81

J Kedokter Trisakti Vol.23 No.3

Studi in vitro : hambatan zink sulfat terhadappertumbuhan kuman Salmonella

Julius E. Suryawidjaja*, Elly Herwana**, Adi Hidayat***, dan Murad Lesmana**Bagian Mikrobiologi, **Bagian Farmakologi, dan ***Bagian Kesehatan Masyarakat,

Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti

ABSTRAK

Suplementasi zink dilaporkan dapat mengurangi lama dan beratnya diare dengan cara mempercepat terjadinyapenyembuhan dan regenerasi sel-sel epitel intestinal yang mengalami kerusakan. Di antara kuman-kuman yangmenyebabkan diare, Salmonella masih tetap menjadi masalah kesehatan yang utama. Mekanisme kerja efek langsungzink terhadap kuman penyebab diare Salmonella belum pernah dilaporkan. Penelitian ini bertujuan menilai efekhambatan zink sulfat terhadap pertumbuhan galur klinis Salmonella enterica ser. Typhi dan Salmonellae non-tifoid.Hasil penelitian menunjukkan, sebanyak 15% isolat Salmonella ser. Typhi mengalami hambatan oleh zink sulfatpada konsentrasi 1,0 mg/mL dan hambatan terhadap seluruh isolat ditunjukkan pada konsentrasi zink sulfat sebesar1,8 mg/mL. Setelah galur Salmonella ser. Typhi, Salmonella ser. Typhimurium, dalam jumlah 7%, juga telah dihambatoleh zink sulfat pada konsentrasi 1,0 mg/mL. Salmonellae lainnya menunjukkan hambatan pertumbuhan oleh zinksulfat antara konsentrasi 1,2 mg/mL dan 2,0 mg/mL. Salmonella ser. Paratyphi A adalah satu-satunya spesies Salmonellayang memperlihatkan rentangan konsentrasi hambatan zink yang sempit yaitu antara 1,2 1,6 mg/mL. Studi invitroini menunjukkan bahwa zink menghambat pertumbuhan serotipe Salmonella yang seringkali merupakan penyebabdiare.

Kata kunci : Zink sulfat, hambatan, pertumbuhan, Salmonella, diare

An in vitro study : inhibition effect of zinc sulfateon growth of Salmonella species

ABSTRACT

Zinc supplementation has been reported effective in reducing the duration and severity of diarrhea byenhancing the recovery and regeneration of impaired intestinal epithelial cells. Among enteropathogens thatcause diarrhea, Salmonella species are one of the major pathogens causing diarrheal diseases. Effect of zinc ongrowth of Salmonella species had never been reported. This study was undertaken to evaluate the inhibitioneffect of zinc sulfate on growth of Salmonella species. A number (15%) of Salmonella ser. Typhi strains testedwere inhibited by zinc sulfate of 1.0 mg/mL and were completely inhibited at the concentration of zinc sulfate of1.8 mg/mL. Following Salmonella ser. Typhi was Salmonella ser. Typhimurium, of which 7% were also beginningto be inhibited by zinc sulfate at 1.0 mg/mL. Other Salmonellae were inhibited by zinc sulfate at concentrationsbetween 1.2 mg/mL and 2.0 mg/mL. However, Salmonella ser. Paratyphi A was the only Salmonella species whichshowed a narrow range of zinc inhibition concentrations, between 1.2 1.6 mg/mL. This in vitro study indicatethat zinc has an inhibition effect on growth of Salmonella serotypes which was found as the causative agents ofdiarrheal diseases.

Key words : Zinc sulfate, inhibition, growth, Salmonella, diarrhea

Surjawidjaja, Herwana, Hidayat, Lesmana Hambatan zink terhadap Salmonella

82

PENDAHULUAN

Penyakit infeksi diare merupakan kausa utamadari morbiditas dan mortalitas pada anak-anak diseluruh dunia. Pada anak-anak di bawah usia 5tahun dilaporkan setiap tahun sekitar 1,5 miliarepisode dan 1,5 - 2,5 juta kematian akibat diare.(1,2)

Diare terjadi umumnya di daerah dengan kondisisanitasi dan hygiene lingkungan buruk, penyediaanair yang tidak memadai, kemiskinan, sertapendidikan yang masih terbatas, seperti yangbanyak dijumpai di negara-negara berkembang.(2)

Survei Kesehatan Nasional yang diselenggarakanoleh Departemen Kesehatan Republik Indonesiapada tahun 2001 menunjukkan sekitar 9,4%kematian pada bayi-bayi dan 13,2% pada anak-anak yang berumur antara 1-4 tahun, disebabkanoleh karena diare.(3) Meskipun penggunaan larutanrehidrasi oral telah berhasil secara substansialmenurunkan mortalitas diare di seluruh dunia,namun morbiditas infeksi diare masih tetap tinggidan merupakan masalah kesehatan masyarakat.(1,4)

Di antara kuman-kuman yang menyebabkandiare, Salmonella masih tetap menjadi masalahkesehatan yang utama. Salmonellosis nontifoid dantifoid jelas merupakan penyakit yang terjadidiakibatkan oleh makanan (foodborne disease).Walaupun dilaporkan bahwa insidens penyakittifoid selama beberapa tahun ini stabil, kasus-kasussalmonellosis nontifoid meningkat di mana-manadi dunia.(4) Sejak lebih dari dua dekade terakhir,insidens infeksi Salmonella nontifoid di beberapanegara naik dengan pesat sehingga mencapaitingkat epidemik.(5,6) Infeksi oleh nontifoidSalmonella biasanya merupakan suatugastroenteritis yang sembuh sendiri (self-limiting)dan tidak membutuhkan pengobatan antibiotika,namun sekuele yang serius meliputi infeksi sistemikdan kematian seringkali terjadi.(6) Pada keadaan inisering kali antibiotika sangat dibutuhkan. Namun,akhir-akhir ini banyak galur Salmonella yang telahberkembang menjadi resisten terhadap satu ataulebih (multi-resisten) antibiotika yang lazimdigunakan pada pengobatan diare.

Penggunaan zink untuk pengobatan beberapapenyakit serta efek dari suplementasi zink terhadappenyakit diare telah banyak dilaporkan.(7-9)

Suplementasi zink terbukti secara efektifmengurangi lamanya serta beratnya penyakit diarepada anak di bawah usia 3 tahun.(7) Efek inidilaporkan konsisten pada semua penelitiansuplementasi zink terhadap infeksi diare. Meskipunmekanisme kerja zink pada kasus-kasus diare belumsecara keseluruhan dimengerti, namun hasil daribeberapa penelitian menunjang observasi tentangefek positif zink untuk mencegah terjadinya diareberkelanjutan atau diare kronik dengan caramempercepat penyembuhan dan regenerasi sel-selepitel usus yang rusak yang disebabkan olehdiare.(8,9)

Sejauh ini, laporan-laporan mengenaisuplementasi zink dalam kaitan dengan penyakitinfeksi diare hanya sampai pada kesimpulan bahwazink mempunyai efek di dalam memperbaikikerusakan usus serta mengembalikan fungsinyayang meliputi absorpsi cairan dan elektrolit, sertameningkatkan respons imunitas setempat.(9)

Sedangkan efek langsung zink terhadap kumanpenyebab diare belum pernah dilaporkan.

Penelitian ini bertujuan menilai efek hambatanzink sulfat terhadap pertumbuhan spesies kumanSalmonella, khususnya serotipe yang seringdijumpai sebagai penyebab diare.

METODE

Medium agar zink sulfat (ZSA)Larutan zink sulfat dibuat dengan cara

melarutkan 0,2 g ZnSO4.7H2O ke dalam 10 mLair suling (distilled water) untuk mendapatkankonsentrasi zink sulfat sebesar 20 mg/mL (larutaninduk). Larutan disterilkan dengan cara filtrasi,menggunakan filter Millipore (Millipore Co.,Bedford, MA). Dari larutan induk ini (20 mg/mL),diambil berbagai volume untuk ditambahkankepada agar Mueller Hinton cair (500C) sampaivolumenya menjadi 20 mL sehingga didapatkankonsentrasi zink sulfat tertentu dalam agar MuellerHinton. Agar yang mengandung zink sulfat inikemudian dituang ke dalam lempeng petri dandibiarkan dingin dan membeku pada suhu kamar.Dengan cara ini diperoleh medium agar zink sulfat(ZSA) dengan kandungan zink sulfat pada masing-masing medium sebesar 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL,

83

J Kedokter Trisakti Vol.23 No.3

0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL, 1,0 mg/mL, 1,2 mg/mL, 1,4mg/mL, 1,6 mg/mL, 1,8 mg/mL, dan 2,0 mg/mL.

Isolat kumanIsolat kuman patogen enterik yang digunakan

pada studi ini adalah isolat klinik Salmonella yangberasal dari penderita diare dan merupakankumpulan isolat (stock cultures) di LaboratoriumMikrobiologi Fakultas Kedokteran UniversitasTrisakti. Masing-masing isolat tersebut adalahSalmonella enterica ser. Typhi, Salmonellaenterica ser. Paratyphi A, Salmonella enterica ser.Typhimurium, Salmonella enterica ser. Virchow,Salmonella enterica ser. Hadar, Salmonellaenterica ser. Enteritidis, dan Salmonella entericaser. Weltevreden. Jumlah masing-masing serotipeSalmonella yang diuji dicantumkan pada Tabel 1.Jumlah keseluruhan isolat Salmonella yangdigunakan di dalam pengujian ini adalah 310.

Di Laboratorium, isolat-isolat disimpansebagai biakan kuman di dalam tryptic soy broth(TSB) yang ditambah gliserol dengan kadar 20%,dibekukan dan diletakkan di dalam lemaripendingin bersuhu 700C. Sebelum pengujian,biakan dikeluarkan dan dibiarkan mencair (thawed)pada suhu kamar. Selanjutnya biakan ditanamkanpada medium agar darah, diinkubasikan pada suhu370C untuk waktu 18-24 jam. Koloni-koloni yangtumbuh diseleksi, diambil dan diuji secarabiokimiawi untuk menentukan identitas dankemurniannya. Biakan murni dari kuman patogenenterik ini kemudian dipindahkan ke dalam tabungyang berisi 5 mL kaldu brain heart infusion (BHI),dan diinkubasi 18-24 jam pada suhu 370C.

Inokulasi zink sulfat agarBiakan kuman Salmonella dalam BHI yang

berumur 18-24 jam tersebut kepekatannyadisesuaikan dengan standar McFarland 0,5 dengancara menambahkan larutan garam faal ke dalambiakan kaldu sampai diperoleh kekeruhan sesuaiyang dikehendaki. Biakan kaldu berisi kuman yangtelah ditipiskan sesuai dengan standar McFarland0,5 ini dipindahkan ke dalam sumur-sumurmicrotiter plate. Ke dalam masing-masing sumurini dimasukkan 10 ml biakan kaldu.

Inokulasi ZSA dilakukan denganmenggunakan suatu aparatus replikasi inokulumberupa lempeng logam dengan sengkelit jarum yangjumlahnya 32 buah sehingga dapat memindahkanbiakan dalam jumlah yang sekaligus banyak (32buah) ke atas lempeng agar. Dengan menggunakanaparatus replikasi inokulum, diambil 1 ml biakankaldu dan dipindahkan ke atas lempeng agar ZSA.Semua biakan kaldu juga dipindah tanamkan keatas lempeng agar Mueller Hinton yang tidakmengandung zink sebagai pembanding (kontrol).Lempeng-lempeng agar kemudian diinkubasiselama 18-24 jam secara aerobik pada suhu 370C.

Interpretasi hasil pengujianKonsentrasi hambatan minimal dari zink sulfat

dibaca dan dicatat sebagai konsentrasi terendah darizink sulfat yang menyebabkan hambatan lengkapterhadap biakan pada lempeng agar ZSA danMueller Hinton (sebagai pembanding), denganmengabaikan adanya satu koloni tunggal ataupertumbuhan tipis yang disebabkan inokulum.

HASIL

Hasil pengujian efek hambatan zink sulfatterhadap berbagai serotipe Salmonella disajikanpada Tabel 2. Efek hambatan dari zink sulfat mulaitampak pada konsentrasi 0,8 mg/mL. Padakonsentrasi ini, 15% dari Salmonella enterica ser.Typhi yang diuji dan 7% dari Salmonella ser.Typhimurium, sudah mengalami hambatan,sedangkan galur Salmonella lainnya baru mulaimengalami hambatan oleh zink sulfat padakonsentrasi >1,0 mg/mL atau lebih tinggi.

Tabel 1. Jenis-jenis Salmonella yangdigunakan pada pengujian zink

Surjawidjaja, Herwana, Hidayat, Lesmana Hambatan zink terhadap Salmonella

84

Meskipun demikian, sebanyak 50% dariisolat yang diuji mengalami hambatan pada kadarzink sulfat antara 1,2 - 1,4 mg/mL.

Salmonella enterica ser. Virchow (20%) danser. Hadar (33%), keduanya termasuk di dalamSalmonella serogrup C, tampak mulai mengalamihambatan pada konsentrasi zink sulfat lebih tinggiyaitu 1,2 mg/mL, sedangkan inhibisi oleh zink sulfatsebesar 50% tampak pada Salmonella ser. Virchowpada konsentrasi zink sulfat antara 1,4 to 1,5 mg/mL dan pada Salmonella ser. Hadar padakonsentrasi 1,4 mg/mL.

Meskipun hampir semua Salmonella ser.Typhimurium (91%) dan Salmonella ser. Typhi(96%) serta Salmonella ser. Enteritidis (98%) telahmengalami hambatan pertumbuhan padakonsentrasi zink sulfat 1,4 mg/mL; tetapi baru padakonsentrasi 1,6 mg/mL mereka secara keseluruhanmengalami hambatan. Hambatan terhadap seluruh(100%) isolat Salmonella ser. Paratyphi A yangdiuji diperlihatkan oleh zink sulfat dengankonsentrasi 1,4 mg/mL. Sekitar 2-4% Salmonellaser. Hadar, ser. Virchow dan ser. Weltevreden masihbertahan pada konsentrasi zink sulfat 1,6 mg/mL,tetapi seluruhnya tidak tumbuh lagi pada zink sulfatdengan konsentrasi 1,8 mg/mL. Pada konsentrasizink sulfat 2,0 mg/mL tidak ada lagi isolatSalmonella yang masih menunjukkan pertumbuhan.

PEMBAHASAN

Defisiensi zink yang ringan dan sedang kerapkali dijumpai terutama pada anak-anak di negara

berkembang. Defisiensi zink dianggap menjadisalah satu penyebab meningkatnya insidens diaredan keadaan ini memperburuk episode penyakit.(10)

Baqui dkk.(9) melaporkan bahwa anak-anak yangmendapat suplementasi zink pada saat mengalamidan sesudah menderita diare, menunjukkanpenurunan durasi diare sebesar 24% dan penurunaninsidens diare sebesar 15%, serta kecenderunganberkurangnya risiko untuk mengalami diarekembali. Hasil yang dilaporkan oleh Baqui dkk.(9)

ini sesuai dan konsisten dengan laporan-laporan lainsebelumnya yang menyatakan bahwa pemberianzink pada bayi dan anak-anak penderita diare,secara klinis menunjukkan reduksi dari durasiepisode diare, berkurangnya berat penyakit sertamenurunnya risiko diare yang berkepanjangan.Dengan demikian zink mengurangi frekuensiterjadinya diare kronis dan durasi penderita yangmengalami tinja berair.(6,7,9) Mekanisme darisuplementasi zink terhadap penyakit diare belumseluruhnya diketahui. Ada kemungkinan efek zinkdi dalam menghentikan proses diare berhubungandengan terjadinya perbaikan dari absorpsi air danelektrolit oleh usus,(11) regenerasi epitel usus,meningkatnya kadar enzim enterosit dan ekskresikuman-kuman patogen dari usus yang terjadi lebihcepat.(9,12) Studi in vitro ini menunjukkan bahwazink sulfat pada konsentrasi antara 1,2 dan 1,8 mg/mL mampu menghambat pertumbuhan Salmonella.

Penelitian efek antimikrobial dari zink secarain vitro ini dilakukan terhadap Salmonella karenakuman ini di Indonesia merupakan mikro-organismeyang dominan sebagai kausa diare bersama-sama

Tabel 2. Konsentrasi hambatan zink sulfat terhadap Salmonella enterica ser.Typhi dan Salmonella non-typhoid

85

J Kedokter Trisakti Vol.23 No.3

dengan Vibrio cholerae dan Shigella.(13) Bentukzink yang digunakan pada penelitian ini adalah zinksulfat (ZnSO

4.7H

20) karena bahan atau senyawa ini

yang paling banyak dipakai sebagai suplementasipada penyakit diare. Dari hasil penelitian initampak bahwa mayoritas (96%) dari kumanSalmonella yang diuji mengalami hambatan olehzink sulfat pada nilai konsentrasi minimal zinksulfat antara 1,4 - 1,6 mg/mL dan seluruh isolatSalmonella tidak tumbuh lagi pada medium yangmengandung zink sulfat dengan konsentrasi 2,0 mg/mL. Dosis suplementasi zink yang digunakan untukpenderita diare anak-anak seperti dilaporkan(12,14,15)

adalah antara 20 mg/hari sampai 25 mg/hari atausetara dengan 88 mg - 110 mg zink sulfat(ZnSO

4.7H

2O). Mengingat bahwa zink sulfat yang

akan diabsorpsi di usus hanya sekitar 5% sampai26% saja(16) maka 74-95% atau 65,1 mg 104,5mg dari dosis inisial (88 mg - 110 mg) yangdiberikan ke penderita, yang sebenarnya tertinggaldi usus, tidak diabsorpsi. Jumlah ini akanterdistribusi ke seluruh usus dan beberapa faktorseperti misalnya gerakan usus, asupan dan retensiair, dapat mengubah konsentrasi relatif dari zinksulfat yang tidak terabsorpsi sehingga menyebabkankonsentrasi zink sulfat di tempat-tempat tersebutmenjadi jauh lebih rendah. Namun, dosis yangdigunakan dalam berbagai penelitian diare padaanak-anak(7-9,12) terbukti cukup efektif untukmenyembuhkan diare. Konsentrasi zink sulfat yangtidak terabsorpsi dan tertinggal di usus ini masihlebih tinggi bila dibandingkan dengan konsentrasihambatan minimal zink sulfat terhadap Salmonella(2,0 mg/mL).

KESIMPULAN

Zink tidak hanya mempunyai efek terapeutisyang sifatnya faali seperti yang ditujukkan olehkhasiatnya pada penyembuhan penyakit diare, tetapizink juga mempunyai efek menghambatpertumbuhan kuman Salmonella. Dengan demikianpenyembuhan penyakit, berkurangnya gejala-gejalapenyakit yang berat dan menurunnya risikoterjadinya diare yang berkepanjangan adalahkarena efek dual dari zink.

UCAPAN TERIMA KASIH

Peneliti mengucapkan terima kasih kepadaPimpinan Fakultas Kedokteran Universitas Trisaktiyang telah memberikan bantuan dana bagi kegiatanpenelitian ini. Tidak lupa ucapan terima kasihdisampaikan kepada para petugas LaboratoriumMikrobiologi Fakultas Kedokteran UniversitasTrisakti atas bantuannya mempersiapkan kumpulanisolat.

Daftar Pustaka

1. Black RE, Morrin SS, Bryce J. Where and why are10 million children dying every year. Lancet 2003;361: 2226-34.

2. Kosek M, Bern C, Guerrant RI. The global burdenof diarrheal disease, as estimated from studiespublished between 1992-2000. Bull WHO 2003;81: 197-204.

3. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Surveikesehatan nasional 2001. Jakarta: Badan Penelitiandan Pengembangan Kesehatan DepartemenKesehatan Republik Indonesia; 2002.

4. Victoria CG, Bryce J, Fantaine O, Mcmasch R.Reducing deaths from through oral rehydrationtherapy. Bull World Health Organ 2000; 78: 1246-55.

5. Olsen SJ, Bishop R, Brenner FW, Roels TH, BeanN, Tauxe RV, et al. The changing epidemiology ofSalmonella: Trends in serotypes isolated fromhumans in the United States, 1987-1997. J InfectDis 2001; 183: 753-61.

6. Fierer J, Swancutt M. Non-typhoid Salmonella: areview. Curr Clin Trop Infect Dis 2000;20:134-57.

7. Hidayat A, Achadi A, Sunoto, Soemarmo PS. Theeffect of zinc sulfate supplementation in childrenunder three years of age with acute diarrhea inIndonesia. Med J Indones 1998; 7: 237-41.

8. Gupta DN, Mondal SK, Ghosh S, Rajendran K, SurD, Manna B. Impact of zinc supplementation ondiarrhoeal morbidity in rural children of WestBengal, India. Acta Paediatr 2003; 92: 531-6.

9. Baqui A, Black RE, Arifeen SE, Yunus M,Chakraborty J, Ahmend S, et al. Effect of zincsupplementation started during diarrhoea onmorbidity and mortality in Bangladeshi children:community randomized trial. BMJ 2002; 325:1059-63.

Surjawidjaja, Herwana, Hidayat, Lesmana Hambatan zink terhadap Salmonella

86

10. Bahl R, Bhandari N, Hambidge KM, Bhan MK.Plasma zinc as a predictor of diarrheal andrespiratory morbidity in children in an urban slumsetting. Am J Clin Nutr 1998; 68 (suppl): 414S-7S.

11. Gishan F. Transport of electrolytes, water andglucose in Zn deficiency. J Pediatr GastroenterolNutr 1984; 3: 608-12.

12. Sazawal S, Black RE, Bhan MK, Bhandari N, SinhaA, Jalla S. Zinc supplementation in young childrenwith acute diarrhea in India. N Engl J Med 1995;333:839-44.

13. Oyofo BA, Subekti D, Tjaniadi P, Machpud N,Komalarini S, Setiawan B, et al. Enteropathogensassociated with acute diarrhea in community and

hospital patients in Jakarta, Indonesia. FEMSImmunol Med Microbiol 2002; 34: 139-46.

14. Strand TA, Chandyo RK, Bahl R, Sharma PR,Adhikara RK, Bhandari N, et al. Effectiveness andefficacy of zinc for the treatment of acute diarrheain young children. Pediatrics 2002; 109: 898-903.

15. Bhandari N, Bahl R, Taneja S, Strand TA, MolbakK, Ulvik RJ, et al. Substantial reduction in severediarrheal morbidity by daily zinc supplementationin young North Indian children. Pediatrics 2002;109: 86-92.

16. Bettger WJ, ODell BL. A critical physiological roleof zinc sulfate in the structure and function ofbiomembranes. Life Sci 1981; 28: 1425-38.