Infeksi Makrofag yang Tergantung Antibodi yang Disebabkan Oleh Sindorma Respirasi

Akut Berat Koronavirus

Ming Shum Yip1†, Nancy Hiu Lan Leung1†, Chung Yan Cheung2, Ping Hung Li1, Horace Hok

Yeung Lee1, Marc Daëron3,4, Joseph Sriyal Malik Peiris1, Roberto Bruzzone1,5* and Martial

Jaume1*

Abstrak

Latar Belakang: Risiko infeksi komunitas koronavirus masih menjadi perhatian publik dan

vaksinasi menjadi kunci dalam pencegahan kejadian Sindroma Respirasi Akut Berat

Koronavirus. Sebelumnya, kami telah melaporkan bahwa antibodi yang ditimbulkan dari

kandidat vaksin SARS-CoV yang berasal dari rekombinan yaitu trimer protein spike SARS-

CoV memicu infeksi lajur sel imun. Hal ini mendorong kami untuk meneliti mekanisme dan

respon molekuler infeksi makrofag yang melalui antibodi.

Metode: Kami menggunakan sel imun primer untuk mengevaluasi kerentanan terhadap

infeksi SARS-CoV dalam kondisi adanya antibodi anti-Spike. Kami menggunakan mikroskop

fluoresen dan Real-Time Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain

Reaction(RT-PCR) untuk menilai kejadian dan dampak infeksi. Kami menggunakan analisis

mutasi pada serial kontruksi potongan dan chimeric Fragment crystallizable γ Receptors

(FcγR) yang berikatan dengan pathogen untuk menilik lebih jauh mekanisme molekuler yang

mendasari.

Hasil: Kami mendapati serum anti-Spike meningkatkan infeksi makrofag melalui replikasi

SARS-CoV Spike-Pseudotyped Lentiviral Particles (SARS-CoVpp). Namun makrofag yang

terinfeksi tidak mendukung replikasi virus. IgG antiviral yang terpurifikasi dapat

meningkatkan infeksi, namun bukan faktor pada serum kekebalan tikus yang dapat terlarut

dan heat-inactivated. Infeksi melalui antibody tergantung pada anggota dari famili FcγRII,

yang menunjukkan kerentanan terhadap sel ST486 naif, walaupun ikatan dalam komplek

imun di permukaan FcγRII penting namun tidak cukup untuk memicu Antibody-Dependent

Enhancement (ADE) pada infeksi. Lebih lanjut, hanya FcγRII dengan domain sinyal

sitoplasma yang intak yang dapat mempertahankan ADE pada infeksi SARS-CoVpp,

sehingga dapat memberikan infomrasi lebih lanjut mengenai peran downstream signaling

FcγRII.

Simpulan: Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa makrofag dapat terinfeksi oleh SARS-CoV

melalui ADE yang dimediasi oleh IgE dan mengindikasikan infeksi ini membutuhkan rute

downstream signaling yang diaktivasi oleh ikatan reseptor FcγRII.

Kata Kunci: SARS-CoV, Spike, Antibody-Dependent Enhancement, Makrofag, Reseptor Fcγ,

Antibodi, Pseudotipe

Latar Belakang

Penatalaksanaan berkelanjutan virus respiratorik dalam setting masyarakat di pada dampak

global dari kejadian luar biasa SARS-CoV pada tahun 2003 [1], semenjak kemunculan

infeksi H5N1 pada manusia di banyak negara, khususnya Asia [2], dan infeksi H1N1 pada

manusia pada tahun 2009 [3]. Kegawatan pada masa kini terjadi di Arab peninsula of virus

baru yang berperan dalam Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV), [4,5] dan strain

baru H7N9 virus flu burung yang menginfeksi mansuai [6,7] di China terlalu rendah

menurunkan derajat kebutuhan untuk melanjutkan penelitian ini.

Dewasa ini telah disetujui SARS-CoV tidak hanya dapat menginfeksi saluran pernapasan

tetapi juga sistem organ lain dan beberapa laporan menunjukkan infeksi sel-sel hematopoietik

[8-10]; namun, mekanisme masuknya SARS-CoV yang tidak mengekspresikan SARS-CoV

receptor angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) [11,12] belum diketahui dengan baik.

Baik reseptor C-type lectin seperti liver/lymph node-specific intercellular adhesion molecule-

3-grabbing integrin (L-SIGN) atau dendritic cell specific intercellular adhesion molecule 3-

grabbing non-integrin (DC-SIGN) [13,14], begitu juga infeksi melalui antibodi dapat

memunculkan SARS-CoV dengan potensi perubahan tropisme.

Karena kekurangan strategi penanganan virus yang efektif untuk mengendalikan infeksi

koronavirus, vaksinasi masih dianggap sebagai pilihan utama untuk mencegah SARS dan

penyakit terkait. Sebelumnya kami menemukan bahwa calon vaksin SARS-CoV berdasarkan

rekombinan, full-length SARS-CoV Spike-protein trimer dipicu infeksi lini sel B meskipun

ternyata memunculkan in vivo respon imun penetral dan protektif pada hewan pengerat [15].

Baru-baru ini, penelitian kami menunjukkan bahwa antibodi anti-Spike mempotensiasi

infeksi kedua monositik dan cell-line kekebalan limfoid, tidak hanya oleh SARS-CoVpp

tetapi juga oleh SARS-coronavirus yang bereplikasi [16], sehingga memberikan bukti untuk

mekanisme baru dan serbaguna dimana SARS-CoV dapat masuk ke dalam sel target yang

tidak mengekspresikan reseptor virus ACE2 konvensional dan sebaliknya refrakter terhadap

virus. Infeksi jalur-jalur tersebut mungkin memiliki implikasi untuk memahami tropisme dan

patogenesis virus dan, oleh karena itu, kami diteliti lebih lanjut mekanisme molekuler dan

seluler di yang mendasari infeksi ADE SARS-CoV.

Hasil

Makrofag Primer Rentan Terhadap Infeksi SARS-Cov Melalui Jalur Antibodi

Karena dalam pengamatan kami sebelumnya mengungkapkan bahwa cell-line monositik

manusia THP-1 rentan terhadap infeksi ADE [16], kami meneliti terjadinya infeksi ADE

pada makrofag primer in vitro, pertama dengan mengambil keuntungan dari SARS-CoVpp

yang dapat aman digunakan dengan meniru proses masuknya virus [15,17]. Kami

menemukan bahwa SARS-CoVpp teropsonisasi lebih dari 80% dengan makrofag primer

dengan pengenceran 1: 1000 dengan anti-Spike serum sudah terinfeksi, sebagaimana

didapatkankan pada pewarnaan imunoflurosensi 72 jam pasca infeksi. Sebaliknya, sel-sel

terkena SARS-CoVpp teropsonisasi dengan serum kontrol tidak menunjukkan hasil

pewarnaan positif. Percobaan ini menguatkan pengamatan kami sebelumnya bahwa antibodi

anti-Spike memfasilitasi infeksi SARS-CoVpp pada makrofag. Kami selanjutnya menguji

apakah tropisme yang berubah ini juga ada pada replikasi SARS-CoV. Makrofag terinfeksi

oleh multiplicity of infection of 1 dengan pengenceran yang sama anti-Spike atau serum

kontol dan pola infeksi diperiksa dengan pewarnaan immunofluoresensi protein nukleokapsid

SARS-CoV dan RT-PCR kuantitatif RNA virus. Sinyal imunofluoresensi positif terdeteksi

hanya pada 6 HPI ketika SARS-CoV itu teropsonisasi dengan kontrol dan serum anti-Spike

serum. Menariknya, walaupun adanya serum kontrol menyebabkan infeksi sederhana SARS-

CoV (~ 5% dari sel), 4 kali lipat persentase sel positif tercatat dengan adanya serum anti-

Spike pada dua dari tiga donor. Pola infeksi meningkat seperti dengan jumlah salinan gen

virus yang terukur. Dengan demikian, jika dibandingkan dengan inokulum yang mengandung

serum kontrol, ada 2 sampai 3 kali lipat deteksi strand positif dan negatif dari gen virus di

makrofag terinfeksi dengan adanya serum anti-Spike pada 1 dan 6 hpi. Ada penurunan cepat

RNA virus 6-24 HPI pada kedua kondisi dan tidak ada perubahan lebih lanjut yang terdeteksi

pada waktu kemudian. Namun, perlu dicatat bahwa set primer yang digunakan untuk gen

nukleokapsid juga bisa mendeteksi strand negatif dari genome RNA virus dan tidak bisa

dibedakan dari bahan sub-genom. Selain itu, kami mengukur dengan RT PCR salinan

kuantitatif dari kedua nukleokapsid virus dan gen ORF1b dalam kultur supernatant untuk

menentukan pelepasan partikel SARS-CoV dari makrofag yang terinfeksi. Jumlah salinan

dari kedua RNA virus tidak berubah saat semua poin yang dipilih selama eksperimen (kurang

dari 200 salinan/ ml), terlepas dari apakah makrofag sudah terinfeksi dengan adanya serum

kontrol atau serum anti Spike.

Infeksi ADE SARS-CoVpp tergantung pada dosis fraksi IgG pada serum imun yang

dilemahkan panas

Kami telah menunjukkan bahwa serum anti-Spike tikus bisa memicu infeksi sel Raji [16].

Dalam konteks ADE, antibodi terhadap protein virus dianggap sebagai pemain utama dari

peningkatan [18,19]; lihat ulasan [20,21]. Untuk menghilangkan kemungkinan ikutsertanya

faktor yang terlarut lainnya selama ADE pada SARS, di bagian ini kita menyelidiki

kemampuan antibodi anti-Spike tersendiri dalam meningkatkan infeksi sel imun. Kami

dimurnikan IgG dari protein G-sepharosa kromatografi dari anti-Spike tikus dan serum

kontrol, dan digunakan pengenceran 2 kali lipat serial 10-,125 ug/mL bagian dimurnikan

untuk membentuk kompleks imun dengan SARS-CoVpp dan kemudian menginfeksi sel Raji.

Hasilnya menunjukkan bahwa IgG yang telah dimurnikan dari serum anti-Spike tikus

memicu infeksi dalam sel Raji, lebih jelasnya dengan meningkatnya konsentrasi

imunoglobulin. Flow through dari serum yang sama, yang diencerkan dengan faktor yang

sesuai untuk menjadi sebanding dengan konsentrasi IgG akhir yang digunakan, menimbulkan

tidak ada infeksi terdeteksi pada seluruh konsentrasi. Perbedaan signifikan antara infeksi

ADE dengan IgG anti-Spike tikus yang dimurnikan dan flow-through diamati pada

konsentrasi 10 dan 2,5 mg / mL, dan perbedaan marjinal 0,625 ug / mL. Seperti yang

diharapkan, IgG yang dimurnikan maupun flow through dari kontrol tidak memicu ADE yang

signifikan dari infeksi pada semua konsentrasi.

Penentu molekul FcγRII yang mendasari ADE SARS-CoVpp

Penelitian terbaru kami telah mengungkapkan peran dominan FcγRII (CD32) dalam mediasi

ADE SARS-CoV[16]. Untuk mendapatkan informasi lebih lanjut ke dalam mekanisme

molekuler yang mendasari kami telah menyelidiki keterlibatan domain yang berbeda dari

FcγRII dalam mediasi ADE. Untuk tujuan ini kami menghasilkan serangkaian konstruksi

potongan yang hanya membawa ectodomain dan domain transmembran FcγRII, dan

konstruksi chimeric dengan ectodomain satu reseptor dan transmembran serta endodomain

lain. Kami kemudian memverifikasi ekspresi konstruksi ini pada sel ST486 dengan sitometri

menggunakan antibodi monoklonal spesifik (clone FLI8.26) yang mengikat Ig-like kedua

D2γ dari FcγRII. Dari catatan, porsi ikatan Fc dari kelompok FcγRII sangat mirip antara

FcγRIIA-H131, FcγRIIA-R131, FcγRIIB1 [22] dan juga FcγRIIB2, karena muara struktur

ekstraseluler identik seperti FcγRIIB1. Temuan kami menunjukkan bahwa semua FcγRII

terdeteksi (abu-abu gelap) dalam sel ST486 dibandingkan dengan isotope kontrol (abu-abu

terang). Kami kemudian menguji kemampuan berbagai konstruksi untuk mengikat kompleks

imun anti-Spike yang dimurnikan IgG-SARS-CoVpp dan mendapati bahwa semua

transfectants ST486 mampu mengikat kompleks imun. Akhirnya kami menyelidiki apakah

perbedaan dalam kerentanan terhadap infeksi ADE SARS-CoVpp yang diberikan oleh

berbagai konstruksi FcγRII. Ketika imun kompleks yang dibentuk oleh 5 mg/mL anti-Spike

IgG tikus yang dimurnikan (konsentrasi dimana tingkat infeksi tertinggi diamati pada sel

Raji) dan SARS-CoVpp ditambahkan ke sel ST486 yang mengekspresikan FcγRII, keempat

transfectants mengekspresikan bentuk wildtype FcγRII (cf. FcγRIIA-H vs. FcγRIIA-R, dan

FcγRIIB1 vs FcγRIIB2, sesuai dengan konstruksi 1, 5, 9, 10, masing-masing) yang terinfeksi,

dengan ST486 yang mengekspresikan FcγRIIA menjadi lebih rentan terhadap infeksi

daripada FcγRIIB (cf. konstruksi 1,5 dan 9). Semua konstruksi potongan endodomain

(FcγRIIA-H IC., FcγRIIA-R. IC dan FcγRIIB. IC, sesuai dengan konstruksi 2, 6, 11 masing-

masing) tidak rentan terhadap infeksi ADE, menunjukkan bahwa pengikatan kompleks imun

anti-Spike IgG-SARS-CoVpp tidak cukup untuk membantu dan memerlukan sinyal

endodomain yang kompeten. Namun, tidak semua konstruksi chimeric mampu

mempertahankan infeksi ADE, mengindikasikan bahwa domain swapping mungkin memiliki

menganggu transduksi sinyal. Jadi hanya chimera dengan ektodomain FcγRIIA-H dan

endomain FcγRIIB1, atau dengan ektodomain FcγRIIB dan endomain FcγRIIA,

menunjukkan infeksi ADE signifikan secara statistik. Hal ini tidak dapat dijelaskan oleh

perbedaan dalam ekspresi permukaan atau pengikatan pseudopartikel yang teropsonisasi,

seperti FcγRIIB.EC/IIA.IC (viz., kontruksi 12) menunjukkan ADE kuat meskipun

kemampuan mengikat kompleks imunnya terendah.

Diskusi

Kemungkinan respon kekebalan terhadap patogen mungkin juga memiliki efek merusak pada

homeostasis host dan hal ini telah menjadi fokus dari beberapa penelitian. Sebagai contoh,

hiperinduksi sitokin setelah infeksi flu burung telah terlibat dalam tingkat keparahan dari

penyakit [23] dan infeksi sel melalui ADE telah diketahui terjadi pada beberapa penyakit

virus [20,21]. Di sini menunjukkan bahwa antibodi anti-Spike mempotensiasi infeksi sel

kekebalan primer manusia dengan SARS-CoVpp dan SARS-coronavirus yang dapat

bereplikasi.

Meskipun kami jelas memperoleh bukti berlangsungnya infeksi (misalnya, de novo sintesis

protein virus struktural N), makrofag ADE yang terinfeksi tidak mendukung replikasi

produktif SARS-CoV dan setelah inisiasi gen virus untuk transkripsi dan sintesis protein,

proses replikasi terhenti dalam siklus tanpa pengeluaran virus. Replikasi SARS-CoV yang

gagal menjadi makrofag telah didokumentasikan [24] tetapi, berbeda dengan laporan

sebelumnya ini di mana 90% dari makrofag terinfeksi oleh SARS-CoV tanpa serum imun

(MOI = 1-2), kami mengamati tingkat infeksi yang jauh lebih rendah (sekitar 5-7%). Salah

satu kemungkinan adalah bahwa perbedaan tersebut mungkin karena perbedaan waktu

sampling (6 jam dalam penelitian kami terhadap 15 jam dalam penelitian Cheung) dan

protokol yang digunakan untuk in vitro diferensiasi (yaitu, makrofag dibedakan dengan

adanya serum janin anak sapi dalam penelitian kami, dan plasma autolog telah dihilangkan

dua hari sebelum infeksi [8]), yang mengarah ke perbedaan infektivitas sel. Atau, kita juga

harus mempertimbangkan bahwa pembacaan eksperimen pseudopartikel adalah ekspresi gen

reporter luciferase, yang berada di bawah kendali HIV backbone.

Hal ini dapat menyebabkan tingkat ekspresi protein yang lebih tinggi jika dibandingkan

dengan replikasi yang gagal pada infeksi SARS-CoV pada makrofag. Dengan demikian,

perbedaan ini mungkin disebabkan sebagian karena ketidakmampuan untuk mendeteksi

jumlah rendah protein Spike oleh imunofluoresensi dan sensitivitas yang berbeda dari dua

metode. Dari catatan, pemasukan yang dimediasi anti-Spike lebih spesifik untuk partikel

Spike yang pseudotipe, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1 dari [16].

Karena pengamatan klinis telah melaporkan buruknya kondisi pada pasien SARS pada fase

awal tertular [25-27], akan menarik untuk diuji dan dikumpulkan kondisi pasien SARS pada

waktu yang berbeda-beda setelah onset SARS. Namun, kami belum mampu untuk melakukan

tes konklusif pada perpustakaan serum; Selain itu, kita harus menyadari kemungkinan bahwa

ADE hanya mungkin terjadi dalam celah sempit selama infeksi dan hanya dalam subset dari

pasien yang terinfeksi. Kemungkinan alternatif bahwa internalisasi oleh makrofag mungkin

sebenarnya merupakan mekanisme tambahan untuk mengendalikan penyebaran virus

memerlukan penyelidikan lebih lanjut.

Secara umum, penelitian ini bertujuan untuk meningkatan pemahaman yang lebih baik

tentang ADE pada infeksi virus dan berfokus pada identifikasi apakah reseptor imun dan/

atau komponen serum yang memungkinkan penetrasi patogen ke dalam sel target, juga

dikenal sebagai ADE ekstrinsik, atau hilir untuk infeksi ADE- atau ADE intrinsik [20,21,28].

Hasil kami sebelumnya menunjukkan bahwa hanya FcγRIIA dan, pada tingkat lebih rendah,

FcγRIIB1 yang memicu infeksi melalui SARS-CoVpp dengan adanya serum anti-Spike [16].

Meskipun ia telah diharapkan juga dapat menghalangi percobaan FcγR blocking dalam

makrofag, koekspresi semua FcγRs di sel-sel ini [29,30] akan menyebabkan blokade antibodi

untuk mengikat tidak hanya untuk FcγR target melalui bagian Fab, tetapi juga untuk FcγR

lainnya melalui bagian Fc mereka membuat kedua FcγRs tidak tersedia untuk interaksi

dengan pseudopartikel yang teropsonisasi dan akan mencegah interpretasi hasil yang ambigu.

Oleh karena itu kami meneliti molekul/ sinyal yang dibutuhkan untuk mendasari infeksi

SARS-CoV yang dimediasi FcγRII dan menilai kontribusi relatif dari ekstraseluler dan

transmembran dan domain intraseluler dari anggota famili Fcγ reseptor II dalam mediasi

infeksi ADE. Domain ikatan IgG ekstraselular FcγRIIA dan FcγRIIB berhubungan erat

dengan 78% dari homologi pada tingkat asam amino. Meskipun demikian, dua reseptor ini

memiliki kemampuan yang berbeda dan afinitas untuk mengikat imunoglobulin [31]. Selain

itu, FcγRIIA membawa sebuah Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif (ITIM),

yang memberi reseptor IgG sifat reseptor efektor yang berbeda [29,30,32]. Secara

keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa ikatan antara SARS-CoVpp ke sel melalui

domain ekstraseluler FcγRs tidak cukup untuk memicu infeksi ADE karena membutuhkan

domain intraseluler yang intak. Memang, terlepas dari tingkat ekspresi yang mirip dengan

permukaan sel dibandingkan dengan FcγRII wildtype, semua reseptor FcγRII bermutasi

memiliki pemotongan dari domain intraseluler mereka (FcγRII IC) menjadi tidak dapat

memicu ADE infeksi sementara tetap mempertahankan tingkat kemampuan ligan untuk

mengikat. Hasil yang diperoleh dari seluruh konstruksi chimeric domain intraseluler FcγRIIA

dan FcγRIIB bertukar memberikan dukungan lebih lanjut untuk interpretasi ini. Dari catatan,

transmembran dan domain intraseluler muncul menambah kerentanan terhadap infeksi

FcγRII parental. Dengan demikian, wildtype FcγRIIA menimbulkan ADE lebih besar dari

FcγRIIB dan mencangkok bagian sitoplasma dari FcγRIIB mengurangi kerentanan terhadap

ADE dari chimera dengan FcγRIIA domain ekstraseluler ke tingkat yang sebanding dengan

yang diamati untuk potongan FcγRIIA mutan.

Namun, hubungan antara internalisasi kompleks imun dan infeksi ADE oleh SARS-CoV

melalui FcγRIIs tampaknya menjadi proses yang kompleks. Dengan demikian, FcγRIIB2

telah terbukti untuk menengahi internalisasi kompleks imun pada tingkat yang lebih cepat

daripada FcγRIIA [33], sedangkan kami menemukan bahwa infeksi ADE melalui FcγRIIA

lebih menonjol dibandingkan dengan FcγRIIB. Baru-baru ini, keterlibatan dari sinyal

downstream dipicu oleh aktivasi FcγRs telah dievaluasi dan ditemukan bahwa berhubungan

dengan ADE infeksi virus dengue [34]. Dengan demikian, pencabutan kompetensi

penyaluran sinyal FcγRI dan FcγRII dikaitkan dengan penurunan yang signifikan dari

fagositosis, tetapi hanya kegagalan penyaluran sinyal FcγRI yang tidak bias memicu ADE

pada virus dengue. Sebaliknya, tidak ada efek yang terlihat pada infektivitas virus dengue

pada kompleks imun pada kedua wildtype dan FcγRIIA yang inkompeten dalam penyaluran

sinyal. Temuan ini menunjukkan perbedaan mendasar antara FcγRIA dan FcγRIIA

sehubungan dengan kemampuan meningkatkan kekebalan tubuh dan menunjukkan bahwa

perbedaan mekanisme dapat berlangsung antara FcγR ini pada virus dengue untuk masuk

dalam kompleks imun [34].

Simpulan

Hasil kami menunjukkan bahwa, adanya antibodi terhadap antivirus yang ditimbulkan vaksin,

SARS-CoV menampilkan tropisme yang berubah ke arah sel imun primer, yang tidak

mengekspresikan reseptor virus konvensional dan sebaliknya refrakter terhadap virus.

Sejumlah kandidat vaksin SARS telah diuji pada model hewan percobaan [35,36], banyak

yang didasarkan pada glikoprotein Spike virus sebelumnya diidentifikasi sebagai yang paling

imunogenik menginduksi antibodi penetral dan pelindung [14,15,37,38]. Dari catatan,

beberapa vaksin terhadap coronavirus hewan juga telah muncul, tapi pengembangannya telah

terbukti sulit karena peningkatan kekebalan tubuh dari penyakit pada ADE [39-41]. Terlepas

dari kenyataan bahwa jalur infeksi alternatif ini tampaknya memiliki dampak yang terbatas,

tetap menarik untuk menimbang peranan infeksi SARS-CoV yang dimediasi antibodi pada

fungsionalitas sel target, demi memahami tropisme dan patogenesis virus dan mengevaluasi

potensi jebakan yang terkait dengan imunisasi terhadap coronavirus manusia. Aspek ini

memiliki relevansi lebih terhadapt kegawatan Mers-CoV menunjukkan bahwa ketersediaan

vaksin virus, yang telah menunjukkan kemampuan untuk menangani lintas spesies, adalah

salah satu dari beberapa pilihan yang tersedia untuk mencegah penyebaran infeksi

menyebabkan penyakit berat dengan angka kematian yang tinggi pada manusia [42].

Bahan dan metode

Cell line dan vektor ekspresi

Cell line berikut yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari American Type Culture

Collection (ATCC; Manassas, VA, USA): HEK293T (sel epitel ginjal manusia; CRL-11268),

Raji (Burkitt limfoma / B limfosit-ledakan), ST486 (limfoma / B lymphoblast Burkitt yang

kurang ekspresi FcγR; CRL-1647). Sel HEK293T yang dikultur di DMEM dilengkapi dengan

10% serum janin sapi yang dilemahkan dengan panas, 0,6 mg / l penisilin dan 60 mg / l

streptomisin, sedangkan sel-sel hematopoietik yang tumbuh di RPMI-1640 ditambah dengan

10% panas dilemahkan FBS (Fetal Bovine Serum), 1% non-esensial amino-asam, 4 mM L-

glutamine, 1 mM natrium piruvat, 0,6 mg / l penisilin, 60 mg / l streptomisin, dan 20 pM 2-ß-

mercaptoethanol (semua dari invitro-gen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Semua sel

dipertahankan pada 37°C dalam suasana dilembabkan dengan pasokan CO2 5%.

Kultur makrofag derivat monosit

Protokol penelitian telah disetujui oleh Institutional Review Board dari Universitas Hong

Kong / Hospital Au-thority Hong Kong Barat Cluster (UW09-375). Darah sampel dari donor

yang sehat diperoleh dari Hong Kong Palang Merah Pelayanan Transfusi Darah. Sel-sel

darah manusia diisolasi dari mantel buffy dan makrofag derivat monosit dihasilkan in vitro

menggunakan protokol dimodifikasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [24,43]. Secara

singkat, sel mononuklear diisolasi oleh kepadatan gradien Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech,

Uppsala, Swedia) untuk menghapus eritrosit, granulosit, dan sel debris. Monosit yang

diperkaya dengan plastic adherence, dipanen, dilakukan pembibitan (106 sel/ml) pada piring

kultur dan memungkinkan untuk dilihat selama 14 hari di hadapan 5% plasma manusia

autologus dan 1% serum janin anak sapi sebelum digunakan. Kemurnian makrofag adalah

secara konsisten di atas 90%, seperti yang dipastikan oleh imunofluoresensi pewarnaan untuk

CD68 manusia, glikoprotein lisosomal yang dieskpresikan sangat baik oleh makrofag dan

monosit [44,45].

Produksi serum imun anti-Spike

Tikus BALB/c diimunisasi dengan protein rekombinan Spike SARS-CoV ditambah dengan

tawas, seperti yang dijelaskan sebelumnya [15,16]. Tikus yang disuntikkan larutan garam

sebagai kontrol. Serum dikumpulkan pada hari 55 pasca-imunisasi, dinonaktifkan dengan

panas selama 30 menit pada 56°C dan disimpan pada suhu -20°C untuk penggunaan

selanjutnya.

Produksi dan penggunaan partikel lentiviral pseudotipe dengan SARS-CoV Spike

Protokol untuk menghasilkan SARS-CoV pseudotipe partikel lentivirus mengekspresikan gen

reporter luciferase (SARS-CoVpp) telah dijelaskan di tempat lain [17]. Berikut langkah

pemurnian dari 20% sucrose cushion, partikel virus terkonsentrasi dititrasi dengan ELISA

untuk lentivirus terkait HIV-1 protein p24 menurut instruksi produsen (Sel Biolabs, Inc, San

Diego, CA, USA), dan disimpan pada -80°C sampai digunakan. Untuk tes ADE, anti-Spike

tikus yang dilemahkan panas atau serum kontrol diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C

dengan SARS-CoVpp. Inokulum ini diendapkan pada sel dan infeksi melanjutkan selama 1

jam pada 37°C. Setelah sel dicuci berulang diinkubasi selama 60-65 jam tambahan dan

kemudian tetap dalam paraformaldehyde 4% (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)

untuk dilihat pada mikroskop immunofluoresen.

Infeksi SARS-CoV yang dapat bereplikasi

Prosedur laboratorium yang melibatkan virus bereplikasi dilakukan di Biosafety Level-3

Containment (State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, University of Hong

Kong). Strain SARS-CoV yang digunakan (HK39849) adalah isolat klinis [46], yang dikultur

di sel janin rhesus ginjal-4 (FRhK-4, kode ATCC CRL-1688). anti-Spike tikus yang

dilemahkan panas atau serum kontrol diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C dengan

SARS-CoVpp dan makrofag derivat monosit terinfeksi pada MOI dari 1 selama 60 menit

pada 37 ° C. Dicuci setelah berulang, sel dikultur dengan media segar (waktu 0) ditambah

dengan 2% FBS untuk titik waktu terindikasi (jam) pasca infeksi dan tetap di 4%

paraformaldehyde (Sigma-Aldrich Inc.) untuk imunofluoresensi mikroskop, atau disuspensi

dalam lisis buffer (buffer RLT, RNeasy RNA Mini kit; QIA-GEN, Germantown, MD, USA)

untuk real-time kuantitatif RT-PCR. Sampel kultur sel supernatan dipanen pada HPI yang

berbeda juga dicampur dengan penyangga RLT dan diproses seperti di atas untuk RT-PCR.

Imunofluoresensi mikroskop

Infektivitas SARS-CoV yang dapat bereplikasi ditunjukkan oleh imunofluoresensi secara

tidak langsung dengan antibodi monoklonal tikus yang ditujukan terhadap SARS-CoV

nukleosida-kapsid protein (clone 4D11, sebuah hadiah dari Dr. Kwok-Hung Chan,

Departemen Mikrobiologi Klinik, Queen Mary rumah sakit, Hong Kong), pada pengenceran

1: 200. Pewarnaan terungkap dengan tetramethylrhodamine-5- (dan-6) -isothiocyanate

(TRITC) conjugated goat anti-mouse antibody (Invitrogen Life Technologies) pada

mikroskop AxioObser-ver Z1 (Carl Zeiss, Inc, Thornwood, New York, Amerika Serikat).

Gambar yang diambil dari 5 bidang yang dipilih secara acak di sebuah perbesaran 400X

diperoleh dengan kamera AxioCam MRm dan dianalisis dengan software Metamorph

(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Infektivitas ditentukan sebagai persentase sel

mengekspresikan virus antigen. Prosedur pewarnaan serupa digunakan untuk menilai-

bernyanyi infeksi oleh SARS-CoVpp, kecuali untuk penggunaan imunofluoresensi langsung

dengan fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated goat antibody monoklonal spesifik

untuk luciferase kunang-kunang (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) pada pengenceran 1:

100.

Real-time kuantitatif RT-PCR untuk ekspresi gen virus

RNA diekstraksi dengan RNeasy RNA Mini kit (QIAGEN), menurut rekomendasi produsen;

konsentrasi dan kemurnian RNA diukur dengan metode optik standar. Sebaliknya transkripsi

dilakukan total RNA dengan reverse transcriptase Superscript III sebagaimana ditentukan

oleh produsen (Invitrogen Life Technologies). Untuk kuantifikasi salinan gen SARS-CoV,

cDNA yang dihasilkan dalam reaksi terpisah maju maupun terbalik primer yang spesifik

untuk nucleokapsid dan gen ORF1b yang mengamplifikasi strand negatif dan positif RNA

virus. Pengujian ini memungkinkan membedakan antara sinyal yang dihasilkan oleh

masuknya virus yang mencerminkan proses replikasi aktif [47]. Primer spesifik dan probe

TaqMan Kecil Groove Binder digunakan untuk mendeteksi gen nukleokapsid SARS-CoV

telah dijelaskan sebelumnya [48]. Namun, perlu dicatat bahwa set primer yang digunakan

untuk gen nukleokapsid juga bisa mendeteksi strand negatif dari RNA virus dan tidak bisa

membedakannya dari bahan sub-genom. The qPCR assay dilakukan dalam volume akhir dari

20 ml dan sinyal fluoresensi itu dideteksi dengan LightCycler 480-II (Roche Sains Terapan,

Mannheim, Jerman) diprogram sebagai berikut: 95°C selama 10 menit, diikuti oleh 45 siklus

95°C selama 10 detik, 60°C selama 30 detik, dan 72°C selama 1 detik. Hasil dinyatakan

sebagai jumlah target eksemplar per 108 salinan gen 18S rRNA, yang digunakan untuk

menormalkan hasil. Untuk memastikan konsistensi pengukuran qPCR selama periode waktu

penelitian, batch yang sama pada primer dan probe digunakan. Hasil qPCR dianggap valid

apabila efisiensi kurva standar adalah antara 1,9-2,1 dan nilai R2 lebih besar dari 0,99.

Pemurnian IgG dari serum tikus

IgG dimurnikan dari tikus yang diimunisasi dan kontrol menggunakan protein G-sepharosa

(GE Healthcare, Little Chalfont, Inggris) sesuai dengan rekomendasi pabrik. Kemurnian

fraksi IgG diperiksa dengan pewarnaan perak berikut elektroforesis gel dan konsentrasi anti-

Spike IgG ditentukan oleh ELISA.

Pembangunan vektor lentiviral untuk wildtype, bentuk endodomain potongan dan chimeric

dari FcγRII (hCD32)

Strategi untuk menghasilkan plasmid wildtype untuk reseptor IgG manusia (FcγRs) dengan

mengganti Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) gen dari vektor bicistronic

pCHMWS-eGFP_IRES_Hygromycin (hadiah dari Drs Rik Gijsbers. Dan Zeger Debyser,

Katholieke Uni- versiteit Leuven, Belgia) dengan urutan coding untuk FcγRIIA (hCD32a)

isoform (FcγRIIA.R131 dan FgRIIA H131 GenBank aksesi No NM_021642) dan FcγRIIB1

(hCD32b;. GenBank aksesi No AF543826) dikutip oleh BglII dan SalI situs, seperti yang

dijelaskan di tempat lain [16]. Urutan sintetis (GeneArt, Regensburg, Jerman) dimasukkan ke

transfer plasmid asli untuk menghasilkan tipe liar konstruksi. pCHMWS-

FcγRIIB2_IRES_Hygromycin dibangun dengan menukar domain intraseluler FcγRIIB2,

diperoleh dari RT-PCR amplifikasi urutan yang diinginkan dari poliklonal Raji cDNA,

dengan wilayah yang sesuai dari pCHMWS-FcγRIIB1_IRES_Hygromycin. Konstruksi

wildtype yang kemudian digunakan untuk menghasilkan bentuk potongan dan chimeric dari

FcγRIIs dengan teknik standar. Semua plasmid disekuensi oleh Pusat Genomic Ilmu dari

University of Hong Kong. Generasi cell-line ST486 stabil mengekspresikan wildtype dan

FcγRs bermutasi menggunakan lentiviral berdasarkan partikel-transduksi gen. Cell line yang

dihasilkan oleh transduksi sel ST486 monoklonal dengan partikel lentiviral virus vesikular

stomatitis (VSV) G pseu-dotyped berlambang transgen ditentukan seperti yang dijelaskan

sebelumnya [16]. Pada 2 hari pasca-infeksi, ekspresi permukaan sel dari FcγRs dipantau oleh

aliran cy-tometry dan sel-sel yang kemudian dibiakkan dalam media selektif yang

mengandung 250 mg / ml higromisin (Invitrogen Life Technologies) jika diperlukan.

Akhirnya, beberapa baris sel monoklonal untuk setiap konstruk diisolasi dan ekspresi

transgen dikonfirmasi oleh aliran sitometri.

Evaluasi ekspresi FcγR pada ST486 transfected jalur sel dengan sitometri

Ekspresi FcγRIIs dievaluasi oleh aliran cytometry seperti yang dijelaskan dalam [16]. The

MAbs tikus berikut adalah MOPC-21 (IgG1, κ) atau MPC-11 (IgG2b, κ) kontrol isotipe (baik

dari BioLegend, San Diego, CA, USA). Sel dicuci dan antibodi primer mengikat terungkap

dengan pewarnaan di atas es selama 30 menit dengan kambing FITC-terkonjugasi antibodi

anti-tikus (Jackson Immu-noResearch, West Grove, PA, USA). Data dikumpulkan dari

setidaknya 10.000 sel-sel hidup singlet pada aliran LSRII CYT-ometer (BD Biosciences, San

Jose, CA, USA) dan dianalisis menggunakan software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR,

USA).

Pengikatan kompleks imun dengan FcγRII

Kompleks imun SARS-CoVpp-IgG diperoleh dengan menginkubasi SARS-CoVpp dengan

30ug/ml baik anti-Spike tikus terpurifikasi atau kontrol IgG pada 37 ° C selama 1 jam.

Campuran itu kemudian didinginkan dengan cepat di atas es selama 10 menit dan

ditambahkan (100 ml/well) ke sel ST486 (3×105 sel/well), yang sebelumnya telah diwarnai

dengan 0,1% pewarnaan fixable viability eFluor 660 (eBioscience, San Diego, CA, USA).

Setelah diinkubasi 1 jam di atas es, sel dicuci dua kali dengan PBS dingin, difiksasi dengan

1% paraformaldehyde selama 20 menit pada es dan ikatan kompleks imun terdeteksi dengan

pewarnaan dengan 5 mg/ml FITC-Conjugated Goat Anti-Mpuse F(ab')2 (Jackson

ImmunoResearch) pada suhu 4°C selama 30 menit. Data dikumpulkan dan dianalisis seperti

dijelaskan di atas.

Analisis statistik

Hasilnya menunjukkan rata-rata±SEM dari jumlah pengamatan. Perbedaan statistik antara

kelompok diuji dengan t-test tidak berpasangan dengan tingkat signifikansi 0,05.