JUDUL: PENGEMBANGAN APLIKASI SENYAWA...

LAPORAN TAHUNAN

HIBAH BERSAING

JUDUL:

PENGEMBANGAN APLIKASI SENYAWA DERIVAT KALKON

BERSUBSTITUEN BROMO PADA KANKER LEHER RAHIM

DAN KANKER PAYUDARA MELALUI PENDEKATAN

KOMBINASI DENGAN AGEN KEMOTERAPI

Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun

Dibiayai oleh DIPA Direktorat Penelitian Pengabdian kepada

Masyarakat Nomor DIPA-023.04.1.673453/2015, tanggal

14 Nopember 2014, DIPA revisi 01 tanggal 03 Maret 2015.

Skim : Penelitian Hibah Bersaing Tahun Anggaran 2015

Nomor : 062/SP2H/PL/DIT.LITABMAS/II/2015

Tanggal 5 Pebruari 2015

Ketua/Anggota Tim

Dra. Retno Arianingrum, M.Si 0015126803 Prof. Dr. Indyah Sulistyo Arty, MS 0006045104

UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA

OKTOBER 2015

3

Pengembangan Aplikasi Senyawa Derivat Kalkon Bersubstituen Bromo

Pada Kanker Leher Rahim dan Kanker Payudara Melalui Pendekatan

Kombinasi dengan Agen Kemoterapi

RINGKASAN

Kanker leher rahim dan kanker payudara merupakan neoplasma malignan

dengan insiden tinggi dan banyak menyebabkan kematian bagi penderitanya.

Upaya untuk menemukan obat kanker yang bertarget molekuler spesifik perlu

terus dilakukan untuk meningkatkan efektivitasnya, mengurangi efek samping dan

resistensi terhadap agen kemoterapi seperti Doksorubisin. Perkembangan terapi

kanker dewasa ini mengarah pada kombinasi agen kemoterapi dan agen

kemopreventif. Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) telah banyak di teliti sebagai

senyawa terapetika, khususnya sebagai obat antitumor. Pada umumnya kalkon

dan derivatnya beraksi sebagai agen kemopreventif dengan menghambat

proliferasi sel, menghambat siklus sel dan induksi apoptosis. Senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on merupakan senyawa

derivat kalkon bersubtituen bromo, yang telah terbukti memiliki aktivitas

sitotoksik pada sel kanker leher rahim, namun belum dikaji lebih lanjut

aplikasinya pada sel lain dan potensinya sebagai agen ko-kemoterapi. Tujuan

jangka panjang dari penelitian ini adalah mengkaji aplikasi senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai agen ko-

kemoterapi dengan Doksorubisin pada sel kanker leher rahim HeLa dan sel

kanker payudara T47D. Pada tahun pertama dilakukan: (1) investigasi aktivitas

sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-

on, dokso-rubisin, dan kombinasinya dengan metode MTT [3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2.5-dipheniltetrazolium bromide] assay; (2) pengamatan

morfologi sel menggunakan mikroskop fase kontras dan pengamatan apoptosis

dengan metode flowcytometri; serta (3) pengamatan ekspresi protein yang

berperan dalam mekanisme apoptosis (Bcl-2 dan Bax) dengan teknik

immunositochemical analysis.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on bersifat sitotoksik pada sel HeLa dan sel

T47D dengan IC50 berturut-turut sebesar 50 M dan 45 M. Nilai IC50

Doksorubisin diperoleh sebesar 6 M pada sel HeLa dan 185 nM pada sel T47D.

Kombinasi senyawa tersebut dengan Doksorubisin di bawah nilai IC50 pada

umumnya memberikan efek sinergi hingga sinergi kuat pada sel HeLa, dan

mendekati aditif hingga sinergi pada sel T47D. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on pada pemakaian tunggal dan

kombinasinya dengan Doksorubisin dapat memacu terjadinya apoptosis baik pada

sel HeLa maupun sel T47D. Jalur pemacuan apoptosis adalah dengan dengan

menurunkan ekspresi Bcl-2 dan meningkatkan ekspresi Bax pada sel HeLa dan

T47D.

Kata kunci : Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-

1-on, ko-kemoterapi, doksorubisin, HeLa, dan T47D, apoptosis,

Bcl-2, dan Bax.

4

PRAKATA

Puji Syukur Alhamdulillaah, kami panjatkan kehadirat Allah S.W.T, atas

segala Rahmat dan Hidayah-Nya sehingga kegiatan penelitian berjudul

“Pengembangan Aplikasi Senyawa Derivat Kalkon Bersubstituen Bromo Pada

Kanker Leher Rahim dan Kanker Payudara Melalui Pendekatan Kombinasi

dengan Agen Kemoterapi” pada Tahun pertama ini dapat terlaksana dengan baik.

Kegiatan ini terselenggaran atas bantuan dana DIKTI melalui program Penelitian

Hibah Bersaing tahun 2015. Terlaksananya kegiatan ini juga tidak terlepas dari

bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini kami mengucapkan

terima kasih kepada :

1. Rektor UNY yang telah memberi kesempatan kepada kami untuk

melaksanakan kegiatan penelitian ini

2. Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM) UNY

atas kepercayaan dan kesempatan yang diberikan untuk kegiatan penelitian

ini.

3. Dekan FMIPA UNY atas ijin yang telah diberikan.

4. Kepala Laboratorium Parasit Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada

atas ijin dan perkenannya.

5. Teknisi di laboratorium laboratorium Parasit Fakultas Kedokteran UGM atas

bantuannya dalam pelaksanaan penelitian ini

6. Berbagai pihak yang tidak dapat kami sebutkan satu per satu

“Tiada gading yang tak retak”, kami pun menyadari masih terdapat

kekurangan-kekurangan baik dalam pelaksanaan kegiatan maupun penulisan

laporan kemajuan ini, untuk itu kami mengharapkan saran dan kritik dari berbagai

pihak.

Yogyakarta, Nopember 2015

Tim Peneliti

5

DAFTAR ISI

Hal

HALAMAN SAMPUL………….………………………………………. 1

HALAMAN PENGESAHAN .…………………………………………. 2

RINGKASAN …………………………………………………………… 3

PRAKATA………………..……………………………………………… 4

DAFTAR ISI…………………………………………………………….. 5

DAFTAR TABEL……………………………………………………….. 6

DAFTAR GAMBAR……………………………………………………. 7

DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………….. 10

BAB I. PENDAHULUAN……………………………………………. 11

A. Latar Belakang…………………………………………… 11

B. Batasan dan Rumusan Masalah………………………… 13

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA……………………………………….. 15

A. Kanker, Daur Sel, dan Apoptosis …….………………… 15

B. Pengobatan Kanker dan Masalah Resistensi……………….. 17

C. Potensi Senyawa Kalkon dan Derivatnya

Sebagai Antikanker ……………………………………. 19

D. Roadmap Penelitian ………………………..…………….. 19

BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .……………….. 22

A. Tujuan Penelitian ………………………………………… 22

B. Manfaat Penelitian……………………………………….. 22

BAB IV. METODE PENELITIAN…………………………………….. 24

A. Lokasi Penelitian ………….………………………… 24

B. Rancangan Penelitian ………………………….…………. 24

C. Subyek dan Obyek Penelitian ………………………….. 24

D. Penelitian Tahun Pertama……………………………….. 24

BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………….. 29

A. Hasil Penelitian……………….………………………… 29

B. Pembahasan ………………….………………………… 47

BAB VI. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA………………….. 53

BAB VII.KESIMPULAN DAN SARAN …………………………….. 56

A. Kesimpulan…….……………….………………………. 56

B. Saran…………………………….……………………… 56

DAFTAR PUSTAKA………………………………………………….. 57

LAMPIRAN……………………………………………………………. 61

6

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Rancangan penelitian tahun pertama……………………….. 25

Tabel 2. Persen viabilitas sel HeLa pada perlakuan kombinasi

senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi

konsentrasi……………………………………………………. 32

Tabel 3. Interpretasi nilai indeks kombinasi (CI) ……………………… 34

Tabel 4. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa

1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi terhadap

sel HeLa………………………………………………………… 34

Tabel 5. Persen viabilitas sel T47D perlakuan kombinasi senyawa

1-(4’-bromo-fenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi. ………… 38

Tabel 6. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa

1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi………… 40

Tabel 7. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidrok-

si-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap kematian sel HeLa

menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer……. 41


si-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin dan kombinasi

keduanya terhadap kematian sel HeLa menggunakan Annexin

dengan pembacaan Flowcytometer……………………………. 42


si-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap kematian sel T47D

menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer…… 43


si-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin dan kombinasi

keduanya terhadap kematian sel T47D menggunakan Annexin

dengan pembacaan Flowcytometer……………………………… 44

7

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi

-3-metoksifenil)-2-propen-1-on……………………………… 21

Gambar 2. Bagan alir penelitian pada tahun pertama…………………… 28

Gambar 3. Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan viabilitas

sel HeLa ……………………………………………………. 29

Gambar 4. Morfologi sel HeLa: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan

dengan perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil)

-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on konsentrasi :

(b) 5 M, (c) 10 M, (d) 20 M, (e) 40 M, dan (f) 60 M.

Tanda panah putih menunjukkan sel hidup, dan panah

merah menunjukkan sel yang mati………………………….. 30

Gambar 5. Efek penghambatan proliferasi sel HeLa karena perlakuan

senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on (BHM) pada konsentrasi 12, 5; 25; 50;

dan 75 M dengan waktu inkubasi 0, 24,48, dan 72 jam …….. 31

Gambar 6. Hubungan konsentrasi Doksorubisin dengan viabilitas

sel HeLa ………………………………………………………. 31

Gambar 7. Morfologi sel HeLa : (a) tanpa Perlakuan (kontrol sel) dan

dengan perlakuan Doksorubisin konsentrasi : (b) 0,625 M,

(c) 1,25 M, (d) 2,5 M, (e) 5 M, (f) dan 10 M.

Tanda panah putih menunjukkan sel hidup, dan panah

merah menunjukkan sel yang mati……………………………… 32

Gambar 8. Profil viabilitas sel HeLa perlakuan kombinasi senyawa

1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

(konsentrasi 3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M) dan

Doksorubisin (konsentrasi 0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M). ……….. 33

Gambar 9. Morfologi sel HeLa: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel);

(b) perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidrok-

si-3-metoksifenil)-2-propen-1-on konsentrasi 25 M,

(c) perlakuan Doksorubisin 3 M, (d) perlakuan

kombinasi senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on 25 M dan Doksorubisin 3 M…. 34

Gambar 10. Nilai CI perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil)

-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi

3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M) dan Doksorubisin (konsentrasi

0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M) pada kultur sel HeLa……………… 35

Gambar 11. Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan viabilitas

8

sel T47D ………………………………………………………. 35

Gambar 12. Morfologi sel T47D: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan

dengan perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidrok-

si-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, konsentrasi : (b) 5 M,

(c) 10 M, (d) 20 M, (e) 40 M,(f) dan 60 M…………… 36

Gambar 13. Efek penghambatan proliferasi sel T47D karena

perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksi-

fenil)-2-propen-1-on (BHM) pada konsentrasi 11,25; 22,5; 45;

dan 67,5 M dengan waktu inkubasi 0, 24,48, dan 72 jam ……. 37

Gambar 14. Hubungan konsentrasi Doksorubisin dengan viabilitas sel T47D. 38

Gambar 15. Morfologi sel T47D : (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan

dengan perlakuan Doksorubisin konsentrasi : (b) 50 nM,

(c) 100 nM, (d) 150 nM, (e) 200 nM, (f) dan 250 nM………. 38

Gambar 16. Profil viabilitas sel T47D perlakuan kombinasi senyawa

1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-

1-on (konsen-trasi 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 M)

dan Doksorubisin (konsentrasi 11,5625; 23,125; 46,25;

dan 92,65 nM)………………………………………………….. 39

Gambar 17. Morfologi sel T47D: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel);

(b) perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi

-3-metoksifenil)-2-propen-1-on konsentrasi 22,5 M,

(c) perlakuan Doksorubisin 92,5 nM, (d) perlakuan

kombinasi senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksi-

fenil)-2-propen-1-on 22,5 M dan Doksorubisin 92,5 M…. 40

Gambar 18. Nilai CI perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil)

-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi

2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 M) dan Doksorubisin

(konsentrasi 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,65 nM)

pada Sel T47D……………………………………………….. 41

Gambar 19. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)

-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap

proses apoptosis pada sel HeLa…………………………….. 42

Gambar 20. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap proses

apoptosis pada sel T47D……………………………………… 43

Gambar 21. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi

-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan

kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa.

(a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat

dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel

yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-

bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

12,5 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 1,5 M,

9

dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan

dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2 positif

panah penuh , negatif panah putus-putus ---> )……….. 45

Gambar 22. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidrok-

si-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan

kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel HeLa.


dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang

dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil)

-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 12,5 M,

(d) Perlakuan tunggal doksorubisin 1,5 M, dan

(e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah

mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax positif panah

penuh , negatif panah putus-putus --->…………………….. 46



kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel T47D.





(d) Perlakuan tunggal doksorubisin 46,25 nM, dan


mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2 positif panah

penuh , negatif panah putus-putus ---> ) ………………….. 47



kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel T47D.





(d) Perlakuan tunggal doksorubisin 46,25 nM, dan


mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax positif panah

penuh, negatif panah putus-putus --->……………....... 48

10

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLA Perlakuan

Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksi-

fenil)-2-propen-1-on…………………………………… 61

Lampiran 2. Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel

HeLa Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-

3-metoksifenil)-2-propen-1-on ……………………… 62

Lampiran 3. Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLa Perlakuan

Doksorubisin ………………………………………….. 64

Lampiran 4. Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan

Doksorubisin pada Sel HeLa …………………………. .65

Lampiran 5. Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan

Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksi-

fenil)-2-propen-1-on…………………………………… 66

Lampiran 6. Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel

T47D Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-

3-metoksifenil)-2-propen-1-on ……………………… 67

Lampiran 7. Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan

Doksorubisin ………………………………………….. 69

Lampiran 8. Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan

Doksorubisin pada Sel T47D …………………………. 70

Lampiran 9 Personalia Tenaga Peneliti

Lampiran 10. Publikasi pada “International Conference ICB Pharma II

“Current Breakthrough in Pharmacy Material and Analyses”

Lampiran 11. Draf HKI dan Publikasi

Lampiran 12. Surat Perjanjian Internal Pelaksanaan Penelitian Desentralisasi

SKIM: Penelitian Hibah Bersaing

Lampiran 13. Berita Acara Pelaksanaan Seminar Proposal dan

Instrumen Penelitian

Lampiran 14. Berita Acara Seminar Hasil Penelitian

11

BAB 1

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan yang

tidak terkontrol dan penyebaran dari sel yang abnormal (American Cancer

Society, 2012). Menurut WHO, angka kematian yang disebabkan oleh penyakit

kanker semakin meningkat dari tahun ke tahun. Dilaporkan terdapat lebih dari 10

juta kasus kanker per tahun di dunia, bahkan International Agency for Research

on Cancer (IARC) memperkirakan pada tahun 2030 akan ada sekitar 21,4 juta

penderita kanker tersebar di seluruh dunia. Kanker payudara dan kanker leher

rahim merupakan kelompok kanker penyebab kematian pertama dan kedua di

dunia pada wanita (WHO, 2009). Berdasarkan sepuluh kanker primer pada

wanita di Indonesia, kanker leher rahim menempati posisi pertama mencapai

28,66%, diikuti kanker payudara mencapai 17,77% (Tjindarbumi dan

Mangunkusumo, 2002).

Beberapa metode untuk pengobatan kanker telah dilakukan, diantaranya

pembedahan, kemoterapi dan penyinaran (radiasi). Namun, masing-masing

metode mempunyai kelemahan, sehingga tingkat keberhasilannya masih rendah

(King, 2000). Kegagalan yang sering terjadi pada pengobatan melalui kemoterapi

disebabkan karena rendahnya selektivitas obat anti kanker dan adanya

fenomena resistensi sel kanker terhadap agen kemoterapi (drug-resistence)

(Wong et al., 2006). Resistensi terhadap obat anti kanker payudara, leher rahim,

kolon, prostat dan leukemia banyak ditemukan (Davis et al., 2003). Oleh karena

itu, pengembangan dan penemuan pengobatan kanker yang spesifik,

khususnya kanker payudara dan kanker leher rahim perlu terus

diupayakan.

Salah satu agen kemoterapi kanker yang telah diketahui menimbulkan

resistensi adalah Doksorubisin. Senyawa golongan antrasiklin ini diberikan pada

berbagai jenis kanker. Selain menimbulkan resistensi, Doksorubisin dapat

menyebabkan kardiotoksisitas pada penggunaan jangka panjang (Ferreira et al.,

2008). Salah satu alternatif untuk mengatasi resistensi adalah melalui kombinasi

12

agen kemoterapi dengan agen kemopreventif sehingga dapat meningkatkan

keberhasilan terapi.

Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) adalah jenis keton dengan ikatan tidak

jenuh yang telah banyak di teliti sebagai senyawa terapetika, khususnya

sebagai obat antitumor. Bahkan disebutkan oleh karena aktivitasnya sebagai

”high therapeutic index”, kalkon di anggap sebagai ”the new era of medicines”

dalam kapasitasnya sebagai antitumor, antibakterial, dan anti-inflamatory (Afzal

et al., 2008). Disebutkan pula bahwa sebagian besar target utama dari senyawa-

senyawa kalkon adalah mempengaruhi daur sel (Boumendjel et al., 2009).

Shen et al., (2007) telah membuktikan bahwa struktur dasar kalkon (1,3-

difenilpropen-1-on) menghambat aktivasi nuclear factor kappa (NF-B). NF-B

merupakan faktor transkripsi yang sangat berperan dalam pengembangan dan

progresi kanker, karena NF-B mengatur banyak gen yang terlibat dalam

inflamasi, cell survival, proliferasi sel, invasi, angionegenis, dan metastasis (Sen

et al., 1986). Penghambatan aktivasi NF-B tersebut menyebabkan adanya

induksi apoptosis, penghambatan siklus sel, dan menurunkan ekspresi Bcl-XL

sebagai downstream target dari NF-B pada kultur sel kanker kandung kemih

T24 dan HT-1376, serta sel payudara MCF-7 dan MDA-MB-231 (Hsu et al.,

2006). Penggunaan agen yang mampu menghambat NF-κB seperti senyawa

kalkon akan memberikan keuntungan ganda pada terapi antikanker, yaitu dapat

meminimalkan resistansi dan sekaligus sebagai agen antikanker.

Arty, Arianingrum dan Atun (2012), berhasil mensintesis senyawa derivat

kalkon yang mengandung substituen gugus bromo, yaitu senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on. Hasil uji sitotoksik

terhadap kultur sel leher rahim HeLa menunjukkan bahwa senyawa ini berpotensi

sebagai antikanker dengan IC50 sebesar 9,6 g/mL (kategori sangat aktif).

Senyawa ini juga terbukti memiliki aktivitas sebagai antioksidan yang sangat kuat

(Arty et al., 2013). Kedua aktivitas tersebut diduga merupakan kontribusi adanya

gugus hidroksil dan bromo yang bersifat elektronegatif. Sejauh ini penelitian

yang dilakukan masih terbatas pada uji sitotoksik pada sel HeLa dan uji

antioksidan.

13

Penelitian-penelitian tersebut menjadi dasar awal pemikiran untuk

mengembangkan aplikasi senyawa derivat kalkon bersubstituen bromo ini sebagai

sebagai obat antikanker pada kultur sel kanker yang lain, khususnya pada sel

T47D yang banyak digunakan sebagai model sel kanker payudara. Demikian juga

perlu dikembangkan aplikasinya sebagai agen ko-kemoterapi obat antikanker

seperti Doksorubisin yang sering menimbulkan resistensi. Penelitian yang akan

dilakukan meliputi penelusuran mekanisme aksi dan target molekuler dari

senyawa ini baik pada pemakaian tunggal maupun kombinasinya dengan

Doksorubisin, akan diarahkan pada bagaimana pengaruhnya terhadap pemacuan

apoptosis, penghambatan daur sel (cell cycle arrest), ekspresi protein yang

berpengaruh pada mekanisme apoptosis (Bcl-2 dan Bax) dan proses daur sel

(cyclin).

B. Batasan dan Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang permasalahan di atas, maka ruang lingkup

penelitian ini dibatasi pada mempelajari potensi senyawa derivat kalkon

bersubstituen bromo, yaitu 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on sebagai agen antikanker dan agen ko-kemoterapi Doksorubisin pada

kultur sel kanker leher rahim HeLa dan sel payudara T47D. Fokus penelitian

yang diamati adalah hal-hal yang berkaitan dengan faktor penghambatan sel

kanker, yaitu aktivitas sitotoksik, kemampuan dalam memacu apoptosis,

menghambat daur sel, dan mempengaruhi ekspresi protein yang terlibat dalam

apoptosis (Bcl-2 dan Bax), dan proses daur sel (cyclin), baik pada penggunaan

secara tunggal maupun bila dikombinasikan dengan Doksorubisin. Dengan

demikian rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :

Pada tahun pertama :

1. Bagaimana aktivitas sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel

HeLa dan sel T47D?

2. Bagaimana efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap

pemacuan apoptosis pada sel HeLa dan sel T47D ?

14

3. Bagaimana perubahan ekspresi protein yang mempengaruhi apoptosis (Bcl-2

dan Bax) pada sel HeLa sel T47D karena perlakuan senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan

kombinasi keduanya ?

Pada tahun kedua :

1. Bagaimana efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-


daur sel HeLa dan sel T47D ?

2. Bagaimana perubahan ekspresi protein regulator daur sel (cyclin D/cyclin E/

cyclin B) pada sel HeLa sel T47D akibat perlakuan senyawa 1-(4’-


kombinasi keduanya ?

15

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

A. Kanker, Daur Sel, dan Apoptosis

Penyakit kanker masih merupakan masalah kesehatan utama di dunia.

World Health Organization (WHO) melaporkan bahwa pada tahun 1997, dari 50

juta kematian yang terjadi, sebanyak 12% disebabkan oleh kanker dan dua

pertiganya terjadi di negara berkembang (WHO, 1998). Di Indonesia kanker

merupakan penyebab kematian utama disamping penyakit menular. Jumlah

penderita kanker di Indonesia terus bertambah, dari 3,8% pada tahun 1990

menjadi 4,1% pada tahun 1995 (Depkes, 1997).

Kanker adalah penyakit hasil mutasi gen atau kesalahan jalur transduksi

sinyal yang memungkinkan terjadinya kerusakan sel (Petak et al., 2005). Pada sel

kanker gangguan transduksi sinyal akan menyebabkan pembelahan yang

berlebihan, penghambatan deferensiasi sel, dan penurunan kematian sel

(apoptosis). Adanya perubahan ini, maka sel kanker akan berkembang dan

menyebar ke jaringan lain sekaligus akan mengalami perubahan kromosom dan

mutasi genetik. Perubahan genetik pada gen-gen yang mengatur pertumbuhan,

yaitu onkogen dan gen tumor supressor merupakan perubahan yang sering terjadi

(Meiyanto, 1999). Akibatnya sel akan berproliferasi terus menerus dan

menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal (Lodish et al., 2000).

Setiap sel baik sel normal maupun sel kanker mengalami perkembangan

melalui suatu siklus yang disebut daur sel (cell cycle). Daur sel meliputi beberapa

fase, yaitu : membelah (fase proliferatif), dalam keadaan istirahat (tidak

membelah, G-0) dan secara permanen tidak membelah. (Foster et al., 2001). Daur

sel diawali dari masuknya sel pada fase G-1, pada fase ini sel melakukan

persiapan untuk sintesis DNA (Wyllie et al., 2000). Selanjutnya pada fase S

terjadi replikasi DNA sel. Di akhir fase ini sel siap memasuki fase G-2 untuk

melakukan pertumbuhan dan sintesis protein yang memadai untuk dua sel. Setelah

fase mitosis, sel dapat kembali ke fase G-1 untuk melanjutkan cell cycle atau

memasuki fase G-0. Fase G-0 adalah fase istirahat (cell cycle arrest), dimana sel

mengalami kelelahan dan berhenti membelah (quiescent cells) (Meiyanto, 2002).

Sel dapat keluar dari fase G-0 dan memasuki fase G-1 kembali jika melewati

16

restriction point (R) (Pines, 1997). Untuk melewati restriction point (R)

dibutuhkan CDK4/6 (cyclin dependent kinase 4/6) yang diaktivasi oleh cyclin D

(CycD) (Foster et al., 2001). CycD bersama CDK4/6 akan mengaktifkan faktor

transkripsi E2F dengan cara melepaskannya dari protein pRb (Lodish et al.,

2000). E2F akan memacu ekspresi CycE, CycA, dan E2F yang lain. Kompleks

CycE-CDK2 dan CycA-CDK2 berperan dalam fosforilasi pRb. E2F memacu

ekspresi protein lain yang diperlukan dalam replikasi DNA, misalnya dihidrofolat

reduktase, timidin kinase, timidilat sintase, dan DNA polimerase sehingga sel

memasuki fase S (Teich, 1997). Pada fase S, terjadi aktivasi synthesis promoting

factor (SPF) yaitu kompleks CycA-CDK2, yang pada akhir fase ini mengalami

degradasi. Pada fase G2 akan terjadi kenaikan jumlah kompleks CycB-CDC2

yang disebut mitosis promoting factor (Gondhowiardjo, 2004).

Regulasi daur sel dihambat oleh Cyclin–dependent kinase inhibitor (CKI).

Protein CKI meliputi CDK inhibitory protein/Kinase inhibitory protein (Cip/Kip)

yaitu p21, p27 dan p57 yang membentuk kompleks trimerik dengan CDK2-

CycE/CycA dan Inhibitor of cyclin–dependent kinase 4 (INK4) yaitu p15, p16,

p18, dan p19 yang membentuk dimer dengan protein CDK4/6 (Foster et al.,

2001). Tumor suppressor gene pRb dan p53 menghambat siklus sel (Teich, 1997)

dan memberi kesempatan sel untuk melakukan perbaikan DNA atau apoptosis

(Hanahan and Weinberg, 2000).

Gangguan pada regulator daur sel akan menyebabkan terganggunya

program daur seperti halnya pada sel kanker. Pada sel kanker, daur sel sudah tidak

dapat diatur lagi sehingga mengalami pembelahan terus menerus (Meiyanto,

2002). Oleh karena itu, pada perkembangan penelitian mengenai kanker,

regulator-regulator cell cycle ini potensial untuk dijadikan target obat

antikanker. Penghambatan terhadap CDK4/CDK6 menjadi target pengobatan

kanker untuk menghambat proliferasi sel dengan menghentikan cell cycle pada

fase G0 atau G1 arrested.

Sel kanker juga mampu menghindari mekanisme apotosis (program

kematian sel). Apoptosis merupakan kematian sel yang terjadi akibat induksi dari

sel itu sendiri. Apoptosis dapat terjadi akibat faktor intrinsik ketika sel mengalami

kerusakan yang irreversibel pada DNA. Apoptosis yang terjadi akibat pemicuan

17

faktor ekstrinsik melibatkan peran reseptor tumor necrosis factor tertentu yang

disebut reseptor kematian, yaitu TNF-2, reseptor CD95 (Fas/APO-1), dan reseptor

TRAIL (Lodish et al., 2000). Protein yang berperan dalam regulasi apoptosis

diantaranya p53, keluarga protein Bcl-2, Apaf, Caspase, inhibitor protein

proapoptosis (serta reseptor yang merespon sinyal kematian. Sel yang mengalami

apoptosis memiliki beberapa karakteristik antara lain peningkatan ekspresi protein

proapoptosis (Bax, Bid dan Bak) dan penekanan ekspresi protein antiapoptosis

(Bcl-2 dan Bcl-xL), peningkatan level sitokrom C sitosolik, aktivasi caspase,

aktivasi PARP1, fragmentasi DNA, dan kerusakan membran sel. Akumulasi dari

berbagai karakteristik tersebut menyebabkan munculnya badan-badan apoptosis

yang terjadi akibat fragmentasi sel (Gerl and Vaux, 2005). Salah satu penyebab

resistensi terhadap proapoptosis karena adanya mutasi pada protein p53 atau

peningkatan aktivitas antiapoptosis misalnya pada upregulasi jalur PI3 kinase

Akt/PKB.

B. Pengobatan Kanker dan Masalah Resistensi

Pengobatan kanker pada umumnya didasarkan pada upaya pengambilan

jaringan kanker atau dengan mematikan sel kanker dan meminimalkan efek

pengobatan terhadap sel normal disekitarnya. Saat ini pengambilan kanker yang

paling utama adalah operasi, radioterapi dan kemoterapi, namun ketiga jenis

pengobatan tersebut memiliki kekurangan. Operasi akan berhasil pada beberapa

tumor yang telah berkembang, tetapi sulit mengobati pada stadium awal

metastasis (Lodish et al, 2000). Pengobatan dengan radiasi mampu membunuh

tumor lokal namun radiasi juga akan membunuh sel normal disekitarnya.

Sebagian besar obat kemoterapi seperti taxol, 5-fluorourasil (5-FU) dan

adriamisin memiliki target pada pembelahan sel (Boyer and Tannock, 2005),

tetapi kemoterapi ini dapat menyebabkan diare dan kerontokan rambut. Agen

kemoterapi ini juga tidak efektif untuk sel yang mengalami mutasi p53, sehingga

perlu dikembangkan agen-agen baru untuk pengobatan kanker yang aman (Lodish

et al., 2000).

Salah satu permasalahan yang sering timbul dalam terapi kanker adalah

resistensi obat kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Berbagai obat

18

kemoterapi yang digunakan dalam terapi kanker menjadi kurang berefek karena

disebabkan oleh resistensi obat kemoterapi yang timbul di dalam sel.

Doksorubisin merupakan obat kemoterapi dari golongan antrasiklin yang

diberikan pada berbagai jenis kanker, seperti kanker payudara dan leukimia.

Doksorubisin dapat berinterkalasi dengan DNA sehingga fungsi DNA sebagai

template dan pertukaran sister chromatid terganggu dan pita DNA terputus. Obat

ini juga dapat bereaksi dengan sitokrom P450 reduktase dengan adanya NADPH

membentuk zat perantara. Zat perantara tersebut akan bereaksi dengan oksigen

menghasilkan radikal bebas yang dapat menghancurkan sel. Aktivitas sitotoksik

Doksorubisin tersebut dapat dihasilkan setelah masuk ke dalam sel kanker.

Namun, penggunaannya dibatasi karena menyebabkan efek samping seperti mual,

myelosuppression, aritmia, dan cardiomyopathy diikuti gagal jantung (Singal and

Iliskovic, 1998).

Selain itu, seringkali ditemukan kasus toleransi dan resistensi sel kanker

terhadap Doksorubisin. Resistensi obat ini disebabkan oleh pompa efflux P-

glycoprotein (P-gp). P-gp merupakan salah satu jenis protein transport sel yang

diekspresikan oleh gen MDR-1 (Valeria, 2005). Dalam kondisi normal, P-gp

berperan dalam absorbsi, distribusi dan eliminasi obat di dalam tubuh (Matheny et

al., 2001). P-gp dapat menurunkan konsentrasi zat sitotoksik di dalam sel

(Valeria, 2005). Pada kasus kanker payudara, seperti pada sel MCF-7, ekspresi

berlebih dari P-gp akan menurunkan konsentrasi agen kemoterapi seperti

Doksorubisin, paclitaxel, dan vincristin di dalam sel melalui mekanisme

pengeluaran obat (efflux) dari dalam sel, sehingga potensi sitotoksik Doksorubisin

pada sel kanker akan berkurang (Wong et al., 2006). Sampai saat ini, belum

ditemukan agen kombinasi yang efektif dengan efek samping yang rendah. Agen

kemoterapi tambahan yang diberikan justru menambah efek samping, seperti

cardiotoxicity. Peningkatan aksi obat kemoterapi seperti Doksorubisin dapat

dibantu oleh adanya senyawa lain yang mampu menghambat CDK4 sebagai

protein yang memacu proliferasi sel. CDK4 merupakan protein kinase yang

berperan penting dalam transduksi proliferasi sel kanker. Penghambatan protein

ini dapat mencegah sel berproliferasi sehingga jumlah sel kanker tidak bertambah.

Perkembangan sel yang terhenti ini akan meningkatkan potensi aksi dari

19

Doksorubisin sebagai agen kemoterapi. Oleh karena itu, perlu dikembangkan

senyawa yang potensial sebagai agen kombinasi dan memiliki resiko

toksisitas rendah.

C. Potensi Senyawa Kalkon dan Derivatnya Sebagai Antikanker

Berdasarkan studi penelusuran literatur menunjukkan bahwa beberapa

senyawa golongan flavonoid dan terpenoid telah diketahui memiliki aktivitas

antitumor (Mathivadhani et. al., 2007, Kampa et al., 2004). Senyawa kalkon

merupakan senyawa yang termasuk dalam famili flavonoid dan banyak di teliti

sebagai therapeutic, khususnya sebagai obat antitumor. Upaya-upaya untuk

melakukan eksplorasi senyawa kalkon sebagai antikanker telah dilakukan, baik

dengan isolasi senyawa dari bahan alam maupun sintesis. Diantaranya senyawa

flavon dan kalkon glikosida yang diisolasi dari ekstrak metanol bunga

Helichrysum arenarium, senyawa-senyawa tersebut memiliki aktivitas

menghambat tumor necrosis faktor- (TNF- )-induced citotoxixity pada sel

L929. TNF- sangat berperan dalam pengaturan mekanisme apoptosis (Toshio,

et al., 2009).

Beberapa senyawa kalkon hasil sintesis diantaranya : Trans-4-lodo,4-

boranyl-chalcone memiliki aktivitas antitumor terhadap malignant glioma cell

lines secara in vitro dan in vivo (Sasayama, et al., 2007); senyawa 4-dihydroxy-6-

methoxy-3, 5-dimethylchalcone bersifat antitumor terhadap enam cancer cell lines

secara invitro (Ye, et al., 2004); senyawa 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-

dimethylchalcone memiliki aktivitas antitumor terhadap ”solid human carcinoma

xenograft model”. secara invivo (Ye, et al., 2005). Tidak kalah menariknya

adalah senyawa 2-hydroxy-4- methoxychalcone yang memiliki aktivitas anti-

angiogenic dan antitumor (Lee, et al, 2006).

D. Roadmap Penelitian

Arty, et al., (2000), berhasil mensintesis beberapa derivat kalkon, yaitu

senyawa mono para-hidroksi kalkon yaitu : (a) 3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1-

fenil-2-propen-1-on atau MPHK A ; (b) 3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1-(4”-

metoksifenil)-2-propen-1-on atau MPHK B; (c) 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-

20

3’-metoksifenil)-2-propen-1-on atau MPHK C; (d) 3-(3’, 5’-ditersierbutil-4’-

hidroksifenil)-1-(4”-fluorofenil)-2-propen-1-on atau MPHK D, dan (e) 3-(3’,5’-

ditersierbutil-4’-hidroksifenil)-1-(4”-kloro-fenil)-2-propen-1-on atau MPHK E.

Berdasarkan uji aktivitas penghambatan lipid peroksidasi non enzimatis, dan

aktivitas penghambatan siklooksigenase, senyawa-senyawa ini menunjukkan

sangat poten sebagai antioksidan.

Hasil uji sitotoksisitas dari senyawa tersebut terhadap sel HeLa dan sel

Raji menunjukkan bahwa senyawa MPHK A dan MPHK C atau 1-(4”-

fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on memiliki aktivitas

sitotoksik dalam menghambat pertumbuhan sel HeLa dan sel Raji (Arty, 2009).

Penelitian lebih lanjut terhadap senyawa MPHK A menunjukkan bahwa senyawa

ini bersifat sitotoksik pada sel kanker payudara T47D, serta tidak bersifat

sitotoksik terhadap sel normal Vero (Arianingrum, et al.,2010). Pada sel T47D,

senyawa MPHK A bersifat antiproliferasi dengan menekan viabilitas sel, dan

mempengaruhi daur sel dengan menginduksi sel pada fase G1 (Arianingrum, et al,

2012). Penelitian lebih lanjut pada senyawa MPHK C, yaitu senyawa derivat

kalkon bersubstituen fluoro 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-

propen-1-on menunjukkan bahwa senyawa ini bersifat sitotoksik pada sel HeLa

dengan IC50 sebesar sebesar 34 M yang termasuk kategori aktif. Demikian juga

pada penggunaan senyawa ini dengan kombinasi Doksorubisin terbukti

memberikan efek sinergi kuat. Senyawa ini baik tunggal maupun kombinasinya

dengan Doksorubisin juga terbukti mampu memacu terjadinya apoptosis pada sel

HeLa, sehingga mengakibatkan menurunkan viabilitas sel (Arianingrum et al.,

2013). Hasil penelitian ini telah didaftarkan patennya dengan nomor

P00201304740.

Arty et al (2012, dan 2013) juga telah berhasil mensintesis senyawa

derivat kalkon bersubstituen bromo, yaitu 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on (Gambar 1), dengan mereaksikan 4-bromoasetofenon

dan vanilin melalui kodensasi aldol silang dengan katalis asam. Senyawa ini yang

berbentuk kristal berwarna kuning dengan rendemen 69,83% dan titik lebur 103-

106oC. Senyawa ini memiliki sifat antioksidan yang sangat kuat terhadap DPPH

dengan IC50 sebesar 10,14 g/mL, dan bersifat sitotoksik yang sangat kuat

21

terhadap cancer cell lines sel HeLa dengan IC50 sebesar 9,6 g/mL sehingga

berpotensi sebagai antikanker. Sejauh ini belum dilakukan penelitian lebih lanjut

dan mendalam tentang aplikasi pada sel kanker yang lain dan penggunanaanya

bila di kombinasikan dengan agen kemoterapi yang lain.

Gambar 1. Struktur senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on

HO

HO

F

O

CH3O

Br

22

BAB 3

TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

A. Tujuan Penelitian

Pada tahun pertama :

1. Menginvestigasi aktivitas sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-

3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada

sel HeLa dan sel T47D.

2. Mengkaji efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-


pemacuan apoptosis pada sel HeLa dan sel T47D.

3. Mengamati perubahan ekspresi protein yang mempengaruhi apoptosis (Bcl-2

dan Bax) pada sel HeLa sel T47D akibat perlakuan senyawa 1-(4’-


kombinasi keduanya

Pada Tahun kedua :



daur sel HeLa dan sel T47D.

2. Mengamati perubahan ekspresi protein regulator daur sel (cyclin D/cyclin E/

cyclin B) pada sel HeLa sel T47D akibat perlakuan senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, , Doksorubisin, dan

kombinasi keduanya

B. Manfaat Penelitian

Penelitian ini penting dilakukan mengingat obat antikanker yang selektif

dan murah masih sangat diperlukan. Terlebih insiden kanker leher rahim dan

kanker payudara di Indonesia menduduki peringkat pertama dan kedua, dan

seringkali terjadi toleransi dan resistensi obat. Dengan pengembangan aplikasi

senyawa ini melalui pendekatan kombinasi dengan agen kemoterpi diharapkan

dapat meningkatkan efektivitas kemoterapi, mengatasi masalah resistensi dan

menurunkan resiko toksisitas akibat kemoterapi. Penelitian ini akan memberikan

sumbangan informasi mengenai aktivitas derivat kalkon bersubstitusi bromo, baik

23

tunggal maupun kombinasi dengan agen kemoterapi Doksorubisin dalam

pengobatan kanker. Hasil penelitian ini, dapat dijadikan dasar aplikasi klinik ko-

kemoterapi pengobatan kanker leher rahim dan kanker payudara. Selain itu

penelitian ini juga mengembangkan sistem analisis untuk ko-kemoterapi pada

level molekuler.

24

BAB 4

METODE PENELITIAN

A. Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Organik dan Biokimia

Universitas Negeri Yogyakarta dan laboratorium Parasitologi Fakultas

Kedokteran Universitas Gadjah Mada.

B. Rancangan Penelitian

Rancangan dan indikator capaian terukur dari penelitian ini disajikan pada

Tabel 1.

C. Subyek dan Obyek Penelitian

Subyek penelitian ini adalah senyawa derivat kalkon bersubstituen bromo,

1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on. Objek peneli-

tiannya adalah aplikasinya sebagai agen ko-kemoterapi Doksorubisin pada sel

HeLa dan sel T47D, pada tahun pertama meliputi : (1) uji sitotoksik, (2) uji

aktivitas pemacuan apoptosis, dan (3) uji pengamatan protein yang terlibat dalam

apoptosis apoptosis (Bcl-2 dan Bax). Pada tahun kedua : (1) uji penghambatan

daur sel, dan (2) uji pengamatan protein yang mempengaruhi daur sel (cyclin

D/cyclin E/ cyclin B).

D. Penelitian Tahun Pertama

1. Uji Sitotoksik dengan MTT assay

a. Alat yang digunakan : tangki nitrogen cair, mikroskop fluoresensi,

mikroskop fase kontras,mikroskop fluoresensi, penangas air, sentrifuge,

inkubator CO2 , incubator, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

reader, hemocytometer (New Bauer), tabung conical steril, scraper, tissue

culture flask, ampul, plate, laminar airflow, pH meter, mikroplate 96

sumuran, mikropipet, vorteks, timbangan elektrik, eppendorft, pipet, dan tip.

25

Tabel 1. Rancangan penelitian tahun pertama

Tahun Pertama No Kegiatan Penelitian Metode Indikator Target Luaran

1. Uji sitotoksik tunggal :

a. Senyawa1-(4’-bromofenil)-3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on pada sel HeLa &

sel T47D

b. Doksorubisin pada sel HeLa

& sel T47D

MTT assay a. IC50 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on pada sel HeLa & sel

T47D

b. IC50 Doksorubisin pada sel HeLa

& sel T47D

2. Uji sitotoksik kombinasi :

Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-


propen-1-on + Doksorubisin

pada sel HeLa & sel T47D

MTT assay CI senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-

on + Doksorubisin pada sel HeLa &

sel T47D

3. Pengamatan pemacuan

apoptosis perlakuan:

a. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-



sel T47D

b. Doksorubisin pada sel HeLa

& T47D

c. Kombinasi 1-(4’-bromofenil)-

3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-

2-propen-1-on +Doksorubisin

pada sel HeLa & T47D*)

Flowcytometry Persentase sel yang apoptosis karena

perlakuan :

a. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-



T47D.

b. Doksorubisin pada sel HeLa &

sel T47D

c. Kombinasi senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on +

Doksorubisin pada sel sel HeLa

& T47D

4. Analisis ekspresi protein

regulator apoptosis Bcl-2 dan

Bax karena perlakuan:

a. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-



sel T47D

b. Doksorubisin pada sel T47D

c. Kombinasi 1-(4’-bromofenil)-

3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-

2-propen-1-on +Doksorubisin

pada sel HeLa & sel T47D*)

ICC Level ekspresi protein Bcl-2 dan Bax

karena perlakuan:

a. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-



T47D

b. Doksorubisin pada sel T47D

c. Kombinasi senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on +

Doksorubisin pada sel HeLa & sel

T47D

tanda *) dilakukan bila uji sitotoksisik kombinasi memberikan hasil sinergi positif

b. Bahan yang digunakan: Cell line cancer Sel HeLa dan T47D, Medium

Rosewell Park Memorial Institut (RPMI) 1640 (GIBCO BRL) untuk sel

HeLa, medium penumbuh mengandung growth factor 10% dan 20% FBS

(Fetal Bovine Serum) (Sigma Chem. CO. St. Louis. USA), DMEM

(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) (Invitrogen) ntuk sel T47D, etidium

26

bromid, RNA-se, DMSO (Dimetil Sulfoksida), natrium karbonat (E.Merck),

kertas saring 0,2 m, akuades, fungison dan antibiotik penisilin dan

streptromisin (Sigma Chem. CO. St. Louis. USA), hepes dan tripsin (Sigma

Chem. CO. St. Louis. USA). PBS (Phospat Buffer Saline), MTT (3-(4,5-

dimetil tiazol-2-yl)-2,5-difenil tetra-zolium bromida), SDS (Sodium duodecyl

sulphate)10% dalam HCl 0,01 N.

c. Prosedur Kerja

Sel dengan konsentrasi 1 x 104 sel/sumuran didistribusikan ke dalam plate

96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk beradaptasi dan menempel di

sumuran. Keesokannya media diambil kemudian ditambahkan 100 μl media

kultur yang mengandung DMSO 0,2% (kontrol) atau sampel, inkubasi selama 24

atau 48 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang,

dicuci dengan 100 l PBS. Kemudian ke dalam masing-masing sumuran

ditambahkan 100 l media kultur yang mengandung MTT 5 mg/ml, inkubasi lagi

selama 4 jam pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT

membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4 jam, media yang

mengandung MTT dibuang, kemudian ditambahkan larutan SDS untuk

melarutkan kristal formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian

dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Data

absorbansi perlakuan tunggal dikonversi ke dalam persen sel. Potensi aplikasi

dalam terapi kombinasi dianalisis dengan membandingkan viabilitas sel perlakuan

tunggal dengan kombinasi. Data absorbansi perlakuan tunggal dikonversi ke

dalam persen sel hidup dan digunakan untuk menghitung IC50. Potensi aplikasi

dalam terapi kombinasi dianalisis dengan menggunakan metode indeks kombinasi

(combinatorial index method/CI) berdasarkan Chou (Reynolds and Maurer,

2005).

2. Uji Pengamatan Apoptosis dengan Flowcytometri

a. Alat yang digunakan : plate 6 well, flowcytometer, eppendorft, pipet, dan

tip.

27

b. Bahan yang digunakan : 1X Working Solution (1 mL 100X Stock Solution

diencerkan menjadi 1/100 dalam Phosphat Buffer Saline (PBS) dan

Annexin- V-Fluos Staining Kit Roche.

c. Prosedur Kerja

Sel (kepadatan 5 X 105 sel/sumuran) ditanam dalam plate 6 well sampai

50-60 % konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 24 jam.

Medium diambil dan dimasukkan dalam tabung sentrifus. Sel di cuci dengan

tripsin 0,25% untuk melepas sel dari plate dan dilakukan inkubasi selama 3 menit

dalam inkubator CO2. Kemudian ditambahkan media kultur 1 mL. Sel beserta

media kultur tersebut dipindahkan juga dalam tabung sentrifus. Selanjutnya sel

yang masih tersisa dalam plate dicuci dengan PBS 2X masing-masing sebanyak 1

mL dan PBS ditambahkan dalam tabung sentrifus. Kemudian disentrifus pada 600

g selama 5 menit. Media dibuang dan sel dicuci dengan PBS 1 mL dan disentrifus

pada 200 g selama 5 menit. Larutan PBS dibuang dan sel diresuspensi dengan 100

mL Annexin-V-Fluos-labelling solution yang terdiri dari (2 L Annexin-V-Fluos,

100 L buffer, dan 2 L propidium iodide ) untuk 1 kali reaksi. Inkubasi selama

10 menit pada ruang gelap dan dianalis dengan flowcytometer.

3. Uji Penghambatan Ekspresi Protein dengan Imunositokimia

a. Alat yang digunakan : coverslips, plate 24 well, incubator, mikroskop

cahaya.

b. Bahan yang digunakan : Metanol (Merck), Etanol (Merck), PBS, akuades,

hydrogen peroksida (H2O2), antibodi primer terhadap Bcl-2 (Biocare) dan

Bax, Starr Trek Universal HRP Detection Kit (Biocare), mayer-

hemaktoksilin (Dako), xylol, enteler.

c. Prosedur Kerja

Sel (kepadatan 5 X 104

sel/sumuran) ditanam pada coverslips dalam plate

24 sampai 80 % konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 24

jam. Medium diambil, dicuci dengan PBS 2 kali. Selanjutnya sel dalam coverslips

difiksasi dengan metanol dingin dan dicuci PBS 2 kali, kemudian dicuci dengan

akuades 2 kali. Coverslips dipindahkan dalam slide kemudian ditambahkan 300

L H2O2 (1: 9 dalam akuades), kemudian diinkubasi selama 10 menit, dibuang

28

dan dicuci dengan PBS 2 kali. Selanjutnya di tambahkan 100 L Blocking

(Background Snipper), inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar, dibuang dan

ditambahkan 50 L antibodi primer (Bcl-2 atau Bax) inkubasi selama 60 menit.

Setelah dibuang dicuci dengan PBS 2 kali, kemudian tambahkan 100 L antibody

sekunder (Trekkie Universal) inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Setelah

dibuang, dicuci dengan PBS 2 kali dan ditambahkan Trek Avidin-HRP, diinkubasi

selama 10 menit pada suhu kamar, dibuang dan dicuci dengan PBS 2 x.

Dilanjutkan dengan penambahan 100 L DAB, diinkubasi 5 menit, dibuang, dan

dicuci dengan akuades. Setelah dibuang dan dibersihkan dengan tissue

ditambahkan dengan 300 L mayer-hemaktoksilin dan diinkubasi 5 menit.

Kemudian dicuci dengan akuades hingga bersih. Slide (preparat) dicelup dalam

etanol, kemudian dicelup dalam xylol. Setelah kering ditutup dengan cover glass

dan ditambahkan enteler. Ekspresi protein diamati menggunakan mikroskop. Sel

yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklat/gelap,

sedangkan yang tidak mengekspresikan protein tertentu memberikan warna ungu.

Bagan alir penelitian tahun pertama disajikan pada Gambar 2.

Gambar 2. Bagan alir penelitian pada tahun pertama

Senyawa Derivat Kalkon Bersubstitusi Bromo

1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-

on

Uji aktivitas sitotoksik kombinasi senyawa derivat kalkon bersubstutisi

bromo dan Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D

IC 50

% viabilitas

sel & nilai CI

Doksorubisin

Uji aktivitas sitotoksik senyawa derivat kalkon

bersubstitusi bromo dan Doksoribisin tunggal pada sel

HeLa & sel T47D

Uji induksi apoptosis perlakuan senyawa derivate kalkon bersubstitusi

bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel HeLa &

sel T47D

% sel yang

mengalami

apoptosis

Uji efek senyawa derivat kalkon bersubstutisi bromo, Doksorubisin,

dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi protein yang berperan

dalam apoptosis : Bcl-2 dan Bax.

Ekspresi protein

Bcl-2 dan Bax

TAHUN I

29

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL PENELITIAN

1. Uji Sitotoksik

Uji sitotoksik dilakukan untuk mengetahui sifat sitotoksik dari senyawa 1-

(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, baik pada

penggunaan tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin terhadap sel

HeLa dan T47D. Pada penelitian ini uji sitotoksisitas dilakukan menggunakan

metode MTT.

a. Uji Sitotoksik Terhadap Sel HeLa

1) Uji sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on terhadap sel HeLa

Potensi ketoksikan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel HeLa dinyatakan dalam bentuk grafik

hubungan antara konsentrasi dengan prosentase viabilitas sel (Gambar 3), dan

data selengkapnya disajikan pada Lampiran 1. Berdasarkan hasil pengamatan

tersebut menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi senyawa yang

diberikan, semakin renah viabilitas sel Hela atau semakin banyak jumlah sel HeLa

yang mengalami kematian. Berdasarkan hasil perhitungan (Lampiran 1) diperoleh

nilai IC50 dari senyawa ini terhadap sel HeLa sebesar 50 M.

Gambar 3. Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dengan viabilitas sel HeLa

Morfologi sel HeLa karena perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on disajikan pada Gambar 4. Bila

IC50 = 50 M

30

dibandingkan dengan kontrol sel, nampak bahwa semakin besar konsentrasi

penambahan senyawa tersebut, semakin banyak sel yang mengalamai kematian.

Gambar 4. Morfologi sel HeLa: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan

perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-

2-propen-1-on konsentrasi : (b) 5 M, (c) 10 M, (d) 20 M, (e) 40

M, dan (f) 60 M. Tanda panah putih menunjukkan sel hidup, dan

panah merah menunjukkan sel yang mati.

Uji doubling time untuk menunjukkan sifat proliferasi (Gambar 5)

menunjukkan bahwa senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on mampu menekan laju pertumbuhan sel. Data selengkapnya disajikan

pada Lampiran 2.

2) Uji sitotoksik Doksorubisin terhadap sel HeLa

Hasil uji sitotoksik Doksorubisin terhadap sel HeLa disajikan pada

Gambar 6 dan data selengkapnya disajikan pada Lampiran 3. Viabilitas sel HeLa

semakin menurun dengan meningkatnya konsentrasi Doksorubisin, dari hasil

perhitungan, nilai IC50 Doksorubisin terhadap sel HeLa sebesar 6 M.

Perubahan morfologi sel HeLa karena penambahan senyawa

Doksorubisin disajikan pada Gambar 7. Bila dibandingkan dengan kontrol sel,

a b

f

c

d e

31

nampak bahwa semakin besar konsentrasi penambahan Doksorubisin, semakin

banyak sel yang mengalami kematian.

Gambar 5. Efek penghambatan proliferasi sel HeLa karena perlakuan

senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-

1-on (BHM) pada konsentrasi 12, 5; 25; 50; dan 75 M dengan

waktu inkubasi 0, 24,48, dan 72 jam .

Gambar 6. Hubungan konsentrasi Doksorubisin dengan viabilitas sel HeLa

3) Uji sitotoksik kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin terhadap sel HeLa

Uji sitotoksik kombinasi Doksorubisin dan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel HeLa dilakukan pada

konsentrasi (1/16; 1/8; 1/4; dan 1/2 ) dari nilai IC50 atau dibawah nilai IC50.

Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang

digunakan sebesar 3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M, sedangkan konsentrasi

Doksorubisin sebesar 0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M. Kombinasi kedua senyawa ini

IC50 = 6 M

32

mampu menurunkan viabilitas sel lebih rendah daripada penggunaan masing-

masing senyawa secara tunggal sebagaimana ditunjukkan pada Tabel 2 .

Gambar 7. Morfologi sel HeLa : (a) tanpa Perlakuan (kontrol sel) dan dengan

perlakuan Doksorubisin konsentrasi : (b) 0,625 M, (c) 1,25 M,

(d) 2,5 M, (e) 5 M, (f) dan 10 M. Tanda panah putih

menunjukkan sel hidup, dan panah merah menunjukkan sel yang

mati.

Tabel 2. Persen viabilitas sel HeLa pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-

bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan

Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi.

Viabilitas Sel (%)

Doksorubisin (M)

1-(4’-

bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-

metoksi-fenil)-

2-propen-1-on

(M)

0 0,375 0,75 1,5 3

0 100 72,39 69,05 58,55 50,09

3,125 95,80 67,39 63,87 58,12 51,20

6,25 96,85 64,73 67,14 57,07 47,87

12,5 80,54 53,55 53,86 26,87 11,12

25 50,71 9,20 5,93 5,99 5,44

Penurunan viabilitas sel tersebut juga nampak pada Gambar 8. Pada

penelitian ini viabilitas sel terendah diperoleh pada kombinasi konsentrasi

Doksorubisin sebesar 3 M. dan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 25 M.

a b c

f e d

33

Gambar 8. Profil viabilitas sel HeLa perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsen-

trasi 3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M) dan Doksorubisin (konsentrasi

0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M).

Morfologi sel karena pengaruh perlakuan 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on tunggal, Doksorubisin tunggal dan

kombinasinya disajikan pada Gambar 9.

Gambar 9. Morfologi sel HeLa: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel); (b) perlakuan

senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-

on konsentrasi 25 M, (c) perlakuan Doksorubisin 3 M, (d)

perlakuan kombinasi senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on 25 M dan Doksorubisin 3 M.

a

d c

b

34

Selain itu sitotoksik kombinasi juga ditetapkan dengan menghitung

indeks interaksi antara agen kemoterapi dengan 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-

3-metoksifenil)-2-propen-1-on menggunakan persamaan :

Combination Index/CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2

D1 dan D2 adalah konsentrasi sampel yang digunakan dalam perlakuan

kombinasi. (Dx)1 dan (Dx)2 adalah konsentrasi tunggal yang dapat menghasilkan

efek sebesar yang ditimbulkan perlakuan kombinasi (Reynols and Maurer,2005).

Angka CI yang diperoleh diinterpretasikan sebagaimana Tabel 3, sedangkan hasil

perhitungannya disajikan pada Tabel 4 dan Gambar 10, sedangkan data

selengkapnya di sajikan pada Lampiran 4.

Tabel 3. Interpretasi nilai indeks kombinasi (CI)

Nilai CI Interpretasi

< 0,1 sinergi sangat kuat

0,1 - 0,3 sinergis kuat

0,3 - 0,7 sinergis

0,7 - 0,9 sinergis ringan-sedang

0,9 - 1,1 mendekati aditif

1,1 - 1,45 antagonis ringan-sedang

1,45 - 3,3 antagonis

> 3,3 antagonis kuat-sangat kuat

Tabel 4. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-


Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi terhadap sel HeLa.

Nilai CI

Doksorubisin (M)

1-(4’-bromofenil) -

3-(4-hidroksi-3-

metoksi-fenil)-2-

propen-1-on

(M)

0,375 0,75 1,5 3

3,125 0,364 0,495 0,583 0,633

6,25 0,384 0,716 0,608 0,549

12,5 0,350 0,443 0,201 0,144

25 0,244 0,232 0,235 0,239

Berdasarkan perhitungan nilai CI, terlihat bahwa pada kombinasi

senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan

35

Doksorubisin, memberikan interprestasi sinergi (nilai CI 0,3 – 0,7) hingga

sinergi kuat (nilai CI antara 0,1-0,3). Hasil ini membuktikan bahwa senyawa 1-

(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on berpotensi untuk

digunakan sebagai agen ko-kemoterapi Doksorubisin pada sel HeLa.

b. Uji Sitotoksik Terhadap Sel T47D

1) Uji sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on terhadap sel T47D

Hasil uji sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel T47D disajikan pada Gambar 11 yang

menggambarkan grafik hubungan antara konsentrasi dengan prosentase viabilitas

sel.

Gambar 10. Nilai CI perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi 3,125; 6,25;

12,5; dan 25 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 0,375; 0,75; 1,5;

dan 3 M) pada kultur sel HeLa.

Gambar 11. Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dengan viabilitas sel T47D

IC50 = 45 M

36

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa terdapat hubungan langsung antara

perubahan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-

2-propen-1-on dengan tingkat kematian sel T47D. Semakin tinggi konsentrasi

senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on,

semakin rendah viabilitas sel T47D. Berdasarkan hasil perhitungan, diperoleh

nilai IC50 dari senyawa ini terhadap sel T47D sebesar 45 M (Lampiran 5).

Perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on jug menyebabkan perubahan morfologi sel T47D sebagaimana

disajikan pada Gambar 12. Semakin besar konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil)

-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, semakin banyak sel yang mati.

Gambar 12. Morfologi sel T47D: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan

perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-

2-propen-1-on, konsentrasi : (b) 5 M, (c) 10 M, (d) 20 M, (e)

40 M,(f) dan 60 M.

Efek penghambatan prolifaerasi (Gambar 13) menunjukkan bahwa

senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mampu

menekan laju pertumbuhan sel T47D. Data selengkapnya disajikan pada Lampiran

6.

2) Uji sitotoksik Doksorubisin pada sel T47D

Hasil pengamatan uji sitotoksik Doksorubisin terhadap sel T47D

(Gambar 14) menunjukkan bahwa semakin tinggi perlakuan konsentrasi

a b

f

c

d e

37

Doksorubisin, semakin rendah vibilitas sel T47D. Nilai IC50 Doksorubisin

terhadap sel T47D sebesar 185 nM (Lampiran 7).

Gambar 13. Efek penghambatan proliferasi sel T47D karena perlakuan

senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-

1-on (BHM) pada konsentrasi 11,25; 22,5; 45; dan 67,5 M dengan

waktu inkubasi 0, 24,48, dan 72 jam .

Gambar 14. Hubungan konsentrasi Doksorubisin dengan viabilitas sel T47D.

Morfologi sel T47D karena penambahan Doksorubisin (Gambar 15)

menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi penambahan Doksorubisin,

semakin banyak sel yang mengalami kematian.

IC50 = 185 nM

38

Gambar 15. Morfologi sel T47D : (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan

perlakuan Doksorubisin konsentrasi : (b) 50 nM, (c) 100 nM, (d)

150 nM, (e) 200 nM, (f) dan 250 nM.

3) Uji sitotoksik kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada sel T47D

Uji sitotoksik kombinasi Doksorubisin dan senyawa 1-(4’-bromofenil) -

3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel T47D pada konsentrasi

(1/16; 1/8; 1/4; dan 1/2 ) dari nilai IC50. Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan sebesar 2,8125; 5,625;

11,25; dan 22,5 M, sedangkan konsentrasi Doksorubisin sebesar 11,5625; 23,125;

46,25; dan 92,65 nM. Kombinasi kedua senyawa ini mampu menurunkan viabilitas

sel lebih rendah daripada penggunaan masing-masing senyawa secara tunggal

sebagaimana ditunjukkan pada Tabel 5 .

Tabel 5. Persen viabilitas sel T47D perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromo-

fenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin

pada berbagai variasi konsentrasi.

Viabilitas sel (%)

Doksorubisin (nM)

1-(4’-

bromofenil) -

3-(4-hidroksi-

3-metoksi-

fenil)-2-

propen-1-on

(M)

0 11,5625 23,125 46,25 92,65

0 100 99,34 96,01 70,67 49,12

2,8125 96,6 98,38 87,18 67,95 33,87

5,625 93,3 84,25 85,31 63,15 28,37

11,25 81,1 71,33 61,33 36,65 5,50

22,5 49,7 46,74 26,35 9,39 5,15

a b c

f e d

39

Penurunan viabilitas sel pada perlakuan kombinasi juga nampak pada

Gambar 16. Pada penelitian ini viabilitas sel terendah diperoleh pada kombinasi

konsentrasi Doksorubisin sebesar 93 nM dan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 23 M.

Gambar 16. Profil viabilitas sel T47D perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-

bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsen-

trasi 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 M) dan Doksorubisin

(konsentrasi 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,65 nM).

Morfologi sel karena pengaruh perlakuan 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on tunggal, Doksorubisin tunggal dan

kombinasinya terhadap sel T47D disajikan pada Gambar 17. Hasil pengamatan

morfologi menunjukkan bahwa perlakuan kombinasi 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on tunggal dan Doksorubisin meningkatkan

kematian sel T47D dibandingkan dengan perlakuan tunggalnya.

Berdasarkan perhitungan nilai CI (Tabel 6 dan Gambar 18),

menunjukkan bahwa pada kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin, memberikan interprestasi

mendekati aditif ( nilai CI antara 0,9-1,1 ) pada konsentrasi kombinasi rendah

dan sinergi (( nilai CI antara 0,3-0,7 pada konsentrasi kombinasi tinggi. Dari hasil

ini membuktikan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on juga berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-

kemoterapi Doksorubisin pada sel T47D.

40

Gambar 17. Morfologi sel T47D: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel); (b) perlakuan

senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-

on konsentrasi 22,5 M, (c) perlakuan Doksorubisin 92,5 nM, (d)

perlakuan kombinasi senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on 22,5 M dan Doksorubisin 92,5 M.

Tabel 6. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-


Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi.

Nilai CI

Doksorubisin (nM)

1-(4’-bromofenil) -

3-(4-hidroksi-3-

metoksi-fenil)-2-

propen-1-on

(M)

11,5625 23,125 46,25 92,65

2,8125 1,043 0,997 0,517 0,416

5,625 0,668 1,028 0,526 0,426

11,25 0,559 0,494 0,392 0,385

22,5 0,533 0,425 0,410 0,517

2. Uji Pengamatan Apoptosis dengan Flowcytometer

a. Uji apoptosis pada sel HeLa

Pengamatan apoptosis dilakukan pada sel HeLa tanpa perlakukan,

dengan perlakukan 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-

on, dengan perlakuan Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada inkubasi 24

a

d

b

c

41

jam. Hasil pengamatan apoptosis dengan perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on selama inkubasi 24 jam pada sel HeLa

disajikan pada Tabel 7 dan Gambar 19. Hasil tersebut menunjukkan bahwa

semakin tinggi konsentrasi 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on semakin banyak sel HeLa yang mengalami apoptosis.

Gambar 18. Nilai CI perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsen-trasi 2,8125; 5,625;

11,25; dan 22,5 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 11,5625; 23,125;

46,25; dan 92,65 nM) pada Sel T47D.

Pada perlakuan kombinasi, konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on digunakan sebesar 12,5 M (¼ IC50) dan

Doksorubisin sebesar 1,5 M (¼ IC50). Hasil pengamatan apoptosis dengan

flowcytometer pada sel HeLa disajikan pada Tabel 8.

Tabel 7. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap kematian sel HeLa

menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer.

Perlakuan

senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-


propen-1-on (M)

Prosentase (%) Sel HeLa

Sel

Hidup

Early

Apoptosis

Late

Apoptosis

Nekrosis

0 94,64 1,32 2,08 2,01

12,5 85,06 8,34 2,73 3,95

25 54,01 27,47 12,34 6,35

50 14,49 25,25 47,17 13,48

42

Gambar 19. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap proses apoptosis pada sel

HeLa.


metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin dan kombinasi keduanya

terhadap kematian sel HeLa menggunakan Annexin dengan

pembacaan Flowcytometer.

Perlakuan

Prosentase (%) Sel HeLa

Sel

Hidup

Early

Apoptosis

Late

Apoptosis

Nekrosis

Tanpa Perlakuan 94,64 1,32 2,08 2,01

BHM 12,5 M 85,06 8,34 2,73 3,95

Doksorubisin 1,5 M 58,70 21,61 9,52 10,63

12,5 M BHM + Doksorubisin

1,5 M 56,22 16,32 7,02 21,09

Keterangan : BHM = senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on baik senyawa tunggal maupun

kombinasi dengan Doksorubisin mampu memacu apoptosis sel Hela dibandingkan

tanpa perlakuan. Perlakuan senyawa kombinasi lebih dapat memacu apoptosis

dibanding perlakuan secara tunggal. Namun bila dibandingkan dengan perlakuan

43

dengan Doksorubisin tunggal, penambahan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on memacu terjadinya nekrosis.

b. Uji apoptosis pada sel T47D

Hasil pengamatan apoptosis dengan perlakuan senyawa 1-(4’-

bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on selama inkubasi 24 jam

pada sel HeLa disajikan pada Tabel 9 dan Gambar 20. Hasil tersebut

menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-

3-metoksifenil)-2-propen-1-on semakin banyak sel T47D yang mengalami

apoptosis.


metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap kematian sel T47D

menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer.

Perlakuan

senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-


propen-1-on (M)

Prosentase (%) Sel T47D

Sel

Hidup

Early

Apoptosis

Late

Apoptosis

Nekrosis

0 90,72 2,18 4,49 2,65

11,25 90,55 2,24 3,93 3,32

22,5 86,10 4,84 6,59 2,25

45 15,13 25,79 42,14 17,12

Gambar 20. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap proses apoptosis pada sel

T47D.

44

Pada perlakuan kombinasi, konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan sebesar 11,25 M (¼

IC50) dan Doksorubisin sebesar 46,25 nM (¼ IC50). Hasil pengamatan apoptosis

dengan flowcytometer pada sel HeLa disajikan pada Tabel 10.


metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin dan kombinasi keduanya

terhadap kematian sel T47D menggunakan Annexin dengan

pembacaan Flowcytometer.

Perlakuan

Prosentase (%) Sel T47D

Sel

Hidup

Early

Apoptosis

Late

Apoptosis

Nekrosis

Tanpa Perlakuan 90,72 2,18 4,49 2,65

BHM 11,25 M 90,55 2,24 3,93 3,32

Doksorubisin 46,25 nM 90,45 2,46 4,71 2,43

12,5 M BHM + Doksorubisin

46,25 nM 82,93 5,09 6,31 5,90

Keterangan : BHM = senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on baik senyawa tunggal maupun

kombinasi dengan Doksorubisin mampu memacu apoptosis sel T47D

dibandingkan tanpa perlakuan. Perlakuan senyawa kombinasi lebih dapat memacu

apoptosis dibanding perlakuan secara tunggal. Demikian juga bila dibandingkan

dengan perlakuan dengan Doksorubisin tunggal.

3. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax dengan Imunokimia

Protein Bcl-2 dan protein Bax merupakan protein yang berperan dalam

mekanisme terjadinya apaptosis. Sel yang mengalami apoptosis memiliki

beberapa karakteristik antara lain terjadi peningkatan ekspresi protein

proapoptosis diantaranya Bax, dan penekanan ekspresi protein antiapoptosis,

diantarnya Bcl-2.

45

a. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax pada sel HeLa

Hasil uji pengamatan ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa (Gambar 21)

menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on dapat menurunkan ekspresi Bcl-2 yang terlihat dari menurunnya sel

yang berwarna coklat dengan perlakuan senyawa ini, baik pada pemakaian

tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin.

Gambar 21. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi

keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa. (a). Kontrol sel

tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b)

Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi),

(c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on 12,5 M, (d) Perlakuan tunggal

doksorubisin 1,5 M, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya.

Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2

positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> ) .

Hasil uji pengamatan ekspresi Bax (Gambar 22) pada sel HeLa

menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on dapat meningkatkan ekspresi Bax yang terlihat dari meningkatnya sel

yang berwarna coklat dengan perlakuan senyawa ini, baik pada pemakaian

tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin.

c

a b

e d

46



keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel HeLa. (a). Kontrol sel





doksorubisin 1,5 M, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya.

Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax

positif panah penuh , negatif panah putus-putus --->

b. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax pada sel T47D

Hasil uji ICC ekspresi Bcl-2 pada sel T47D (Gambar 23) menunjukkan

bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on,

Doksorubisin, dan kombinasi keduanya dapat menurunkan ekspresi Bcl-2. Hal ini

nampak dari menurunnya jumlah sel yang berwarna coklat dengan perlakuan

senyawa-senyawa tersebut. Pemakaian kombinasi lebih menurunkan ekspresi Bcl-

2 dibandingkan dengan pemakaian tunggal.

Perlakuan dengan senyawa baik tunggal maupun kombinasinya dengan

Doksorubisin ini juga mampu meningkatkan ekspresi Bax pada sel T47D

(Gambar 24). Pemakaian kombinasi 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dengan Doksorubisin lebih meningkatkan ekspresi

Bax dibandingkan dengan pemakaiannya secara tunggal.

e d c

b a

47



keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel T47D. (a). Kontrol sel





doksorubisin 46,25 nM, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya.

Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2


B. PEMBAHASAN

Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

(BHM) merupakan senyawa derivat kalkon yang mengandung gugus bromo pada

cincin nomor 4’; gugus hidroksil pada cincin nomor 4 atau posisi para; gugus

metoksi pada cincin nomor 3 (meta); serta memiliki gugus karbonil dengan ikatan

tidak jenuh Senyawa dengan rumus molekul C16H13O3Br ini memiliki titik

lebur 103-106oC (Arty dkk., 2012). Senyawa dasar kalkon (1,3-difenilpropen-1-

on) telah banyak diteliti aktivitasnya sebagai antitumor, antibakterial, dan anti-

inflamatory (Afzal et al., 2008). Penelitian tentang sifat sitotoksik dari senyawa

1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on secara in vitro

masih terbatas pada kultur sel kanker HeLa. Hasil uji sitotoksik pada sel HeLa

menunjukkan senyawa ini bersifat toksis dengan nilai IC50 sebesar 9,6 g/mL

Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on juga

memiliki sifat antioksidan yang sangat kuat, yaitu 10,14 g/mL. Bila ditinjau dari

a b

c d e

48

struktur senyawanya, aktivitas antioksidan dan antikanker ini kemungkinan besar

berasal dari adanya kontribusi gugus hidroksil dan bromide yang bersifat

elektronegatif. (Arty dkk, 2012).



keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel T47D. (a). Kontrol sel





doksorubisin 46,25 nM, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya.

Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax


Hasil penelitian ini menunjukkan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap

sel kanker leher rahim HeLa dan sel payudara T47D. Perlakuan senyawa ini

memberikan efek sitotoksik cukup tinggi yaitu IC50 = 50 M ( 16,65 g/mL) pada

sel HeLa dan IC50 = 45 M (14,98 g/mL pada sel T47D. Ueda (2002)

menyatakan bahwa senyawa dapat dinyatakan poten jika memiliki nilai IC50

kurang dari 100 g/mL. Dengan demikian penelitian ini menunjukkan bahwa 1-

(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on merupakan senyawa

yang poten sebagai antikanker.

a

e c

b

d

49

Adanya gugus OH pada posisi para dari senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on diperkirakan memberikan kontribusi

pada sifat toksisitas senyawa terhadap sel HeLa dan T47D. Pada beberapa hasil

penelitian tentang aktivitas senyawa derivat kalkon, adanya substitusi gugus

metoksi pada cincin A dan substitusi fluoro, kloro, bromo dan cincin B mampu

meningkatkan penghambatan aktivitas NF-B, suatu faktor transkripsi yang

berperan dalam pengembangan dan progresi kanker (Folmer, et.al., 2006, dan

Kim, et. al., 2007). Selain itu adanya gugus karbonil tak jenuh -

unsaturated carbonylyang terdapat pada kalkon juga memberikan kontribusi

pada aktivitas sitotoksik pada sel HeLa dan T47D. Menurut Srinivasan, et al,

(2009) adanya ikatan tak jenuh yang bersifat sangat elektrofilik dapat

menimbulkan radikal thiyl yang mengarah ke pengurangan alkena melalui adisi

Michaelis kovalen dari nukleofil, seperti SH dari cystin dari DNA, yang mengikat

NF-B.

Perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on juga menunjukkan perubahan morfologi sel yang signifikan seiring

meningkatnya konsentrasi senyawa yang diberikan. Perubahan morfologi sel

tersebut menyebabkan menurunnya viabilitas sel HeLa dan T47D.

Hasil uji doubling time menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-

3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on bersifat antiproliferasi, baik pada sel

HeLa maupun sel T47D. Perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 12,5 M pada sel HeLa mampu menghambat

laju pertumbuhan sel tersebut, namun sel masih dapat berkembang hingga 72 jam.

Perlakuan di atas konsentrasi tersebut, yaitu 25, 50 dan 75 M menyebabkan sel

tidak dapat berkembang. Pada sel T47D, perlakuan senyawa dengan konsentrasi

11,25 dan 22,5 M menghambat laju pertumbuhan sel, dimana sel masih dapat

berkembang hingga jam ke 48, kemudian mengalami penurunan jumlah sel dan

akhirnya mati. Pada konsentrasi senyawa 45 dan 67,5 M menyebabkan sel tidak

dapat berkembang.

Bila dibandingkan dengan nilai IC50 doksorubisin, senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on memiliki aktivitas lebih

rendah. Doksorubisin merupakan agen kemoterapi yang banyak digunakan dalam

50

terapi berbagai kanker epitel. Doksorubisin dapat berinterkelasi dengan DNA

sehingga fungsi DNA sebagai template dan pertukaran sister chromatid terganggu

pada pita DNA terputus. Obat ini juga dapat bereaksi dengan sitokrom P450

reduktase dengan adanya NADPH membentuk zat perantara yang akan bereaksi

dengan oksigen menghasilkan radikal bebas yang dapat menghancurkan sel. Pada

penelitian ini diperoleh nilai IC50 doksorubisin terhadap sel HeLa sebesar 6 M

dan 185 nM pada sel T47D.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan doksorubisin

mampu meningkatkan aktivitas sitotoksik baik pada sel HeLa maupun sel T47D,

dibandingkan dengan perlakuan tunggal. Perlakuan kombinasi pada sel HeLa

dibawah konsentrasi IC50 menghasilkan efek dari sinergi (saling menguatkan)

hingga sinergi kuat. Viabilitas sel terendah terjadi pada kombinasi senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 25 M dan dokso-

rubisin 3 M. Pada sel T47D perlakuan kombinasi dibawah konsentrasi IC50

menghasilkan efek mendekati aditif pada konsentrasi terendah, dan efek sinergi

pada konsentrasi yang lebih tinggi. Viabilitas sel terendah pada sel T47D terjadi

pada kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on konsentrasi 22,5 M dan doksorubisin 92,65 nM. Hasil ini

membuktikan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi

doksorubisin.

Hasil pengamatan apoptosis menggunakan flowcytometer menunjukkan

bahwa perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on sebesar 12,5 M (1/4 IC50) dengan waktu inkubasi 24 jam

menyebabkan 11,07% sel HeLa mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi

dibandingkan dengan sel HeLa tanpa perlakuan (3,4%). Pada perlakuan senyawa

dengan konsentrasi lebih tinggi, yaitu 25 M (1/2IC50) dan 50 M (IC50)

menyebabkan lebih banyak sel yang mengalami apoptosis, yaitu berturut-turut

sebesar 39,81% dan 72,42%. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mampu menginduksi

terjadinya apoptosis pada sel HeLa. Perlakuan kombinasi 12, 5 M senyawa ini

51

dengan 1,5 M doksorubisn menyebabkan 23,34% sel HeLa mengalami

apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dari perlakuan tunggal senyawa (11,07%),

namun lebih rendah dari perlakuan tunggal doksorubisin (31,13%). Perlakuan

kombinasi mengarahkan sel HeLa ke arah nekrosis. Hal ini dapat dipahami karena

penelitian ini dilakukan secara invitro, sehingga sangat dimungkinkan sel yang

mengalami apoptosis selanjutnya akan mengalami nekrosis, karena tidak ada

mekanisme keterlibatan makrofag.

Demikian juga pada sel T47D, perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 11,25 M (1/4 IC50) dengan

waktu inkubasi 24 jam menyebabkan 6,17% sel T47D mengalami apoptosis.

Jumlah ini lebih tinggi dibandingkan dengan sel T47D tanpa perlakuan (2,18%).

Pada perlakuan senyawa dengan konsentrasi lebih tinggi, yaitu 22,5 M (1/2IC50)

dan 45 M (IC50) menyebabkan lebih banyak sel yang mengalami apoptosis, yaitu

berturut-turut sebesar 11,44% dan 67,93%. Hasil ini menunjukkan bahwa

senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mampu

menginduksi terjadinya apoptosis pada sel T47D. Perlakuan kombinasi senyawa

ini pada konsentrasi 11,25 M dan doksorubisn 46,25 nM menyebabkan 11,4%

sel T47D mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dari perlakuan tunggal

senyawa (6,17%), dan perlakuan tunggal doksorubisin (7,17%). Data ini

menunjukkan bahwa kombinasi senyawa ini dengan doksorubisin meningkatkan

kemampuan doksorubisin dalam memacu terjadinya apoptosis. Kemampuan

senyawa ini dalam memacu apoptosis menyebabkan viabilitas sel HeLa dan

T47D menurun. Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian Hsu et al., (2006)

yang menunjukkan bahwa struktur inti dari kalkon mampu menghambat

proliferasi sel pada sel kanker payudara dengan menginduksi apoptosis.

Hasil pengamatan ekspresi protein Bcl-2 baik pada sel HeLa maupun sel

T47D menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on baik tunggal maupun kombinasinya dengan

doksorubisin mampu menurunkan level ekspresi Bcl-2. Dalam kaitannya dengan

proses apoptosis, hal ini menunjukkan bahwa senyawa ini mampu memacu

terjadinya apoptosis dengan menurunkan ekspresi Bcl-2.

52

Senyawa ini, baik pemakaian tunggal maupun kombinasi dengan

doksorubisin juga mampu meningkatkan level ekspresi Bax pada sel HeLa dan

T47D. Bcl-2 dan Bax merupakan Bcl-2-family, yaitu gen yang sangat berperan

dalam jalur pengaturan apoptosis. Protein-protein yang termasuk Bcl-2 family

pada umumnya mengatur apoptosis melalui regulasi permeabilitas membrane luar

mitokondria. Penelitian Shen et al, 2007 menunjukkan bahwa kalkon dapat

menghambat proliferasi sel dengan menginduksi apoptosis pada sel kanker

kandung kemih manusia, yaitu sel T24 dan HT-1376. Pada kedua sel ini kalkon

secara signifikan meningkatkan ekspresi protein p21 dan p27, serta menurunkan

level cyclin B1, cyclin A, dan Cdc2, sehingga menyebabkan cell cycle arrest.

Selain itu kalkon meningkatkan ekspresi Bax dan Bak, tetapi menurunkan level

Bcl-2 dan Bcl-XL, sehingga memacu apoptosis melalui jalur mitokondria dengan

melepaskan sitokrom dan mengaktivasi caspase-9 dan caspase-3. Induksi jalur

mitokondria dan penghambatan aktivasi NF-B berperan penting dalam

mempengaruhi aktivitas antiproliferasi kalkon pada sel T24 dan HT-1376.

Pada penelitin ini, senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on merupakan kalkon dengan substitusi gugus hidroksil,

metoksi, dan Bromo ternyata juga mampu menghambat proliferasi sel dan

memacu apoptosis. Adanya kemampuan senyawa ini dalam menurunkan level

ekspresi Bcl-2 dan meningkatkan level ekspresi Bax, menunjukkan bahwa

senyawa ini mampu memacu apoptosis dengan induksi jalur mitokondria.

53

BAB 6

RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA

Sejauh ini, secara keseluruhan penelitian tahun pertama telah

dilaksanakan. Pada tahun kedua akan dilanjutkan dengan kegiatan penelitian

sebagaimana pada Gambar 24, yaitu :



daur sel HeLa dan T47D.

2. Mengamati perubahan ekspresi protein regulator daur sel (cyclin D/cyclin E/

cyclin B) pada sel HeLa dan T47D dengan adanya perlakuan senyawa 1-(4’-


kombinasi keduanya

Gambar 24. Bagan Alir Penelitian

Metode penelitian yang dilakukan adalah :

1. Uji Penghambatan Daur Sel dengan Flowcytometry

a. Alat yang digunakan : Flowcytometer (FACSCalibur),pPerlengkapan

perlindungan diri (sarung tangan steril, jas lab.), waterbath yang telah distel

temperaturnya (37°C), Laminar Air Flow Hood (LAF), inkubator CO2, tissue

culture flask/dish, pen marker, mikropipet, tip, rak ampul/tempat eppendorf,

tissue, alat-alat gelas, flakon, timbangan analitik, mikroskop cahaya, inverted

Uji penghambatan daur sel perlakuan senyawa derivat kalkon

bersubstitusi bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel

HeLa & sel T47D

% sel pada

setiap daur sel

Uji efek senyawa derivat kalkon bersubstutisi bromo, Doksorubisin,

dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi protein yang berperan

dalam daur sel (cycD/cyc E/ cycB)

Ekspresi protein

(cycD/cyc E/

cycB)

TAHUN II

54

microscope, tabung konikal, haemocytometer, cell counter, kamera digital,

autoklaf, filter, vorteks, sentrifus.

b. Bahan yang digunakan: Reagen propidium iodida (PI) : 7% triton X

(Merck), 0,2% RNase, 5% PI (Sigma) 0,1 mg% dalam PBS, dilarutkan

dengan PBS hingga 100%.

c. Prosedur Kerja

Sel hasil panen ditumbuhkan pada plate kultur 6 sumuran sejumlah 5 x 105

sel/sumuran. Setelah inkubasi selama 24 jam sel diberi perlakuan dengan 1-(4”-

fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on pada berbagai

konsentrasi. Pemanenan sel dilakukan pada jam ke 24 dan jam 48 setelah

perlakuan. Sel dipanen menggunakan tripsin/EDTA 0.25%/0.02%, kemudian

disentrifugasi 1000 RPM selama 5 menit, dan dicuci dengan PBS dingin. Sel

diinkubasi dengan larutan propidium iodida (PI) 500 ml (PI 50 mg/ml dalam PBS

yang mengandung 0.1% triton-X). Sel selanjutnya diberi perlakuan dengan

RNAse bebas DNAse (20 mg/ml) selama 10 menit pada suhu 370C. Sel dianalisis

dengan alat flowcytometer BD FACSCalybur.

2. Penghambatan Ekspresi Protein dengan Imunositokimia

a. Alat yang digunakan : coverslips, plate 24 well, incubator, mikroskop

cahaya.

b. Bahan yang digunakan : Aseton (E.Merck), serum kambing normal

(Novocastra), antibodi primer terhadap cyclin, PBS, streptavidin, biotin,

antibodi IgG sekunder terbiotinilasi (Novocastra), konjugat streptavidin

terhadap peroksidase kuda (Novocastra), kromogen 3,3-diaminobenzidin

(DAB) (Novocastra), akuades, dan mayer-hematoksilin (Dako).

c. Prosedur Kerja

Sel (kepadatan 5 X 104

sel/sumuran) ditanam pada coverslips dalam

plate 24 sampai 80 % konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama

4 dan 8 jam. Medium diambil, dicuci dengan PBS. Selanjutnya dilakukan fiksasi

dengan formalin 4% selama 20 menit, cuci PBS, dilanjutkan dengan dehidrasi

menggunakan etanol konsentrasi bertingkat yaitu 50, 70 dan 95%, masing-masing

selama 5 menit. Cover slip yang memuat sel diangkat, diletakan diatas dish 6 cm.

55

Ditetesi dengan normal mouse serum (1:50) selama 15 menit, dibuang (tanpa

cuci), lalu ditetesi dengan Primer Antibodi Monoklonal anti Bax dan Bcl-2 selama

60 menit dan dicuci dalam PBS sebanyak 3 kali. Preparat diinkubasi dalam biotin

selama 10 menit dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit.

Kemudian preparat diinkubasi dalam streptavidin-peroksidase selama 10 menit

dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit. Selanjutnya, preparat

diinkubasi dalam DAB selama 3-8 menit dan dicuci dengan akuades. Preparat

direndam dalam hematoksilin selama 3-4 menit untuk counterstain dan dicuci

dengan akuades. Ekspresi protein diamati menggunakan mikroskop cahaya. Sel

yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklat/gelap,

sedangkan yang tidak mengekspresikan protein tertentu memberikan warna ungu.

56

BAB 7

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

bersifat sitotoksik dengan IC50 sebesar 50 M pada sel Hela, dan 45 M pada

sel T47D. Demikian juga Doksorubisin memiliki aktivitas sitotoksisk dengan

IC50 sebesar 6 M pada sel Hela dan 185 nM pada sel T47D. Kombinasi

senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

dengan Doksorubisin umumnya memberikan efek sinergi hingga sinergi kuat

pada sel HeLa, dan efek mendekati aditif hingga sinergi pada sel T47D.


pada pemakaian tunggal dan kombinasinya dengan Doksorubisin memacu

terjadinya apoptosis pada sel HeLa dan sel T47D.


pada pemakaian tunggal dan kombinasinya dengan Doksorubisin mampu

menurunkan ekspresi Bcl-2 dan meningkatkan ekspresi protein Bax.

B. Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menelusuri pengaruh senyawa ini

terhadap daur sel dengan mengamati ekspresi protein yang berperan dalam

daur sel.

57

DAFTAR PUSTAKA

Afzal S., Asad M. K, Rumana Q. F, Ansari, Muhammad F. N, and Syed S. S.

2008. Redox Behavior of Anticancer Chalcone on a Glassy Carbon

Electrode and Evaluation of its Interaction Parameters with DNA, Int. J.

Mol. Sci. 2008, 9, 1424-1434

American Cancer Society, 2012, Cancer Facts and Figure 2012, Atlanta,

American Cancer Society, Inc.: 1-6

Arianingrum, R., Arty, I.S., dan Atun S., 2010, “Uji Sitotoksisitas Senyawa Mono

Para Hidroksi Kalkon terhadap Cancer cell lines T47D”, Saintek Jurnal,

UNY

Arianingrum, R., Arty, I.S., dan Atun S., 2013, Kajian Potensi Senyawa Derivat

Kalkon Bersubstituen Fluoro Sebagai Agen Ko-Kemoterapi Doxorubicin

Pada Sel Kanker Leher Rahim Untuk Mengatasi Masalah Resistensi,

Laporan Penelitian Fundamental 2013, LPPM, UNY.

Arianingrum, R., Hermawan, A., Meiyanto, E., and Purnomo, H., 2012,

Molecular Docking Studies of Chalcone Derivate Compound MPHC A

With Tyrosine Kinase Receptors, Proceeding in 24th Federation of Asian

Pharmaceutical Associations Congress (FAPA) Bali, Indonesia on

September 13 – 16.

Arty, I.S., 2009, “Synthesize and Citotoxicity Test of Several Compounds of

Mono Para Hidroxy Chalcone”, Indo. J. Chem., 10 (1), 110-115

Arty, I.S., Arianingrum, R., dan Atun, S., 2012., Sintesis Senyawa Mono Para

Hidroksi Kalkon Bersubstituen Bromo Dengan Katalis Asam dan

Potensinya Sebagai Antioksidan dan Antikanker, Laporan Penelitian Guru

Besar, LPPM.

Arty, I.S., Arianingrum, R., dan Atun, S., 2013, Sintesis Senyawa Mono Para

Hidroksi Kalkon Bersubstituen Bromo Dengan Katalis Asam dan

Potensinya Sebagai Antioksidan, Prosiding seminar Nasional Optimalisasi

Penelitian dan PPM untu Pencerahan dan Kemandirian Bangsa, LPPM

UNY.

Arty, S.A., Henk T, Samhudi, Sastrohamidjojo, and Henk an der Goot., 2000.,

Synthesis of benzylideneacetophenones and their inhibition of

lipidperoxidation., Eur. J., Med. Chem. 35, 449-457

Boumendjel A, Ronot X, Boutonnat. 2009 . Chalcone derivatives acting as cell cycle

blockers : potensial anticancer drugs ? J Curr Drug Targets. Apr;10(4):363-71.

Boyer, M.J., and Tannock, I.F., 2005, The Basic Science of Oncology: Cellular

and Molecular Basis of Drug Treatment for Cancer, Mc Graw Hill

Compay, forth edition, New York.

Davis, J.M., Navolanic, P.M., Weinstein-Oppenheimer, C.R., Steelman, L.S.,

Wei, H., Konopleva, M., Blagosklonny, M.V., and McCubrey, J.A., 2003,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Boumendjel%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ronot%20X%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Boutonnat%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus


58

“Raf-1 and Bcl-2 Induce Distinc and Common Pathways That Contribute

to Breast Cancer Drug Resistantce”, Clin. Cancer Res.9:1161-1170.

Departemen Kesehatan RI. (1997). Profil Kesehatan Indonesia. Depkes RI.

Jakarta

Ferreira, G.C., Epping, M., Kruyt, F.A.E., and Giaccone, G., 2008, “Apoptosis:

Target of Cancer Therapy”, Clin. Cancer Research., 8: 2024-2034

Foster, J.S., Henley, D.C., Ahamed, S., and Wimalasena, J., 2001, “Estrogen and

Cell Cycle Regulation in Breast Cancer”, Trend Endocr. Metab.

12(7):320-327

Gerl, R., and Vaux, D.L., 2005, Apoptosis in The Development and Treatment of

Cancer, Carcin., 26 (2), 263-270.

Gondhowiardjo, S., 2004, Proliferasi Sel dan Keganasan, Majalah Kedokteran

Indonesia, 54 (7), 289-299.

Hanhanan, D., and Wienberg, R.A., 2000, “The Hallmarks of Cancer”, Cell, 100,

57-70.

Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.W., and Lin, C.C., 2006, “Chalcone Inhibits the

Proliferation of Human Breast Cancer Cell by Blocking Cell Cycle

Progression and Inducing Apoptosis”, Food Chem Toxicol, 44 (5):704-13

IARC, 2010, IARC Launch the Devinitive Cancer Statistics Resource Globocon,

Press Release No 201., 1-2.

Kampa, M., Alexaki, Vassilia-Ismini., Notas, George., Nifli, Artemissia-Phoebe.,

Nistikaki, Anatassia., Hatzoglou, Anastassia., Bakogeorge, Efstathia,

Koumtzoglou, Elena., Blekas, George., Boskou, Dimitrios., Gravanis,

Achille., and Castanas, E., 2004, Antiproliferatif and Apoptotic Effect of

Selective Phenolic Acids on T47D Human Breast Cancer Cells: Potential

Mechanisms of Action., Breast Cancer Res, 6: R63-R74

King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, Pearson Education, Second Edition,

England. p.1-7,228-231, 263-264

Lee, Y.S.; Lim, S.S.; Shin, K.H.; Kim, Y.S.; Ohuchi, K.; Jung, S.H.2006. Anti-

angiogenic and antitumoractivities of 2-hydroxy-4- methoxychalcone.

Biol. Pharm. Bull. 29, 1028-1031.

Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P, Baltimore, D., and Darnell, J.,

2000, Molecular Cell Biology, 4th

edition, New York: W.H. Freeman

Matheny, C. J. M., Lamb, M. W., Brouwer, K. L. R., and Pollack, G. M., 2001,

“Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Implications of P-glycoprotein

Modulation”, Pharmacotherapy, 21 (7), 778-796.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16307839

59

Mathivadani, P., Shanthi, P., and Sachdanandam, P., 2007, Apoptotic Effect of

Semecarpus anacardium nut Extract on T47D Cancer Cell Line., Cell.

Biol. Int., 31, 1198-1206

Meiyanto, E., 2002, Bahan Kuliah Biologi Molekuler: Signal Transduksi-Cell

Cycle-Transposon, Proyek Que Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.

Petak, I., Houghton, Janet A., and Kopper, L., 2006, Molecular Targeting of Cell

Death Signal Transduction Pathways in Cancer, Current Signal

Transduction Therapy, 1, 113-131Pahl, H.L., 1999, “Activators and Target

Genes of Rel/NF-κB Transcription Factors”, Oncogene 18 6853–6866.

Pines, J., 1997, Mammalian Cell Cycle, Oncogenes and Tumor Suppressors, IRL

Press, Oxford University Press, New York, 189-191.

Reynold, C.P., and Meurer, B.J., 2005, Evaluating Response to Antineoplastic

Drug Combination in Tissue Culture Models, Methods Mol. Med., 110,

173-183

Sasayama, T.; Tanaka, K.; Mizukawa, K.; Kawamura, A.; Kondoh, T.; Hosoda,

K.; Kohmura, E. 2007. Trans-4-lodo,4-boranyl-chalcone induces antitumor

activity against malignant glioma cell lines in vitro and in vivo. J. Neu-

Onc. 85, 123-132

Sen R. and Baltimore D., 1986, “Inducibility of Kappa Immunoglobulin

Enhancer-Binding Protein Nf-kappa B by a Posttranslational Mechanism”,

Cell, 1986 : 47, 921-8

Shen, K.H, Chang, JK, Hsu, Y.L, and Kuo, P.L., 2007, “Chalcone Arrests Cell

Cycle Progression and Induces Apoptosis Through Induction

Mitochondrial Pathway and Inhibition of Nuclear Faktor Kappa B

Signaling in Human Bladder Cancer Cells”, Basic Clin Pharmacol

Toxicol, 101 : 254-61

Singal, P.K., and Iliskovic, N., 1998, “Doxorubicin-induced Cardiomyopathy”, N.

Engl. J. Med. 339:900-905

Teich, N. M., 1997, Oncogenes and Cancer in Franks, L.M. dan Teich, N.M.,

Cellular and Molecular Biology of Cancer, 3rd

Edition, Oxford University

Press, London.

Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo, R., 2002, “Cancer in Indonesia, Present and

Future”, Jpn. J. Clin. Oncol. 32 (Supplement 1): S17-21

Toshio M. Li-Bo W. ,Seikou N. , Kiyofumi N., Eri Y., Hisashi M., Osamu .M.,

Li-Jun W., and Masayuki Y., 2009., Medicinal Flowers. XXVII.1) New

Flavanone and Chalcone Glycosides, Arenariumosides I, II, III, and IV,

and Tumor Necrosis Factor-a Inhibitors from Everlasting, Flowers of

Helichrysum arenarium, Chem. Pharm. Bull. 57(4) 361—367 (2009)

Valeria, P., 2005, “Changes in P-Glycoprotein Activity Are Mediated by The

Growth of A Tumour Cell Line as Multicellular Spheroids”, Cancer Cell

International, 5.

60

WHO, 2009, Cancer Control, Knowlendge into Action, WHO Guide for Effective

Programes, www.who.int/cancer

Wong, H.L., Bendayan, R., Rauth, A.M., Xue, H.Y., Babakhanian, K., and Wu,

X.Y., 2006, “A Mechanistic Study of Enhanced Doxorubicin Uptake and

Retention in Multidrug Resistant Breast Cancer Cells Using A Polymer-

Lipid Hybrid Nanoparticle System”, The Journal of Pharmacology and

Experimental Therapeutics, 317 (3), 1372-1381

World Health Organization. 1998. The World Health Report : live in the 21st

century, A vision for all, WHO, Geneva

Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D., Keesey, J., and Manzow, S., 2000,

Cell Death Apoptosis and Necrosis, Rosche Diagnostic Corporation

Ye, C.L.; Liu, J.W.; Wei, D.Z.; Lu, Y.H.; Qian, F. 2005. In vivo antitumor activity

by 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone in a solid human

carcinoma xenograft model. Canc. Chemo.Pharm., 55, 447-452.

Ye, C.L.; Liu, J.W.; Wei, D.Z.; Lu, Y.H.; Qian, F.2004. In vitro anti-tumor

activity of 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone against six

established human cancer cell lines. Pharmacol. Res. 2004, 50, 505-510

61

LAMPIRAN 1

Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLa Perlakuan

Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

Konsentrasi

(M)

Log

Konsentrasi

Absorbansi Viabilitas Sel (%) Rerata Standar

Error 1 2 3 1 2 3 Viabilitas

sel (%)

70 1,845 0,316 0,313 0,316 27,571 27,232 27,571 27,458 0,113

65 1,813 0,336 0,324 0,308 29,831 28,475 26,667 28,324 0,916

60 1,778 0,38 0,39 0,451 34,802 35,932 42,825 37,853 2,507

55 1,740 0,575 0,535 0,553 56,836 52,316 54,350 54,501 1,307

50 1,699 0,514 0,508 0,511 49,944 49,266 49,605 49,605 0,196

45 1,653 0,661 0,66 0,652 66,554 66,441 65,537 66,177 0,322

40 1,602 0,634 0,635 0,632 63,503 63,616 63,277 63,465 0,100

35 1,544 0,675 0,671 0,645 68,136 67,684 64,746 66,855 1,063

30 1,477 0,834 0,742 0,848 86,102 75,706 87,684 83,164 3,757

25 1,398 0,875 0,895 0,918 90,734 92,994 95,593 93,107 1,404

20 1,301 0,937 0,915 0,924 97,740 95,254 96,271 96,422 0,722

Kontrol Sel 0,955 0,955 0,960

Kontrol Media 0,071 0,914 0,073

Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,942, r = 0,9706.

Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=11 adalah 0,602.

r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut :

y = -131,64x + 274,26

50= -131,64x + 274,26

x = 1,7036 , IC50 = in log x

IC50 = 50 M

62

LAMPIRAN 2

Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel HeLa Perlakuan


Jumlah sel HeLa pada pengamatan jam 24, 48, dan 72 dengan perlakuan BHM

12,5; 25; 50; dan 75 M dan tanpa perlakuan (kontrol)

Jam Kontrol Kadar BHM (mM)

75 50 25 12,5

1 2 3 4

JUMLAH SEL RATA-RATA

0 5000,000 4918,033 4726,776 4904,372 5373,406

24 12504,554 268,670 1261,416 2818,761 5159,381

48 11404,110 51,370 1261,416 2568,493 9731,735

72 13515,982 268,265 222,603 656,393 9880,137


75 50 25 12,5

1 2 3 4

LOG JUMLAH SEL RATA-RATA

0 3,699 3,692 3,675 3,691 3,730

24 4,097 2,429 3,101 3,450 3,713

48 4,057 1,711 3,101 3,410 3,988

72 4,131 2,429 2,348 2,817 3,995

63

Jam Kontrol Kadar BHM (M)

75 50 25 12,5

JUMLAH SEL RATA-RATA X 104

sel 2 x lipat 10000 9836 9454 9809 10747

Log jumlah sel 4,000 3,993 3,976 3,992 4,031

Doubling time 37,000 74

Perlakuan Persamaan garis Slope Nilai Doubling Time (Jam)

Kontrol y = 0,0052x + 3,8076 0,0052 37,000

BHM 12,5 M y = 0,0045x + 3,6961 0,0045 74,000

BHM 25 M y = -0,0111x + 3,741 -0,0111 -

BHM 50 M y = -0,0166x + 3,6531 -0,0166 -

BHM 75 M y = -0,0188x + 3,2413 -0,0188 -

64

LAMPIRAN 3

Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLa Perlakuan Doksorubisin

Konsentrasi

(M)

Log

Konsentrasi


Error 1 2 3 1 2 3 Viabilitas

sel (%)

75 1,875 0,169 0,175 0,120 15,83 16,83 7,67 13,44 2,903

50 1,699 0,209 0,231 0,215 22,50 26,17 23,50 24,06 1,094

25 1,398 0,257 0,265 0,270 30,50 31,83 32,67 31,67 0,631

12,5 1,097 0,378 0,377 0,375 50,67 50,50 50,17 50,44 0,147

10 1,000 0,400 0,361 0,370 54,33 47,83 49,33 50,50 1,965

5 0,699 0,390 0,378 0,363 52,67 50,67 48,17 50,50 1,302

2,5 0,398 0,410 0,408 0,410 56,00 55,67 56,00 55,89 0,111

1 0,000 0,490 0,462 0,449 69,33 64,67 62,50 65,50 2,016

0,5 -0,301 0,576 0,603 0,507 83,67 88,17 72,17 81,33 4,764

0,25 -0,602 0,615 0,600 0,622 90,17 87,67 91,33 89,72 1,082

0,125 -0,903 0,624 0,646 0,626 91,67 95,33 92,00 93,00 1,171

Kontrol Media 0,076 0,073 0,072 0,074

Kontrol Sel 0,681 0,669 0,671 0,674




y = -27,182x + 70,811

50 = -27,182x + 70,811

x = 52,08, IC50 = in log x

IC50 = 6 M

65

LAMPIRAN 4

Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada Sel HeLa

Variasi Konsentrasi :

IC50 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (BHM): 50M

IC50 Doksorubisin : 6M

1/16 1/8 1/4 1/2

BHM (M) 3,125 6,25 12,5 25

Dox ((M) 0,375 0,75 1,5 3

A. Viabilitas Sel

BHM(M) Dox(M)

0 0,375 0,75 1,5 3

0 100 72,39 69,05 58,55 50,09

3,125 95,80 67,39 63,87 58,12 51,20

6,25 96,85 64,73 67,14 57,07 47,87

12,5 80,54 53,55 53,86 26,87 11,12

25 50,71 9,20 5,93 5,99 5,44

Persamaan Garis Lurus :

Doksorubisin : y = -27,182 + 70,811 (x = log konsentrasi)

BHM : y = -131,64x + 274,26 (x = log konsentrasi)

B. Konsentrasi Doksorubisin Tunggal

0,375 0,75 1,5 3

3,125 1,336 1,801 2,930 5,264

6,25 1,674 1,365 3,202 6,983

12,5 4,315 4,203 41,362 157,054

25 184,711 243,739 242,467 254,158

C. Konsentrasi BHM Tunggal

0,375 0,75 1,5 3

3,125 37,282 39,650 43,841 49,481

6,25 39,055 37,444 44,654 52,453

12,5 47,490 47,235 75,736 99,759

25 103,157 109,236 109,118 110,184

D. Combination Index

0,375 0,75 1,5 3

3,125 0,364 0,495 0,583 0,633

6,25 0,384 0,716 0,608 0,549

12,5 0,350 0,443 0,201 0,144

25 0,244 0,232 0,235 0,239

66

LAMPIRAN 5

Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan


Konsentrasi

(M)


Error 1 2 3 1 2 3 Viabilitas sel

(%)

80 0,142 0,144 0,131 8,70 8,95 7,29 8,31 0,517

60 0,320 0,320 0,361 31,46 31,46 36,70 33,21 1,748

40 0,529 0,494 0,512 58,18 53,71 56,01 55,97 1,292

20 0,738 0,708 0,696 84,91 81,07 79,54 81,84 1,597

10 0,741 0,750 0,802 85,29 86,45 93,09 88,28 2,431

5 0,796 0,784 0,779 92,33 90,79 90,15 91,09 0,645

Kontrol Sel 0,854 0,851 0,863 0,856

Kontrol Media 0,074 0,074 0,074 0,074




y = -1,127x + 100,17

50= -1,127x + 100,17

x = 45

IC50 = 45 M

67

LAMPIRAN 6

Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel T47D Perlakuan


Jumlah sel T47D pada pengamatan jam 24, 48, dan 72 dengan perlakuan senyawa

BHM dan tanpa perlakuan (kontrol)


67,5 45 22,5 11,25

1 2 3 4

JUMLAH SEL RATA-RATA

0 5000,000 5399,543 5045,662 5097,032 5079,909

24 13401,826 428,082 2106,164 4914,384 9452,055

48 13858,447 507,991 2106,164 7551,370 12888,128

72 11883,562 205,479 313,927 1906,393 10724,886


67,5 45 22,5 11,25

1 2 3 4

LOG JUMLAH SEL RATA-RATA

0 3,699 3,732 3,703 3,707 3,706

24 4,127 2,632 3,323 3,691 3,976

48 4,142 2,706 3,323 3,878 4,110

72 4,075 2,313 2,497 3,280 4,030

68


67,5 45 22,5 11

JUMLAH SEL RATA-RATA X 104

sel 2 x lipat 10000 10799 10091 10194 10160

Log jumlah sel 4,000 4,033 4,004 4,008 4,007

Doubling time 33,479 47

Perlakuan Persamaan garis Slope Nilai Doubling Time (Jam)

Kontrol y = 0,0048x + 3,8393 0,0048 33,479

BHM 11,25 M y = 0,0046x + 3,7893 0,0046 47,000

BHM 22,5 M y = -0,0046x + 3,8035 -0,0046

BHM 45 M y = -0,0151x +3,7544 -0,0151 -

BHM 67,5 M y = -0,0174x + 3,4733 -0,0174 -

69

LAMPIRAN 7

Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan Doksorubisin

Konsentrasi

(nM)


Error 1 2 3 1 2 3 Viabilitas sel

(%)

250 0,349 0,367 0,354 35,90 38,30 36,57 36,92 0,713

225 0,399 0,395 0,399 42,55 42,02 42,55 42,38 0,177

200 0,387 0,391 0,391 40,96 41,49 41,49 41,31 0,177

175 0,490 0,483 0,486 54,65 53,72 54,12 54,17 0,270

150 0,516 0,515 0,520 58,11 57,98 58,64 58,24 0,203

125 0,538 0,570 0,553 61,04 65,29 63,03 63,12 1,229

100 0,570 0,553 0,559 65,29 63,03 63,83 64,05 0,662

75 0,707 0,660 0,700 83,51 77,26 82,58 81,12 1,947

50 0,702 0,702 0,742 82,85 82,85 88,16 84,62 1,773

Kontrol Sel 0,817 0,832 0,844 0,831

Kontrol Media 0,081 0,079 0,078 0,079




y = -0,241x + 94,58

50 =-0,241x + 94,58

x = 185

IC50 = 185 nM

70

LAMPIRAN 8

Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada Sel T47D

Variasi Konsentrasi :

IC50 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (BHM): 45M

IC50 Doksorubisin : 185 nM

1/16 1/8 1/4 1/2

BHM (M) 2,8125 5,625 11,25 22,5

Dox (nM) 11,5625 23,125 46,25 92,5

E. Viabilitas Sel

BHM(M) Dox(nM)

0 11,5625 23,125 46,25 92,65

0 100 99,34 96,01 70,67 49,12

2,8125 96,62 98,38 87,18 67,95 33,87

5,625 93,34 84,25 85,31 63,15 28,37

11,25 81,07 71,33 61,33 36,65 5,50

22,5 49,67 46,74 26,35 9,39 5,15

Persamaan Garis Lurus :

Doksorubisin : y = -0,241x + 94,58 (x = konsentrasi)

BHM : y = -1,127x + 100,17 (x = konsentrasi)

F. Konsentrasi Doksorubisin Tunggal

11,5625 23,125 46,25 92,65

2,8125 -15,79 30,71 110,52 251,90

5,625 42,86 38,46 130,42 274,73

11,25 96,48 137,96 240,38 369,62

22,5 198,49 283,11 353,49 371,08

G. Konsentrasi BHM Tunggal

11,5625 23,125 46,25 92,65

2,8125 1,584 11,528 28,593 58,827

5,625 14,126 13,185 32,848 63,709

11,25 25,592 34,461 56,364 84,000

22,5 47,405 65,501 80,551 84,313

H. Combination Index

11,5625 23,125 46,25 92,65

2,8125 1,043 0,997 0,517 0,416

5,625 0,668 1,028 0,526 0,426

11,25 0,559 0,494 0,392 0,385

22,5 0,533 0,425 0,410 0,517

71

LAMPIRAN 9

Personalia Tenaga Peneliti

Personalia yang terlibat dalam kegiatan ini adalah :

No. Nama/NID

Instansi Asal Bidang

Ilmu

Alokasi

Waktu

(jam/minggu)

Urain Tugas

1. Retno Arianingrum, M.Si

/0015126803

FMIPA UNY Biokimia 15 Jam Ketua

Uji sitotoksik

Uji aktivitas

pemacuan

apoptosis

Uji

Pengamatan

Daur Sel

Uji Ekspresi

Protein

2. Prof. Dr. Indyah Sulistyo

Arty, M.S /0006045104

FMIPA UNY Kimia

Organik

Farmasi

10 Jam Anggota

Uji sitotoksik

72

Publikasi pada “International Conference ICB Pharma II

“Current Breakthrough in Pharmacy Material and Analyses”

74

Draf Paten

Deskripsi

PENGGUNAAN KOMBINASI DERIVAT KALKON BERSUBSTSITUEN

BROMO DAN DOKSORUBISIN PADA PENGOBATAN KANKER PAYUDARA

Bidang Teknik Invensi :

Invensi ini berhubungan dengan penggunaan senyawa

1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-

propen-1-on tunggal dan kombinasinya dengan agen ko-

kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel

kanker payudara.

Latar Belakang Invensi

Kanker payudara merupakan salah satu jenis

kanker penyebab kematian di dunia setelah kanker paru-

paru, perut, hepar, dan kolon dengan insidensi sebesar

502.000 kasus (WHO, 2006). Di Indonesia, pravalensi

kanker payudara menduduki peringkat ke-2 setelah kanker

leher rahim dan merupakan penyebab kematian utama pada

wanita. Dari semua kasus kanker pada wanita Indonesia,

pada tahun 1991 kasus kanker payudara mencapai 17,77%

(Tjindarbumi and Mangunkusumo, 2002).

Beberapa metode untuk pengobatan kanker telah

dilakukan, diantaranya pembedahan, kemoterapi dan

penyinaran (radiasi). Namun, masing-masing metode

mempunyai kelemahan, sehingga tingkat keberhasilannya

masih rendah (King, 2000). Kegagalan yang sering

terjadi pada pengobatan melalui kemoterapi disebabkan

karena rendahnya selektivitas obat anti kanker dan

adanya fenomena resistensi sel kanker terhadap agen

kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Oleh

karena itu, pengembangan dan penemuan pengobatan

kanker,khususnya kanker payudara perlu terus

diupayakan.

75

Diantara agen kemoterapi kanker yang telah

menimbulkan resistensi adalah doksorubisin. Senyawa

golongan antrasiklin ini diberikan pada berbagai jenis

kanker. Selain menimbulkan resistensi, doksorubisin

dapat menyebabkan kardiotoksisitas pada penggunaan

jangka panjang (Ferreira et al., 2008). Salah satu

alternatif untuk mengatasi resistensi adalah kombinasi

agen kemoterapi dengan agen kemopreventif sehingga

dapat meningkatkan keberhasilan terapi.

Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) adalah jenis keton

dengan ikatan tidak jenuh yang telah banyak di

teliti sebagai senyawa terapetika, khususnya sebagai

obat antitumor. Oleh karena aktivitasnya sebagai ”high

therapeutic index”, kalkon di anggap sebagai ”the new

era of medicines” dalam kapasitasnya sebagai antitumor,

antibakterial, dan anti-inflamatory (Afzal et al.,

2008). Disebutkan pula bahwa sebagian besar target

utama dari senyawa-senyawa kalkon adalah mempengaruhi

daur sel (Boumendjel et al., 2009). Shen et al, 2007

telah membuktikan bahwa struktur dasar kalkon (1,3-

difenilpropen-1-on) mampu menghambat aktivasi nuclear

factor kappa (NF-B). Penghambatan aktivasi NF-B

tersebut menyebabkan adanya induksi apoptosis,

penghambatan siklus sel, dan menurunkan ekspresi Bcl-XL

sebagai downstream target dari NF-B pada kultur sel

kanker kandung kemih T24 dan HT-1376, serta sel

payudara MCF-7 dan MDA-MB-231 (Hsu et al., 2006).

Beberapa senyawa derivat kalkon yang mengandung gugus

hidroksi pada posisi para seperti broussochalcone A;

xanthoangelol D; butein; isoliquiritigenin;

licochalcone A; isoliquiritigenin 2’-metil eter, dan

xanthohumol juga mampu menghambat aktivasi NF-B (Yadav

76

et al., 2011).

Penelusuran terhadap beberapa paten menunjukkan

bahwa beberapa derivat kalkon telah digunakan dalam

pengobatan kanker, seperti pada United States Patent US

6,498,195 B2 “Use of 1-Propanone-1-(2,4-

dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-hydroxyphenyl as

anticarcinogenic agent”, United States Patent US

7,872,029 B2 “Chalcone and its analogs as agent for the

inhibition of angiogenesis and related disease states”.

Arty et al., (2013), telah mensintesis senyawa

derivat kalkon bersubtituen bromo, yaitu 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

(Gambar 1). Senyawa ini terbukti memiliki aktivitas

antioksidan yang tinggi dan berpotensi sebagai

antikanker pada sel kanker leher rahim.

Invensi ini menggunakan senyawa 1-(4’-


baik tunggal maupun kombinasinya dengan agen ko-

kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel

kanker payudara T47D. Pengujian sebagai antikanker

dilakukan dengan uji sitotoksik menggunakan MTT {3-

(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium

bromida}. Perhitungan sitotoksisitas kombinasi

digunakan Combination Index (CI) (Reynols and

Maurer,2005).

Ringkasan Invensi

Penggunaan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai

antikanker baik secara tunggal maupun kombinasinya

dengan doksorubisin ini dilakukan untuk menghasilkan

dosis yang efektif dalam mematikan sel kanker payudara.

77

Penggunaan senyawa ini dalam treatment meliputi tahapan

berikut:

a. Preparasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan

doksorubisin (produk Kalbe Farma) untuk uji

aktivitas sitotoksik dimana senyawa tersebut

dilarutkan dalam DMSO (Dimetilsulfoksida).

b. Pengujian aktivitas sitotoksik senyawa baik

tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin

terhadap sel T47D (ATCC) menggunakan metode MTT

dan perhitungan kombinasi dosis efektif

menggunakan Combination Index (CI) (Reynols and

Maurer,2005).

Uraian Singkat Gambar

Gambar 1 memperlihatkan struktur senyawa 1-(4’-


atau 3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1-fenil-2-propen-

1-on).

Gambar 2 memperlihatkan hubungan konsentrasi

senyawa


propen-1-on dengan % viabilitas sel T47D

Gambar 3 memperlihatkan hubungan konsentrasi

doksorubisin dengan % viabilitas sel T47D

Uraian Lengkap Invensi

a. Preparasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-

3-metoksifenil)-2-propen-1-on

Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dilarutkan dalam pelarut

DMSO hingga konsentrasi 100.000 mikromolar sebagai

larutan induk. Selanjutnya dibuat variasi konsentrasi

78

5; 10; 20; 40; 60; dan 80 mikromolar dengan menggunakan

media kultur (MK). Media kultur yang digunakan dibuat

dari: (1) Penisilin-streptomisin (Penstrep) 2%. (2)

Fetal Bovine Serum (FBS) 10%, dan (3) Fungizon 0,5%

dilarutkan hingga 100 ml dengan medium Rosewell Park

Memorial Institut (RPMI) 1640 (GIBCO BRL) yang dibuat

dengan melarutkan 10,4 g RPMI ditambah NaHCO3 2,2 g;

Hepes 2 g dilarutkan dengan akuabides steril dan

dikondisikan pada pH 7,2 – 7,4, ditambahkan akuades

hingga volume akhir 1 liter. Selanjutnya disterilisasi

dengan filter 0,2 mikron.

Senyawa doksorubisin dilarutkan dengan media

kultur yang sama dengan variasi konsentrasi 50; 75;

100; 125; 150; 175; 200; 225 dan 250 nanomolar. Variasi

konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan untuk

kombinasi sebesar : 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5

mikromolar, sedangkan konsentrasi doksorubisin sebesar

: 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar.

b. Uji aktivitas sebagai antikanker pada sel kanker

payudara

Sel dengan konsentrasi 1 x 104 sel/sumuran

didistribusikan ke dalam plate 96 sumuran dan

diinkubasi selama 24 jam untuk beradaptasi dan menempel

di sumuran. Keesokannya media diambil kemudian

ditambahkan 100 μl media kultur yang

mengandung DMSO 0,1% (kontrol) atau sampel, inkubasi

selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang

mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 mikroliter

PBS (Phospate Buffer Saline). Kemudian ke dalam masing-

masing sumuran ditambahkan 100 mikroliter media kultur

yang mengandung MTT 5 mg/ml, inkubasi lagi selama 4 jam

79

pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT

membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4

jam, media yang mengandung MTT dibuang, kemudian

ditambahkan larutan SDS untuk melarutkan kristal

formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit

kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang

gelombang 595 nm.

Data yang diperoleh pembacaan ELISA reader berupa

absorbansi masing-masing sumuran dikonversi ke dalam

persen viabilitas sel. Persentase viabilitas sel

dihitung menggunakan rumus:

Absorbansi sel dengan perlakuan-absorbansi kontrol media X 100%

Absorbansi kontrol sel – absorbansi kontrol media

Data yang berupa viabilitas sel kemudian dianalisis

dengan membuat grafik log konsentrasi versus viabilitas

sel. Nilai IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan

penghambatan pertumbuhan 50% dari populasi sel sehingga

dapat diketahui potensi sitotoksisitasnya (Doyle and

Griffiths, 2000).

Sitotoksik kombinasi ditetapkan dengan menghitung

indeks interaksi antara doksorubisin dengan senyawa 1-

(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-

1-on menggunakan persamaan :

Combination Index/CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2

D1 dan D2 adalah konsentrasi sampel yang digunakan

dalam perlakuan kombinasi. (Dx)1 dan (Dx)2 adalah

konsentrasi tunggal yang dapat menghasilkan efek

sebesar yang ditimbulkan perlakuan kombinasi (Reynols

and Maurer,2005). Angka CI yang diperoleh

diinterpretasikan sebagaimana Tabel 1.

Potensi ketoksikan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-

(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel

80

T47D disajikan pada Gambar 3, yaitu memiliki nilai IC50

sebesar 45 mikromolar yang berarti sangat aktif.

Sedangkan potensi ketoksikan doksorubisin disajikan

pada Gambar 4, memiliki nilai IC50 sebesar 185

nanomolar.

Tabel 1. Interpretasi Nilai Indeks Kombinasi (CI)

Nilai CI Interpretasi

< 0,1 sinergi sangat kuat

0,1 - 0,3 sinergis kuat

0,3 - 0,7 sinergis

0,7 - 0,9 sinergis ringan-sedang

0,9 - 1,1 mendekati aditif

1,1 - 1,45 antagonis ringan-sedang

1,45 - 3,3 antagonis

> 3,3 antagonis kuat-sangat kuat

(Reynols and Maurer,2005)

Uji sitotoksik kombinasi doksorubisin dan

senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel T47D pada

konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 2,8125; 5,625;

11,25; dan 22,5 mikromolar, sedangkan konsentrasi

doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5

nanomolar. Kombinasi kedua senyawa ini mampu menurunkan

viabilitas sel lebih rendah daripada penggunaan senyawa


propen-1-on maupun doksorubisin secara tunggal

sebagaimana ditunjukkan pada Tabel 2 .

81

Tabel 2. Persen viabilitas sel perlakuan kombinasi

senyawa 1-4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dan doksorubisin

pada berbagai variasi konsentrasi.

Viabilitas sel (%) pada

variasi konsentrasi:

1-4’-

bromofenil)-3-

(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-

2-propen-1-on

(M)

Doksorubisin (nM)

0 11,5625 23,125 46,25 92,65

0 100 99,34 96,01 70,67 49,12

2,8125 96,62 98,38 87,18 67,95 33,87

5,625 93,34 84,25 85,31 63,15 28,37

11,25 81,07 71,33 61,33 36,65 5,50

22,5 49,67 46,74 26,35 9,39 5,15

Berdasarkan perhitungan nilai CI (Tabel 3),

terlihat bahwa pada kombinasi senyawa 1-(4’-


dengan konsentrasi sebesar 2,8125; 5,625; 11,25; dan

22,5 mikromolar, dan konsentrasi doksorubisin sebesar :

11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar memberikan

interprestasi antara mendekati aditif (0,9 – 1,1) pada

konsentrasi kombinasi rendah dan sinergi (0,3-0,7).

Dari hasil ini membuktikan bahwa senyawa 1-(4’-


berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi

doksorubisin pada pengobatan kanker payudara. Kombinasi

yang efektif dalam mematikan sel T47D adalah pada

penggunaan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 11,25 mikromolar

dan doksorubisin sebesar 92,65 nanomolar.

82

Tabel 3. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan

kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksi-fenil)-2-propen-1-on dan

doksorubisin pada berbagai variasi

konsentrasi.

Nilai CI pada perlakuan kombinasi:

1-4’-bromofenil)-3-

(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-

propen-1-on (M)

Doksorubisin (nanomolar)

11,5625 23,125 46,25 92,65

2,8125 1,0 1,0 0,5 0,4

5,625 0,7 1,0 0,5 0,4

11,25 0,6 0,5 0,4 0,4

22,5 0,5 0,4 0,4 0,5

83

Klaim

1. Penggunaan senyawa 1-4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-

3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai antikanker

pada sel kanker payudara T47D dengan IC50 sebesar 45

mikromolar.

2. Penggunaan kombinasi senyawa 1-4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar

11,25 mikromolar dan doksorubisin sebesar 92,65

nanomolar sebagai antikanker pada sel payudara.

84

Abstrak

PENGGUNAAN KOMBINASI DERIVAT KALKON BERSUBSTSITUEN

BROMO DAN DOKSORUBISIN PADA PENGOBATAN KANKER

PAYUDARA

Invensi ini berhubungan dengan penggunaan senyawa

derivat kalkon 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on baik tunggal dan

kombinasinya dengan agen ko-kemoterapi doksorubisin

sebagai antikanker pada sel kanker payudara T47D.

Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on dan doksorubisin

dilarutkan dalam media kultur yang mengandung DMSO.

Senyawa ini secara tunggal dapat digunakan sebagai

antikanker dengan IC50 sebesar 45 mikromolar, dan

dikombinasikan dengan doksorubisin dengan dosis efektif

pada penggunaan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 11,25

mikromolar dan doksorubisin sebesar 92,65 nanomolar.

85

Gambar 1

Gambar 2

Gambar 3

HO

HO

F

O

CH3O

Br

IC50 = 45 M

IC50 = 185 nM

86

Manuscripts for Asian Pasific Journal of Tropical Biomediicine

Cytotoxic and apoptotic effects of a chalcones derivative with

bromo substituent on HeLa cells

Retno Arianingrum

*, Indyah Sulistyo Arty

Department of Chemistry Education, Faculty of Mathematics and Natural

Science, Universitas Negeri Yogyakarta, Yogyakarta, Indonesia

ABSTRACT

Objective: To investigate the cytotoxic effect, apoptosis induction, and Bcl-2

expression of a chalcone derivate 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on against human cervix cancer HeLa cell lines.

Methods:

The cytotoxic effect was analyzed using MTT [3-(4,5 dimethyltiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazoilium bromide] assay, the apoptotic effect was determined by

Annexin-V flowcytometry method, and the expression of Bcl-2 was identified

using immunocytochemistry method.

Results: The research results showed that the IC50 of 1-(4’-bromophenyl) -3-(4-

hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on was 53 M, and it increased the

apoptotic induction and decreased the Bcl-2 expression level.

Conclusion: According to the result, this compound is potential to be developed

as chemotherapeutic agent for cervix cancer by inducing apoptosis.

Keywords: 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on

,cytotoxic effect, apoptosis induction, Bcl-2 expression, HeLa

cancer cells

1. Introduction

Cancer is the second most fatal disease after heart attack. Cervix cancer is one

type of cancer that has high prevalence and the first most common cancer

worldwide which causes mortality [1]

. In Indonesia, cervical cancer is the first

most frequent one in women [2]

. Current cancer therapies (surgery, radiation,

immunotherapy, and chemo-therapy) [3]

lead to undesired physical and

psychological distress to the patients. So that researches on finding new anticancer

compounds that have better therapeutic efficacy and fewer side-effects are still

needed.

Chalcones (trans-1,3-diaryl-2-propen-1-ones)4, a biosynthetic product of the

shikimate pathway, belonging to the flavonoid family are precursors of open chain

flavonoids and isoflavonoids, which are abundant in edible plants. Synthetic

chalcones can be prepared by an aldol condensation between a benzaldehyde and

acetophenone in the presence of strong bases. There are also some reports of acid-

catalyzed aldol condensations5. Chalcones and their derivates have attracted

increasing attention due to their numerous pharmacological applications. They

have displayed a broad spectrum of pharmacological activities, one of them being

anti-cancer6-10

. Many chalcones and their derivates have been shown to induce

87

apoptosis in different types of cancer cells through a wide variety of mechanisms.

These compounds have a common target, the Bcl-2 protein, which can induce

apoptosis in cancer cells11-14

.

A chalcone derivate compound, 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on (Figure 1) , was synthesized by reaction between

vanilin and 4-bromoacetofenon through a cross-aldol condensation reaction under

acidic conditions15

. Our previous research has reported that this compound has

antioxidant and cytotocix activity on HeLa cells (no publish). However, there has

been no research on how it affects apoptosis and Bcl-2 protein expression in

HeLa cells. In this study, the effects of cytotoxicity, apoptosis induction and Bcl-2

expression of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-

on were investigated. This study is useful for further development of this

compound as medicine in the treatment of cervix cancer.

Figure 1. The structure of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on

2. Materials and methods

2.1 Materials

The compound, 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-

propene-1-on, was produced through a cross-aldol condensation reaction of

vanillin and bromoacetofenon in an acidic condition. The compound was used as

a stock solution with concentration of 100 mg/ml in dimethylsulfoxide (DMSO).

The final concentration of DMSO in the study wells was kept less than 0.1%.

2.2 Cell culture and cytotoxic assay

HeLa cervical cancer cells were obtained from the collection of the

Laboratory of Parasitology, Faculty of Medicine, Universitas Gadjah Mada

(UGM). Cells were grown in medium culture RPMI (Rosewell Park Memorial

Institut) from Gibco containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco) and 1%

penicillin-streptomycin (Gibco) at 37oC in a humidified atmosphere of 5%

CO2/95% air. Tripsin-EDTA 0.025% (Gibco) was used to detach cells on the

flask.

A cytotoxic assay was performed using [3-4, 5 dimetiltiazol-2-yl)-2,5

difeniltetra-zoilium bromide] (MTT) colorimetric assay. T47D cells were seeded

at a density of 5x103

cells / well and allowed to attach for 24 hours in a humidified

HO

HO

F

O

CH3O

Br

88

incubator at 37oC. One day after initial seeding, the cells were treated with various

concentrations of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-

propene-1-on. After 24 hours incubation, the culture medium was removed and

the cells were washed with 100 L Phosphate Buffered Saline (Sigma). Then, 100

L of MTT (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) solution (0.5 mg/ml diluted

with DMEM medium) was added to each well, followed by incubation for 4 h at

37oC. Viable cells react with MTT to produce purple formazan crystals. Then, 100

L stopper reagent (10% Sodium dodecyl sulphate from Sigma Chemical, St.

Louis, MO, USA in 0.01M HCl) was added to dissolve the formazan crystal. The

cells were incubated for 12 hours (overnight) at room temperature and protected

from light. The absorbance of each well was measured using ELISA reader (Bio-

Rad) at λ 595 nm. The absorbance was converted to a percentage of viable cells18

.

The IC50 concentration was calculated by the concentration that caused 50%

inhibition of cell growth19

. Calculations of the IC50 value were done using the

linear regression of concentration versus cell viability.

2.3 Apoptosis Analysis

HeLa cells were seeded on a six tissue culture well-plate at 5 x 105

cells per

well. After 24 hours incubation the cells were treated with various cincentration of

1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on. After

incubation the cells were removed using 0.25% trypsine solution and then spinned

at 2000 rpm for 3 minute, and then washed twice with cold PBS. The cells were

re-suspended in 500 l of Annexin V buffer (Roche) and then treated with

Annexin V and propidium iodide (PI) for 10 minutes at room temperature and

protected from light. The treated cells were subjected to a FAC-Scan flow-

cytometer. Bivariant analysis of FITC-fluorescence (FL-1) and PI-fluorescence

(FL-3) gave different cell populations where the phenotype of FITC (-) and PI (-)

were designed as viable cells, while the FITC (+) and PI (-) as early apoptotic

cells; the FITC (-) and PI (+) as necrotic cells; and the FITC (+) and PI (+) as late

apoptotic cells.

2.4 Immunocytochemistry method

HeLa cells were seeded on the coverslips of a 24 well-plate at 5 x 104 cells

per well and incubated for 24 hours (or until 80% confluent). The medium in each

well was then replaced by the fresh medium containing various concentrations of

1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on and then

placed in a humidified incubator at 37 ˚C within an atmosphere of 5% CO2 and

95% air for 24 hours. The cells were then harvested and were washed with PBS

and fixed with cold methanol for 10 minutes at -4°C freezer. After that, the cells

in coverslips were placed each on a respective slide. The cells were washed with

PBS and distilled water, then were blocked in a hydrogen peroxide blocking

solution for 10 minutes at room temperature. They were again washed with PBS,

and then incubated with pre-diluted blocking serum for 10 minutes at room

temperature. Next, the cells were stained with primary Bcl-2 antibody for 1 hour

at room temperature. After three time-washing with PBS, the secondary antibody

89

was applied for 15-20 min, and then washed with PBS three times. The slides

were incubated with streptavidin-biotin complex for 10 minutes, and then washed

with PBS three times. The slides were incubated in DAB (3, 3 diaminobenzidine)

solution for 3-5 minutes and washed with distilled water. Cells were

counterstained with Mayer-Haematoxilin reagent for 3-4 minutes. After

incubation, the coverslips were washed with distilled water and then immersed in

absolute ethanol and in xylol afterward. The protein expression was assessed

under a light microscope. Cells which with expression give a dark brown color in

the cell membrane, while the cells with no expression will give purple color.

3. Results

3.1 The cytotoxic effect of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-

2-propene-1-on on HeLa cells

The cytotoxic activity of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on was presented in Figure 2. The results indicated

that the compound showed growth inhibitory effect on HeLA cells in dose

dependent manner. Based on linear regression between concentration and cell

viability percentage (p<0.05), IC50 of the compound is 53 M.

Figure 2. The cytotoxic effect of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on HeLa cells was determined using MTT

assay. The studies were conducted by incubating 5x103 cells in 96 well plates

for 24 hours in RPMI medium without or with 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-

hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on treatments of 20, 25, 30, 35, 40,

45, 50, 55, 60, 65 and 70 M. The profile of cell viability is expressed in

(A)

(B) (C)

(D)

90

mean ± SD from three experiments (A). The morphological changes and cell

populations under the treatment of the compound concentrations of 0 M or

control (B) were compared to that of 20 M (C) and 60 M (C). The bold

arrow indicates normal living cells, whereas the dashed arrows indicate the

cell morphology changes. The cell morphology was observed using inverted

microscope with 100x magnification.

3.2 The 1 -(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on

effect on apoptosis induction

The effect of 1 -(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-

propene-1-on treatment on HeLa cells apoptosis determined using flowcytometric

method. The result showed that the compound induced the HeLa cell apoptosis at

early and late phases of cell apoptosis as shown in Figure 3.

Figure 3. The effect of 1 -(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on treatment on apoptotic induction of

HeLa cells. The cells were seeded at 5x105 cells/well on six wells tissue

culture plate, then treated with the compound concentrations of 0, ¼

IC50, ½ IC50, and IC50. After 24 hours incubation, cell were harvested as

described in the methodology, added with AnnexinV and PI reagents,

were then subjected to FACS flowcytometer.

3.3 The effect of 1 -(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-

propene-1-on treatment on Bcl-2 expression

To confirm the apoptosis mechanism of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-

3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on, a study on the effect of the compound on the

expression of Bcl-2 was conducted using an immunocytochemistry method. Bcl-2

is a protein which suppresses cell apoptosis. Interestingly, the expression of Bcl-

2 of the compound treated cells was lower compared to that of the control cells

(Figure 4). These data showed that 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on has potency to induce cell apoptosis by

suppressing the Bcl-2 expression.

91

Figure 4. The expression of Bcl-2 on HeLa cells was determined using

immunocytochemistry method. (A) is the control cells without antibody, (B)

control cell with Bcl-2 Ab, and (C) 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on 12,5 M. The experiment used DAB as the

chromogen. Dark brown staining in cell’s cytoplasm and mitochondria membrane

indicated the positive expression of Bcl-2. Cells which showed purple colour after

counterstained with Mayer-Haematoxilin indicated negative expression of Bcl-2.

The bold arrow indicates the positive expression, whereas the dashed arrows

indicate the negative expression of the protein.

4. Discussion

The research results showed that 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-2-propene-1-on compound has anticancer potency, especially

through its inhibition on the cell proliferation. It has cytotoxic effect to human

cervical cancer cell-lines HeLa with IC50 of 53 M. Prayong20

mentioned that

compound with IC50 less than 100 µM is potentially to be developed as anticancer

agent. The cytotoxic effect of the compound could be related with its ability to

accelerate the cell apoptosis, as shown by the data that the compound induced

apoptosis in HeLa cells.

Apoptosis is a programmed-cell death which is characterized by changes

on cell morphology, membrane blabbing and chromatine21

. In this study, the

characteristic changes of cell morphology, such as cell shrinking, nuclear

fragmentation, and cell apoptosis were more extensive after the treatment with 1-

(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on (Figure 1).

The flowcytometry analysis showed that treatment with the compouns at 12,5 M

increased the cell death from 4.4% to 11.07%, and increased up to 39.81% after

treatment with 25 M, and increased up to 72.42% with 50 M These data

indicated that the compound is able to induce apoptosis. Ability in inducing

apoptosis on cancer cells is an important property for a prospective anticancer

drug because cancer cells generally are capable to evade apoptosis.

Apoptosis process occurs via various mechanisms. NF-B protein inhibits

apoptosis through increasing transcription of Bcl-2 that prevents the release of

cytochrome c by Bax in mitochondria22

. The inhibition of NF-B also causes

decreasing of Bcl-2 and Bcl-XL expressions, two main anti apoptotic proteins.

The study showed that the 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-

(C) (A) (B)

92

2-propene-1-on treatment decreased the level of Bcl-2 which in turn induced the

HeLa cell’s apoptosis.

Some references stated that the main structure of chalcones, that is 1,3-

diphenyl-2-propenone, has been proven to have a chemopreventive effect on

human breast cancer cell lines of MCF-7 and MDA-MB-23123

and human bladder

cancer cell lines of T24 and HT-137624

. It was showed to inhibit the proliferation

of T24 and HT-1376 cells by inducing apoptosis and blocking cell cycle progress

at G2/M phase. It significantly increased the expression of p21 and p27 proteins,

and decreased the levels of cyclin B1, cyclin A and Cdc2, which contribute the

cell cycle arrest. Moreover it increased the expression of Bax and Bak, and

decreased the levels of Bcl-2 and Bcl-XL which subsequently triggered

mitochondrial apoptotic pathway via releasing cytochrome c and activating

caspase-9 and caspase-3. Chalcone has also an inhibitor activity to Nuclear factor

kappa B (NF-κB) at concentration of 50 M. NF-κB is a transcription factor that

plays a major role in development and progression of cancer because it regulates

more than 400 genes involved in inflammation, cell survival, cell proliferation,

invasion, angiogenesis, apoptosis, cell cycle and metastasis 25

.

The study’s compound, 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-

propene-1-on, is a chalcone derivate that has -3’ methoxy , 3 bromo, and -4’

hydroxyl phenyl moieties. Base on the references, those structure modifications

still retain the cytotoxic activity of chalcones. It was showed that increased

apoptosis induction via suppressing Bcl-2 level in HeLa cells. So that 1-(4’-

bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on may have

potential effects on the NF-κB survival system which play important roles in the

anti-proliferative activity on the HeLa cells. The detail molecular mechanism of

the apoptotic induction is still needs to be explored.

Conflict of interest statement

We declare that we have no conflict of interest

Acknowledgments

We gratefully thanks to DP2M DIKTI (Directorate of Higher Education)

Ministry of Education Indonesia through “Hibah Bersaing”Research Grant 2015

for financial support in this study.

References [1] American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2012. Atlanta: American Cancer

Society; 2012. Page 9

[2] Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo, R. 2002. Cancer in Indonesia, Present

and Future. Jpn. J. Clin. Oncol. 32 (Supplement 1): S17-21.

[3] King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, Pearson Education, Second Edition,

England. p.1-7,228-231, 263-264

[4] Wong, H.L., Bendayan, R., Rauth, A.M., Xue, H.Y., Babakhanian, K., and

Wu, X.Y. 2006. A Mechanistic Study of Enhanced Doxorubicin Uptake and

Retention in Multidrug Resistant Breast Cancer Cells Using A Polymer-

Lipid Hybrid Nanoparticle System. The Journal of Pharmacology and

Experimental Therapeutics, 317 (3), 1372-1381

[5] Davis, J.M., Navolanic, P.M., Weinstein-Oppenheimer, C.R., Steelman,

L.S., Wei, H., Konopleva, M., Blagosklonny, M.V., and McCubrey, J.A.,

93

2003, “Raf-1 and Bcl-2 Induce Distinc and Common Pathways That

Contribute to Breast Cancer Drug Resistantce”, Clin. Cancer Res.9:1161-

1170.

[6] Ferreira, A.L.A., Matsubara, L.S., and Matsubara, B.B. 2008.

Anthracycline-Induced Cardiotoxicity, Cardio-vascular & Hematological

Agents in Medical Chemistry. 6. 278-281.

[7] Afzal S., Asad M. K, Rumana Q. F, Ansari, Muhammad F. N, and Syed S.

S. 2008. Redox Behavior of Anticancer Chalcone on a Glassy Carbon

Electrode and Evaluation of its Interaction Parameters with DNA, Int. J.

Mol. Sci. 2008, 9, 1424-1434

[8] Boumendjel A, Ronot X, Boutonnat. 2009 . Chalcone derivatives acting as cell

cycle blockers : potensial anticancer drugs ? J Curr Drug Targets. Apr;10(4):363-71.

[9] Shen, K.H, Chang, JK, Hsu, Y.L, and Kuo, P.L., 2007, “Chalcone Arrests

Cell Cycle Progression and Induces Apoptosis Through Induction

Mitochondrial Pathway and Inhibition of Nuclear Faktor Kappa B Signaling

in Human Bladder Cancer Cells”, Basic Clin Pharmacol Toxicol, 101 : 254-

61

[10] Pahl, H.L., 1999, “Activators and Target Genes of Rel/NF-κB Transcription

Factors”, Oncogene 18 6853–6866.

[11] Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.W., and Lin, C.C., 2006, Chalcone Inhibits

the Proliferation of Human Breast Cancer Cell by Blocking Cell Cycle

Progression and Inducing Apoptosis. Food Chem Toxicol. 44 (5):704-13

[12] Guttridge, D.C., Albanese, C., Reuther, J.Y., Pestell, R.G., and Baldwin,

Jr. A.S., 1999, “NF-κB Controls Cell Growth and Differentiation Through

Transcriptional Regulation of Cyclin D1”, Mol. Cell. Biol., 19, 5785 - 5799.

[13] Hinz, M., Krappmann, D., Eichten, A., Heder, A.,, Scheidereit, C., and

Strauss, M., 1999, “NF-κB Function in Growth Control: Regulation of

Cyclin D1 Expression and G0/G1-to-S-Phase Transition”, Mol. Cell. Biol.,

19, 2690 - 2698.

[14] Arty SA. Synthesize and cytotoxic test of several compounds of mono para

hydroxy Chalcones. Indo J. Chem 2010; 10 (1) 110-115

[15] Arianingrm, R., Arty, I. S., dan Atun, S. 2010. Uji Sitotoksisitas Senyawa

Mono Para Hidroksi Kalkon terhadap Cancer cell lines T47D, Saintek, 16

(2) : 121 -132

[16] Arianingrum R, Sunarminingsih R, Meiyanto E, Mubarika S. Potential of a

chalcone derivate compound as cancer chemoprevention in breast cancer.

IPCBEE 2012; 38: 41-45

[17] Arianingrum R, Sunarminingsih R, Meiyanto E, Mubarika S. Cytotoxic

effect of para hydroxyl chalcone (pHmMC) on MCF-7 breast cancer cells

by inducing cell arrest and apoptosis. 2ndICRIEMS proceedings 2015; C-

11:89-95

[18] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:

application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol Methods

1983; 65: 55-63

[19] Doyle A, Griffith JB. Cell and tissue culture for medical research. New

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Boumendjel%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ronot%20X%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16307839

94

York: John Willey and Sons Ltd. 2000

[20] Reynold, C.P. and Meurer, B.J. 2005. Evaluating Response to

Antineoplastic Drug Combination in Tissue Culture Models. Methods Mol.

Med. 110, 173-183

[21] Di Leo A, Tanner M, Desmed C, Paesman M, Cardoso F, Durbecq V,et al.

p-53 gene mutations as a predictive marker in a population of advanced

breast cancer patients randomly treated with doxorubicin or docetaxel in the

context of a phase III clinical trial. Ann Oncol 2007; 18: 997-1003.

[22] Vayssade M, Haddada H, Faridoni-Laurens L, Tourpin S, Valent A, Benard

J, et al. p73 functionally replaces p53 in adriamycin-treated, p53-deficient

breast cancer cells. Int J Cancer 2005; 116(6): 860-869.

[23] Rudin CM, Thompson CB. Regulation and clinical relevance of

programmed cell death. Annu Rev Med 1997; 48: 267-281.

[24] Simstein R, Burow M, Parker A, Weldon C, Beckman B. Apoptosis,

chemoresistance, and breast cancer: Insights from the MCF-7 cell model

system. Exp Biol Med 2003;101:995-1003

[25] Yadav VR, Prasad S, Sung B, Anggarwal BB. The role of chalcones in

suppression of NF-kB-mediated inflammation and cancer. International

Immunopharmacology 2011; 11 (3) : 295-309

JUDUL: PENGEMBANGAN APLIKASI SENYAWA...

Documents

Transcript of JUDUL: PENGEMBANGAN APLIKASI SENYAWA...