6. Pelabelan RadioaktifBanyak isotop radioaktif yang sangat berguna untuk proses biokimia (Tabel 6.1). label radioaktif dipaparkan ke makromolekul, terutama protein, baik pada biosintesis, misalnya pada translasi dengan adanya zat 35S-Methionine, atau secara enzimatis, misalnya penggunaan 32P-labeled ATP pada proses fosforilasi protein oleh protein kinase, atau secara kimiawi dengan cara modifikasi rantai samping asam amino. Contoh reagen yang digunakan pada proses radiolabelling kimiawi protein dapat dilihat pada tabel 6.2.Keuntungan utama radioisotop adalah deteksi yang mudah dan sangat sederhana, termasuk juga grup yang diberi label secara kimiawi identik dengan analog alaminya; hal ini menyebabkan makromolekul dapat diamati dalam lingkungan alaminya tanpa kehilangan material secara signifikan. Tetapi radioisotope sangat berbahaya walau diberikan pada dosis rendah, terutama jika dalam bentuk molekul biologi aktif. Proteksi dan pembuangan merupakan kerugian utama; oleh karena itu, pelabelan non-radioaktif, seperti biotynilasi atau pelabelan fluorescent harus menjadi pilihan utama jika memungkinkan.( contoh pada protocol 3.6.7 dan 4.1.10)Penting! Beri perlakuan yang diperlukan agar sesuai dengan peraturan nasional atau regional yang mengatur penggunaan bahan radioaktif! Patuhi good laboratory practice sebagai tindakan pencegahan sesuai dengan radionuklida yang digunakan. Perlengkapan lab, kaca mata pelindung, dan sarung tangan harus selalu digunakan. Hindari polusi radioaktif untuk melindungi lingkungan sekitar anda.Bekerja dengan radioaktif tidak lebih berbahaya dibanding bahan infeksius/ beracun, terutama jika 10 peraturan emas dipatuhi: 1. Pahami sifat zatnya dan dapatkan pelatihan praktis. 2. Rencanakan untuk minimalisasi waktu kontak dengan radiaktif. 3. Jaga jarak dari sumber radiasi. 4. Gunakan pelindung yang sesuai. 5. Tempoatkan bahan radiaktif di tempat tertentu. 6. Gunakan pakaian yang sesuai dan dosimeter. 7. Periksa area kerja secara berkalauntuk kontaminasi. 8. Taati peraturan lokal dan bekerja secara aman. 9. Minimalisasi penumpukan zat sampah dan pembuangan secara tepat 10. Setelah selesai bekerja, periksa diri anda, mandi, dan periksa ulang.Tabel 6.1 Radioisotop yang penting secara biokimia. Waktu paruh, energy , dan radioaktifitas spesifikRadionuklidaWaktu ParuhEnergi (f)Aktivitas spesifik (TBq/ miliatom)

aMenangkap elektron

Contoh pelabelan radioaktif dengan phosphorus-32 (32P) dan iodine-125 (125I) pada bab ini dipilih karena dua alasanL: relative mudah dilakukan, dan pengukuran radioaktif yang sederhana. 32P diukur dalam air dengan mengukur radiasi CERENKOV menggunakan liquid scintillation counter dan 125I diukur dengan pengukur gamma. Kedua isotop juga dapat diukur dengan autoradiografi. Keuntungan lain dua isotop ini adalah waktu paruh yang singkat, sehingga mempermudah pembuangan limbah nuklir.6.1 Decay RadiaktifHukum Decay Radioaktif: N, radioaktifitas pada waktu t; N0, radiaktifitas pada t=0; t , waktu paruh isotopMassa zat radioaktif per MBq: M = Mr . (kBq) . t . CM: masa zat radioaktif (microgram); Mr: massa molar dan atom relatif; (kBq): radioaktifitas sesungguhnya dalam kBq; C: konstanta (lihat tabel 6.3)Radioaktifitas spesifik S pada F persen kemurnian isotop (t dalam hari) dihitung dengan:S = F . 4,81 . 1011/ t dalam MBq/mmolS = S/Mrdalam MBq/mgTabel 6.2. Reagen untuk pelabelan protein radioaktifKelompok akseptor dalam proteinReagen penanda (pembawa isotop radioaktif)

aReagen dapat ditandai oleh isotop radioaktif yang berbeda, misalnya 3H, 14C, atau 125I

6.2 Tabel decay untuk 32-Phosphorus, 35-Sulfur, dan 125-IodineJumlah N pada tabel 6.4 6.6 mewakili bagian radioaktifitas yang ditemukan pada hari ke-n setelah eksperimen dimulai.Tabel 6.3. Konstanta untuk perhitungan radioaktifitas spesifikt C

Tabel 6.4. Tabel Decay 32PhosphorusHariAngkaHariAngkaHariAngka

Tabel 6.5 Tabel Decay 35SulfurHariAngkaHariAngkaHariAngka

Tabel 6.6 Tabel Decay 125IodineHariAngkaHariAngkaHariAngka

a) Jika dimulai dengan 15kBq 32P, 15. 0,787 = 11,805 kBq ditemukan 5 hari kemudianb) Saat 8000 dpm 32P diukur pada hari ke-6, sampel sebenarnya mengandung 8000/0,748 = 10.695 dpm dan 178,25 Bq

6.3 Inkorporasi Enzimatik (32P)-Phosphate kedalam ProteinBanyak sistem membran biologis dan organel sel mengandung kinase, yang mentransfer kelompok phosphate ke protein, terutama serine, threonine, dan residu tyrosine. Fosforilasi enzim menghasilkan acylphosphate atau phosphoamide juga dapat diamati. Berdasarkan stabilitas kimiawi, fosfoprotein ini dibagi menjadi acid-stable (alkali labile), hydroxylamine-sensitive, dan acid labile.ReferensiWeller M (1979) Protein Phosphorylation: the nature, function, and metabolism of protein with covalently bound phosphorus. Pion, London.Subunit katalitik cycloAMP-dependent protein kinase (cAMP PrK) memindahkan residu phosphate terminal ATP menjadi residu serine pada beberapa protein. Protocol yang ditunjukkan berikut memungkinkan fosforilasi cAMP-dependent dan reaksi fosforilasi enzimatik protein yang lainnya.A. 480mM KCl, 160 mM Histidine, 40 mM MgCl2, pH 6,8B. 2,5mM Tris-ATP2,3C. (-32P) ATP dalam lar. B 10-20 kBq/lD. 0,5M NaF dalam ddH2OE. 2mM EGTAF. 50g/ml subunit katalitik cAMP PrKG. 50g/ml cAMP PrK inhibitor4H. 50g/ml calmodulinI. 2mM CaCl2J. 50mM KCL, 20mM Tris HCL, 0,2mM DTE atau DTT, pH 6,8K. 15% asam trikloroasetat (w/v), 50mM sodium phosphate dalam airPipetkan campuran sesuai tabel 6.7, dinginkan tabung dalam kolam es, lalu tambahkan larutan protein atau suspense membran yang mengandung 10-200g protein, dan isi dengan ddH2O sampai masing-masing 200l. Pre-inkubasi pada 30oC selama 3menit, lalu mulai fosforilasi dengan menambahkan 20l larutan C.

Tabel 6.7 Protokol fosforilasi dengan Protein Kinase (PrK)Tipe protein kinaseLarutan (l per 200l campuran)

ADEFGHI

cAMP PrK Eksogen

Kontrol

Calmodulin-sensitive cAMP PrK endogen

Kontrol

PrK endogen dengan adanya calmodulin endogen

Kontrol

PrKb Endogen lain

Kontrol

aHilangkan inhibitor cAMP PrK jika enzim ini tidak ada, atau aktifitasnya adalah sebagaikontrolbAktivator potensial PrK, misalnya cAMP,cGMP, inositol fosfat, atau lemak dapat ditambahkan dalam konsentrasi fisiologis

2Tuangkan larutan sodium ATP ke kolom kecil resin, diseimbangkan dengan Tris Elute Tris-ATP dengan ddH2O dan amati dengan absorbsi UV pada 260 nm.3Jika radioaktifitas spesifik (-32P) ATP tidak terlalu tinggi atau jika fosfatase endogen tidak ada, konsentrasi akhir 250M ATP dapat dikurangi4Preparasi inhibitor cAMP PrK menurut Demaille JJ, Peters KA, Fischer EH (1977) Biochem 16:3080

Hentikan fosforilasi: dengan pengenceran 50x menggunakan larutan J dingin dan sentrifugasi pada suhu 0oC sebanyak 50.000 100.000 g selama 30 menit (pada fosforilasi membran), atau dengan menambahkan 1ml larutan K dingin setelah 10 detik 5 menit.Untuk memperkirakan total 32P-Phosphorus, saring presipitat diatas filter fiberglass dan hitung radioaktifitasnya. Jika menggunakan elektroforesis, kumpulkan presipitat dengan sentrifugasi 5000g dan sebarkan pellet pada buffer sampel yang sesuai. Pilih sistem elektroforesis yang mempertimbangkan perbedaan stabilitas pH dari produk fosforilasi.6.4 Iodinasi dengan reagen (125I)-IodinePerhatian! 125-I dapat dilepaskan pada iodinasi meskipun mengginakan larutan. Bekerja dengan pelindung khusus. Periksa tiroid anda setelah 6 dan 24 jam setelah bekerja dengan reagen iodinasi.Iodine terinkorporasi ke dalam protein secara oksidatif, enzimatis, atau elektrokimia. Inkorporasi oksidatif menggunakan oksidan organikimiawi, seperti chloramines T atau iodo-gen (1,3,4,6-tetrachloro-3,6-diphenyl glycouril). Inkorporasi enzimatik dengan bantuan lactoperoxidase. Dengan cara ini iodine dipaparkan ke dalam residu phenyl (tyrosyl) dari protein.Konjugasi protein dengan reagen BOLTON-HUNTER yang sudah dilakukan labelisasi radioaktif mengubah rantai samping lysine.6.4.1 Protokol Chloramine-TA. Larutan Na125I, 3,7 GBq/mlB. 0,25 M buffer Sodium Phosphate, pH 7,5C. 50 M buffer Sodium Phosphate, pH 7,5D. 5mg/ml chloramines-T (sodium N-chloro-p-toluenesulfonamide) dalam lar. CE. 0,3% 2 mercaptoethanol (v/v) dalam larutan CF. 0,1% serum albumin (w/v) atau 0,1% gelatin (w/v) atau 2% serum terinaktivasi panas (v/v) dalam larutan CG. 0,2% NaI (w/v) dalam larutan FPeriapkan larutan D,E, dan G tepat sebelum memulai eksperimen.Pipet 5-10 l larutan A (4-7 MBq) ke 4ml tabung uji polystyrene atau silicon. Lalu tambahkan 25 l larutan B, diikuti10 l larutan protein (2-5 g dilarutkan dalam larutan C), 10 l larutan D, and 100 l larutan E. vortex setiap ditambahkan larutan baru. Isi sampai 1cc dengan larutan G dan hitung radioaktifitas total.Seimbangkan 1 x 10 cm Sephadex G-25 dengan 50ml larutan F. campurkan sampel yang teriodinasi dengan larutan F, dan ambil fraksinya 1ml. protein yang teriodinasi terlihat pada volume kosong, dan iodine-125 bebas tercampur pada total volume. Perkirakan radioaktivitasnya dan hitung radioaktifitas spesifik (Bequerel per milligram protein)Jika protein teriodinasi akan digunakan pada bioassay, cek aktivitas biologisnya (antigenisitas, aktivitas enzimatik, pengikatan ligand, dll) dibandingkan dengan yang tidak teriodinasi.6.4.2 Iodinasi dengan Reagen BOLTON-HUNTERA. Reagen BOLTON-HUNTER (N-Succymidyl 3(4-hydroxy-5-(125I)-iodophenyl)propionate) (70-150 TBq/mMol) dalam BenzeneB. 0,1M buffer Borate, pH 8,5C. 0,2M Glycine dalam larutan BD. 0,1% serum albumin (w/v) atau 0,1% gelatin (w/v) dalam 50 mM buffer phosphate, pH 7,5Pipet 5-10 MBq (250.000-500.000 dpm) larutan A ke dalam 4 ml tabung reaksi. Uapkan perlahan menggunakan nitrogen kering dengan arus lambat. Tambahkan 10 l larutan protein, mengandung 2-5 g protein dalam larutan B, dan goyangkan perlahan dalam kolam es selama 30 menit. Tambahkan 0,5 ml larutan C dan terus diguncangkan pada 0oC. Isi sampai 1 ml dengan larutan D setelah tambahan waktu 5 menit. Pisahkan protein terlabel dengan reagen yang tidak direaksikan seperti pada protokol 6.4.1.