SISTEM PROKARIOT & EUKARIOT, PROTEIN TERAPEUTIK & VAKSIN

PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN PADA SEL EUKARIOTAyu Permata Ratu, MSiSekolah Tinggi Farmasi MuhammadiyahSistem Prokariot & EukariotSistem Ekspresi prokariot umumnya lebih sering digunakan untuk memproduksi protein rekombinan daripada eukariot.Protein eukariot yang disintesis di dalam bakteri sering kali tidak stabil atau aktivitas biologinya rendah atau tidak ada. (ada beberapa dr prokariot tk mengalami perubahan gugus gula,deglikosilasi)Bakteri yang memproduksi toksin dapat mengkontaminasi produk akhir walau telah dilakukan purifikasi = bahaya bagi manusia atau hewan.(menempel pd produk akhir)Untuk menghindari hal tersebut, menggunakan sistem ekspresi eukariot untuk memproduksi protein terapeutikSistem Prokariot & EukariotDi dalam eukariot ada bbrp modifikasi yang dapat terjadi pada tingkat posttranslasi, setelah sintesis protein selesai:Formasi ikatan disulfida yang benar.Pemotongan proteolitik pada bentuk awal Glikosilasi (penmbahan gugus gula)Penambahan asam amino dalam protein

Sistem Ekspresi YeastEkspresi protein rekombinan pada S. cerevisiae telah banyak berhasil dilakukan. Tetapi walaupun beberapa hasil tinggi, ekspresi umumnya rendah.Disebabkan:Selama scale up, plasmid kehilangan jumlah frekuensinya, walau telah diinduksi dengan adanya promotorProtein rekombinan biasanya terjadi hyperglikosilasi, mengandung lebih dari 100 residu mannosa di setiap rantai samping N-linked oligosaccharide.Kebanyakan trial, protein dirancang untuk disekresikan ke ruang periplasma.(diantara dinding sel dan setelah sitoplasma)Protein PharmaceuticalsPenggunaan utama teknologi DNA rekombinan adalah memproduksi protein .Pengembangan utama teknologi DNA rekombinan, sebagian besar protein farmasetik manusia tersedia dalam jumlah terbatas.Produk Komersial Rekayasa MikrobaHuman Protein PharmaceuticalsJumlah sangat terbatasProduksinya mahalBiological mode of action belum dikarakteristik jelas

300 macam protein terapeutik manusia yang potensial telah diklon, dan telah melalui berbagai uji selama bertahun-tahun sebelum tersedia secara komersial

Pharmaceutical BiotechnologyDiseasesDrugDiabetesInsulinHaemophilia Factor VIIIStrokeTissue Plasminogen activatorGrowth FailureHuman Growth hormonAnaemiaErythropoietinViral infectionInterferonSistem Ekspresi Protein bakteri

Yeast Mammalia Insect

8Sistem Ekspresi Protein pada Sel EukariotSaccharomyces cerevisiaePichia pastorisBaculovirus-insectMammalian celsOptimizing Gene Expression

- sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda- jika menggunakan prokariot sebagai sel inang akan menurunkan biaya- namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis bentuk fungsional protein heterogous masih tetap?? Optimizing Gene Expression

Harus dipilih berdasarkan kriteria :-memproduksi protein heterologus yang mirip dengan mature authentic protein-mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi-mudah dipurifikasiContoh : human interleukin 3Produksi paling baik di Bacillus licheniformis (mampu menerima vektor secara alami)meskipun produksi banyak di E. coli, tapi menghasilkan protein interleukin-3 yang salah. Sistem Prokariot VS EukariotJumlah protein Jumlah proteinMedium sederhanaMedium kompleksPertumbuhanPertumbuhan Modifikasi pasca-translasi (-)Modifikasi pasa-translasi (+)Ukuran protein Ukuran proteinKonformasi protein sederhanaKonformasi protein kompleksProkariot VS EukariotTerdapat organel bermembran yang memiliki fungsi spesific (RE,AG)

Protein targeting in Eukaryot

Aparatus golgi ada penambahan gugus gula

= N-glycolylneuraminic acid

= Galactose

= N-acetylglucosamine

= Mannose

= Fucose

= N-acetylneuraminic acid

= XyloseGlikosilasi pada protein berkaitan dengan:Pelipatan protein : struktur tersierAktivitas biologisStabilitasWaktu paruh in vivo

Kloning pada YeastMenggunakan vektor shuttleKloning awal dilakukan di Escherichia coli :Penyiapan DNA sisipan dan DNA plasmidLigasi dan transformasiKonfirmasi kebenaran klonPurifikasi plasmid rekombinanTransformasi ke dalam sel yeastVektor ShuttleVektor shuttle : vektor yang dapat melakukan replikasi dalam lebih dari satu organisme (co/ E. coli dan S. cerevisiae).

Vektor ShuttleOri bakteri dan YeastResisten AB (bakteri)Marka seleksiG418,zeocin resistanceGene for production of URA, HIS, TRP, LEU, ADE

Marka SeleksiGen resistensi terhadap inhibitor : methotrexat dan tembaga.Gen pengkode biosintesis asam amino :Gen LUE2 : mengkode -isopropil-malat dehidrogenase yang mengkatalisis perubahan asam piruvat menjadi leusin.Gen TRP1 : terlibat dalam biosintesis triptofanGen URA3 : mengkode orotidin-5-fosfat dekarboksilase (enzim yang mengkatalisis 1 tahap biosintesis nukleotida pirimidin).

Advantages for P. pastorisGrow to extremely high cell densitiesIntracelullar or secretedPichia secretes low levels of native proteinEasier purification!High product yieldsExample : Sea Raven anti-freeze protein40 mg/L (secreted)Example : Hepatitis B Virus surface antigenYield : 400 mg/L (intra celluar)Pertimbangan Pemilihan Sistem Ekspresi (Inang)Ukuran protein ((disesuaikan dengn selnya)Terjad proses modifikasi ato tdkGlikoprotein atau protein (glikosilasi menentukan aktivitas atau tidak)Ada tidaknya ikatan disulfida26FUNGSI RE : Sintesis ProteinRE adl tempat sintesis protein yg ditujukan untuk disimpan dlm organel bermembran lain atau dieksport ke luar sel Protein di buat di REK dengan signal hidrofobik Urutan signal penting untuk protein mencapai targetnya di REIntermediate diantara translasi dan pengikatan adalah kompleks ribonucleoprotein yg disebut signal recognition particle (SRP)Setelah urutan signal diputus, tetapi masih terjadi translasi protein, terdapat empat kemungkinan modifikasi yang terjadi pd protein27

28

Apa yg akan terjadi pd protein setelah translokasi ke dlm RE?Glikosilasi protein(dilakuan oleh enzim2 RE) mol. Karbohidrat (gula) diikatkan ke asam amino dr protein Dilakukan oleh enzim yg ada di terletak di RE Mol. Gula selanjutnya dimodifikasi di GolgiSebagian besar protein yg ditranslokasi ke RE mengalami glikosilasi, beberapa protein sitosol juga di glikosilasiFungsi glikosilasi (?) : inhibitor glikosilasi memp. sedikit efek pd fungsi protein meningkatkan resistensi thd protease (protease utk memotong,krn udh da penambahan gula jd gbs diganggu protease,stabil

beberapa interaksi protein-protein tergantung pd glikosilasiStruktur Apparatus Golgi1.Aparatus golgi terdiri darisetumpuk kantong pipihyang dikelilingi membran yang strukturnya sama dengan membran sel2.Kantong-kantong pipih ini dinamakansisterna.3.Terdapat hampir di semua sel eukariotik dan banyak dijumpai pada organ tubuhyang melaksanakan fungsi ekskresi, misalnya ginjal.4.Setiap sel hewan memiliki 10 - 20 A. Golgi dan ratusa badan golgi pada tumbuhan.5.Disekitar sisternaterdapat vesikel-vesikel dengan berbagai ukuran, diantaranya berfusi dengan bagian tepi sisterna.6.Aparatus golgi biasanya berasosiasi dengan RE kasar yang terpisah oleh jarak yang sempit.Sisi Aparatus golgi yang menghadap ke RE kasar disebutcis(daerah pembentukan vesikel).Muka cis berfungsi sebagai penerima vesikula transpor dari REsisi yang berlawanan dengan RE kasar disebuttrans(daerah pemasakan vesikel).muka trans berfungsi mengirim vesikula transpor. Vesikula transpor adalah bentuk transfer dari protein yang disintesis RE. Apabila protein ini tidak dikeluarkan oleh badan golgi, maka akan disimpan di dalam sel sebagai lisosom.Aparatus golgi terdiri dari tiga komponen :1.CisternaeMerupakan bangunan dasar.yang menjadi ciri apparatus golgi Terdiri Dari sekitar 5 lempeng cisterna yang sejajar melengkung bentuk piala tiap cisterna berupa kantung gepeng tertekuk.Bagian tepi tiap cisterna biasanya menggembung dan berlobang-lobang .dibagian tepi itu ada pembuluh yang menghubungkan semua cisternae sesamanya.daerah tepi itu juga memiliki tonjolan-tonjolan yang akan cepat membentuk vasikula-vasikula atau mungkin juga bakal membentuk cisterna baru

2.VesikulaBagian vesikula terdapat dibawah (sebelah kedalam sel) bagian cisternae yang terdiri dari banyak gelembung serta memiliki warna yang terang.vesikula tumbuh dari reticulum endoplasma. Mungkin dekat kebagian cisternae vesikula tergabung membentuk cisterna baru.

3.Vakuola Bagian ini berada dibagian atas (sebelah puncak) yang terdiri dari banyak gelembung.vakuola berisi bahan sekresi (getahan) cisterna bagian atas akan pecah dan membentuk vakuola Ada tiga macam protein yang dihasilkan oleh Golgi, antara lain:1)Protein membran inti, membran plasma dan protein membran organel2)Protein sekretori yang disimpan dalam bentuk vesikel3)Protein enzim yang disimpan dalam vesikel (lisosom)Fungsi Aparatus Golgi Antara Lain:1.Glikosilasi2.Menyiapkan sekter untuk sekresi sel3.Reparasi membaran sel4.Pembentukan senyawa penyusun dinding selCisternaAfter initial glycosylation and quality-control in the RER lumen, most proteins pass into the Golgi body. The Golgi has stacked cisternae, which, unlike the RER, are not contiguous. Each cisterna plays a specific role:cis Golgi network (CGN) cis cisterna medial cisterna trans cisterna trans Golgi network (TGN)