KESEHATAN

LAPORAN PENELITIAN HIBAH BERSAING

PENELUSURAN POTENSI EKSTRAK SAMBUNG NYAWA (Gynura procumbens (Lour) Merr.) TERSTANDARISASI SEBAGAI

AGEN KEMOPREVENTIF DAN KO-KEMOTERAPI PADA SEL KANKER PAYUDARA DAN LEHER RAHIM

Tim Peneliti:

Nunuk Aries Nurulita, M.Si., Apt.

Prof. Sugiyanto, S.U., PhD., Apt

Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan Nasional, sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian Nomor : 094/SP2H/PP/DP2M/III/2010, tanggal 01 Maret 2010

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO NOVEMBER 2010

HALAMAN PENGESAHAN LAPORAN AKHIR 1. Judul Penelitian : Penelusuran Potensi Ekstrak Sambung Nyawa (Gynura procumbens)

Terstandarisasi sebagai Agen Kemopreventif dan Ko-kemoterapi pada Sel Kanker Payudara dan Leher Rahim

2. Ketua Peneliti a. Nama Lengkap : Nunuk Aries Nurulita b. Jenis Kelamin : Perempuan c. NIP : 2160217 d. Jabatan Fungsional : Lektor e. Jabatan Struktural : - f. Bidang Keahlian : Biologi dan Onkologi Molekuler g. Fakultas/Jurusan : Farmasi/- h. Perguruan Tinggi : Universitas Muhammadiyah Purwokerto i. Tim Peneliti

No. Nama Bidang Keahlian

Fakultas/Jurusan Perguruan Tinggi

1. Nunuk Aries Nurulita, M.Si., Apt.

Biologi dan Onkologi Molekuler

Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto

1. Prof. Dr. Sugiyanto, SU., Apt.

Farmakologi Biokimiawi

Farmasi Universitas Gadjah Mada

3. Pendanaan dan Jangka Waktu Penelitian a. Jangka waktu penelitian yang diusulkan : 2 (dua) tahun

Biaya Total yang diusulkan untuk 2 tahun : Rp. 99.930.000,- b. Biaya yang disetujui tahun I (2010) : Rp. 34.650.000,-

Mengetahui, Purwokerto, 18 Oktober 2010 a.n. Dekan, Fakultas Farmasi UMP PD1 Ketua Peneliti, Pri Iswati Utami, M.Si., Apt. Nunuk Aries Nurulita, M.Si., Apt. NIK. 2160218 NIK. 2160217

Menyetujui, a.n. Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat

Universitas Muhammadiyah Purwokerto Sekretaris,

Edi Joko Setyadi, SE., M.Si. NIP. 19740505 200501 1002

LAPORAN HASIL PENELITIAN

SUMMARY

Our recent study has evaluated ethanolic extract of Gynura procumbens (EEG) as co-chemotherapy agent in combination with doxorubicin (DOX) and 5-Fluorouracil (5-FU) against breast cancer cell line, T47D and MCF-7 cells and also with cisplatin (CISP) and 5-Fluorourasil (5-FU) on cervic cancer cell line, HeLa. This study aims to assess whether EEG show synergism with DOX, 5-FU and CISP and to evaluated apoptotic induction because of these treatment. MTT assay was used to measure the growth inhibitory effec of both single (EEG, DOX, 5-FU, or CISP) and combination treatments. EEG inhibited cells growth in a dose dependent manner the IC50

According to the results obtained, EEG appears to possess sensitizing properties, and cause cell cycle arrest and apoptosis on WiDr cells. EEG demonstrates a possibility of additive to synergism properties when combined with 5-FU but not CISP.

value on T47D, MCF-7, and Hela resulted 87, 271, and 328 μg/mL, respectively. Combination assessment was conducted beetwen EEG-DOX on T47D and MCF-7 cell lines, EEG-5-FU on T47D and HeLa cell lines, and also EEG-CISP on HeLa cell line. EEG sensitizes T47D and MCF-7 cells that was treated by DOX/5-FU, boosting its therapeutic potential. Conversely when EEG was combined with CISP on HeLa cell line, it seemed to cause antagonism. Ethidum bromide-acridine orange staining was used to concluded apoptosis phenomenone. EEG single induced apoptosis on both of breast cancer cell lines and resulted synergism effect when it combined with DOX and 5-FU. The inhibitory effect on cell viability was enhanced when it was combined with CISP on HeLa cell line.

PRAKATA

Peneltian ini mempunyai kontribusi yang sangat besar mengingat tingkat insidensi

kanker payudara dan leher rahim semakin besar di Indonesia dan cepatnya laju toleransi dan

resistensi agen kemoterapi yang digunakan. Dengan pengembangan terapi kombinasi antara

agen kemoterapi dengan agen kemopreventif sebagai kokemoterapi, diharapkan dapat

meningkatkan efektivitas kemoterapi, mengatasi masalah resistensi dan menurunkan resiko

toksisitas akibat kemoterapi.

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat bagi pengembangan

penelitian G. procumbens sebagai agen co-chemotherapy kanker. Penelitian ini diharapkan

dapat mengungkap potensi efek sinergistik ekstrak etanol daun G, procumbens dengan agen

kemoterapi doxorubisin, 5-fluorourasil, dan cisplatin. Adanya efek sinergis kombinasi ekstrak

etanol dengan agen kemoterapi tersebut diharapkan dapat menurunkan dosis terapi dan

toksisitasnya terhadap sel normal. Untuk selanjutnya pengembangan G. procumbens sebagai

agen kokemoterapi perlu didukung dengan penelitian preklinik dan klinik untuk mendapatkan

data ilmiah yang cukup sebagai dasar rekomendasi G. Procumbens dalam praktek kedokteran

formal.Dengan data ilmiah tersebut diharapkan ekstrak etanol daun G. procumben dapat

segera direkomendasikan sebagai agen Ko-kemoterapi kanker.

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN..................................................................................................... i A. LAPORAN HASIL PENELITIAN

RINGKASAN DAN SUMMARY ................................................................................ ii PRAKATA .................................................................................................................... iii DAFTAR ISI ................................................................................................................. iv DAFTAR TABEL ......................................................................................................... v DAFTAR GAMBAR .................................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................. vii BAB I. PENDAHULUAN .......................................................................................... 1 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 5 BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN ................................................. 11 BAB IV. METODE PENELITIAN .............................................................................. 12 BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN …………………………………………….. 16 BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................... 30 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................... 31 LAMPIRAN ................................................................................................................. 33

B. DRAFT ARTIKEL ILMIAH C. SINOPSIS PENELITIAN LANJUTAN

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Kadar kombinasi yang digunakan dalam penelitian 15 Tabel 2. Nilai IC50

ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi pada sel kanker payudara T47D

19

Tabel 3. Nilai IC50 22 ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi pada sel kanker Payudara MCF-7

Tabel 4. Nilai IC50 24 ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi pada sel kanker leher rahim HeLa

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Hasil identifikasi KLT dengan menggunakan pereaksi sitrobotat dan dilihat dibawak sinar UV 365 nm. A. Fase gerak yang digunakan adalah asam asetat 50% B. Fase gerak yang digunakan adalah BAW (4:1:5). Tampah teridentifikasi adanya flavonoid beberapa spot dan salah satu spot mempunyai nilai hRf sama dengan quersetin. 1. Quersetin 2. Ekstrak etanol daun sambung nyawa

17

Gambar 2 Gambaran mikroskopis morfologi sel HeLa (A), sel T47D (B), dan MCF-7 (C) 18 Gambar 3 Ekstrak etanolik sambung nyawa dapat menurunkan viabilitas sel T47D. Sel T47D

diberi perlakuan ekstrak etanolik sambung nyawa (0-250 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50

18

ekstrak etanolik daun sambung nyawa. Gambar 4 Agen kemoterapi doxorubicin dan 5-FU dapat menurunkan viabilitas sel T47D. Sel

T47D diberi perlakuan agen kemoterapi selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50

19

masing-masing agen tersebut. Gambar 5 Pemberian perlakuan sample uji mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker T47D.

Sel T47D tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

20

Gambar 6 Ekstrak etanolik sambung nyawa dapat menurunkan viabilitas sel MCF-7. Sel MCF-7 diberi perlakuan ekstrak etanolik sambung nyawa (0-1000 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50

20

ekstrak etanolik daun sambung nyawa. Gambar 7 Pemberian perlakuan sample uji mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker MCF-

7. Sel MCF-7 tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

21

Gambar 8 Doxorubicin dapat menurunkan viabilitas sel T47D. Sel T47D diberi perlakuan doxorubicin (0-250 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50 –nya. IC50 doxorubicin

21

= 438 nM. Gambar 9 Pemberian perlakuan doxorubicin mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker

MCF-7. Sel MCF-7 tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

22

Gambar 10 Ekstrak etanolik sambung nyawa dapat menurunkan viabilitas sel HeLa. Sel HeLa diberi perlakuan ekstrak etanolik sambung nyawa (0-600 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50

23

ekstrak etanolik daun sambung nyawa. Gambar 11 Agen kemoterapi 5-FU dan cisplatin dapat menurunkan viabilitas sel HeLa. Sel HeLa

diberi perlakuan agen kemoterapi selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50

23

masing-masing agen tersebut. Gambar 12 Pemberian perlakuan sample uji mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker HeLa.

Sel HeLa tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa

24

penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

Gambar 13 Kombinasi Dox-EGP dan 5-FU-EGP memberikan efek aditif sampai sinergis terhadap penghambatan pertumbuhan sel T47D. uji kombinasi dilakukan dengan masing-masing 4 (empat) seri konsentrasi dibawah konsentrasi IC50,

25

untuk agen kemoterapi dan EGP. Semua nilai CI < 1 yang menunjukkan efek aditif sampai sinergis.

Gambar 14 Kombinasi Dox-EGP (C) dapat menginduksi apoptosis lebih besar jika dibandingkan dengan pemberian tunggal dox atau EGP.

26

Gambar 15 Kombinasi 5-FU-EGP (D dan F) dapat menginduksi apoptosis lebih besar jika dibandingkan dengan pemberian tunggal 5-FU (A dan B) atau EGP (C dan D). Fenomena apoptosis sel akibat pemberian perlakuan. Fenomena apoptosis diamati dengan menggunakan metode pengecatan dengan etidium ndicat-akridin orange. Sel normal menunjukkan warna fluoresensi hijau dan bentuk sel utuh (D/G). sel yang diduga mengalami apoptosis berwarna orange, akibat permiabilitas sel terhadap etidium brimida Turun. Sel dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 100X. Munculnya apoptotic body ( → ) menjadi ndicator awal terjadinya apoptosis.

27

Gambar 16 Kombinasi Dox-EGP sinergis terhadap penghambatan pertumbuhan sel T47D. uji kombinasi dilakukan dengan masing-masing 4 (empat) seri konsentrasi dibawah konsentrasi IC50,

28

untuk agen kemoterapi dan EGP. Semua nilai CI < 1 yang menunjukkan efek aditif sampai sinergis.

Gambar 17 Kombinasi Dox-EGP (C) dapat menginduksi apoptosis lebih besar jika dibandingkan dengan pemberian tunggal dox atau EGP.

29

Gambar 18 Kombinasi Cisp-EGP dan 5-FU-EGP hanya memberikan efek aditif terhadap penghambatan pertumbuhan sel HeLa. Uji kombinasi dilakukan dengan masing-masing 4 (empat) seri konsentrasi dibawah konsentrasi IC50,

29

untuk agen kemoterapi dan EGP.

3

A. LAPORAN HASIL PENELITIAN

BAB I. PENDAHULUAN

Kanker merupakan permasalahan yang serius karena tingkat kejadiannya semakin

meningkat dari tahun ke tahun. WHO melaporkan terdapat lebih dari 10 juta kasus kanker

pertahun di dunia. Pada tahun 2006, diperkirakan ada 1,3 juta kasus kanker di Amerika

Serikat, dan lebih dari 550 ribu orang meninggal karena penyakit ini (WHO, 2006). Dari

data tahun 1998 – 1991, di Indonesia diperkirakan terdapat 170-190 kasus kanker per

100.000 orang (Tjindarbumi and Mangunkusumo, 2002).

Kanker payudara dan leher rahim merupakan dua macam kanker yang frekuensi

kejadiannya paling tinggi di antara kanker-kanker jenis lain yang sering menyerang wanita.

Hal ini tidak hanya terjadi di suatu tempat saja, namun hampir di seluruh dunia termasuk di

Indonesia. Penelitian di Amerika menyatakan bahwa satu dari delapan wanita Amerika

terserang kanker payudara dan 30% dari penderita mengalami kematian (WHO, 2006).

Sampai saat ini, pengobatan kanker yang efektif dan efisien belum juga ditemukan,

sehingga para peneliti memberikan perhatian besar pada penelitian obat antikanker. Tren

masyarakat untuk back to nature banyak memotivasi para peneliti dalam usaha pencarian

obat kanker dari senyawa-senyawa alam, karena kenyataannya memang belum ada obat

kanker yang benar-benar selektif sebagai antikanker.

Kegagalan yang sering terjadi dalam usaha pengobatan kanker, utamanya melalui

kemoterapi, lebih dikarenakan berkurangnya efikasi agen kemoterapi akibat adanya

mekanisme muti drug resistance (Conze, 2001), termasuk pada doxorubicin. Beberapa

penelitian bahan alam mulai diarahkan pada agen kokemoterapi, dengan tujuan

meningkatkan sensitivitas, menekan resistensi sel kanker dan mengurangi efek samping

yang ditimbulkan oleh agen kemoterapi.

Daun Gynura procumbens merupakan salah satu tanaman yang mempunyai potensi

sebagai antikanker. Daun G. Procumbens mengandung flavonoid dan glikosidanya, seperti

quercetin, kaempferol-3-O-neohesperidosida, kaempferol-3-glukosida, quercetin-3-O-

rhamnosyl(1-6)galaktosida, quercetin-3-O-rhamnosyl(1 -6)glukosida. Selain itu juga

mengandung sterol dan glikosida sterol. Ekstrak etanol daun G. procumbens terbukti

memberikan efek kemopreventif pada karsinogenesis kanker payudara tikus (Meiyanto,

dkk, 2007). Fraksi fenolik daun G. procumbens dapat menghambat proliferasi dan memacu

apoptosis sel Hela (Meiyanto dan Septisetyani, 2005). Penelitian kokemoterapi daun G.

procumbens bersama dengan doxorubisin pada sel T47D menunjukkan efek sinergis (Jenie

4

dan Meiyanto, 2007). Penelitian ini bertujuan untuk menguji potensi ko-kemoterapi ekstrak

etanolik G. procumben dengan doxorubicin terhadap sel kanker payudara T47D dan sel

kanker leher rahim HeLa.

Daun Gynura procumbens telah diketahui mempunyai kandungan kimia utama

berupa flavonoid dan glikosidanya, yaitu quercetin dan kaemferol. Fraksi polar ekstrak

etanol daun G. procumbens memiliki efek sitotoksik menghambat proliferasi dan

menginduksi apoptosis terhadap sel kanker serviks, HeLa, dengan IC50 119 μg/ml

(Meiyanto dan Septisetyani, 2005). Flavonoid yang diisolasi dari fraksi etil asetat ekstrak

etanolik daun G. procumbens memiliki aktivitas sitotoksik dengan IC50 sebesar 98 μg/ml

terhadap sel kanker payudara T47D dan meningkatkan ekspresi p53 dan Bax (regulator

apoptosis) (Maryati, 2006). Pengembangan agen ko-kemoterapi didasari oleh adanya

resistensi agen kemoterapi kanker, yang difokuskan pada peningkatan sensitivitas sel

kanker terhadap agen kemoterapi.

Penelitian ini diharapkan memberikan landasan yang lebih kuat mengenai khasiat

ekstrak etanolik G. procumbens sebagai agen kemopreventif dan ko-kemoterapi dalam

terapi kanker payudara dan kanker leher rahim. Uji kemopreventif ekstrak etanolik G.

Procumbens meliputi uji sitotoksik, doubling time, serta pengecatan DNA pada cell line

T47D dan HeLa.. Standarisasi ekstrak etanolik G. procumbens dengan senyawa penanda

quersetin dan kaemferol. Pengujian ko-kemoterapi ekstrak etanolik G. Procumbens

dilakukan dengan menetapkan nilai sitotoksisitas sinergistik. Nilai ini ditetapkan dengan

menghitung indeks interaksi antara agen kemoterapi dengan ekstrak etanolik G.

Procumbens. Pengamatan perubahan fase-fase siklus sel dilakukan dengan flowcytometry

assay. Perubahan fase-fase siklus sel dianalisis dengan mengamati perubahan distribusi sel

berdasarkan DNA contents. Pengamatan ekspresi protein-protein regulator siklus sel dan

apoptosis dilakukan dengan metode imunositokimia, dalam rangka penelusuran

mekanisme molekulernya.

5

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

Kanker dan siklus sel

Kanker pada dasarnya merupakan sel dengan proliferasi yang tidak terkendali

akibat kerusakan gen, utamanya pada regulator daur sel (Sherr, 1996). Pertumbuhan kanker

merupakan proses mikroevolusioner yang dapat berlangsung dalam beberapa bulan atau

beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini dinamakan karsinogenesis, dimulai dari satu sel

kanker yang memperbanyak diri dan membentuk koloni kecil dalam jaringan yang sama.

Selanjutnya terjadi perubahan genetik (seperti aktivasi onkogen) yang menyebabkan koloni

dari sel abnormal menjadi malignan (Scheneider, 1997). Perubahan genetik pada gen-gen

yang mengatur pertumbuhan, yaitu onkogen dan tumour supressor gene merupakan

perubahan yang sering terjadi (Meiyanto, 1999). Akibatnya sel akan berproliferasi terus

menerus dan menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal.

Daur sel suatu sel kanker pada dasarnya sama dengan sel normal, yaitu terdapat tiga

keadaan: sedang membelah (fase proliferatif), dalam keadaan istirahat (tidak membelah,

Go), dan secara permanen tidak membelah. Sel tumor membelah melalui 4 fase, yaitu :

fase G1, fase S (Sintesis DNA), fase G2 dan fase M (Foster et al., 2001).

Fase G1 merupakan fase yang paling menentukan terhadap keseluruhan daur sel,

karena merupakan tahap penting dari sistem regulasi signal pertumbuhan. Fase ini

berfungsi untuk memastikan cukupnya sinyal untuk kelangsungan sel dan akurasi transmisi

informasi genetik (King, 2000).

Fase S (Sintesis DNA ) ditandai dengan adanya proses sintesis DNA dan replikasi

genomnya (Wyllie et al., 2000). Sel mereplikasikan DNA menjadi dua set DNA yang

identik, dan dengan demikian sel siap memasuki fase G2 (Meiyanto, 2002). Fase ini

berlangsung secepat mungkin dengan tujuan meminimalkan pengaruh agen luar (King,

2000).

Pada fase G2

Pada fase M, sel melakukan pembagian genome kepada sel anak dengan sama

(Wyllie et al., 2000) dengan bantuan sistem mikrotubulus yang membawa kromatid ke

kutub yang berlawanan dalam sel (King, 2000). Setelah proses ini selesai, sel akan

, sel melakukan persiapan untuk proses pembagian genome ke sel anak

dan juga memastikan ketepatan replikasi DNA dengan enzim preparasi DNA (Wyllie et

al., 2000). Selain itu, sel juga melakukan pertumbuhan dan sintesis protein sehingga

cukup untuk kelangsungan dua sel yang akan terbentuk (Meiyanto, 2002).

6

melakukan pembelahan (cytokinesis) sehingga menghasilkan dua sel anak yang identik

(Meiyanto, 2002). Kedua sel akan masuk ke fase G1 atau masuk fase istirahat (G0)

(Wyllie et al., 2000)

Regulasi daur sel biasanya diatur oleh tiga jenis gen, yaitu oncogen, suppressor

genes dan gen yang mengatur replikasi dan repair DNA (Sofyan, 2000). Kedua jenis gen

tersebut (oncogen dan suppressor) bekerja secara harmonis untuk mengatur perkembangan

sel dalam rangka menjaga integritas tubuh secara keseluruhan. Kerusakan pada gen-gen

tersebut berisiko terjadinya kanker atau proliferasi berlebihan (Meiyanto, 1999).

Regulasi daur sel dilakukan oleh tiga kelompok protein utama, yaitu cyclin, cyclin-

dependent serine/threonin protein kinases (Cdks) dan cyclin-dependent kinase inhibitor

(CKIs) (King, 2000). Sel mengalami siklus sangat tergantung pada aktivasi cyclin

dependent kinase (Cdk). Aktivasi Cdk ini berdasar pada ikatannya dengan partner

regulator spesifik lain yaitu Cyclin (Foster et al., 2001). Ikatan itu terjadi jika Cdk telah

diaktivasi dahulu oleh Cdk activating kinases (CAK) dengan jalan fosforilasi residu treonin

(Pan et al., 2002). Tiga protein Cdk utama yang berperan adalah Cdk 4/6, Cdk2, dan Cdk1.

Protein Cdk 4/6 dan Cdk 2 berperan dalam fase G1. Cdk 4/6 diaktivasi oleh faktor

pertumbuhan sehingga menyebabkan sel keluar dari fase G0 dan memasuki fase G1 (Foster

et al., 2001). Komplek Cdk4/6-Cyc D juga berfungsi dalam transisi dari awal ke

pertengahan fase G1 (Pan et al., 2002). Cdk2 berperan pada akhir fase G1 agar sel

menyelesaikan fase ini, melakukan sintesis DNA (fase S) dan akhirnya masuk awal G2.

Cdk1 berperan pada fase G2 akhir sehingga sel menjalani dan menyelesaikan proses

mitosisnya (Foster et al., 2001).

Aktivasi Cdk dihambat oleh dua kelompok utama protein pengikat, yaitu keluarga

INK4 dan keluarga CIP/KIP. Kelompok protein INK4 antara lain adalah

p16INK4 membentuk dimer dengan protein Cdk4 dan Cdk6. Ikatan ini menghambat ikatan

Cdk4/6 dengan cyclin D sehingga menghambat aktivasi kinase tersebut. Kelompok protein

CIP/KIP adalah protein p21CIP1, p27CIP1 dan p57CIP1. Protein-protein tersebut membentuk

komplek trimer dengan Cdk2 yang terikat pada Cyc B atau Cyc A. Protein p21CIP1 dan

p27CIP1 juga membentuk ikatan dengan kompleks Cdk4/6-Cyclin D sehingga menghambat

aktivitasnya pada fase G1. Di lain sisi, ikatan trimer p27CIP1

Regulasi daur sel melalui gen supresor biasanya melalui gen Retinoblastoma (Rb)

dan gen p53. Protein Rb berperan dalam regulasi daur sel secara umum, sedangkan protein

-Cyc D-Cdk4/6 ini

menyebabkan Cyc E-Cdk 2 dan atau Cyc A-Cdk2 tidak terhambat sehingga memacu sel

dari fase G1 ke fase S dan masuk ke awal fase G2 (Foster et al., 2001).

7

p53 berperan dalam perbaikan DNA dan pemacuan apoptosis (King, 2000). Protein p53

mencegah reflikasi dari DNA yang rusak pada sel normal dan mendorong program

penghancuran sendiri sel yang mengandung DNA yang tidak normal (Sofyan, 2000).

Rb bekerja dengan cara menghambat aktivitas faktor transkripsi dari sel, yakni

E2F (King, 2000). E2F merupakan faktor transkripsi penting yang bekerja dengan cara

menginduksi gen-gen transkripsi agar mengekspresikan protein-protein tertentu, yang

sangat diperlukan untuk kelangsungan proses transisi sel dari fase G1 ke fase S (Pan et al.,

2002).

Rb yang aktif berada dalam bentuk hipofosforilasi, sehingga akan mengikat E2F

(King, 2000). Protein Rb sendiri merupakan target utama mekanisme fosforilasi oleh

komplek Cdk-Cyc (Weinberg, 1996). Jika Rb berada dalam bentuk hiperfosforilasi maka

menjadi tidak aktif, akibatnya E2F akan terlepas (King, 2000). Protein E2F bebas, menjadi

aktif dan menginduksi gen-gen transkripsi yang penting untuk kelangsungan daur sel (Pan

et al., 2002).

Protein p53 berhubungan langsung dengan proses induksi gen CIP1 khususnya

yang mengekspresikan p21CIP1

Resistensi kanker terhadap agen kemoterapi

(Shapiro dan Harper, 1999). Inhibitor Cdk ini memegang

peran penting dalam memacu cell cycle arrest pada fase G1 (Pan et al., 2002). Hal ini

menunjukkan bahwa p53 menyebabkan G1 arrest secara tidak langsung.

Ekspresi protein p53 akan meningkat jika selama fase S terjadi kerusakan DNA.

Protein p53 ini akan memberikan tiga efek, yaitu perbaikan DNA, penghentian sintesis

DNA, dan atau pemacuan apoptosis. Stimulasi apoptosis bisa lewat mekanisme penurunan

ekspresi protein Bcl-2 dan peningkatan protein Bax (King, 2000). Mekanisme kerja Bcl-2

menghambat apoptosis dengan aksi berlawanan terhadap faktor induksi apoptosis Fasl

yang biasanya diekspresikan jika sel dalam keadaan stres (Kampa at al, 2003). Protein Bax

merupakan pemacu terjadinya apoptosis (King, 2000).

Perkembangan resistensi sel kanker terhadap agen kemoterapi merupakan faktor

penting bagi keberhasilan pengobatan kanker. Resistensi terhadap obat banyak ditemukan

pada kanker payudara, prostat dan leukimia. Berbagai mekanisme yang memperantarainya

antara lain adalah inaktivasi obat, pengeluaran obat oleh pompa pada membran sel, mutasi

pada target obat, kegagalan inisiasi apoptosis (Davis et al., 2003, Notarbartolo et al.,

2005). Penelitian Davis et al. (2003) menunjukkan bahwa ekspresi Bcl-2 dan aktivasi Raf-

1 yang berlebihan berperan dalam timbulnya resistensi doxorubicin, lebih lanjut lagi

8

tingkat mRNA P-glikoprotein meningkat pada sel T47D sehingga akan mengekspresikan

Raf-1 aktif secara berlebihan. Bcl-2 termasuk dalam keluarga protein pengatur apoptosis

baik sebagai pro maupun anti apoptosis. Protein-protein ini memodulasi apoptosis melalui

pembentukan homodimer atau heterodimer dengan anggota keluarga Bcl-2 yang lain.

Ekspresi Bcl-2 yang berlebihan ditemukan pada banyak kasus kanker termasuk kolorektal,

prostat dan 70% dari kanker payudara (King, 2000; Davis et al., 2003). Sedangkan Raf-1,

isoform dari Raf, merupakan intermediat dalam cascade signal transduksi yang diinisiasi

oleh berbagai faktor pertumbuhan. Protein ini berperan dalam jalur signal transduksi

Raf/MEK/ERK. Jika diaktivasi isoform Raf mampu meningkatkan ekspresi protein-protein

tertentu termasuk p21Cip1 dan c-Myc (Davis et al., 2003). Signal transduksi tersebut

berperan dalam pengaturan mekanisme yang memperantarai resistensi obat, misalnya jalur

Raf/MEK/ERK mengatur ekspresi pompa keluar P-glikoprotein (P-gp).

P-glikoprotein adalah suatu transporter yang bergantung pada ATP, terletak di

permukaan membran plasma sel. Aktivitas P-gp memompa keluar agen kemoterapi dari sel

diduga mengakibatkan timbulnya resistensi sel kanker terhadap kemoterapi (multidrug

resistance). Transporter ini mampu memompa keluar berbagai senyawa termasuk banyak

agen kemoterapi seperti etoposide, antrasiklin (doxorubicin), dan alkaloid vinca. Namun

demikian senyawa seperti verapamil, analog dihidropiridin, dan siklosporin A mampu

membalikkan resistensi yang diperantarai P-gp dengan menghambat aktivitas transporter

tersebut (Kitagawa, 2006).

Ko-kemoterapi

Pada umumnya hampir semua regimen dalam pengobatan kanker merupakan

suatu kombinasi dari beberapa obat. Idealnya kombinasi obat tersebut merupakan agen-

agen yang memiliki efek sinergis melawan sel kanker namun dengan profil toksisitas yang

masih dapat ditoleransi (efek toksik seminimal mungkin) sehingga secara klinik akan lebih

efisien dibandingkan dengan agen tunggal. Kebanyakan kombinasi kemoterapi yang

diterapkan saat ini dikembangkan secara empiris. Namun demikian, sampai saat ini belum

ada terapi pengobatan untuk kanker payudara yang telah metastasis. Meskipun telah

banyak agen sitotoksik yang digunakan dalam pengobatan penyakit ini, tetapi

penggunaannya dibatasi oleh resistensi sel kanker terhadap obat. Selain itu, agen

kemoterapi sering menimbulkan toksisitas yang tinggi terhadap organ normal. Oleh

karenanya pengembangan cara pengobatan baru bagi kanker payudara sangat diperlukan

(Tyagi et al., 2004).

9

Salah satu pendekatan yang dapat dilakukan adalah mengkombinasikan senyawa

fitokimia atau obat yang non-toksik namun efektif melawan sel kanker dengan agen

kemoterapi, yang mana akan meningkatkan efikasinya dan menurunkan toksisitasnya

terhadap jaringan normal (Sharma et al., 2004, Tyagi et al., 2004). Uji in vitro

menggunakan metode Combination Index (CI) merupakan salah satu model uji preklinik

untuk mengetahui efek dari suatu kombinasi sebagai usaha pendekatan penerapan

kombinasi yang bermanfaat secara klinik. Metode ini dapat menghemat biaya

pengembangan obat dan mempercepat proses menuju uji klinik. Model uji in vitro dapat

digunakan sebagai uji preklinik awal untuk menggambarkan interaksi kombinasi sehingga

ketika selanjutnya dilakukan uji in vivo maka akan berjalan lebih efisien. Interaksi yang

dihasilkan dari suatu kombinasi dapat berupa efek sinergis (efek kombinasi lebih besar

daripada aktivitas aditif yang diperkirakan dari masing-masing agen tunggal), aditif,

antagonis (kebalikan dari efek sinergis) (Reynolds and Maurer, 2005).

Model sel yag digunakan dalam penelitian adalah sel T47D dan HeLa. Sel T47D

adalah cell line kanker payudara manusia yang mengekspresikan reseptor estrogen (ER +)

dan berasal dari efusi pleural pasien yang menderita kanker payudara. Sel T47D diambil

dari jaringan payudara seorang wanita berumur 54 tahun, merupakan sel adherent

(melekat) yang dapat ditumbuhkan dalam media penumbuh DMEM atau RPMI yang

mengandung fetal bovine serum (FBS) 10% dan antibiotik Penicilin-Streptomycin 1%

(ATCC1,2

Gynura procumbens merupakan salah satu tanaman yang telah banyak diteliti

mengenai potensinya sebagai antikanker. Beberapa penelitian in vivo membuktikan bahwa

ekstrak etanol daun G. procumbens mampu menghambat pertumbuhan tumor paru dan

tumor lambung mencit yang diakibatkan oleh benzo(α)piren (Sugiyanto et al., 1993).

Ekstrak alkohol daun G. procumbens dilaporkan mempunyai efek antimutagenik terhadap

tumor paru mencit yang diakibatkan oleh benzo(α)piren. Ekstrak etanol daun G.

procumbens juga telah terbukti memberikan efek kemopreventif pada karsinogenesis

kanker payudara tikus (Meiyanto, dkk, 2007). Fraksi fenolik daun G. procumbens ter bukti

dapat menghambat proliferasi dan memacu apoptosis sel Hela (Meiyanto dan Septisetyani,

2005). Daun G. procumbens juga telah diteliti memiliki potensi sebagai antiangiogenik

(Jenie dkk, 2006).

, 2007). Karakteristik molekuler sel T47D adalah sel tersebut mengekspresikan

p53 mutan. Sel Widr adalah sel kanker kolon yang berpotensi metastasis tinggi dan laju

resistensinya cepat.

Gynura procumbens (Lour) Merr. Sebagai Agen Kemopreventif

10

Sugiyanto, et al. (2003) melaporkan bahwa senyawa aktif ekstrak etanol daun G.

procumbens yang memiliki aktivitas antikarsinogenik adalah flavonoid yang mengarah ke

golongan flavon/flavonol. Penelitian lebih jauh oleh Maryati (2006) menunjukkan

flavonoid yang diisolasi dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun G. procumbens

memiliki aktivitas sitotoksik dengan IC50 sebesar 98 μg/ml terhadap sel T47D dan secara

kualitatif meningkatkan ekspresi p53 dan Bax (regulator apoptosis). Hasil tersebut

menguatkan hasil penelitian sebelumnya baik terhadap ekstrak etanolik maupun fraksi-

fraksinya yang mengarahkan pada efek kemopreventif G. procumbens, baik sebagai

blocking maupun suppressing.

Penelitian kokemoterapi daun G. procumbens bersama dengan doxorubisin

menunjukkan adanya efek sinergis kombinasi keduanya yang berpotensi meningkatkan

efikasi agen kemoterapi dan menurunkan toksisitasnya pada jaringan normal (Jenie dan

Meiyanto, 2007).

11

BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

Penelitian ini bertujuan untuk memberikan landasan ilmiah mengenai potensi

antikanker dan mekanismenya ekstrak etanolik terstandar dari daun sambung nyawa (G.

procumbens) sebagai agen kemopreventif maupun ko-kemoterapi pada kanker payudara

dan kanker leher rahim.

Data yang akan diungkap dari penelitian ini penting artinya untuk memberi landasan

yang kuat dan rasional pada penggunaan preparat tanaman tersebut sebagai agen fitoterapi.

Penelitian semacam ini perlu dipercepat, mengingat besarnya potensi kekayaan alam

Indonesia yang secara empirik telah diungkap potensinya sebagai obat. Khususnya yang

berkaitan dengan penyakit kanker, perlu ditingkatkan intensitas penelitiannya untuk

mengungkap rasionalitas keberhasilan terapi preparat tanaman yang telah sering dilaporkan

khasiatnya. Keberhasilan penelitian akan memberikan harapan pengembangan lebih lanjut

pengembangan manfaat daun sambung nyawa sebagai agen kemopreventif, yaitu pencegah

terjadinya dan berkembangnya kanker.

Penelitian ko-kemoterapi sangat penting artinya untuk aplikasi lebih lanjut ekstrak

daun sambung nyawa dalam mengatasi masalah resistensi agen kemoterapi kanker. Dalam

hal ini, ekstrak daun sambung nyawa tersebut dapat digunakan sebagai pendamping

kemoterapi konvensional sebagaimana yang telah banyak dipraktekkan di masyarakat.

Hasil-hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar pengembangan lebih lanjut.

12

BAB IV. METODE PENELITIAN

A. BAHAN DAN ALAT

1. Bahan Uji:

a. Simplisia daun sambung nyawa (Gynura procumbens) diperoleh dari Balai Besar

Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2PTO2

b. Sel kanker payudara, T47D dan kanker leher rahim, HeLa, diperoleh dari koleksi

kultur sel Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM

T)

Tawangmangu Jawa Tengah.

2. Alat Penelitian

a. alat-alat untuk TLC /kromatografi lapis tipis

b. Alat-alat gelas dan timbangan analitik,

c. inkubator thermostat dan Laminar Air Flow Hood (LAF),

d. mikroskop dan alat untuk cell culture

e. hemocytometer, cell counter dan alat sterilisasi.

f. ELISA reader

3. Bahan kimia

a. Etanol pa dan teknik

b. plat TLC

4. Bahan untuk pekerjaan kultur sel

a. media pencuci RPMI 1640 dan media penumbuh RPMI-serum

b. Bahan untuk uji sitotoksisitas : PBS, Tripsin-EDTA, MTT

c. Bahan untuk pengecatan DNA : Etidium bromida dan akridine oranye

d. Bahan untuk ko-kemoterapi : Doxorubicin (Adriamycin) dari Instalasi Farmasi

Rumah Sakit Dr. Sardjito Yogyakarta.

e. Bahan untuk flowcytometry : Povidium Iodide (PI)

f. Bahan untuk imunositokimia : serum kambing normal (Novocastra),

anti-IgG terkonjugasi biotin, streptavidin-

peroxidase,3,3-diaminobenzidin (DAB),

Meyer-hematoksilin (Dako),

anti-CycD, CDK2, p53, BCl-2, dan Bax

g. Standard : Quercetin (Siqma Aldrich)

13

B. Rencana Penelitian:

Tahun I

A. Standarisasi ekstrak daun sambung nyawa (Gynura procumbens), standarisasi

dilakukan dengan dua metode, yaitu:

1.

Pembakuan tata cara pelarutan, dalam hal ini perbandingan pelarut sesuai

konsentrasi yang diinginkan serta organoleptik ekstrak yang antara lain meliputi

pengenalan terhadap rasa, bau, warna, dan kekentalan.

Metode organoleptik

2.

Identifikasi adanya senyawa quersetin dan kaemferol dalam ekstrak etanolik

daun sambung nyawa dilakukan menggunakan KLT dengan pembanding

senyawa quersetin dan kaemferol.

Metode instrumental

B. Uji kemopreventif ekstrak etanolik daun sambung nyawa(Gynura

procumbens) dan senyawa standard quercetin dan kaemferol pada cell line

kanker payudara (T47D) dan leher rahim (HeLa).

1.

2 kg serbuk kering daun sambung nyawa dimaserasi dengan etanol (96%) tiga

kali masing-masing selama 3 hari, rendaman disaring sehingga diperoleh filtrat.

Filtrat yang didapat diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator diperoleh

ekstrak kental. Pengeringan ekstrak dilanjutkan dengan freeze-dryer, kemudian

ekstrak yang diperoleh di standarisasi.

2.

Preparasi Ekstrak Etanolik

3.

Pembuatan larutan uji

Larutan uji dibuat segar dengan melarutkan ekstrak terstandar atau senyawa

standard dengan DMSO. Selanjutnya dibuat seri konsentrasi larutan uji 100

ug/ml, 50 ug/ml, 25 ug/ml, dan 10 ug/ml dan 5 ug/ml dalam media kultur.

Pekerjaan ini juga dilakukan di dalam LAF.

a. Preparasi Sel (T47D dan HeLa)

Pemeriksaan Sitotoksisitas

Tiap jenis sel diambil dari tanki Nitrogen cair, segera dicairkan dalam

penangas air 37oC, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul

dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi

mediaum RPMI 1640. Suspensi disentrifuse 325 X gravitasi selama 5 menit,

kemudian supernatan dibuang diganti medium RPMI baru, kemudian

14

disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifuse lagi 325 X gravitasi

selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet ditambah 1 ml medium

penumbuh yang mengandung 20% PBS, disuspensikan perlahan hingga

homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam beberapa (3-4) buah tissue

culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC dengan

aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan

huingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.

b. Panen Sel

Setelah jumlah sel cukup, medium diganti dengan medium RPMI

1640/DMEM baru sebanyak 5 ml dan sel dilepas dari dinding flask

menggunakan scraper, sel dipindah ke dalam labu takar steril dan ditambah

medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifus 325 X gravitasi

selama 5 menit. Sel dicuci dua kali menggunakan medium yang sama dan

dihitung jumlah selnya menggunakan homocytometer. Suspensi sel

ditambah sejumlah medium hingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 5 X

104 sel/100 µl dan siap untuk penelitian.

c. Uji Sitotoksisitas

Sel didistribusi ke dalam sumuran dan diinkubasi selama 24 dan 48 jam

bersama sampel (ekstrak atau senyawa standard) dengan bervariasi kadar.

Pada akhir inkubasi, kepada masing-masing sumuran ditambahkan 10μl

MTT 2,5 μg/ml dalam medium RPMI. Kemudian diinkubasi lagi semalam

pada suhu 37o

4.

C. Enzym yang dilepaskan oleh sel (hidup) akan bereaksi

dengan MTT membentuk warna ungu/biru. Reaksi ini dihentikan dengan

penambahan reagen stopper, lalu diincubasi semalam pada suhu kamar.

Serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.

Sel ditumbuhkan di dalam sumuran dengan medium yang ditambah ekstrak dengan

seri kadar. Sampling dilakukan pada jam ke-0, 24, 48 dan 72 dengan metode MTT.

Uji Doubling Time Sel

5.

Pada akhir inkubasi setelah 48 jam medium diambil, sel difiksasi dengan metanol

pada obyek glass kemudian ditambahkan RNA-ase dan etidium bromida-akridin

oranye 0,1% kemudian ditutup dengan deck glass. Sel diamati setelah 30 menit di

bawah mikroskop fluoresensi (Hanif et al., 1997).

Pengecatan DNA

15

C. Uji Ko-kemoterapi ekstrak etanolik terstandar daun sambung nyawa

(G.procumbens) pada sel kanker payudara dan leher rahim

Sel T47D atau HeLa sejumlah 3 x 103

Doxorubicin (IC

sel/sumuran didistribusikan ke dalam plate 96

sumuran dan diinkubasi selama 24 jam. Keesokannya media diambil, dicuci PBS,

ditambahkan 100 μL media kultur yang mengandung DMSO 0,5.% v/v saja (kontrol)

atau sampel tunggal yaitu ekstrak atau senyawa standard atau agen kemoterapi

doxorubisin saja atau gabungan keduanya, inkubasi selama 48 jam. Media kultur

dibuang, dicuci dengan 100 μL PBS. Masing-masing sumuran ditambahkan 100 μL

media kultur yang mengandung MTT 5 mg/mL, inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu

37.°C. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, dicuci dengan PBS,

kemudian ditambahkan larutan asam isopropanol, digoyang di atas shaker selama 10

menit kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550

nm.

Tabel 1. Kadar kombinasi yang digunakan dalam penelitian

50 Ekstrak etanolik G. procumbens (IC) 50)

1/10 1/4 1/3 1/2

1/10 1/10 : 1/10 1/10 : 1/4 1/10 : 1/3 1/10 : 1/2

1/4 1/4 : 1/10 1/4 : 1/4 1/4 : 1/3 1/4 : 1/2

1/3 1/3 : 1/10 1/3 : 1/4 1/3 : 1/3 1/3 : 1/2

1/2 1/2 : 1/10 1/2 : 1/4 1/2 : 1/3 1/2 : 1/2

Pengujian Ko-khemopreventif ekstrak etanolik daun sambung nyawa (Gynura

procumbens) dilakukan dengan menetapkan nilai sitotoksisitas sinergistik. Nilai ini

ditetapkan dengan menghitung indeks interaksi antara agen kemoterapi dengan

ekstrak etanolik daun sambung nyawa (Gynura procumbens), menggunakan

persamaan:

I= (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2

Dimana Dx adalah konsentrasi dari satu senyawa tunggal yang dibutuhkan untuk

memberikan efek (dalam hal ini adalah IC50 terhadap pertumbuhan sel kanker

payudara dan kanker leher rahim) dan (D)1, (D)2 adalah besarnya konsentrasi kedua

senyawa untuk memberikan efek yang sama (Notarbartolo et al., 2005).

16

BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN

Pembuatan Simplisia Kayu Sambung nyawa

Simplisia daun sambung nyawa (Gynura procumbens) diperoleh dari BP2T2OT Tawang

mangu Jawa Tengah. Simplisia tersebut berupa daun sambung nyawa yang telah dikeringkan

dengan menggunakan sinar matahari tidak langsung dan dengan bantuan oven. Untuk keperluan

ekstraksi dengan metode maserasi, diperlukan simplisia dengan derajat tertentu, disesuaikan

dengan jenis simplisia. Untuk simplisia daun sambung nyawa digunakan ayakan dengan Mesh 16.

Dengan derajat halus tersebut diharapkan dapat menambah luas permukaan kontak antara simplisia

dengan pelarut, sehingga proses ekstraksi berjalan lebih efektif.

Untuk keperluan maserasi digunakan 1,0 Kg serbuk kering simplisia daun sambung nyawa,

ditempatkan dalam bejana maserasi. Pelarut yang digunakan adalah etanol 96 %. Maserasi dengan

etanol dilakukan sebanyak 3 (tiga) kali, atau dilakukan re-maserasi, bertujuan agar senyawa aktif

yang terkandung dalam kayu Sambung nyawa terekstrak sebanyak mungkin. Penyarian dengan

metode re-maserasi ini meghasilkan rendemen ekstrak etanolik G. procumbens sebesar 10,4 %.

Penentuan kandungan golongan senyawa

Pada penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa senyawa yang berpotensi sebgai anti

kanker adalah golongan flavonoid khususnya flavon dan flavanol, maka dalam identifikasi

kandungan ekstrak ini difokuskan pada flavonoidnya saja. Metode yang digunakan untuk

identifikasi adalah kromatografi lapis tipis (KLT) dengan sistem sebagai berikut :

sistem 1 :

Fase Diam : selulosa

Fase Gerak : Butanol : Asam Asetat : Akuadest (5: 1: 4)

Pereaksi semprot : sitroborat

Sistem 2 :

Fase Diam : selulosa

Fase Gerak : asam asetat 50 %

Pereaksi semprot : sitroborat

Identifikasi kandungan flavonoid ini menggunakan pembanding quersetin, yang juga

merupakan salah satu kandungan kimia dalam daun sambung nyawa. Hasil identifikasi dengan

KLT adalah sebagai berikut :

17

Gambar 1. Hasil identifikasi KLT dengan menggunakan pereaksi sitrobotat dan dilihat dibawak sinar UV 365 nm. A. Fase gerak yang digunakan adalah asam asetat 50% B. Fase gerak yang digunakan adalah BAW (4:1:5). Tampah teridentifikasi adanya flavonoid beberapa spot dan salah satu spot mempunyai nilai hRf sama dengan quersetin. 1. Quersetin 2. Ekstrak etanol daun sambung nyawa

Hasil KLT masih menunjukkan spot yang berekor sehingga masih diperlukan optimasi fase

gerak lebih lanjut sehingga diperoleh spot yang betul-betul terpisah satu dengan yang lain. Fase

gerak yang digunakan pada KLT yang dapat menghasilkan spot yang terpisah dengan baik akan

digunakan sebagai acuan fase gerak (pengembang) dalam identifikasi profil kandungan senyawa

kimia dengan menggunakan HPLC.

Untuk keperluan standarisasi dilakukan 2 (dua) kali ekstraksi dengan metode maserasi dan

dilanjutkan dengan identifikasi profil kandungan senyawa kimia dengan HPLC dibandingkan

dengan senyawa Quercetin dan Kaemferol sebagai senyawa penanda (marker).

Kultur Sel Kanker Payudara, T47D dan Kanker Leher Rahim, HeLa

Sel kanker T47D dikultur dengan menggunakan media DMEM sedangkan sel HeLa

menggunakan media RPMI, ditambah dengan FBS 10%, Penisilin streptomisin 10 %, dan

Fungison 5 %. Sel kanker dikultur sampai 70-80% konfluen dan untuk selanjutnya harus

segera dipanen dan digunakan untuk keperluan uji.

Untuk mempertahankan sel agar tidak mengalami mutasi karena disub kultur terus

menerus maka subkultur dibatasi maksimal sampai 5 (lima) kali, dan setiap kali panen

dilakukan penyimpanan sel pada tabung Cryopreservation dan disimpan pada -80 o

C.

Setelah 5 (lima) kali subkultur sel disimpan dan untuk keperluan kultur berikutnya

dilakukan dengan pencairan kembali (thawing) dari tabung Cryopreservation. Perubahan

sel dapat dilihat dengan pengamatan mikroskopis morfologi sel.

18

Gambar 2. Gambaran mikroskopis morfologi sel HeLa (A), sel T47D (B), dan MCF-7 (C)

Uji Sitotoksik Tunggal Ekstrak G. Procumbens dan Beberapa Agen Kemoterapi

Penelitian ini dimulai dengan uji sitotoksik, dengan tujuan untuk menentukan

parameter ketoksikan yaitu IC 50 yang menunjukkan potensi ketoksikan ekstrak etanolik

daun sambung nyawa. Nilai IC50 menunjukkan kadar senyawa uji yang mampu

menghambat cell viability sebesar 50 %. Nilai IC50 juga digunakan sebagai patokan untuk

menentukan konsentrasi senyawa uji dalam uji doubling time.

Sel Kanker Payudara, T47D

Pengaruh pemberian perlakuan pada sel kanker T47D dapat dilihat dengan

mengamati profil viabilitas sel kontrol dibandingkan dengan sel dengan perlakuan ekstrak

sambung nyawa, quercetin, dan agen kemoterapi Doxorubicin, dan 5-Fluorouracil.

Gambar 3. Ekstrak etanolik sambung nyawa dapat menurunkan viabilitas sel T47D. Sel T47D diberi perlakuan ekstrak etanolik sambung nyawa (0-250 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50

A

ekstrak etanolik daun sambung nyawa.

B

19

Gambar 4. Agen kemoterapi doxorubicin dan 5-FU dapat menurunkan viabilitas sel T47D. Sel T47D diberi perlakuan agen kemoterapi selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50 masing-masing agen tersebut. Tabel 2. Nilai IC50

Agen/sampel

ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi pada sel kanker payudara T47D

Persamaan garis lurus Korelasi IC50 EGP Y= -0,689x + 110,1 R2 87 ug/mL =0,945 Dox Y= -0,730x + 96,26 R2 63 nM =0,967 5-FU Y= -19,82x + 100,1 R2 2,528 (Log)

337 uM =0,954

Pemberian perlakuan EGP, Dox, dan 5-FU dapat menekan pertumbuhan sel kanker

payudara T47D yang sejalan dengan meningkatnya konsentrasi sample uji. Nilai IC50 EGP

relative rendah, nilai ini akan menjadi acuan untuk uji berikutnya yaitu uji kombinasi

dengan agen kemoterapi Dox/5-FU.

20

Gambar 5. Pemberian perlakuan sample uji mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker T47D. Sel T47D tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

Sel Kanker Payudara, MCF-7

Pengarus pemberian perlakuan pada sel kanker MCF-7 dapat dilihat dengan

mengamati profil viabilitas sel kontrol dibandingkan dengan sel dengan perlakuan ekstrak

sambung nyawa, quercetin, dan agen kemoterapi Doxorubicin.

Gambar 6. Ekstrak etanolik sambung nyawa dapat menurunkan viabilitas sel MCF-7. Sel MCF-7 diberi perlakuan ekstrak etanolik sambung nyawa (0-1000 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50 ekstrak etanolik daun sambung nyawa.

21

Gambar 7. Pemberian perlakuan sample uji mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker MCF-7. Sel MCF-7 tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

Gambar 8. Doxorubicin dapat menurunkan viabilitas sel T47D. Sel T47D diberi perlakuan doxorubicin (0-250 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50 –nya. IC50 doxorubicin = 438 nM.

22

Gambar 9. Pemberian perlakuan doxorubicin mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker MCF-7. Sel MCF-7 tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body. Tabel 3. Nilai IC50

Agen/sampel

ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi pada sel kanker Payudara MCF-7

Persamaan garis lurus Korelasi IC50 EGP Y= -0,171x + 96,34 R2 271 ug/mL = 0,939 DOX Y= -0,0835x + 86,589 R2 438 nM =0,9225

Sel Kanker Leher Rahim, HeLa

Pengarus pemberian perlakuan pada sel kanker HeLa dapat dilihat dengan

mengamati profil viabilitas sel kontrol dibandingkan dengan sel dengan perlakuan ekstrak

sambung nyawa dan agen kemoterapi Doxorubicin, 5-Fluorouracil, dan Cisplatin.

23

Gambar 10. Ekstrak etanolik sambung nyawa dapat menurunkan viabilitas sel HeLa. Sel HeLa diberi perlakuan ekstrak etanolik sambung nyawa (0-600 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50 ekstrak etanolik daun sambung nyawa.

Gambar 11. Agen kemoterapi 5-FU dan cisplatin dapat menurunkan viabilitas sel HeLa. Sel HeLa diberi perlakuan agen kemoterapi selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50 masing-masing agen tersebut.

24

Tabel 4. Nilai IC50

Agen/sampel

ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi pada sel kanker leher rahim HeLa

Persamaan garis lurus Korelasi IC50 EGP Y= -0,189x + 111,9 R2 328 ug/mL = 0,987 5-FU Y= -0,011x + 64,70 R2 1336 uM = 0,938 Cisplatin Y= -0,840x + 86,60 R2 100 uM = 0,894

Gambar 12. Pemberian perlakuan sample uji mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker HeLa. Sel HeLa tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

Hasil perhitungan IC50 ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi

doxorubicin, 5-FU, dan cisplatin digunakan sebagai acuan untuk uji berikutnya yaitu

pengamatan uji kombinasi, pengamatan apoptosis dengan metode double staining, dan

pengamatan kinetika proliferasi dengan metode doubling time.

25

Uji Kokemoterapi agen kemoterapi dengan ekstrak etanolik sambung nyawa

Sel Kanker Payudara T47D

Dox dan 5-FU telah digunakan sebagai agen kemoterapi lebih dari 3 (tiga) dekade

terakhir, tetapi penggunaannya sangat dibatasi oleh efek samping yang ditimbulkan (Tyagi

et al. , 2004). Dox dapat menimbulakan efek samping mual, imunosupresi, dan aritmia

yang bersifat reversibel dan dapat dikontrol dengan pemberian obat lain. Pada penggunaan

jangka panjang Dox dapat menyebabkan cardiomyopathy diikuti dengan gagal jantung.

Efek samping Dox sangat bergantung pada dosis pemberiannya (Wattanapitayakul et al.,

2005). Penggunaan 5-FU secara tunggal sudah jarang sekali dilakukan seiring dengan

menurunnya sensitivitas agen kemoterapi ini pada beberapa sel kanker.

Uji kombinasi yang dilakukan adalah Dox-EGP dan 5-FU-EGP pada sel T47D.

Konsentrasi kombinasi menggunakan acuan IC50 dan secara bertahap menurun (seperti

tercantum dalam metode penelitian).

Gambar 13. Kombinasi Dox-EGP dan 5-FU-EGP memberikan efek aditif sampai sinergis terhadap penghambatan pertumbuhan sel T47D. uji kombinasi dilakukan dengan masing-masing 4 (empat) seri konsentrasi dibawah konsentrasi IC50, untuk agen kemoterapi dan EGP. Semua nilai CI < 1 yang menunjukkan efek aditif sampai sinergis.

26

Hasil uji kombinasi yang telah dilakukan dapat dilihat bahwa G. Procumbens

mempunyai potensi untuk diteliti lebih jauh sebagai agen kokemoterapi bagi agen Dox dan

5-FU dan diperlukan penelusuran mekanisme aksinya.

Pengamatan Apoptosis dengan Metode Double Staining

Pengamatan fenomena apoptosis dengan metode double staining menggunakan

etidium bromida dan akridin oranye mempunyai arti penting sebagai parameter awal

pengamatan mekanisme kematian sel melalui jalur apoptosis.

Gambar 14. Kombinasi Dox-EGP (C) dapat menginduksi apoptosis lebih besar jika dibandingkan dengan pemberian tunggal dox atau EGP.

27

Gambar 15. Kombinasi 5-FU-EGP (D dan F) dapat menginduksi apoptosis lebih besar jika dibandingkan dengan pemberian tunggal 5-FU (A dan B) atau EGP (C dan D). Fenomena apoptosis sel akibat pemberian perlakuan. Fenomena apoptosis diamati dengan menggunakan metode pengecatan dengan etidium ndicat-akridin orange. Sel normal menunjukkan warna fluoresensi hijau dan bentuk sel utuh (D/G). sel yang diduga mengalami apoptosis berwarna orange, akibat permiabilitas sel terhadap etidium brimida Turun. Sel dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 100X. Munculnya apoptotic body ( → ) menjadi ndicator awal terjadinya apoptosis.

28

Sel Kanker Payudara MCF-7

Gambar 16. Kombinasi Dox-EGP sinergis terhadap penghambatan pertumbuhan sel T47D. uji kombinasi dilakukan dengan masing-masing 4 (empat) seri konsentrasi dibawah konsentrasi IC50, untuk agen kemoterapi dan EGP. Semua nilai CI < 1 yang menunjukkan efek aditif sampai sinergis.

Gambar 17. Kombinasi Dox-EGP (C) dapat menginduksi apoptosis lebih besar jika dibandingkan dengan pemberian tunggal dox atau EGP.

Sel Kanker Leher Rahim HeLa

Uji kombinasi yang dilakukan adalah 5-FU-EGP dan CISP-EGP pada sel HeLa.

Konsentrasi kombinasi menggunakan acuan IC50

dan secara bertahap menurun (seperti

tercantum dalam metode penelitian).

29

Gambar 18. Kombinasi Cisp-EGP dan 5-FU-EGP hanya memberikan efek aditif terhadap penghambatan pertumbuhan sel HeLa. Uji kombinasi dilakukan dengan masing-masing 4 (empat) seri konsentrasi dibawah konsentrasi IC50, untuk agen kemoterapi dan EGP.

Hasil uji kombinasi pada sel HeLa hanya menunjukan efek aditif dan antagonis ringan,

sehingga potensi pengembangan sebagai agen kokemoterapi sangat kecil. Untuk sel HeLa

tidak dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menelusuri mekanisme molekulernya.

30

BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan dari hasil peneltian ini adalah :

1. Ekstrak etanolik Gynura procumbens mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai

agen kokemoterapi dengan agen kemoterapi doxorubicin pada sel kanker payudara

MCF-7 dan T47D, serta 5-Fluorouracil pada sel kanker payudara T47D.

2. Potensi kokemoterapi ekstrak etanolik Gynura procumbens pada sel kanker leher rahim

hanya menghasilkan efek aditif dan bahkan antagonis ringan, sehingga potensi

pengembangan sebagai agen kemoterapi sangat kecil.

31

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., 1`994, Moleculer Biology of the Cell, 3th ed., Garland Publisher, Inc., New York and London.

Conze, D., Weiss, L., Regen, P.S., Bushan, A., Weaver, D., Johnson, P., and Rincon, M., 2001, Autocrine production of interleukin 6 causes multidrug resistance in breast cancer cells, Cancer Reasearch, 61, 8851-8858.

Davis, J.M., Navolanic, P.M., Weinstein-Oppenheimer, C.R., Steelman, L.S., Wei H., Konopleva, M., Blagosklonny, M.V., and McCubrey, J.A., 2003, Raf-1 and Bcl-2 induce Distinct and common Pathways tha Contribute to Breast Cancer Drug Resistance, Clinical Cancer Research, 9, 1161-1170.

Fisher, D.E., 1994, Apoptosis in cancer therapy: Croossing the threshold, Cell, 78, 539-542.

Foster, J. S., Henley, D. C., Ahamed, S., and Wimalasena, J., 2001, Estrogen and cell cycle regulation in breast cancer, Trend in Endocrinology and Metabolism, 12(7): 320-327.

Jenie, R.I., Meiyanto, E., dan Murwanti, R., 2006, Efek antiangiogenik ekstrak etanolik daun sambung nyawa (Gynura procumbens (Lour.) Merr.) pada membrane korio alantois (CAM) embrio ayam, MAjalah Farmai Indonesia, 17(1), 50-55.

Jenie, R.I., dan Meiyanto, E., 2007, Ko-kemoterapi ekstrak etanolik daun sambung nyawa (Gynura procumbens (Lour.) Merr.) dan doxorubicin pada sel kanker payudara, Majalah Farmasi Indonesia, 18(2), 81-87.

Kampa, M., Alexaki, V.I., Notas, G., Nifli, A.P., Nistikaki, A., Hatzoglou, A.,Bakogeorgou, E., Kouimtzoglou, E., Blekas, G., Boskou, D., Gravanis, A., Castanas, E., 2003, Antiproliferatif and apoptotic effects of selective phenolic acids on T47D human breast cancer cells: potential mechanism of action, Breast Cancer Res., 6, 63-74.

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd

Notobartolo, M., Poma, P., Perri, D., Dusonchet, L., Cervello, M., and Alessandro, N., 2005, Antitumor effects of curcumin, alone or in combination with cisplatin or doxorubicin, on human hepatic cancer cells, analysis of their possible relationship

Edition, School of Biological Sciences, University of Surrey, Pearson Education, Harlow-England-London-New York, p.228-231,263-264

Kitagawa, S., 2006, Inhibitor Effect of polyphenols on P-Glycoprotein-Mediated Transport, Biol. Pharm. Bull., 29(1), 1-6

Maryati, 2006, MEkanisme antiproliferatif isolate flavonoid daun sambung nyawa (Gynura procumbens (Lour.) Merr.) terhadap sel T47D, Thesis, Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Meiyanto, E., 1999, Efek Antimutagenik Beberapa Fraksi Ekstrak Alkohol Daun Gynura procumbens (Lour)Merr, Laporan Penelitian, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.

Meiyanto, E., 2002, Biologi Molekuler, Buku Ajar, Proyek QUE Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Meiyanto, E. dan Septisetyani, E.P., 2005, Efek Antiproliferatif dan Apoptosis Fraksi Etanolik Ekstrak Etanolik Daun Gynura procumbens terhadap Sel HeLa, Artocarpus, 5(2), 74-80.

Meiyanto, E., Susilowati, S., Tasminatun, S., Murwanti, R., dan Sugiyanto, 2007, Efek kemopreventif ekstrak etanolik Gynura procumbens (Lour) Merr. Pada karsinogenesis kanker payudara tikus, Majalah Farmasi Indonesia, 18(3), 154-161.

32

to change in NF-κB activation levels and in IAP gene expression, Cancer Letter, 224, 53-65.

Pan, M.H., Chen, W.J., Lin-Shiau, S., Ho, C.H., and Lin, J.K., 2002, Tangeretin induces Cell-cycle through inhibiting cyclin-dependent kinase 2 and 4 activities as well as elevating Cdk inhibitor p21 in human colorectal carcinoma cells, Carcinogenesis, Oxford University Press, 23: 1677-1684.

Reynolds, C.P., and Maurer, B.J., 2005, Evaluating Response to Antineoplastic Drug Combination in Tissue Culture Models, Methods. Mol. Med., 110, 173-183.

Scheneider, A.K., 1997, Cancer Genetics, Encyclopedia of Human Biology, 2nd

Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D., Keesey, J., and Manzow, S., 2000, Cell death apoptosis and aecrosis, Rosche Diagnostic Corporation

Ed., Academic Press.

Shapiro, G.I., and Harper, J.W., 1999, Anticancer drug target: cell cycle and checkpoint control, J. Clin. Invest., 104, 1645-1653.

Sharma, G., Tyagi, A.K., Singh, R.P., Chan, D.C.F., Agarwal, R., 2004, Synergistic anti-cancer effect of grape seed extract and conventional cytotoxic agent doxorubicin against human breast carcinoma cells, Breast Cancer Reasearch and Treatment, 85, 1-12.

Sherr, C.J. 1996, Cancer Cell Cycles, Science, 274: 1672-1677. Singal, P.K., and Illiskovic, N., 1998, Doxorubicin-induced cardiomyopathy, N. Engl. J.

Med. 339, 900-905. Sofyan, R., 2000, Terapi kanker pada tingkat molekuler, Cermin Dunia Kedokteran, 127:

5-10. Sugiyanto, Sudarto, B., dan Meiyanto, E., 1993, Efek Penghambatan Karsinogenisitas

Benzo(a)piren Oleh Preparat Tradisional Tanaman Gynura sp. Dan Identifikasi Awal Senyawa Yang Berkhasiat, Laporan Penelitian P4M DitJen DikTi, Fak. Farmasi UGM, Yogyakarta.

Sugiyanto, Sudarto, B., Meiyanto, E., Nugroho, A. E., Jenie, U. A., 2003, Aktivitas Antikarsinogenik Senyawa yang Berasal dari Tumbuhan, Majalah Farmasi Indonesia, 14 (4), 216-225

Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo, R. 2002. Cancer in Indonesia, Present and Future., Jpn J Clin Oncol., 32 (Supplement 1): S17-S21.

Tyagi, A.K., Agarwal, C., Chan, D.C.F., and Agarwal, R., 2004, Synergistic anti-cancer effects of silibinin with conventional cytotoxic agent doxorubicin, cisplatin, and carboplatin against human breast carcinoma MCF-7 and MDA-MB468 cells, Oncology Report, 11, 493-499.

World Health Organization, 2006, Fact Sheet No. 297, Cancer Wattanapitayakul, S.K., Chularojmontri, L., Herunsalee, A., Charuchongkolwongse, S.,

Niumsakul, S., and Brauer, J.A., 2005, Screening of antioxidants from medicinal plants for cardioprotective effects against doxorubicin toxicity, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 96, 80.

Weinberg, R.A., 1996, How Cancer Arises, Sci. Am., 275(3): 62-75.

33

LAMPIRAN

I. INTRUMEN PENELITIAN Sarana yang digunakan dalam penelitian ini : 1. semua kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi Fakultas Farmasi

dan Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM.

2. Peralatan utama yang dibutuhkan :

No. Nama peralatan Lokasi 1. Peralatan ekstrasi Laboratorium Farmakognosi-

fitokimia Farmasi UMP 2. Peralatan KLT untuk standarisasi Laboratorium Farmakognosi-

fitokimia Farmasi UMP 3. Inkubator CO2 Laboratorium Parasitologi fak

kedokteran UGM 4. Laminar air flow Laboratorium Parasitologi fak

kedokteran UGM 5. Mikroskop fase kontras Laboratorium Parasitologi fak

kedokteran UGM 6. Alat flowcytometry Laboratorium Parasitologi fak

kedokteran UGM

II. BIODATA DAN RIWAYAT PENELITIAN

A. PENELITI UTAMA: 1. Nama Lengkap : Nunuk Aries Nurulita, M.Si., Apt. 2. Pekerjaan : Dosen Fakultas Farmasi

Universitas Muhammadiyah Purwokerto 3. NIK : 2160217 4. Jenis kelamin : Perempuan 5. Tempat dan tanggal lahir : Banyuwangi, 2 April 1975 6. Alamat Rumah : Perumahan UMP Jl. Soka Indah No. 7 Karangsoka

Kembaran Purwokerto Jawa Tengah 7. Pangkat/Golongan : Penata/IIIC 8. Jabatan : Lektor 9. Alamat kantor : Fakultas Farmasi

Universitas Muhammadiyah Purwokerto Jl. Raya Dukuh waluh Kembaran Purwokerto Jawa Tengah 10. Pendidikan

34

Jenjang

Pendidikan

Tempat Tahun selesai

Gelar Bidang studi

S-1 Fak. Farmasi UGM 1998 Drs Ilmu farmasi

Profesi Fak. Farmasi UGM 1999 Apoteker

S-2 Fak. Farmasi UGM 2005 M.Si Ilmu Farmasi (Penemuan Obat)

S-3 Fak. Farmasi UGM Sedang studi

Onkologi molekuler

1. PENGALAMAN PENELITIAN (5 TAHUN TERAKHIR) No. Tahun Judul Penelitian Pendanaan

Sumber Jumlah (Juta Rupiah)

1. 2007-2008

Efek antiproliferatif dan antimetastasis kayu secang (Caesalpinea sappan) terhadap sel kanker payudara T47D

MENRISTEK Prog. insentif riset dasar

2007 : 79 2008 : 80

2. 2007 Efek antiangiogensis ekstrak methanol dan mtetanol-air kayu secang (Caesalpinia sappan, L.)

DIKNAS PROP JATENG

10

3. 2006 Efek sitotoksik ekstrak methanol dan mtetanol-air kayu secang (Caesalpinia sappan, L.) pada sel kanker payudara T47D melalui induksi apoptosis

DIKTI PDM

10

4. 2005 Efek sitotoksik dan antiproliferatif buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) pada sel kanker payudara T47D

KOPERTIS 10

5. 2005 Efek antiangiogensis ekstrak methanol dan mtetanol-air mahkota dewa (Phaleria macrocarpa)

DIKTI PDM

7,5

6. 2004 Daya Antiinflamasi infuse daum mahkota dewa (Phaleria macrocarpa, Scheff. Boerll.) pada tikus putih (Rattus norvegicus) jantan

UMP 2,5

2. PENGALAMAN PUBLIKASI ILMIAH (3 TAHUN TERAKHIR) No. Tahun Judul Artikel Jurnal / seminar

Volume/tempat Nama jurnal /seminar

1. January 15, 2008

The cytotoxicity effect of methanolic fraction of sappan lignum against T47D trough apoptotic induction

Aula Timur ITB

The 1st International Symposium on Molecular Pathogenesis

2. 2007 Efek sitotoksik dan antiproliferatif ekstrak kloroform buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) pada sel kanker payudara T47D

Jurnal farmasi indonesia, volume 3, nomor 4, ISSN 1412-1107 Hal. 168-175

Jurnal Farmasi Indonesia

3. 2007 Efek sitotoksik dan antiproliferatif Universitas Seminar MIPA

35

ekstrak methanol kayu secang (Caesalpinia sappan) terhadap sel kanker payudara T47D

Jendral Soedirman

Kimia

4. 2006 The anticancer effect of Pentagamavunon (PGV-0) against breast cancer cell line, T47D, trough apoptotic induction and angiogenesis suppression mechanism, ,

Faculty of Pharmacy, Gadjah Mada University

International symposium of Curcumin Reasearch

5. 2006 Nunuk Aries Nurulita, Eddy Meiyanto / Efek Antikanker Pentagammavunon-0 (PGV-0) terhadap sel kanker payudara T47D yang diinduksi !7-b-estradiol melalui mekanisme induksi apoptosis dan penghambatan angiogenesis

Sains Kesehatan, Volume 19 No. 1 Hal. 109-125, ISSN 1411-6197 2006

Sains Kesehatan

6. 2006 Nunuk Aries Nurulita, Yoniar Abdullah Muflih / Efek sitotoksik ekstrak methanol kayu secang (Caesalpinia sappan, L.) pada sel kanker payudara T47D melalui induksi apoptosis

Pharmacy, Vol. 04 No. 01, ISSN 1639-3591 2006

Pharmacy

7. 2006 Nunuk Aries Nurulita, Mahdalena / Efek Antikanker Ekstrak Metanol-Air Kayu Secang (Caesalpinia sappan L.) pada Sel Kanker Payudara T47D

Pharmacy, Vol. 04 No. 03, ISSN 1639-3591 2006

Pharmacy

8. 2006 Tjiptasurasa, Nunuk Aries Nurulita, Dwi Hartanti, Ari Indriastuti, Puji Setianingrum / Uji Toksisitas Ekstrak Etanol Daun Pare (Momordica charantia L.) dan Daun Pepaya (Carica papaya L.) terhadap Artemia salina Leach dan Profil Kromatografi Lapis Tipisnya

Pharmacy, Vol. 04 No. 03, ISSN 1639-3591 2006

Pharmacy

36

ANGGOTA PENELITI 1. Nama Lengkap : Prof. Sugiyanto, S.U. PhD., Apt. 2. Pekerjaan : Dosen Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada 3. NIP : 130779543 4. Jenis kelamin : Pria 5. tempat tanggal lahir : Yogyakarta, 8 Agustus 1951 6. Alamat rumah : Jl. Cerme A 40 Perumahan sidoarum Blok II Godean, Sleman 7. Jabatan : Profesor 8. Alamat kantor : Bag. FArmakologi dan FArmasi Klinik

Fakultas Farmasi UGM Sekip Utara Yogyakarta, 55283 9. Telp : (0274) 542907 10. Pendidikan Jenjang

Pendidikan

Tempat Tahun selesai

Gelar Bidang studi

S-1 Fak. Farmasi UGM 1977 Drs Ilmu farmasi

Profesi Fak. Farmasi UGM 1978 Apoteker

S-2 Fak. Kedokteran UGM 1985 SU Biokimia Medis

S-3 The University of Sydney, Australia

1992 PhD Biochemical Pharmacology

3. PENGALAMAN PUBLIKASI ILMIAH (5 TAHUN TERAKHIR) No. Tahun Judul Artikel Jurnal / seminar

Volume/tempat Nama jurnal /seminar

1. 2003 Sugiyanto, B.Sudarto, Edy Meiyanto, Agung Endro Nugroho, and Umar Anggoro Jenie, Anticarcinogenic Activity of Compounds from plants.

14(4), 216 Indonesian Journal of Pharmacy

2. 2003 Wahyu Widyaningsing and Sugiyanto, The Effect of Flavonoid Rutin on Microsomal Metabolism of Benzo(a)pyrene

2(2), 71 Media Farmasi

3. 2003 Sugiyanto, Oetari, and Agung Endro Nugroho, Biotransformation of Pentagammavunon-0 (PGV-0) in vitro and in vivo studies

14(20), 290 Indonesian Journal of Pharmacy

4. 2007 Meiyanto, E., Susilowati, S., Tasminatun, S., Murwanti, R., dan Sugiyanto, 2007, Efek kemopreventif ekstrak etanolik Gynura procumbens (Lour) Merr. Pada karsinogenesis kanker payudara tikus,

18(3), 154-161. Majalah Farmasi Indonesia

37

5. 2007 Meiyanto, E., Tasminatun, S.,

Susilowati, S., Murwanti, R., dan Sugiyanto, 2007, Penghambatan Karsinogenesis Kanker Payudara Tikus terinduksi DMBA pada fase Post Inisiasi oleh ekstrak etanolik Gynura procumbens (Lour) Merr.

18(4), 154-161. Majalah Farmasi Indonesia

38

B. DRAFT ARTIKEL ILMIAH

ETHANOLIC EXTRACT OF Gynura procumbens SENSITIZES BREAST CANCER CELL LINE AGAINST CHEMOTHERAPY AGENT BUT SHOWS ANTAGONISM

ON CERVIC CANCER CELL LINE

Nunuk Aries Nurulita1, Sugiyanto2, and Edy Meiyanto2 1 Faculty of Pharmacy, Universitas Muhammadiyah Purwokerto

2

Jl. Raya Dukuhwaluh Kembaran Purwokerto Central Java 53182 Faculty of Pharmacy Universitas Muhammadiyah Purwokerto, +62 281 636751, +62 281 637239,

Faculty of Pharmacy, Gadjah Mada University

nunuknurulita@yahoo.com

Content Our recent study has evaluated ethanolic extract of Gynura procumbens (EEG) as co-chemotherapy agent in combination with doxorubicin (DOX) and 5-Fluorouracil (5-FU) against breast cancer cell line, T47D and MCF-7 cells and also with cisplatin (CISP) and 5-Fluorourasil (5-FU) on cervic cancer cell line, HeLa. This study aims to assess whether EEG show synergism with DOX, 5-FU and CISP and to evaluated apoptotic induction because of these treatment. MTT assay was used to measure the growth inhibitory effec of both single (EEG, DOX, 5-FU, or CISP) and combination treatments. EEG inhibited cells growth in a dose dependent manner the IC50 value on T47D, MCF-7, and Hela resulted 87, 271, and 328 μg/mL, respectively. Combination assessment was conducted beetwen EEG-DOX on T47D and MCF-7 cell lines, EEG-5-FU on T47D and HeLa cell lines, and also EEG-CISP on HeLa cell line. EEG sensitizes T47D and MCF-7 cells that was treated by DOX/5-FU, boosting its therapeutic potential. Conversely when EEG was combined with CISP on HeLa cell line, it seemed to cause antagonism. Ethidum bromide-acridine orange staining was used to concluded apoptosis phenomenone. EEG single induced apoptosis on both of breast cancer cell lines and resulted synergism effect when it combined with DOX and 5-FU. The inhibitory effect on cell viability was enhanced when it was combined with CISP on HeLa cell line. According to the results obtained, EEG appears to possess sensitizing properties, and cause cell cycle arrest and apoptosis on WiDr cells. EEG demonstrates a possibility of additive to synergism properties when combined with 5-FU but not CISP. Keywords: Gynura procumbens; T47D, MCF-7, HeLa, Apoptosis..

Pendahuluan Kanker merupakan permasalahan yang serius karena tingkat kejadiannya semakin

meningkat dari tahun ke tahun. WHO melaporkan terdapat lebih dari 10 juta kasus kanker pertahun di dunia. Pada tahun 2006, diperkirakan ada 1,3 juta kasus kanker di Amerika Serikat, dan lebih dari 550 ribu orang meninggal karena penyakit ini (WHO, 2006). Dari data tahun 1998 – 1991, di Indonesia diperkirakan terdapat 170-190 kasus kanker per 100.000 orang (Tjindarbumi and Mangunkusumo, 2002).

Kanker payudara dan leher rahim merupakan dua macam kanker yang frekuensi kejadiannya paling tinggi di antara kanker-kanker jenis lain yang sering menyerang wanita. Hal ini tidak hanya terjadi di suatu tempat saja, namun hampir di seluruh dunia termasuk di Indonesia. Penelitian di Amerika menyatakan bahwa satu dari delapan wanita Amerika terserang kanker payudara dan 30% dari penderita mengalami kematian (WHO, 2006).

39

Sampai saat ini, pengobatan kanker yang efektif dan efisien belum juga ditemukan, sehingga para peneliti memberikan perhatian besar pada penelitian obat antikanker. Tren masyarakat untuk back to nature banyak memotivasi para peneliti dalam usaha pencarian obat kanker dari senyawa-senyawa alam, karena kenyataannya memang belum ada obat kanker yang benar-benar selektif sebagai antikanker.

Kegagalan yang sering terjadi dalam usaha pengobatan kanker, utamanya melalui kemoterapi, lebih dikarenakan berkurangnya efikasi agen kemoterapi akibat adanya mekanisme muti drug resistance (Conze, 2001), termasuk pada doxorubicin. Beberapa penelitian bahan alam mulai diarahkan pada agen kokemoterapi, dengan tujuan meningkatkan sensitivitas, menekan resistensi sel kanker dan mengurangi efek samping yang ditimbulkan oleh agen kemoterapi.

Daun Gynura procumbens merupakan salah satu tanaman yang mempunyai potensi sebagai antikanker. Daun G. Procumbens mengandung flavonoid dan glikosidanya, seperti quercetin, kaempferol-3-O-neohesperidosida, kaempferol-3-glukosida, quercetin-3-O-rhamnosyl(1-6)galaktosida, quercetin-3-O-rhamnosyl(1 -6)glukosida. Selain itu juga mengandung sterol dan glikosida sterol. Ekstrak etanol daun G. procumbens terbukti memberikan efek kemopreventif pada karsinogenesis kanker payudara tikus (Meiyanto, dkk, 2007). Fraksi fenolik daun G. procumbens dapat menghambat proliferasi dan memacu apoptosis sel Hela (Meiyanto dan Septisetyani, 2005). Penelitian kokemoterapi daun G. procumbens bersama dengan doxorubisin pada sel T47D menunjukkan efek sinergis (Jenie dan Meiyanto, 2007). Penelitian ini bertujuan untuk menguji potensi ko-kemoterapi ekstrak etanolik G. procumben dengan doxorubicin terhadap sel kanker payudara T47D dan sel kanker leher rahim HeLa.

Daun Gynura procumbens telah diketahui mempunyai kandungan kimia utama berupa flavonoid dan glikosidanya, yaitu quercetin dan kaemferol. Fraksi polar ekstrak etanol daun G. procumbens memiliki efek sitotoksik menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis terhadap sel kanker serviks, HeLa, dengan IC50 119 μg/ml (Meiyanto dan Septisetyani, 2005). Flavonoid yang diisolasi dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun G. procumbens memiliki aktivitas sitotoksik dengan IC50 sebesar 98 μg/ml terhadap sel kanker payudara T47D dan meningkatkan ekspresi p53 dan Bax (regulator apoptosis) (Maryati, 2006). Pengembangan agen ko-kemoterapi didasari oleh adanya resistensi agen kemoterapi kanker, yang difokuskan pada peningkatan sensitivitas sel kanker terhadap agen kemoterapi.

Hasil peneltian ini menunjukkan Ekstrak etanolik Gynura procumbens mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai agen kokemoterapi dengan agen kemoterapi doxorubicin dan 5-Fluorouracil pada sel kanker payudara T47D. Potensi kokemoterapi ekstrak etanolik Gynura procumbens pada sel kanker leher rahim hanya menghasilkan efek aditif dan bahkan antagonis ringan, sehingga potensi pengembangan sebagai agen kemoterapi sangat kecil.

Metode Bahan Uji: Simplisia daun sambung nyawa (Gynura procumbens) diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2PTO2T) Tawangmangu Jawa Tengah. Sel kanker payudara, T47D dan kanker leher rahim, HeLa, diperoleh dari koleksi kultur sel Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM Bahan untuk pekerjaan kultur sel

40

RPMI 1640 dan DMEM, FBS, Penisillin/streptomicin, PBS, Tripsin-EDTA, MTT, Etidium bromida dan akridine oranye, doxorubicin (Adriamycin) dari Instalasi Farmasi Rumah Sakit Dr. Sardjito Yogyakarta. Quercetin (Siqma Aldrich) Standarisasi ekstrak daun sambung nyawa (Gynura procumbens), standarisasi dilakukan dengan dua metode, yaitu: Metode organoleptik Pembakuan tata cara pelarutan, dalam hal ini perbandingan pelarut sesuai konsentrasi yang diinginkan serta organoleptik ekstrak yang antara lain meliputi pengenalan terhadap rasa, bau, warna, dan kekentalan. Metode instrumental Identifikasi adanya senyawa quersetin dan kaemferol dalam ekstrak etanolik daun sambung nyawa dilakukan menggunakan KLT dengan pembanding senyawa quersetin. Uji kemopreventif ekstrak etanolik daun sambung nyawa(Gynura procumbens) dan senyawa standard quercetin dan kaemferol pada cell line kanker payudara (T47D) dan leher rahim (HeLa). Preparasi Ekstrak Etanolik 2 kg serbuk kering daun sambung nyawa dimaserasi dengan etanol (96%) tiga kali masing-masing selama 3 hari, rendaman disaring sehingga diperoleh filtrat. Filtrat yang didapat diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator diperoleh ekstrak kental. Pengeringan ekstrak dilanjutkan dengan freeze-dryer, kemudian ekstrak yang diperoleh di standarisasi.

Pembuatan larutan uji

Larutan uji dibuat segar dengan melarutkan ekstrak terstandar atau senyawa standard dengan DMSO. Selanjutnya dibuat seri konsentrasi larutan uji 100 ug/ml, 50 ug/ml, 25 ug/ml, dan 10 ug/ml dan 5 ug/ml dalam media kultur. Pekerjaan ini juga dilakukan di dalam LAF.

Pemeriksaan Sitotoksisitas Preparasi Sel (T47D dan HeLa) Tiap jenis sel diambil dari tanki Nitrogen cair, segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi mediaum RPMI 1640. Suspensi disentrifuse 325 X gravitasi selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang diganti medium RPMI baru, kemudian disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifuse lagi 325 X gravitasi selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet ditambah 1 ml medium penumbuh yang mengandung 20% PBS, disuspensikan perlahan hingga homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam beberapa (3-4) buah tissue culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan huingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. Panen Sel Setelah jumlah sel cukup, medium diganti dengan medium RPMI 1640/DMEM baru sebanyak 5 ml dan sel dilepas dari dinding flask menggunakan scraper, sel dipindah ke dalam labu takar steril dan ditambah medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifus 325 X gravitasi selama 5 menit. Sel dicuci dua kali menggunakan medium yang sama dan dihitung jumlah selnya menggunakan homocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium hingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 5 X 104 sel/100 µl dan siap untuk penelitian. Uji Sitotoksisitas

41

Sel didistribusi ke dalam sumuran dan diinkubasi selama 24 dan 48 jam bersama sampel (ekstrak atau senyawa standard) dengan bervariasi kadar. Pada akhir inkubasi, kepada masing-masing sumuran ditambahkan 10μl MTT 2,5 μg/ml dalam medium RPMI. Kemudian diinkubasi lagi semalam pada suhu 37oC. Enzym yang dilepaskan oleh sel (hidup) akan bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu/biru. Reaksi ini dihentikan dengan penambahan reagen stopper, lalu diincubasi semalam pada suhu kamar. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Pengecatan DNA Pada akhir inkubasi setelah 48 jam medium diambil, sel difiksasi dengan metanol pada obyek glass kemudian ditambahkan RNA-ase dan etidium bromida-akridin oranye 0,1% kemudian ditutup dengan deck glass. Sel diamati setelah 30 menit di bawah mikroskop fluoresensi (Hanif et al., 1997). Uji Ko-kemoterapi ekstrak etanolik terstandar daun sambung nyawa (G.procumbens) pada sel kanker payudara dan leher rahim Sel T47D atau HeLa sejumlah 3 x 103 sel/sumuran didistribusikan ke dalam plate 96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam. Keesokannya media diambil, dicuci PBS, ditambahkan 100 μL media kultur yang mengandung DMSO 0,5.% v/v saja (kontrol) atau sampel tunggal yaitu ekstrak atau senyawa standard atau agen kemoterapi doxorubisin saja atau gabungan keduanya, inkubasi selama 48 jam. Media kultur dibuang, dicuci dengan 100 μL PBS. Masing-masing sumuran ditambahkan 100 μL media kultur yang mengandung MTT 5 mg/mL, inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37.°C. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, dicuci dengan PBS, kemudian ditambahkan larutan asam isopropanol, digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Hasil dan Pembahasan Uji Sitotoksik Tunggal Ekstrak G. Procumbens dan Beberapa Agen Kemoterapi

Penelitian ini dimulai dengan uji sitotoksik, dengan tujuan untuk menentukan parameter ketoksikan yaitu IC 50 yang menunjukkan potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sambung nyawa. Nilai IC50 menunjukkan kadar senyawa uji yang mampu menghambat cell viability sebesar 50 %. Nilai IC50 juga digunakan sebagai patokan untuk menentukan konsentrasi senyawa uji dalam uji doubling time.

Sel Kanker Payudara, T47D

Pengarus pemberian perlakuan pada sel kanker T47D dapat dilihat dengan mengamati profil viabilitas sel kontrol dibandingkan dengan sel dengan perlakuan ekstrak sambung nyawa, quercetin, dan agen kemoterapi Doxorubicin, 5-Fluorouracil, dan Cisplatin.

42

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200 250 300

% S

el V

iab

el

EGP (ug/mL)

y = -0,689x + 110,1R² = 0,945

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120 140

% S

el V

iab

el

EGP (ug/mL)

Gambar 3. Ekstrak etanolik sambung nyawa dapat menurunkan viabilitas sel T47D. Sel T47D diberi perlakuan ekstrak etanolik sambung nyawa (0-250 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

% S

el V

iab

el

Dox (nM)

ekstrak etanolik daun sambung nyawa.

y = -0,730x + 96,26R² = 0,967

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

% S

el V

iab

el

Dox (nM)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 200 400 600 800 1000 1200

% S

el V

iab

el

5-FU (nM)

y = -19,87x + 100,1R² = 0,954

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

% S

el V

iab

el

Log 5-FU

Gambar 4. Agen kemoterapi doxorubicin dan 5-FU dapat menurunkan viabilitas sel T47D. Sel T47D diberi perlakuan agen kemoterapi selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50 masing-masing agen tersebut.

43

Tabel 1. Nilai IC50

Agen/sampel

ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi pada sel kanker payudara T47D

Persamaan garis lurus Korelasi IC50 EGP Y= -0,689x + 110,1 R2 87 ug/mL =0,945 Dox Y= -0,730x + 96,26 R2 63 nM =0,967 5-FU Y= -19,82x + 100,1 R2 2,528 (Log)

337 uM =0,954

Gambar 5. Pemberian perlakuan sample uji mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker HeLa. Sel HeLa tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

Sel Kanker Leher Rahim, HeLa

Pengarus pemberian perlakuan pada sel kanker HeLa dapat dilihat dengan mengamati profil viabilitas sel kontrol dibandingkan dengan sel dengan perlakuan ekstrak sambung nyawa dan agen kemoterapi Doxorubicin, 5-Fluorouracil, dan Cisplatin.

A

C

B

D

44

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000 1200

% S

el V

iabe

l

EGP (ug/mL)

y = -0,189x + 111,9R² = 0,987

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800

% S

el V

iabe

l

EGP (ug/mL)

Gambar 6. Ekstrak etanolik sambung nyawa dapat menurunkan viabilitas sel HeLa. Sel HeLa diberi perlakuan ekstrak etanolik sambung nyawa (0-600 ug/mL) selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 500 1000 1500 2000 2500

% S

el V

iab

el

5-FU (uM)

ekstrak etanolik daun sambung nyawa.

y = -0,011x + 64,70R² = 0,938

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 500 1000 1500 2000 2500

% S

el V

iab

el

5-FU (uM)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 50 100 150 200 250 300

% S

el V

iab

el

Cisp (uM)

y = -0,840x + 86,60R² = 0,894

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100 120

% S

el V

iabe

l

Cisp (uM)

Gambar 7. Agen kemoterapi 5-FU dan cisplatin dapat menurunkan viabilitas sel HeLa. Sel HeLa diberi perlakuan agen kemoterapi selama 24 jam. Viabilitas sel diamati dengan menggunakan metode MTT. Persamaan garis lurus dari kurva digunakan untuk menghitung IC50 masing-masing agen tersebut. Tabel 2. Nilai IC50 ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi pada sel kanker leher rahim HeLa

45

Agen/sampel Persamaan garis lurus Korelasi IC50 EGP Y= -0,189x + 111,9 R2 328 ug/mL = 0,987 5-FU Y= -0,011x + 64,70 R2 1336 uM = 0,938 Cisplatin Y= -0,840x + 86,60 R2 44 uM = 0,894

Gambar 8. Pemberian perlakuan sample uji mengakibatkan perubahan morfologi sel kanker HeLa. Sel HeLa tanpa perlakuan (A) seperti daun, membrane sel tampak jelas memisahkan sel satu dengan yang lain, dan sel melekat di dasar flash. Sel yang diberi perlakuan dosis tinggi (A), sedang (B), dan rendah (C) tampak mengalami perubahan morfologi berupa penipsan membrane sel sampai terjadi fragmentasi yang diduga merupakan apoptotic body.

Hasil perhitungan IC50 ekstrak etanolik sambung nyawa dan agen kemoterapi doxorubicin, 5-FU, dan cisplatin digunakan sebagai acuan untuk uji berikutnya yaitu pengamatan uji kombinasi, pengamatan apoptosis dengan metode double staining, dan pengamatan kinetika proliferasi dengan metode doubling time.

A

D C

B

46

Uji Kokemoterapi agen kemoterapi dengan ekstrak etanolik sambung nyawa

Sel Kanker Payudara T47D Dox dan 5-FU telah digunakan sebagai agen kemoterapi lebih dari 3 (tiga) dekade

terakhir, tetapi penggunaannya sangat dibatasi oleh efek samping yang ditimbulkan (Tyagi et al. , 2004). Dox dapat menimbulakan efek samping mual, imunosupresi, dan aritmia yang bersifat reversibel dan dapat dikontrol dengan pemberian obat lain. Pada penggunaan jangka panjang Dox dapat menyebabkan cardiomyopathy diikuti dengan gagal jantung. Efek samping Dox sangat bergantung pada dosis pemberiannya (Wattanapitayakul et al., 2005). Penggunaan 5-FU secara tunggal sudah jarang sekali dilakukan seiring dengan menurunnya sensitivitas agen kemoterapi ini pada beberapa sel kanker.

Uji kombinasi yang dilakukan adalah Dox-EGP dan 5-FU-EGP pada sel T47D. Konsentrasi kombinasi menggunakan acuan IC50

512,5

2025

2015

105

01020304050607080

90100

% S

el V

iab

el

Dox (nM)

EGP (ug/mL)

20

15

10

5

dan secara bertahap menurun (seperti tercantum dalam metode penelitian).

25 20 15 7,5

2,55

7,510

00,10,20,30,40,5

0,60,7

0,80,9

1

CI

Dox (nM)

EGP(ug/mL)

2,5

5

7,5

10

150 100 50 25

1025

4050

05

10152025

3035

40

45

50

% Sel Viabel

5-FU UM)

EGP (ug/mL)150 100 50 25

1025

4050

00,10,20,30,40,5

0,60,7

0,80,9

1

Combination

Index

(

CI

)

5-FU (uM)

EGP (ug/mL)

Gambar 9. Kombinasi Dox-EGP dan 5-FU-EGP memberikan efek aditif sampai sinergis terhadap penghambatan pertumbuhan sel T47D. uji kombinasi dilakukan dengan masing-masing 4 (empat) seri konsentrasi dibawah konsentrasi IC50, untuk agen kemoterapi dan EGP. Semua nilai CI < 1 yang menunjukkan efek aditif sampai sinergis.

Hasil uji kombinasi yang telah dilakukan dapat dilihat bahwa G. Procumbens mempunyai potensi untuk diteliti lebih jauh sebagai agen kokemoterapi bagi agen Dox dan 5-FU dan diperlukan penelusuran mekanisme aksinya.

47

Pengamatan Apoptosis dengan Metode Double Staining Pengamatan fenomena apoptosis dengan metode double staining menggunakan etidium bromida dan akridin oranye mempunyai arti penting sebagai parameter awal pengamatan mekanisme kematian sel melalui jalur apoptosis.

` Gambar 10. Kombinasi Dox-EGP (C) dapat menginduksi apoptosis lebih besar jika dibandingkan dengan pemberian tunggal dox atau EGP.

A

C

B

D

48

Gambar 11. Kombinasi 5-FU-EGP (D dan F) dapat menginduksi apoptosis lebih besar jika dibandingkan dengan pemberian tunggal 5-FU (A dan B) atau EGP (C dan D). Fenomena apoptosis sel akibat pemberian perlakuan. Fenomena apoptosis diamati dengan menggunakan metode pengecatan dengan etidium ndicat-akridin orange. Sel normal menunjukkan warna fluoresensi hijau dan bentuk sel utuh (D/G). sel yang diduga mengalami apoptosis berwarna orange, akibat permiabilitas sel terhadap etidium brimida Turun. Sel dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 100X. Munculnya apoptotic body ( → ) menjadi ndicator awal terjadinya apoptosis. Sel Kanker Leher Rahim HeLa

Uji kombinasi yang dilakukan adalah 5-FU-EGP dan CISP-EGP pada sel HeLa. Konsentrasi kombinasi menggunakan acuan IC50

A

dan secara bertahap menurun (seperti tercantum dalam metode penelitian).

C

B

D

F E

G

49

250200

150100

01020304050607080

90

100

150 250 500 700EGP (ug/mL)

%

Sel

Viabel

5-FU uM)

100150

200250

-2

0

2

4

6

8

10

700 500 250 150EGP (ug/mL)

Combination

Index

(

CI)

5-FU (uM)

250200

150100

0

20

40

60

80

100

10 25 40 50Cisp (uM)

EGP (ug/mL)

%Cell

viability

100

150200

250

-5

0

5

10

15

20

50 4025

10

Cisp (uM)

EGP (ug/mL)

Combination

index

Gambar 11. Kombinasi Cisp-EGP dan 5-FU-EGP hanya memberikan efek aditif terhadap penghambatan pertumbuhan sel HeLa. Uji kombinasi dilakukan dengan masing-masing 4 (empat) seri konsentrasi dibawah konsentrasi IC50, untuk agen kemoterapi dan EGP.

Hasil uji kombinasi pada sel HeLa hanya menunjukan efek aditif dan antagonis ringan,

sehingga potensi pengembangan sebagai agen kokemoterapi sangat kecil. Untuk sel HeLa tidak dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menelusuri mekanisme molekulernya. Kesimpulan

Ekstrak etanolik Gynura procumbens mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai agen kokemoterapi dengan agen kemoterapi doxorubicin dan 5-Fluorouracil pada sel kanker payudara T47D dan MCF-7. Potensi kokemoterapi ekstrak etanolik Gynura procumbens pada sel kanker leher rahim hanya menghasilkan efek aditif dan bahkan antagonis ringan, sehingga potensi pengembangan sebagai agen kemoterapi sangat kecil.

50

C. SINOPSIS PENELITIAN LANJUTAN

Hasil penelitian pada tahun pertama menunjukkan bahwa ekstrak etanolik Gynura

procumbens mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai agen kokemoterapi dengan

agen kemoterapi doxorubicin dan 5-Fluorouracil pada sel kanker payudara T47D dan

MCF-7. Potensi kokemoterapi ekstrak etanolik Gynura procumbens pada sel kanker leher

rahim hanya menghasilkan efek aditif dan bahkan antagonis ringan, sehingga potensi

pengembangan sebagai agen kemoterapi sangat kecil. Untuk kelanjutan panelitian pada

tahun kedua maka hanya kombinasi terapi pada sel kanker payudara saja yang akan

ditelusuri lebih lanjut mekanismenya.

Potensi EGP sebagai antikanker akan ditelusuri lebih lanjut sampai ke tingkat

molekuler untuk memastikan mekanismenya. G. procumbens kemungkinan bersifat

sitotoksik melalui mekanisme pemacuan proses apoptosis sel melalui regulasi protein yang

berperan di dalamnya. Pengamatan ekspresi protein-protein yang mengatur apoptosis

dengan metode immunositokimia dan western blot dapat digunakan untuk menelusuri lebih

jauh mekanisme molekuler nya dalam memacu apoptosis.