HIF-1 teroksidasi (hydroxylated) oleh hydroxylases prolyl (PhD) menggunakan -ketoglutarat yang berasal dari asam (TCA) siklus trikarboksilat. The hydroxylated HIF-1 subunit berinteraksi dengan protein von Hippel-Lindau, anggota penting dari E3 kompleks ligase ubiquitin yang polyubiquitylates HIF. Hal ini kemudian dikatabolisme oleh proteasomes, sehingga HIF-1 terus disintesis dan terdegradasi dalam kondisi normoxic [18]. Di bawah hipoksia, HIF-1 hidroksilasi tidak terjadi, sehingga menstabilkan HIF-1 (Gambar. 1). Aktif HIF-1 kompleks pada gilirannya mengikat inti elemen respon hipoksia dalam beragam gen yang terlibat dalam keragaman proses biologis, dan langsung transactivates gen enzim glikolitik [29]. Khususnya, konsentrasi O2, beberapa produk mitokondria, termasuk intermediet siklus TCA dan spesies oksigen reaktif, dapat mengkoordinasikan aktivitas PHD, HIF stabilisasi, maka respon seluler untuk O2 deplesi [30] dan [31]. Kebetulan, gangguan siklus TCA fluks, terutama jika hal itu disebabkan oleh disfungsi dehidrogenase suksinat, menghasilkan penurunan atau hilangnya produksi energi dari kedua rantai transpor elektron dan siklus Krebs, dan juga dalam kelebihan produksi radikal bebas [32]. Hal ini menyebabkan berat neurodegeneration awal-awal atau, seperti yang terjadi pada individu yang membawa mutasi pada subunit non-katalitik dari enzim yang sama, untuk tumor seperti feokromositoma dan paraganglioma. Namun, penurunan siklus TCA mungkin relevan juga untuk perubahan metabolik yang terjadi dalam mitokondria terkena hipoksia, karena akumulasi suksinat telah dilaporkan menghambat PhD [33]. Hal ini untuk diperhatikan bahwa beberapa penulis percaya spesies oksigen reaktif (ROS) menjadi penting untuk mengaktifkan HIF-1 [34], tetapi yang lain menantang ide ini [35], karena itu peran mitokondria ROS dalam regulasi HIF-1 di bawah hipoksia masih kontroversial [36]. Selain itu, kontribusi mitokondria fungsional untuk HIF-1 regulasi juga telah dipertanyakan oleh orang lain [37], [38] dan [39].

3. Pengaruh tingkat oksigen berkurang pada metabolisme energi dalam sel

Oksigen merupakan penentu utama dari metabolisme sel dan ekspresi gen, dan sebagai seluler O2 tingkat penurunan, baik selama hipoksia terisolasi atau iskemia terkait hipoksia, metabolisme dan ekspresi gen profil dalam sel yang diubah secara signifikan. Oksigen rendah mengurangi OXPHOS dan tingkat siklus Krebs, dan berpartisipasi dalam generasi oksida nitrat (NO), yang juga memberikan kontribusi untuk menurunkan tingkat respirasi [23] dan [40]. Namun, oksigen juga penting dalam generasi spesies oksigen reaktif, yang dapat berpartisipasi dalam proses sinyal sel atau dapat menyebabkan kerusakan sel ireversibel dan kematian [41].

Seperti yang disebutkan di atas, sel beradaptasi dengan reduksi oksigen dengan menginduksi HIF aktif, yang berpengaruh pada homeostasis sel energi utama adalah inaktivasi anabolisme, aktivasi glikolisis anaerobik, dan penghambatan mitokondria metabolisme aerobik: siklus TCA, dan OXPHOS. Sejak OXPHOS memasok sebagian besar ATP diperlukan untuk proses seluler, tekanan oksigen rendah sangat akan mengurangi ketersediaan energi sel. Hal ini terjadi melalui beberapa mekanisme: pertama, mengurangi tekanan oksigen menurunkan laju respirasi, karena pertama nonsaturating substrat untuk sitokrom c oksidase (COX), sekunder, untuk alosterik modulasi COX [42]. Sebagai konsekuensinya, penurunan potensial fosforilasi, dengan peningkatan laju glikolisis terutama disebabkan peningkatan alosterik aktivitas fosfofruktokinase; glikolisis namun kurang efisien dan menghasilkan laktat dalam proporsi 0,5 mol / mol ATP, yang akhirnya tetes pH seluler jika sel-sel yang tidak baik perfusi, seperti yang terjadi di bawah pembuluh darah yang rusak atau kondisi iskemik [6]. Selain ini "spontan" (termodinamika-driven) pergeseran dari aerobik untuk metabolisme anaerobik yang dimediasi oleh perubahan kinetik yang paling enzim, HIF-1 faktor mengaktifkan transkripsi gen yang mengkode transporter glukosa dan enzim glikolitik untuk lebih meningkatkan fluks mengurangi setara dari glukosa menjadi laktat [43] dan [44]. Kedua, HIF-1 koordinat dua tindakan yang berbeda pada fase mitokondria oksidasi glukosa: akan mengaktifkan transkripsi gen PDK1 pengkodean kinase yang memfosforilasi dan menginaktivasi piruvat dehidrogenase, sehingga shunting jauh piruvat dari mitokondria dengan mencegah dekarboksilasi oksidatif yang menjadi asetil-CoA [45] dan [46]. Selain itu, HIF-1 menginduksi switch dalam komposisi sitokrom c oksidase dari COX4-1 ke COX4-2 isoform, yang meningkatkan aktivitas spesifik enzim. Akibatnya, baik tingkat respirasi dan tingkat ATP sel hipoksia membawa COX4-2 isoform sitokrom c oksidase ditemukan meningkat secara signifikan sehubungan dengan sel-sel yang sama yang membawa COX4-1 isoform [47]. Kebetulan, HIF-1 juga dapat meningkatkan ekspresi karbonat anhidrase 9, yang mengkatalisis hidrasi reversibel CO2 untuk HCO3- dan H +, sehingga berkontribusi terhadap regulasi pH.

4. Pengaruh tingkat oksigen berkurang pada mitokondria4.1. Pengaruh hipoksia pada struktur mitokondria dan dinamika

Mitokondria membentuk jaringan tubular yang sangat dinamis, morfologi dari yang diatur oleh sering fisi dan fusi acara. Mesin-mesin fusi / fisi yang termodulasi dalam menanggapi perubahan kondisi metabolisme sel, maka salah satu harus mengharapkan hipoksia yang mempengaruhi dinamika mitokondria. Ketersediaan oksigen ke sel-sel menurunkan oksidasi glukosa, sedangkan kekurangan oksigen mengkonsumsi gula lebih cepat dalam upaya untuk menghasilkan ATP melalui glikolisis anaerobik kurang efisien untuk laktat (efek Pasteur). Dengan kondisi tersebut, mitokondria tidak didorong dengan substrat (asetil-CoA dan O2), mendorong perubahan besar struktur, fungsi, dan dinamika (untuk review baru-baru ini melihat [48]). Mengenai struktur dan dinamika, salah satu berkorelasi pertama yang muncul adalah bahwa gangguan fusi mitokondria menyebabkan depolarisasi mitokondria, kehilangan mtDNA yang bisa disertai dengan laju respirasi berubah, dan gangguan distribusi mitokondria dalam sel [49], [50] dan [51]. Memang, paparan neuron kortikal sampai sedang kondisi hipoksia selama beberapa jam, secara signifikan mengubah morfologi mitokondria, penurunan ukuran mitokondria dan mengurangi mitokondria kecepatan berarti. Karena efek ini entah dicegah dengan mengekspos neuron penghambat nitric oxide synthase atau menirukan oleh NO donor di normoxia, keterlibatan jalur NO-dimediasi disarankan [52]. Motilitas mitokondria juga ditemukan dihambat dan dikendalikan secara lokal oleh [ADP] / [ATP] rasio [53]. Menariknya, penulis menggunakan pendekatan asli di mana mitokondria divisualisasikan menggunakan tetramethylrhodamineethylester dan gerakan mereka diikuti dengan menerapkan pelacakan tunggal partikel.Gambar. 1.Perubahan mitokondria besar di hipoksia. Hipoksia dapat menurunkan tingkat transpor elektron menentukan pengurangan m, peningkatan generasi ROS, dan ditingkatkan NO synthase. Satu (atau lebih) dari faktor-faktor ini mungkin berkontribusi terhadap HIF stabilisasi, yang pada gilirannya menyebabkan adaptasi metabolisme dari kedua sel hipoksia dan mitophagy. The m menurun juga bisa menginduksi mengikat aktif IF1, yang mungkin mengubah morfologi mitokondria dan / atau dinamika, dan menghambat mitophagy. Garis padat mengindikasikan mapan perubahan hipoksia pada sel, sedangkan garis putus-putus menunjukkan perubahan belum dinyatakan. Inset, hubungan antara konsentrasi O2 ekstraseluler dan tekanan oksigen.

Pemberitahuan dalam bab ini adalah bahwa enzim mengendalikan regulator morfologi mitokondria menyediakan platform di mana sinyal seluler ditransduksi dalam sel untuk mempengaruhi fungsi mitokondria [54]. Oleh karena itu, orang mungkin berharap bahwa selain faktor mitokondria lainnya [30] dan [55] bermain peran dalam HIF stabilisasi, juga morfologi mitokondria mungkin cukup dikaitkan dengan HIF stabilisasi. Dalam rangka untuk lebih menentukan mekanisme yang terlibat dalam perubahan morfologi mitokondria dan dinamika mereka ketika sel-sel mengalami kondisi hipoksia, studi perintis harus dikuatkan oleh dan diperluas untuk pengamatan pada jenis sel yang berfokus juga pada protein tunggal yang terlibat dalam kedua fusi mitokondria / fisi dan gerak.4.2. Pengaruh hipoksia pada kompleks rantai pernafasan

O2 adalah akseptor terminal elektron dari sitokrom c oksidase (Kompleks IV), yang memiliki afinitas yang sangat tinggi untuk itu, karena konsentrasi oksigen untuk laju pernapasan setengah maksimal pada pH 7,4 sekitar 0,7 pM [56]. Pengukuran fosforilasi oksidatif mitokondria menunjukkan bahwa itu tidak tergantung pada konsentrasi oksigen sampai setidaknya 20 pM pada pH 7,0 dan ketergantungan oksigen menjadi nyata lebih besar karena pH yang lebih basa [56]. Demikian pula, Moncada et al. [57] menemukan bahwa tingkat konsumsi O2 tetap konstan sampai [O2] jatuh di bawah 15 pM. Dengan demikian, sebagian besar laporan dalam literatur menganggap kondisi hipoksia yang terjadi dalam sel pada 5-0,5% O2, berbagai sesuai dengan 46-4,6 pM O2 dalam media kultur sel (lihat Gambar. 1 inset). Karena antara lingkungan ekstraseluler dan mitokondria gradien tekanan oksigen didirikan [58], konsentrasi O2 yang dialami Kompleks IV jatuh dalam kisaran yang mempengaruhi kinetika, seperti dilaporkan di atas.

Dengan kondisi tersebut, sejumlah perubahan pada komponen mesin OXPHOS, sebagian besar dimediasi oleh HIF-1 telah ditemukan. Dengan demikian, Semenza et al. [59] dan lain-lain setelahnya [46] melaporkan bahwa aktivasi HIF-1 menginduksi piruvat kinase dehidrogenase, yang menghambat piruvat dehidrogenase, menunjukkan respirasi yang menurun pembatasan substrat. Selain itu, HIF-1 mekanisme tergantung lain yang mampu mempengaruhi laju respirasi telah dilaporkan. Pertama, komposisi subunit COX diubah dalam sel hipoksia dengan peningkatan degradasi subunit COX4-1, yang mengoptimalkan aktivitas COX dalam kondisi aerobik, dan peningkatan ekspresi dari subunit COX4-2, yang mengoptimalkan aktivitas COX dalam kondisi hipoksia [29] . Di sisi lain, uji langsung laju respirasi dalam sel terkena hipoksia mengakibatkan penurunan yang signifikan dari respirasi [60]. Menurut dengan bukti Zhang et al., Penurunan laju respirasi harus berasal autophagy mitokondria, karena ekspresi HIF-1-dimediasi BNIP3. Penafsiran ini sejalan dengan hasil awal yang diperoleh di laboratorium kami di mana uji aktivitas sintase sitrat sel terkena ketegangan oksigen yang berbeda dilakukan. Gambar. 2 menunjukkan aktivitas sintase sitrat, yang diambil sebagai indeks massa mitokondria [11], sehubungan dengan oksigen ketegangan: [O2] dan massa mitokondria secara langsung terkait.

gb.2 Kegiatan sitrat sintase. Fibroblast primer manusia, yang diperoleh dari biopsi kulit dari 5 donor yang sehat, yang diunggulkan dengan kepadatan 8.000 sel / cm2 glukosa tinggi Dulbecco yang Dimodifikasi Elang Menengah, DMEM (25 mM glukosa, 110 mg / l piruvat, dan 4 mM glutamin) ditambah dengan 15% janin Bovine Serum (FBS). 18 jam kemudian, piring kultur sel dicuci sekali dengan Hank Seimbang Salt Solution (HBSS) dan medium diganti dengan DMEM yang mengandung glukosa 5 mM, 110 mg / l piruvat, dan 4 mM glutamin dilengkapi dengan 15% FBS. Piring kultur sel kemudian ditempatkan ke dalam INVIVO2 dilembabkan hipoksia workstation (Ruskinn Technologies, Bridgend, Inggris) selama 72 jam mengubah media pada 48 jam, dan tekanan parsial oksigen (ketegangan) kondisi adalah: 20%, 4%, 2%, 1 % dan 0,5%. Sel itu kemudian dikumpulkan dalam workstation dengan tripsin-EDTA (0,25% dicuci dengan PBS dan diresuspensi dalam buffer yang mengandung 10 mM Tris / HCl, 0,1 M KCl, 5 mM KH2PO4, 1 mM EGTA, 3 mM EDTA, dan 2 mM MgCl2 pH 7.4 (semua solusi yang aspal dengan kondisi tekanan oksigen yang sesuai). Kegiatan sintase sitrat pada dasarnya diuji dengan menginkubasi 40 mg sel dengan 0,02% Triton X-100, dan pemantauan reaksi dengan mengukur spektrofotometri tingkat bebas koenzim A dirilis, seperti yang dijelaskan dalam [90]. Aktivitas enzim dinyatakan sebagai nmol / min / mg protein. Tiga percobaan independen dilakukan dan tes dilakukan baik duplikat atau rangkap tiga.Gambar pilihan

Namun, pengamatan Semenza et al. harus dilihat dalam kaitannya dengan data yang dilaporkan oleh Moncada et al. [57] dan dikonfirmasi oleh orang lain [61] di mana ia jelas menunjukkan bahwa ketika sel-sel (berbagai jalur sel) kondisi pengalaman hipoksia, Sintase oksida nitrat (NOS-NOS) diaktifkan, maka NO dilepaskan. Seperti yang sudah disebutkan di atas, NO merupakan pesaing kuat dari O2 untuk sitokrom c oksidase, yang hasilnya Km jelas meningkat, maka pengurangan sitokrom mitokondria dan semua pusat redoks lain dari rantai pernapasan terjadi. Selain itu, data yang sangat baru menunjukkan potensi de-aktivasi Kompleks saya ketika oksigen kurang, seperti yang terjadi pada hipoksia berkepanjangan [62]. Menurut Hagen et al. [63] yang tergantung NO penghambatan sitokrom c oksidase harus memungkinkan "disimpan" O2 untuk mendistribusikan dalam sel yang akan digunakan oleh enzim lain, termasuk PhD yang menginaktivasi HIF. Oleh karena itu, kecuali NO penghambatan sitokrom c oksidase terjadi hanya ketika [O2] sangat rendah, penghambatan konsumsi oksigen mitokondria menciptakan paradoks situasi di mana sel mungkin gagal untuk mendaftar hipoksia. Telah tergoda untuk memecahkan paradoks ini, namun sampai saat ini hanya hipotesis telah diusulkan [23] dan [26]. Menariknya, pengamatan baru pada sel ragi terkena hipoksia mengungkapkan normal karbonilasi protein dan tirosin protein nitrasi yang berasal meningkat mitochondrially dihasilkan radikal superoksida dan NO, dua spesies biasanya diproduksi pada tingkat oksigen yang rendah, yang menggabungkan untuk membentuk ONOO- [64]. Berdasarkan studi ini penjelasan yang mungkin telah diusulkan untuk paradoks di atas.

Akhirnya, telah diperhatikan bahwa kekurangan pernapasan mitokondria diamati pada kardiomiosit anjing di mana gagal jantung eksperimental telah diinduksi terletak pada perakitan supermolecular bukan di masing-masing komponen rantai transpor elektron [65]. Pengamatan ini sangat menarik karena hilangnya respirasomes diduga memfasilitasi pembentukan ROS dalam mitokondria [66], karena itu supercomplexes pembongkaran mungkin menjelaskan paradoks berkurang [O2] dan ditingkatkan ROS ditemukan dalam sel hipoksia. Secara khusus, hipoksia bisa mengurangi fusi mitokondria dengan merusak potensial membran mitokondria, yang pada gilirannya dapat menyebabkan supercomplexes pembongkaran, peningkatan ROS produksi [11].4.3. Kompleks III dan ROS produksi

Telah diperkirakan bahwa, dalam kondisi fisiologis normoxic, 1-2% dari aliran elektron melalui rantai pernapasan mitokondria menimbulkan ROS [67] dan [68]. Sekarang diakui bahwa situs utama produksi ROS berada dalam Kompleks I dan III, yang lazim kontribusi Kompleks I [69] (Gambar. 3). Ini mungkin diharapkan hipoksia yang akan menurunkan produksi ROS, karena rendahnya tingkat O2 dan respirasi mitokondria berkurang [6] dan [46], tetapi tingkat ROS adalah paradoks meningkat. Memang, sekitar satu dekade lalu, Chandel et al. [70] memberikan bukti yang baik bahwa spesies oksigen reaktif mitokondria memicu hipoksia yang disebabkan transkripsi, dan beberapa tahun kemudian kelompok yang sama [71] menunjukkan bahwa ROS dihasilkan pada Kompleks III dari rantai pernapasan mitokondria menstabilkan HIF-1 selama hipoksia (Gbr. 1 dan Gambar. 3). Meskipun orang lain telah mengusulkan mekanisme yang menunjukkan peran penting dari mitokondria dalam peraturan HIF-1 selama hipoksia (diulas lihat [64] dan [72]), kontribusi mitokondria ke HIF-1 regulasi telah dipertanyakan oleh orang lain [35], [36] dan [37]. Hasil Gong dan Agani [35] misalnya menunjukkan bahwa penghambatan Kompleks transpor elektron I, III, dan IV, serta penghambatan mitokondria F0F1 ATPase, mencegah ekspresi HIF-1 dan spesies oksigen reaktif mitokondria tidak terlibat dalam HIF peraturan -1 selama hipoksia. Secara bersamaan, Tuttle et al. [73], dengan cara non invasif, pendekatan spektroskopi, tidak menemukan bukti yang menunjukkan bahwa ROS, yang dihasilkan oleh mitokondria, yang diperlukan untuk menstabilkan HIF-1 bawah hipoksia moderat. Para penulis yang sama ditemukan kadar HIF-1 dibandingkan pada sel normal dan 0 (yaitu sel yang tidak DNA mitokondria). Sebaliknya, percobaan yang dilakukan pada model genetik yang terdiri dari sel-sel baik kurang sitokrom c atau sel 0 keduanya bisa bukti peran penting respirasi mitokondria untuk menstabilkan HIF-1 [74]. Dengan demikian, sitokrom c sel nol, yang tidak mampu untuk bernafas, terkena hipoksia sedang (1,5% O2) mencegah oksidasi ubiquinol dan generasi ubisemiquinone radikal, sehingga menghilangkan pembentukan superoksida di Kompleks III [71]. Secara bersamaan, sel 0 kurang transpor elektron, terkena 4 jam sampai sedang hipoksia gagal menstabilkan HIF-1, menunjukkan peran penting dari rantai pernapasan untuk penginderaan seluler tingkat O2 rendah. Selain itu, bukti terbaru yang diperoleh pada sel dimanipulasi genetik (yaitu sitokrom b cybrids kekurangan) menunjukkan peningkatan kadar ROS dan stabil protein HIF-1 selama hipoksia [75]. Selain itu, interferensi RNA dari Kompleks III subunit Rieske protein sulfur besi di sitokrom b sel kekurangan, dihapuskan generasi ROS di situs Qo Kompleks III, mencegah HIF-1 stabilisasi. Pengamatan ini, dibuktikan dengan eksperimen dengan MitoQ, sebuah mitokondria bertarget efisien antioksidan, sangat mendukung keterlibatan mitokondria ROS dalam mengatur HIF-1. Meskipun demikian, secara kolektif, data yang tersedia tidak memungkinkan untuk benar-benar menyatakan peran yang tepat dari mitokondria ROS dalam mengatur HIF-1, namun jalur menstabilkan HIF-1 muncul diragukan lagi mitokondria tergantung [30].

gb3 Sekilas elektron mitokondria dan proton fluks di hipoksia. Elektron dibebaskan dari pengurangan kofaktor (NADH dan FADH2) di bawah aliran normoxia melalui pusat redoks rantai pernapasan (rc) ke molekul oksigen (garis putus-putus biru), yang fluks proton dari matriks mitokondria ke ruang antarmembran digabungkan (biru panah). Proton kemudian mengalir kembali ke matriks melalui sektor F0 dari synthase kompleks ATP, mengemudi sintesis ATP. ATP dibawa ke sitosol sel dengan adenine nukleotida Translocator (panah biru). Di bawah sedang sampai parah hipoksia, elektron melarikan diri rc pusat redoks dan mengurangi molekul oksigen untuk anion superoksida radikal sebelum mencapai sitokrom c (panah merah). Dengan kondisi tersebut, untuk mempertahankan yang sesuai m, ATP yang dihasilkan oleh glikolisis sitosol memasuki mitokondria dimana dihidrolisis oleh F1F0 ATPase dengan ekstrusi proton dari matriks mitokondria (panah merah).4.4. Hipoksia dan ATP sintase

The F1F0 ATPase (ATP synthase) adalah enzim yang bertanggung jawab dari catalysing ADP fosforilasi sebagai langkah terakhir OXPHOS. Ini adalah motor rotary menggunakan motif gaya proton melintasi membran dalam mitokondria untuk mendorong sintesis ATP [76]. Ini adalah enzim reversibel dengan sintesis ATP atau hidrolisis yang terjadi di sektor F1 di sisi matriks membran, katalis kimia yang digabungkan dengan H + transportasi melalui sektor transmembran F0.

Di bawah normoxia enzim mensintesis ATP, tetapi ketika mitokondria mengalami kondisi hipoksia membran mitokondria potensial (m) menurun di bawah level endogen kondisi mapan (140 mV, negatif di dalam matriks [77]) dan F1F0 ATPase dapat bekerja di pembalikan Mode: itu menghidrolisis ATP (diproduksi oleh glikolisis anaerob) dan menggunakan energi yang dilepaskan untuk memompa proton dari matriks mitokondria ke ruang antarmembran, concurring dengan Translocator adenin nukleotida (yaitu hipoksia menukar ATP4- sitosol untuk matriks ADP3-) untuk mempertahankan yang m fisiologis (Gbr. 3). Karena kondisi ketersediaan oksigen terbatas penurunan sitoplasma fosfat energi tinggi ini terutama disebabkan oleh hidrolisis oleh sintase ATP bekerja secara terbalik [6] dan [78], enzim harus diatur secara ketat untuk menghindari pembuangan ATP. Hal ini dicapai dengan protein alami, H + / m tergantung IF1, yang mengikat sektor F1 katalitik pada pH rendah dan m rendah (seperti terjadi hipoksia / iskemia) [79]. IF1 mengikat hasil sintase ATP dalam penghambatan cepat dan reversibel enzim [80], yang bisa mencapai sekitar 50% dari aktivitas maksimal (untuk tinjauan baru-baru ini melihat [6] dan [81]).

Selain efek luas dipelajari ini, IF1 tampaknya terkait dengan produksi ROS dan autophagy mitokondria (mitophagy). Ini adalah mekanisme yang melibatkan degradasi katabolik makromolekul dan organel melalui jalur lisosom yang memberikan kontribusi untuk rumah tangga dan regenerasi metabolit. Degradasi autophagic terlibat dalam regulasi proses penuaan dan beberapa penyakit manusia, seperti miokard iskemia / reperfusi [82], Penyakit Alzheimer, penyakit Huntington, dan penyakit inflamasi (untuk review baru-baru melihat [83] dan [84], dan , seperti yang disebutkan di atas, mempromosikan kelangsungan hidup sel dengan mengurangi ROS dan mtDNA kerusakan dalam kondisi hipoksia.

Campanella et al. [81] melaporkan bahwa, dalam sel HeLa dalam kondisi normoxic, aktivitas autophagic basal bervariasi dalam kaitannya dengan tingkat ekspresi IF1. Dengan demikian, sel-sel yang mengekspresikan hasil IF1 dalam produksi ROS mirip dengan kontrol, sebaliknya sel di mana ekspresi IF1 ditekan menunjukkan produksi ROS ditingkatkan. Secara paralel, sel-sel yang terakhir menunjukkan aktivasi jalur mitophagy, karena itu menunjukkan bahwa variasi dalam tingkat ekspresi IF1 mungkin memainkan peran penting dalam menentukan dua parameter penting dalam konteks review saat ini (Gambar 1).: Tingkat generasi ROS dan mitophagy. Dengan demikian, tingkat ekspresi ditingkatkan hipoksia diinduksi IF1 [81] harus dikaitkan dengan penurunan baik produksi ROS dan autophagy, yang jelas bertentangan dengan hipoksia yang disebabkan ROS meningkat dan dengan autophagy mitokondria HIF-1 tergantung ditampilkan oleh Zhang et al. [60] sebagai respon metabolik adaptif terhadap hipoksia. Namun, dalam percobaan Zhang et al. sel-sel yang terkena hipoksia selama 48 jam, sedangkan inhibitor F1F0-ATPase memberikan sebuah tindakan cepat pada enzim dan untuk pengetahuan kita, belum pernah dilaporkan apakah aksinya tetap selama pameran hipoksia berkepanjangan. Relevan dengan masalah ini adalah pengamatan yang sangat baru yang IEX-1 (gen respon awal langsung-X 1), gen stres diinduksi yang menekan produksi ROS dan melindungi sel dari apoptosis [85], menargetkan mitokondria F1F0-ATPase inhibitor untuk degradasi, mengurangi ROS dengan menurunkan m. Hal ini untuk diperhatikan bahwa percobaan menggambarkan dilakukan di bawah ketersediaan oksigen normal, tetapi tidak masuk akal untuk menyingkirkan IEX-1 dari memainkan peran dalam kondisi stres seperti yang disebabkan oleh hipoksia dalam sel, karena itu masalah ini mungkin layak suatu penyelidikan juga pada tingkat oksigen yang rendah.

Kesimpulannya, data masih muncul mengenai pengaturan fungsi mitokondria oleh F1F0 ATPase dalam respon hipoksia dalam konteks seluler dan fisiologis yang berbeda. Mengingat peran patofisiologi luas modulasi seluler hipoksia, pemahaman tentang tuning halus antara efektor yang berbeda dari sintase ATP diinginkan untuk akhirnya menargetkan terapi masa depan yang paling efektif. Laboratorium kami sebenarnya terlibat dalam melakukan investigasi untuk memperjelas konteks ini.5. Kesimpulan dan perspektif

Mitokondria adalah platform seluler penting bahwa kedua menyebarkan dan memulai sinyal intraseluler yang menyebabkan respon seluler dan metabolisme secara keseluruhan. Selama dekade terakhir, sejumlah besar data yang relevan telah diperoleh pada identifikasi mekanisme adaptasi seluler terhadap hipoksia. Dalam sel hipoksia ada transkripsi ditingkatkan dan sintesis beberapa jalur glikolitik enzim / transporter dan pengurangan sintesis protein yang terlibat dalam katabolisme mitokondria. Meskipun didefinisikan dengan baik parameter kinetik reaksi di hipoksia kurang, biasanya diasumsikan bahwa perubahan transkripsi menyebabkan metabolisme modifikasi fluks. Eksperimen biokimia yang diperlukan telah hampir ditangani sampai sekarang dan hanya dalam beberapa biologi molekuler dan seluler mempelajari transporter dan enzim parameter kinetik dan tingkat fluks telah ditentukan, meninggalkan beberapa ketidakpastian.Pusat untuk fungsi mitokondria dan ROS generasi adalah proton gradien elektrokimia melintasi membran dalam mitokondria yang dibentuk oleh aktivitas proton pemompaan rantai pernapasan, dan yang ketat terkait dengan fungsi F1F0-ATPase. Evaluasi potensi membran mitokondria dalam hipoksia hanya telah dipelajari dengan menggunakan metode semikuantitatif berdasarkan pengukuran intensitas fluoresensi probe diambil oleh sel-sel yang mengalami kondisi normal atau hipoksia. Namun, pendekatan ini secara intrinsik tidak benar karena kemampuan yang berbeda yang molekul oksigen harus memuaskan fluoresensi [86] dan [87] dan konsentrasi pasti probe mencapai dalam mitokondria, yang massanya dapat dikurangi dengan setengah hipoksia [60] . Selain itu, ketidakpastian tentang pengukuran pembentukan radikal dan H2O2 superoksida mitokondria in vivo [88] menghambat studi tentang peran mitokondria ROS kerusakan oksidatif hipoksia, redoks sinyal, dan HIF-1 stabilisasi.

Durasi dan keparahan stres hipoksia berbeda-beda mengaktifkan respon dibahas seluruh dan menyebabkan variasi fenotipe yang substansial antara jaringan dan model sel, yang tidak konsisten dan pasti dikenal. Tentu saja, pemahaman apakah hirarki antara mekanisme respon hipoksia ada dan yang waktu dan kondisi masing-masing mekanisme untuk mengaktifkan tepat, akan meningkatkan pengetahuan kita tentang mekanisme biokimia yang mendasari hipoksia dalam sel, yang pada akhirnya dapat berkontribusi untuk menentukan target terapeutik pada hipoksia terkait penyakit. Untuk tujuan ini mungkin layak menyelidiki organisasi struktural hipoksia yang disebabkan dari kedua enzim rantai pernapasan dalam kompleks supramolekul dan perakitan ATP sintase untuk membentuk oligomer yang mempengaruhi produksi ROS [65] dan dalam struktur membran mitokondria [89], masing-masing. Sebuah penyelidikan pada waktunya di laboratorium kami menunjukkan pengaruh yang signifikan dari kondisi hipoksia menginduksi penurunan massa mitokondria dan kompleks rantai pernapasan, dan perubahan morfologi (naskah dalam persiapan).

Pekerjaan di masa depan akan terus mengeksplorasi efek hipoksia diinduksi dan membantu posisi fungsi mitokondria, dinamika dan sinyal dalam jalur seluler beberapa, termasuk mereka yang terlibat dalam banyak gangguan kompleks yang beragam, seperti tumor, cedera iskemik, komplikasi diabetes, dan hipoksia terkait neurodegeneration .