ISOLASI PROMOTOR GEN LFY PADA TANAMAN Theobroma … · didapatkannya informasi mekanisme terjadinya...

ISOLASI PROMOTOR GEN LFY PADA TANAMANTheobroma cacao L. DENGAN TEKNIK

GENOME WALKINGTM

YOANITA RINA SANTOSO

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2010

ABSTRAK

YOANITA RINA SANTOSO. Isolasi Promotor Gen LFY pada Tanaman Theobroma cacao L. dengan Teknik Genome WalkingTM. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TETTY CHAIDAMSARI.

Kakao merupakan salah satu komoditas perkebunan utama di Indonesia. Namun banyak kendala yang dialami petani kakao di Indonesia yang menyebabkan rendahnya produksi kakao, salah satunya adalah penyakit layu pentil. Penyakit ini dipengaruhi oleh gen sentral pembungaan yaitu gen LFY yangtingkat ekspresinya diatur oleh promotornya. Penelitian ini bertujuan mengisolasi promotor gen LFY yang kemudian diklon pada vektor kloning dan vektor ekspresi. Isolasi promotor gen LFY dilakukan dari daun kakao yang masih muda. Daun diisolasi DNA-nya terlebih dahulu dan selanjutnya dilakukan isolasi promotor menggunakan teknik Genome WalkingTM. Promotor hasil isolasi ditentukan urutan basa nukleotidanya melalui sekuensing dan perangkat lunak Softberry. Hasil yang diperoleh menunjukkan adanya fragmen promotor gen LFY. Hal ini dipastikan dengan adanya TATA box. Fragmen promotor gen LFY yang berukuran 1650 pb diklon ke vektor kloning dan vektor ekspresi yaitu pGEM-TEasy dan pCambia 1303. Plasmid DNA rekombinan ditransformasi ke Agrobacterium tumefaciens menggunakan strain AGLO. Simpulan dari penelitian ini yaitu promotor gen LFY dari tanaman Theobroma cacao L. dapat diisolasi menggunakan metode Genome WalkingTM, sehingga memungkinkan didapatkannya informasi mekanisme terjadinya layu pentil pada tanaman kakao.

ABSTRACT

YOANITA RINA SANTOSO. Isolation of Gene LFY Promoter in Theobroma cacao L. with Genome WalkingTM technique. Under the direction of MARIA BINTANG and TETTY CHAIDAMSARI.

Cacao is one of the main agricultural commodities in Indonesia. Unfortunately, there are many obstacles faced by Indonesian cacao farmers, which results in the low cacao productivity. A major obstacle is the cherelle wilt disease. This disease is affected by the central flowering gene (gene LFY), whose expression level is regulated by its promoter. The objective of this research is to isolate the promoter of gene LFY, to then be cloned into its cloning and expression vectors. The promoter isolation was done from a young cacao leaf. The DNA in the leaf was extracted first, and then the promoter was isolated usingGenome WalkingTM technique. Subsequently, the sequencing method and Softberry software were utilized to determine the promoter’s nucleotides. The result, which was then confirmed by TATA box, proved the existence of gene LFY promoter fragment. A fragment of 1650 bp size was then cloned into cloning and expression vectors: pGEM-T Easy and pCambia 1303. Next, the plasmid of the recombinant DNA was transformed into Agrobacterium tumefaciens using the AGLO strain. The conclusion of this research is that the gene LFY promoter ofTheobroma cacao L. can be isolated using the Genome WalkingTM method, enabling more information on the occurence of cherelle wilt on cacao plants.

ISOLASI PROMOTOR GEN LFY PADA TANAMAN Theobroma cacao L. DENGAN TEKNIK

GENOME WALKINGTM

YOANITA RINA SANTOSO

SkripsiSebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains padaDepartemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2010

Judul Skripsi : Isolasi Promotor Gen LFY pada Tanaman Theobroma cacao L. dengan Teknik Genome WalkingTM

Nama : Yoanita Rina SantosoNIM : G84052657

DisetujuiKomisi Pembimbing

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Dr. Tetty Chaidamsari, M.SiKetua Anggota

Diketahui

Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc.Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Tri Tunggal Mahakudus atas segala rahmat dan berkat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Penelitian yang bertema gen LFY dan berjudul ‘Isolasi Promotor Gen LFY pada tanaman Theobroma cacao L. dengan teknik Genome WalkingTM ‘ ini penulis laksanakan di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) Bogor.

Selesainya penelitian ini tidak lepas dari bantuan beberapa pihak. Oleh karena itu, ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Dr. Tetty Chaidamsari selaku pembimbing yang telah memberi bimbingan, masukan dan arahan. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan teknis, mencari literatur, dan beberapa referensi lainnya, seperti Mba Herti, Mba Nina, dan segenap staf di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, BPBPI. Selain itu penulis juga ingin berterimakasih kepada semua teman-teman Biokimia 42 dan Perwira 45 atas dukungan, doa, dan penghiburannya.

Penulis menyadari dalam penulisan hasil penelitian ini masih terdapat kekurangan. Oleh karena itu, saran dan kritik yang membangun sangat penulis harapkan. Akhir kata, penulis berharap semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Bogor, Januari 2010

Yoanita Rina Santoso

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 26 Juni 1987 dari ayah Yanto Santoso dan ibu Nio Ay Lan. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMU Sedes Sapientiae Semarang dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih mayor dari Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam serta minor dari Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Fisika Dasar pada tahun akademik 2006/2007. Penulis juga pernah melaksanakan Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium Central Garuda Food, PT Tudung Putra Putri Jaya, Bintaro, Jakarta Selatan, selama periode Juli sampai Agustus 2008 dengan judul Penentuan Metode Ekstraksi dan Analisis Aflatoksin dari Kacang Tanah. Selain itu penulis pernah aktif di beberapa organisasi kemahasiswaan, antara lain Comminity of Research and Education in Biochemistry (CREBs) periode 2006/2007 dan 2007/2008 dan Keluarga Mahasiswa Katolik IPB (KeMaKI) sebagai pengurus tahun 2006/2007. Pengalaman lain pengurus yaitu sebagai Sie Konsumsi pada acara LKIP, Pesta Sains Nasional 2007.

DAFTAR ISI

HalamanDAFTAR GAMBAR....................................................................................... . ix

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................ ..... x

PENDAHULUAN ............................................................................................ 1

TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 1Tanaman Kakao (Theobroma cacao L) ...................................................... 1Gen LEAFY ............................................................................................... 2Genome WalkingTM .................................................................................. 3Pemurnian DNA ....................................................................................... 4Kloning .................................................................................................... 5Plasmid sebagai Vektor Kloning ............................................................... 5

BAHAN DAN METODE ................................................................................. 6Alat dan Bahan .......................................................................................... 6Metode Penelitian ...................................................................................... 6

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 11Desain Primer .......................................................................................... 11Isolasi DNA Daun Kakao (modifikasi Chaidamsari et al. 2005)................. 11Genome WalkingTM (Clontech 2007) ........................................................ 11Kloning ke Vektor pGEM-T Easy ............................................................. 13Transformasi ke XL-1 blue ........................................................................ 14PCR Koloni dan Isolasi DNA Plasmid Rekombinan .................................. 14Pengurutan dan Analisis Basa Nukleotida................................................. 14Pemotongan Promotor Gen LFY dan pCambia 1303 ................................. 15Ligasi Promotor LFY dengan pCambia 1303 ............................................. 16Persiapan Transformasi ke Agrobacterium tumefaciens Strain AGLO ....... 16

SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................. 16

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 17

LAMPIRAN ..................................................................................................... 19

DAFTAR GAMBAR

Halaman1 Pohon kakao ............................................................................................... 2

2 Diagram model ABC .................................................................................. 3

3 Prosedur Genome WalkingTM ...................................................................... 3

4 Peta restriksi pGEM-T ............................................................................... 6

5 Pelabelan pada primer, dNTP, dan ddNTP pada metode sequencing........... 10

6 Gambaran metode sequencing secara umum .............................................. 10

7 Hasil elektroforegram isolasi DNA ........................................................... 11

8 Hasil elektroforegram isolasi DNA kakao setelah perlakuan dengan RNase ........................................................................................................ 12

9 Hasil elektroforegram digesti dengan Dra I................................................ 12

10 Hasil elektroforegram digesti oleh enzim restriksi ..................................... 12

11 Hasil elektroforegram purifikasi DNA ....................................................... 12

12 Hasil Genome Walking tahap pertama ...................................................... 13

13 Peta restriksi vektor pGEM-T Easy ........................................................... 13

14 Ilustrasi ligasi promotor ke vektor pGEM-T Easy ..................................... 13

15 Hasil koloni yang terbentuk pada media seleksi ......................................... 14

16 Profil elektroforegram produk PCR menggunakan primer universal M13. 14

17 Data hasil sequencing fragmen DNA forward ............................................ 14

18 Data hasil sequencing fragmen DNA reverse ............................................. 15

19 Hasil pengecekan pada Softberry .............................................................. 15

20 Ilustrasi posisi hasil sequencing terhadap primer dan gen LFY ................... 15

21 Peta restriksi vektor pCambia 1303 ............................................................ 15

22 Hasil elektroforegram purifikasi digesti PCAMBIA 1303 oleh enzim NotIdan BamHI ............................................................................................... 16

23 Hasil elektroforegram digesti pCambia 1303 rekombinan .......................... 16

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Tahap pelaksanaan penelitian..................................................................... 20

2 Pembuatan bufer ekstraksi......................................................................... 21

3 Pembuatan bufer lisis................................................................................. 22

4 Prosedur elektroforesis gel agarosa............................................................ 23

5 Komposisi mix untuk primary PCR.......................................................... 24

6 Komposisi mix untuk secondary PCR...................................................... 24

7 Pembuatan EDTA 0.5 M pH 8.................................................................. 25

8 Pembuatan TBE 5X................................................................................... 26

9 Pembuatan stok larutan PVP..................................................................... 26

10 Pembuatan stok larutan CTAB.................................................................. 27

11 Sekuen DNA gen LFY dari daun kakao..................................................... 28

12 Elektroforegram fragmen DL-1B hasil sekuensing.................................... 29

1

PENDAHULUAN

Tanaman kakao (Theobroma cacao L.) merupakan salah satu komoditas perkebunan yang penting secara sosial dan ekonomi di Indonesia. Kakao merupakan tanaman perkebunan yang dikenal di Indonesia sejak tahun 1560, namun baru menjadi komoditas penting sejak tahun 1951. Tanaman tropis ini berasal dari Amerika Selatan dan menyebar ke Amerika Utara, Afrika, dan Asia. Budidaya kakao di Indonesia diusahakan oleh perusahaan perkebunan negara, swasta, serta perkebunan rakyat (Sunanto 1992). Perkembangan perkebunan kakao, baik perkebunan rakyat maupun perkebunan swasta sangat pesat. Potensi pengembangan kakao di Indonesia cukup besar, baik dari segi sumber daya, teknologi, bahkan peluang pasar dalam dan luar negeri yang akan terus berkembang. Indonesia sendiri merupakan negara pengekspor kakao terbesar ketiga di dunia setelah Pantai Gading dan Ghana, namun produktivitas tanaman kakao di Indonesia tergolong rendah (Deptan 2007).

Kelemahan produksi kakao di Indonesia terletak pada rendahnya jumlah bunga yang berubah menjadi buah dan menyebabkan tingkat produksi juga rendah. Hal ini disebabkan pembungaan yang tidak konsisten dan penyakit layu pentil. Menurut McKelvie (1956), tanaman kakao dewasa yang tumbuh subur dapat menghasilkan 5000-10000 bunga dalam setahun. Dari jumlah bunga tersebut, hanya sekitar 500-1000 bunga atau sekitar 10% yang mengalami pernyerbukan, sisanya yaitu bunga yang mekar dalam 24 jam dan tidak diserbuki akan gugur. Bunga yang telah mengalami penyerbukan, sekitar 10%-30% akan berkembang menjadi buah pentil (cherelle), sedangkan 70%-90% sisanya akan mengalami layu pentil atau kematian fisiologis (cherelle wilt). Selanjutnya jumlah pentil yang dapat tumbuh dan berkembang menjadi buah hingga masak hanya sekitar 50-100 buah (Wood & Lass 1989), sedangkan Iswanto et al. (1999) menyatakan jumlah yang lebih sedikit, yaitu 33-40 buah. Berkaitan dengan hal tersebut, bidang rekayasa molekuler mutlak memegang peranan yang penting mengatasi masalah pembungaan yang tidak stabil pada kakao. Kurangnya informasi mengenai mekanisme pembentukan dan perkembangan bunga secara molekuler merupakan salah satu kendala dalam memperbaiki produktivitasnya. Salah satunya yang dapat dilakukan dengan rekayasa

molekuler adalah dengan mencoba mengisolasi promotor gen LEAFY( LFY) pada tanaman kakao.

Perdagangan kakao di dunia cukup menjanjikan, mulai dari harga yang stabil dan permintaan yang konstan. Indonesia sebagai negara penghasil kakao seharusnya dapat menghasilkan devisa bagi negara. Namun terdapat permasalahan, yaitu rendahnya produktivitas kakao. Hal ini disebabkan sedikitnya bunga yang berhasil menjadi buah pentil. Selain itu, penyakit busuk pentil semakin menurunkan produktivitas kakao di Indonesia. Beberapa penelitian dan literatur menunjukkan bahwa gen LFY merupakan gen pengatur pembungaan yang utama. Gen ini diharapkan dapat mencegah penyakit busuk pentil, mengatur pembungaan, dan akhirnya meningkatkan produktivitas kakao. Oleh karena itu dilakukan penelitian yang bertujuan mengisolasi promotor gen LFY dari tanaman kakao dengan teknik Genome Walking.

Penelitian ini dilaksanakan untuk mengurangi dampak penyakit busuk pentil, yaitu menurunnya produktivitas tanaman kakao. Adanya promotor gen LFY yang disisipkan pada tanaman selain mempercepat pembentukan bunga juga dapat memproduksi bunga pada waktu yang tepat sehingga produktivitas kakao dapat ditingkatkan.

Promotor gen LFY yang berhasil diisolasi dari daun kakao dan ditransformasikan ke dalam tanaman diharapkan dapat mempercepat pembentukan bunga dan meningkatkan produksi bunga. Peningkatan produksi bunga pada akhirnya diharapkan juga meningkatkan produksi buah.

TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Coklat (Theobroma cacao L.)Pohon kakao (Theobroma cacao L.)

(Gambar 1) adalah sejenis tanaman yang tumbuh sepanjang tahun (evergreen) dan berasal dari dataran rendah sebelah timur dari Andes di Amerika Selatan. Kakao membutuhkan iklim yang hangat dan lembab, hujan yang teratur, dan tumbuh di tempat teduh (suhu tidak kurang dari 20°C atau lebih tinggi dari 28°C). Theobroma cacao adalah nama yang diberikan untuk pohon kakao oleh Linnaeus dalam edisi pertama Species Plantarum yang diterbitkan tahun 1753. Spesies ini merupakan spesies diploid dengan jumlah kromosom 20. Tahun 1882 Morris dari Jamaica membedakan dua kelas T. Cacao,

2

yaitu Criollo dan Forastero. Genus Theobroma yang dimiliki kakao termasuk ke dalam famili Sterculiaceae (Chaidamsari et al. 2005).

Tanaman ini menurut Tjitrosoepomo (1988) termasuk ke dalam kerajaan plantae, divisi spermatophyta, kelas dicotyledoneae, ordo malvales, famili malvaceae, genus Theobroma, dan spesies Theobroma cacao L.Bunga tanaman kakao terbentuk sepanjang tahun tetapi intensitas pembentukannya beragam dari waktu ke waktu. Bunga yang terbentuk ditentukan oleh faktor genetis, umur, dan lingkungan tumbuh. Faktor genetis berpengaruh hingga tingkat klon (progeni) yang menyebabkan keragaman jumlah bunga pada masing-masing klon. Pada tanaman yang semakin tua, akan semakin banyak bunga yang terbentuk dan keragaman bunganya lebih tinggi dari pada tanaman yang lebih muda. Bunga banyak terbentuk pada saat musim hujan dan bulan-bulan lembab berikutnya. Bakal bunga terbentuk hingga bunga mekar (reseptif) memerlukan waktu sekitar 30 hari. Bunga yang mekar dan tidak segera diserbuki dalam dua hari (24 jam) akan gugur.

Bunga berkembang dari meristem pucuk dan mengandung sel reproduktif pada tanaman yang lebih tinggi. Kontrol lingkungan (lamanya hari dan suhu) pada kebanyakan tanaman mendorong transisi dari sel yang sedang aktif membelah menjadi sel bunga. Mekanisme kompleks pembentukan bunga dimulai dari pembentukan kelopak bunga, daun bunga, benang sari, dan putik. Gen penanda meristem mengubah sel yang sedang aktif membelah dengan cepat menjadi sel bunga. Sel tunas yang aktif membelah menghasilkan daun selama fase vegetatif mengalami masa transisi menjadi sel bunga melalui satu sampai dua cara (Brian 2003).

Pertumbuhan buah kakao dapat dipisahkan ke dalam dua fase (Mckelvie 1956). Fase pertama berlangsung sejak pembuahan sampai buah berumur 75 hari. Selama 40 hari pertama, pertumbuhan buah agak lambat kemudian sesudah itu cepat dan mencapai puncaknya pada umur 75 hari. Fase kedua ditandai dengan pertumbuhan membesar buah, hingga umur 120 hari. Buah mencapai ukuran maksimum pada umur 143-170 hari. Buah muda yang terbentuk pada bulan pertama belum menjamin hasil yang diperoleh. Sebagian besar buah muda tersebut akan layu dan mati dalam kurun 1-2 bulan yang umum disebut layu pentil (cherelle wilt).

Gambar 1 Pohon kakao.

Gen LEAFYPada spesies tanaman model seperti

Arabidopsis, gen pengendali pembentukan bunga seperti LEAFY (LFY), APETALA1(AP1), CAULIFLOWER (CAL) dan FRUITFULL (FUL) mengontrol transisi pembungaan (Dean & Simpson 2002). Pengetahuan tentang LEAFY banyak dilaporkan terutama pada Arabidopsis. Selama dekade terakhir, studi proses pembungaan Arabidopsis telah dilakukan dengan sangat intensif. Di dalam Arabidopsis, perubahan dari fase vegetatif ke reproduktif dikontrol secara ketat oleh banyak faktor. Gen LEAFY memiliki posisi sentral dan merupakan gen kunci yang diperlukan untuk pembentukan bunga normal. Inisiasi pembungaan di dalam Arabidopsis diatur oleh gen pengkode faktor transkripsi seperti LFY. Gen ini dapat bertindak sebagai media antara proses induksi bunga dan inisiasi bunga dan kemampuan merespons LEAFY (Blazquez et al. 1997). Peranan gen LFY pada Arabidopsisini diharapkan tidak jauh berbeda dari perannya pada tanaman kakao.

Gen LFY merupakan salah satu gen kunci yang berperan dalam proses inisiasi pembungaan pada Arabidopsis thaliana. Mutasi pada gen LFY tersebut dapat mengakibatkan perubahan bunga menjadi meristem vegetatif (Irish 1999, diacu dalam Samanhudi 2006). Sebaliknya, ekspresi LFYdapat mengubah meristem vegetatif menjadi meristem bunga. Selama fase vegetatif, LFYendogen hanya diekspresikan pada level yang rendah, dan pada saat terjadi perubahan dari fase vegetatif ke perkembangan reproduktif ekspresi LFY tersebut meningkat, yang diikuti oleh peningkatan ekspresi APETALA 1 (AP1) (Blazquez et al. 1997). Jadi dapat disimpulkan LFY ikut berperan dalam mengatur transisi ke perkembangan bunga,

3

dengan cara menginduksi ekspresi AP1 pada daerah meristem tunas apikal yang membentuk primordia bunga (William et al. 2004).

Model perkembangan bunga ABC dibuat oleh Coen et al. tahun 1991. Pengamatan terhadap mutan yang ternyata merusak perkembangan organ pembungaan mendasari pembentukan model ABC. Model ini menggambarkan pengaturan perkembangan organ pembungaan oleh berbagai faktor transkripsi pada bagian bunga yang berbeda. Gen kelas A sendirian mengatur perkembangan sepal (kelopak bunga), namun jika berinteraksi dengan gen kelas B dapat mempengaruhi perkembangan petal (mahkota bunga). Hal yang sama terjadi untuk gen kelas C, jika sendiri berfungsi menginisiasi perkembangan carpel (putik), namun jika berinteraksi dengan gen kelas B dapat menentukan perkembangan stamen (benang sari) (Gambar 2).

Gen yang termasuk dalam gen kelas A adalah APETALA 2 (AP2) dan APETALA 1 (AP1), kelas B adalah APETALA 3 (AP3) dan PISTILLATA (PI), sedangkan yang termasuk kelas C adalah AGAMOUS (AG). Gen yang termasuk dalam kelas E adalah SEPALLATA(SEP) 1, 2, 3, dan 4. Gen kelas E ini diperkirakan juga berperan penting dalam perkembangan organ pembungaan.

Gambar 2 Diagram model ABC.

Genome WalkingTM

Amplifikasi dari fragmen DNA genomik kakao dilakukan dengan menggunakan kitGenome Walking. Berdasarkan protokol yang ada, DNA dipotong menggunakan enzim restriksi berupa: Dra I, EcoR V, Pvu II, dan Stu I. Langkah selanjutnya adalah memurnikan DNA dengan ekstraksi fenol:kloroform dan presipitasi etanol. Kemudian setiap fragmen genomik disambung dengan adaptor Genome Walking

yang kemudian digunakan untuk amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) pada fragmen spesifik. Untuk setiap fragmen genomik, dilakukan dua kali PCR menggunakan Advantage 2 Polymerase mix(Clontech 2007) dalam PE Biosystems DNA thermal Cycler 480. Program PCR yang digunakan adalah metode ‘touchdown’ yang meliputi penggunaan suhu penempelan dan pemanjangan yang lebih tinggi beberapa derajat dari Tm primer. Meskipun penempelan primer jauh lebih efisien pada suhu yang lebih rendah, namun pada suhu tinggi ini penempelan jauh lebih spesifik.

Amplifikasi pertama dilakukan dengan menggunakan adaptor-specific primer dan gene-specific primer. Sedangkan PCR kedua dilakukan dengan nested adaptor-specific primer dan nested gene-specific primer (Gambar 3). Hasil PCR dianalisis pada gel agarosa 1.5%. Pita yang diperoleh kemudian diekstrak dan dikloning ke dalam pGEM-T Easy. DNA yang telah terligasi kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten Escherichia coli XL-1 Blue (Chaidamsari 2005).

Primer didesain secara bertahap sesuai dengan langkah prosedur yang digunakan pada Genome Walking. Panjang primer yang didesain adalah 28 basa, hal ini sesuai dengan Innis & Gelfand 1991 yang menyatakan persyaratan desain primer antara lain berukuran 20-28 pb, mengandung G-C > 50%, pasangan primer tidak saling komplemen, nilai melting temperature (Tm) berkisar antara 57- 63 ºC. Jumlah ini memastikan primer akan

Gambar 3 Prosedur Genome WalkingTM.

4

menempel dan memanjang dengan efisien pada suhu 67 ºC. Langkah PCR dilakukan secara nested dengan tujuan mempermudah dalam memperoleh sekuen yang promotor yang diinginkan. Dalam satu kali langkah amplifikasi, didapat sekitar 200 pasangan basa (pb) sekuen promotor. Sehingga jarak primer spesifik satu dengan yang lain juga berjarak sekitar 200 pb. Primer spesifik pertama harus menempel pada gen LFY sedangkan primer spesifik untuk tahap PCR selanjutnya harus menempel pada ujung 3’ dari hasil PCR pertama. Primer-primer spesifik didesain secara bertahap (nested) ke arah kiri hingga ditemukan sekuen gen baru yang menandakan titik awal promotor gen LFY. Primer spesifik didesain ke arah kiri karena letak promotor berada di sebelah kiri gen yang bersangkutan.Hal lain yang perlu diperhatikan dalam desain primer adalah sekuen pada ujung 3’-nya tidak boleh menempel pada ujung 3’ dari AP. Enam sekuen terakhir pada primer ini juga tidak boleh mengandung lebih dari tiga basa guanin (G) dan cystein (C) (Clontech 2007).

Enzim DNA polimerase dapat mengatalisis langkah-langkah penambahan unit deoksinukleotida ke dalam rantai DNA. Enzim ini menambahkan unit deoksinukleotida baru dari deoksinukleotida trifosfat (dNTP) ke dalam rantai DNA yang sudah ada kemudian melepaskan ion pirofosfat (Berg et al. 2007).

Menurut penelitian Kornberg (1961), DNA polimerase dapat membuat utas DNA baru jika terdapat utas DNA tunggal sebagai cetakan. Oligonukleotida yang akan diperpanjang harus sudah menempel pada DNA target terlebih dahulu dengan ujung 3’-OH yang bebas. Perpanjangan rantai DNA baru ini terjadi karena serangan nukleofilik pada ujung 3’-OH . Terbentuk jembatan fosfodiester dan diperoleh ion pirofosfat sebagai hasil samping. Perpanjangan rantai DNA baru terjadi dari arah 5’-fosfat ke ujung 3’-OH.

DNA target memerlukan suhu yang tinggi dalam proses denturasi. Suhu tinggi ini dapat membuat DNA polimerase kehilangan aktivitasnya, oleh karena itu DNA polimerase yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri yang hidup di lingkungan panas. Isolasi dilakukan dari bakteri Thermus aquaticus, sehingga polimerase yang diperoleh bernama Taq polimerase (Campbell & Farrell 2006). Keuntungan dari penggunaan enzim tahan panas ini yaitu mempermudah proses PCR dan memungkinkan pengaturan

suhu tinggi sehingga penempelan primer lebih baik.

Pemurnian DNASelain mengandung DNA, ekstrak sel juga

mengandung protein dan RNA. Untuk memurnikan DNA maka protein dan RNA perlu dihilangkan. Cara yang umum dilakukan untuk menghilangkan protein adalah menambahkan campuran fenol:kloroform (1:1). Pelarut organik ini akan menggumpalkan protein dan meninggalkan DNA dan RNA pada fase air. Setelah pelarut organik ditambahkan, lalu campuran dikocok secara perlahan dan kemudian disentrifugasi sehingga dihasilkan beberapa lapisan. Bagian bawah tabung merupakan fase organik yangmengandung fenol dan kloroform sedangkan bagian atas adalah fase air yang mengandung asam nukleat. Gumpalan protein berada pada fase antara. Ekstraksi perlu dilakukan lebih dari satu kali jika ekstrak sel mengandung protein dalam konsentrasi tinggi. Jaringan tanaman umumnya mengandung karbohidrat dalam jumlah besar yang tidak dapat dihilangkan hanya dengan ekstraksi fenol. Oleh karena itu, biasanya digunakan deterjen cetyltrimetylammonium bromide (CTAB) yang membentuk kompleks tak larut dengan asam nukleat. Deterjen ini, menurut Rogers & Bendich (1994), berfungsi melisis sel, mendenaturasi protein, dan memisahkan karbohidrat dari asam nukleat yang disebabkan perbedaan kelarutan kedua senyawa tersebut terhadap CTAB. Ketika CTAB ditambahkan ke dalam ekstrak tanaman, kompleks asam nukleat-CTAB mengendap, sedangkan karbohidrat, protein, dan komponen lainnya berada dalam supernatan. Setelah dilakukan sentrifugasi dan bagian supernatan dibuang, endapan lalu dilarutkan dengan menambahkan NaCl 1 M yang memecah kompleks tersebut.

Asam nukleat kemudian dapat dipekatkan melalui presipitasi etanol dan RNA yang terkandung dihilangkan melalui penambahan ribonuklease (RNase). Tahap yang paling penting dalam mengisolasi DNA adalah tahap pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan DNA. Menurut Taylor et al. (1993), kegagalan dalam memecahkan semua dinding sel dari suatu jaringan dapat mempengaruhi hasil akhir isolasi DNA. Selain itu, selama penggerusan perlu ditambahkan nitogen cair untuk menjaga suhu tetap dingin sehingga DNA tidak rusak. Penambahan polyvinylpyrrolidone (PVP) dan polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) sebagai antioksidan juga perlu dilakukan untuk

5

mencegah terbentuknya warna coklat polifenol pada DNA. Pencegahan ini dilakukan dengan menghambat aktivitas polifenol oksidase (Rogers & Bendich 1994).

KloningKloning DNA adalah proses perbanyakan

suatu fragmen DNA yang kemudian diisolasi dan diperbanyak melalui proses transformasi ke dalam suatu bakteri E. coli. Agar sepotong DNA dapat diklonkan untuk penelitian, lebih dulu DNA itu harus diikat pada suatu vektor, salah satu vektor yang biasa digunakan adalah plasmid. DNA disambungkan pada DNA plasmid dan molekul kimeriknya ditransformasikan ke dalam inang seperti E. coli. Kemudian plasmid mengadakan replikasi dalam inang, sewaktu inang tumbuh dan membelah, dan potongan DNA yang diinginkan terklonkan (Russel 1980, diacu dalam Sardjoko 1991). Kloning gen untuk mendapatkan klon tertentu dalam jumlah banyak pada prinsipnya berguna untuk mempermudah pengujian, modifikasi dan pemanfaatan gen tersebut.

Plasmid sebagai Vektor KloningPlasmid adalah DNA utas ganda

melingkar yang berukuran relatif kecil dan dijumpai pada bakteri atau yeast. DNA ini mampu bereplikasi secara mandiri sehingga tidak bergantung pada replikasi DNA kromosom dan proses replikasinya juga tidak berkaitan dengan mekanisme pembelahan sel. Umumnya plasmid membawa satu atau sejumlah gen, yang dapat berupa gen pembawa sifat resisten terhadap antibiotika, penyandi enzim restriksi, atau penyandi enzim yang terlibat dalam pembentukan toksin. Kriteria plasmid yang dapat digunakan sebagai vektor antara lain memiliki origin of replication (ORI), berukuran kecil (<10 kb), sekuen DNA-nya diketahui, memiliki jumlah salinan tinggi, mengandung marka seleksi, dan memiliki situs restriksi yang unik (Boyer 2006).

Kloning bertujuan memperbanyak dan mengisolasi DNA yang disisipkan (DNA insert). Fungsi vektor dalam proses ini adalah membawa dan memperbanyak DNA yang disisipkan. Oleh karena itu, semakin kecil ukuran plasmid maka semakin kecil porsi DNA pembawa sehingga semakin besar ukuran DNA insert yang dapat ditampung. Ukuran DNA insert yang besar dalam molekul DNA rekombinan ini mempermudah permurnian DNA insert setelah DNA rekombinan direplikasi di dalam sel. Plasmid

dengan jumlah salinan tinggi umumnya lebih mudah dimurnikan. Marka seleksi yang umum digunakan adalah gen resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Gen resistensi ampisilin menyandi enzim β-laktamase yang dapat memecah molekul ampisilin sehingga sel inang yang membawa plasmid dapat tumbuh dalam medium yang mengandung ampisilin. Gen resistensi tetrasiklin menyandi protein yang berfungsi memompa molekul tetrasiklin keluar sitoplasma sehingga meniadakan efek toksik tetrasiklin terhadap sel inang (Glover 1984).

Plasmid yang berupa DNA berutas ganda dan berbentuk sirkular merupakan DNA ekstra kromosom yang dikenal pada bakteri. Plasmid memiliki dua sifat istimewa yang bermanfaat dalam manipulasi genetik. Plasmid umumnya tidak diperlukan dalam pertumbuhan sel sehingga pada keadaan tertentu dapat keluar masuk tanpa membahayakan sel tersebut karena itu plasmid dapat digunakan sebagai vektor. Gen asing dapat bersatu dengan plasmid secara mudah dan diangkut ke dalam E. coli dan menjadi bagian genom sel inang (Lehninger 1994).

Secara umum plasmid yang baik untuk digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah yang mempunyai berat molekul rendah, mempunyai kemampuan mengekspresikan gen yang dibawanya dari inang, hanya mempunyai sisi pemotong tunggal untuk kebanyakan endonuklease restriksi dan mempunyai dua atau lebih penanda (marker) (Primose & Old 1989).

Vektor yang biasa dimanfaatkan untuk kloning produk PCR adalah pGEM-T. Vektor ini mengandung gen lacZ yang menyandi β-galaktosidase yang akan mengubah X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-Galaktosidase) dari tidak berwarna menjadi biru. pGEM-T mengandung multiple cloning sites (MCS). Daerah restriksi ini memungkinkan lepasnyaDNA insert melalui pemotongan dengan enzim restriksi tunggal, misalnya EcoRI, BstZI, dan NotI. Plasmid pGEM-T mengandung gen resistensi terhadap antibiotika ampisilin dan berukuran 3016 pb (Gambar 4).

Transformasi ke Agrobacterium menggunakan sel kompeten strain AGLO. Sel kompeten adalah sel yang mampu menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia. Sel dapat dibuat menjadi kompeten melalui perlakuan dengan garam kalsium klorida (CaCl2) atau rubidium klorida (RbCl). Mekanisme perubahan sel menjadi kompeten tidak diketahui dengan pasti namun

6

diduga bahwa perlakuan dengan garam-garam tersebut dapat meningkatkan afinitas sel terhadap DNA atau meningkatkan porositas dinding sel.

Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri tanah yang menginduksi timbulnya crown gall akibat dari transfer fragmen DNA (T-DNA) dari plasmid Ti (tumour-inducing) bakteri ke sel tanaman. Plasmid Ti ditemukan pada semua strain A. tumefaciens virulen, berukuran sekitar 200-250 kb, dan stabil pada temperatur dibawah 30oC. Selama pembentukan tumor, urutan tertentu plasmid Ti dan Ti-DNA ditransfer ke sel tanaman dan berintegrasi ke genom inti sel tanaman. (Tzfira & Citovsky 2002).

Gambar 4 Peta restriksi pGEM-T.

BAHAN DAN METODE

Alat dan BahanBerbagai alat yang digunakan dalam

penelitian ini, antara lain gunting, mortar, sentrifus Eppendorf 5417 R dan AllegraTM 64 R F0630, inkubator, spektrofotometer UV-Vis Beckman Coulter DU-150, PCR Biometra T Personal, elektroforesis, gel documenter. Alat pendukung kegiatan mikro yang digunakan yaitu tabung mikro dan mikropipet. Selain itu digunakan juga berbagai alat gelas seperti gelas ukur, gelas piala, pipet volumetrik dan Mohr, corong kaca, cawan petri, tabung Eppendorf, gelas Erlenmeyer, dan segitiga penyebar.

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kakao dari BPBPI. Bahan lain yang digunakan yaitu, aluminium foil, kertas saring, gel agarosa, bufer Tris Borat EDTA (TBE), Etidium Bromida (EtBr), loading dye, marker DNA 1 kb plus ladder, parafilm, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyvinylpolypyrrolidone (PVPP), kloroform, isoamil alkohol, isopropanol, etanol, mili Q

(MQ), enzim restriksi, Sodium oksaloasetat (NaOAc), Genome Walking kit, vektor kloning pGEM-T Easy, vektor ekspresi pCambia, sel kompeten E. coli XL-1 blue, sel kompeten Agrobacterium tumefaciens Strain AGLO, media Luria Bertani (LB), media yeast extract pepton (YEP), dan Tris Etilen Diamin Tetra Asetat (EDTA) atau umum disebut bufer TE. Selain itu juga bahan-bahan penyusun bufer ekstraksi dan bufer lisis, serta pasangan primer juga digunakan.

Metode Penelitian

Isolasi DNA Daun Kakao (Modifikasi Chaidamsari et al. 2005)

Pada isolasi DNA daun kakao, dipilih daun yang berumur sedang dengan ciri daun belum terlalu keras dan warna hijau muda. Daun kemudian dicuci dengan air dan dikeringkan. Tulang daun kemudian dibuang dan daun ditimbang sebanyak 1 gram. Setelah ditimbang, daun dipotong hingga berukuran kecil dan disimpan dalam kertas aluminium foil yang langsung dimasukkan ke dalam nitogen cair (N2 cair). Mortar yang sudah diautoklaf selanjutnya didinginkan dengan N2

cair. Setelah mortar cukup dingin, potongan daun kemudian dimasukkan dan ditambahkan PVP lalu digerus hingga halus. Selama penggerusan, nitogen cair secara kontinyu ditambahkan untuk menjaga suhu tetap dingin dan jaringan tidak rusak. Penambahan PVP yang dilakukan berfungsi mencegah terjadinya pencoklatan akibat zat polifenol yang terkandung pada daun. Setelah daun benar-benar halus, daun dimasukkan ke blender yang berisi 15 mL bufer ekstraksi (Lampiran 2). Campuran tersebut kemudian dikocok selama 2 menit dan disaring menggunakan kain kasa steril. Filtrat yang diperoleh kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 30 mL. Bufer ekstraksi mengandung PVP dan β-merkaptoetanol, antioksidan yang mencegah pencoklatan yang menyebabkan DNA rusak.

Filtrat selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 15000 rpm pada suhu 4 °C selama 15 menit. Supernatan kemudian dibuang dan ke dalam pelet ditambahkan bufer lisis (Lampiran 3). Pelet dan bufer lisis kemudian dikocok perlahan (± 5 menit) hingga homogen. Campuran selanjutnya diinkubasi pada suhu 60 °C selama 1 jam, dengan setiap 15 menit tabung dibolak-balik. Setelah 1 jam, tabung didinginkan 5 menit kemudian dilakukan proses ekstraksi.

7

Ekstraksi dilakukan dengan menambahkan campuran kloroform:isoamil alkohol (CHL:IAA) 24:1 sejumlah 1 volume filtrat, lalu tabung dibolak-balik perlahan selama 10 menit. Tabung disentrifus dengan kecepatan 15000 rpm pada suhu 4 °C selama 10 menit. Ekstraksi dengan CHL:IAA dilakukan 2 kali. Selanjutnya, supernatan diambil dan dipindahkan ke tabung baru, lalu ditambahkan 0.5 volum NaCl 5 M. Tabung dicampur perlahan lalu ditambahkan 0.6 volum isopropanol dan diinkubasi pada suhu 4 °C selama 1 jam. Tabung kemudian disentrifus pada kecepatan 15000 rpm dan suhu 4 °C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan etanol 80% dingin sebanyak 2 kali. Setelah dicuci, pelet dikeringanginkan hingga bau etanol hilang. Pelet kemudian dilarutkan kembali dalam 30-50 µL MQ.

Genome Walking TM (Clontech 2007)Pengecekan Kemurnian DNA Daun

Kakao. Tabung mikro disiapkan, lalu diisi dengan 198 µL MQ dan 2 µL DNA daun kakao. Larutan kemudian dihomogenkan dan dicek nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-VIS Beckman Coulter DU-150. Nilai A260/230 merupakan penanda adanya kontaminasi oleh polisakarida dan polifenol, sedangkan nilai A260/280

menunjukkan ada tidaknya kontaminasi protein. Selanjutnya dilakukan elektroforesis gel untuk melihat profil DNA. Konsentrasi gel yang digunakan adalah 0.5% (Lampiran 4). Marker yang diigunakan adalah marker 1 kb plus DNA Ladder. Sampel sejumlah 1 µL dicampur dengan 0.5 µL loading dye pada parafilm, lalu dengan mikropipet dimasukkan ke dalam sumur pada cetakan gel agarosa. Sumur paling kiri diisi dengan 0.5 µL marker. Elektroforesis dijalankan pada 50-100 V. Hasilnya diamati dibawah lampu UV transilluminator dan difoto dalam gel documenter. DNA yang terkontaminasi RNA kemudian diberi perlakukan dengan RNase. Ke dalam tabung mikro selanjutnya dimasukkan 20 µL sampel DNA dan ditambahkan 2 µL RNase. Tabung ini kemudian lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam.

Pengecekan Kemurnian DNA dengan Pemotongan Menggunakan Dra I. Sejumlah5 µL DNA genomik dimasukkan ke dalam tabung mikro 0.5 mL, lalu ditambahkan 1.6 µL Dra I, 2 µL bufer restriksi Dra I 10X, dan 11.4 µL MQ. Campuran diinkubasi pada 37

°C over night (16-18 jam) untuk memastikan DNA sudah ter-digest. Hasil digest dicek dengan elektroforesis gel agarosa 0.5%.

Pemotongan DNA Genomik Daun Kakao. Tabung mikro disiapkan dan diberi label 1-4. Ke dalam tiap tabung, ditambahkan 25 µL DNA genomik, 8 µL enzim restriksi, 10 µL bufer enzim restriksi, dan 57 µL MQ. Enzim restriksi untuk tiap tabung berturut-turut adalah DraI, EcoRV, PvuII, dan StuI. Masing-masing tabung dicampur perlahan dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama dua jam. Tabung kemudian divorteks pada kecepatan rendah selama 5-10 detik dan kembali diinkubasi pada suhu 37 °C dimana enzim bekerja optimal over night. Hasil digest dicek dengan elektroforesis gel agarosa 0.5%. Enzim yang dipilih adalah enzim yang memotong secara jarang, tujuannya agar fragmen yang diperoleh tidak terlalu kecil.

Purifikasi DNA. DNA genomik kemudian dipurifikasi dengan cara ditambah fenol masing-masing 95 µL. Tabung kemudian divorteks pada kecepatan rendah selama 5-10 detik. Selanjutnya tabung disentrifus sebentar untuk memisahkan fase air dan fase organik. Lapisan atas (fase air) kemudian dipindahkan dengan hati-hati ke tabung baru berkapasitas 1.5 mL. Ke dalam fase air tersebut kemudian ditambahkan masing-masing 95 µL kloroform. Perlakuan dengan fenol dan kloroform digunakan untuk memisahkan sisa pengotor berupa protein yang mungkin masih ada. Glikogen digunakan sebagai pemberat sehingga hasil elektroforesis yang diperoleh nampak jelas. Tabung lalu divorteks pada kecepatan rendah selama 5-10 detik. Langkah selanjutnya sama dengan sebelumnya hingga diperoleh supernatan pada tabung baru. Ke dalamnya, ditambahkan 2 volum etanol 95%, 0.1 volum NaOAc 3 M (pH 4.5), dan 20 µg glikogen. Tabung kembali divorteks pada kecepatan rendah selama 5-10 detik, lalu disentrifus dengan kecepatan 14000 rpm pada suhu 4 °C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 100 µL etanol 80% dingin. Sentrifus dengan kecepatan 14000 rpm pada suhu 4 °C selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet dikeringanginkan. Selanjutnya pelet dilarutkan dalam 20 µL Tris-EDTA (TE). Hasil purifikasi diambil sejumlah 1 µL dan dicek dengan elektroforesis gel agarosa 0.5%.

Ligasi DNA ke Adaptor Genome Walking TM. Penempelan adaptor pada ujung akhir fragmen DNA genom berfungsi menggantikan primer, sehingga primer yang

8

didesain pada langkah sebelumnya hanya satu buah yang nantinya akan berpasangan dengan Adaptor Primer (AP). Ada dua jenis AP yang digunakan yang bersifat nested, hal ini sesuai dengan prosedur Genome WalkerTM dari Clontech. Langkah amplifikasi pertama menggunakan AP1 dan dilanjutkan degan penggunaan AP2. Urutan basa yang dimiliki AP seperti yang terlihat pada Tabel 1.

Dari masing-masing tabung berisi DNA hasil purifikasi, ambil 4 µL dan dipindahkan ke tabung baru berkapasitas 1.5 mL. Ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 1.9 µL Genome Walking Adaptor, 1.6 µL bufer ligasi 10x, dan 0.5 µL T4 DNA ligase. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 16 °C over night. Reaksi ini dihentikan dengan cara perlakuan inkubasi pada 70 °C selama 5 menit. Sejumlah 72 µL TE ditambahkan ke masing-masing tabung dan divorteks pada kecepatan rendah selama 10-15 menit. Selanjutnya, dari tiap-tiap fragmen DNA dilakukan dua kali PCR dengan Advantage 2 Polymerase mix (Clontech).

Primary PCR Genome WalkingTM. Primer yang digunakan dalam tahap ini adalah adaptor-specific primer (ASP) dan gene-specific primer (GSP). Primer yang pertama digunakan adalah Adaptor Primer 1 (AP-1) dan Tc LFY GW Rev 4. Cetakan yang digunakan adalah DNA Library (DL) 1, 2, 3, dan 4. Perlengkapan yang digunakan adalah Platinum Taq (Invitrogen). Sedangkan untuk komposisi campuran dapat dilihat pada Lampiran 5. Program pada PCR terdiri atas 7 siklus (94 °C selama 25 detik, 72 °C selama 3 menit), 32 siklus (94 °C selama 25 detik, 67 °C selama 3 menit), dan terakhir 67 °C selama 7 menit. Hasilnya diambil 5 µL dan dicek pada elektroforesis gel agarosa 1.5%.

Secondary PCR Genome Walking TM.Primer yang digunakan dalam tahap ini adalah nested adaptor-specific primer dan nested gene-specific primer. Primer yang digunakan adalah Adaptor Primer 2 (AP-2) dan Tc LFY-R1. Cetakan yang digunakan adalah hasil primary PCR. Perlengkapan yang digunakan adalah Platinum Taq, sedangkan komposisi campuran dapat dilihat pada Lampiran 6.Program pada PCR terdiri atas 5 siklus (94 °C selama 25 detik, 72 °C selama 3 menit), 20 siklus (94 °C selama 25 detik, 67 °C selama 3 menit), dan 67 °C selama 7 menit.

Pembuatan Sel Escherichia coli Kompeten(Okayama et al. 1990)

Sel E. coli kompeten dibuat dengan cara koloni tunggal bakteri E. coli XL-1 blueditumbuhkan dalam media 2.5 mL LB pada suhu 37 °C over night dan dikocok pada shaker berkecepatan 150 rpm. Selanjutnya 0.4 mL kultur diinokulasi ke dalam 10 mL media LB dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 75 menit. Setelah itu, kultur dikocok pada shaker dengan kecepatan 150 rpm. Hasil inokulasi dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf steril dan didiamkan di dalam es selama 5-10 menit lalu disentrifus pada kecepatan 5000 rpmselama satu menit pada suhu 4 °C. Pelet yang diperoleh kemudian dicuci dengan 1 mL CaCl2 0.1 M dingin, didiamkan dalam es selama 15 menit dan disentrifus pada kecepatan 5000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 200 µL CaCl2 0.1 M dingin dan disimpan dalam es selama 10 menit. Bakteri E. coli sudah menjadi kompeten.

Kloning ke Vektor pGEM-T EasyKloning dilakukan menggunakan

perlengkapan dari Promega (1999). Campuran untuk ligasi dibuat sejumlah 10 µL dengan komposisi 5 µL bufer ligasi, 3.5 µL insert(DNA hasil purifikasi), 0.5 µL vektor pGEM-T Easy, dan 1 µL T4 ligase. Ligasi dilakukan dengan inkubasi pada suhu 4 °C over nightatau pada suhu ruang selama 1 jam. Langkah selanjutnya adalah transfer DNA hasil ligasi ke dalam sel kompeten, yaitu XL-1 Blue.

Dalam tahapan ligasi digunakan enzim T4 ligase yang berfungsi membentuk ikatan fosfodiester antara DNA insert dengan plasmid. Plasmid pGEM-T Easy dipilih karena memiliki kelebihan, yaitu memiliki basa timin (T) pada ujung 3’-nya. Hal ini dapat memudahkan penempelan dengan insertyang memiliki basa adenin (A). SesuaiSambrook et al. 1991, pemurnian vektor berukuran kecil lebih mudah dibandingkan vektor berukuran besar yang cenderung lebih rapuh hal ini juga yang mendasari pemilihan vektor pGEM-T Easy.

Transformasi ke XL-1 blueTransformasi dilakukan menurut metode

Doyle (1996). Sejumlah 10 µL DNA rekombinan hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200 µL sel kompeten (XL-1 blue) dan dihomogenkan dengan cara dicampur perlahan. Tabung diinkubasi di es selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan kejutan panas dengan cara tabung diinkubasi pada suhu 42 °C selama 50 detik dan segera dimasukkan ke

9

dalam es selama 10 menit. Lalu ditambahkan 800 µL LB dan glukosa 20 µM.

Suspensi dikocok dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 °C selama 1.5 jam. Selanjutnya suspensi disebar pada media LA yang mengandung X-Gal 40 mg/L, IPTG 0.1 M, dan ampisilin 100 mg/L. Media LA kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C over night. Koloni putih akan menghasilkan sel kompeten yang mengandung plasmid rekombinan, sedangkan sel yang tidak mengandung plasmid rekombinan akan menghasilkan koloni berwarna biru.

Seleksi gen rekombinan dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer universal M13. Koloni yang dipilih adalah yang berwarna putih. Hasil PCR koloni diamati dengan elektroforesis gel dengan agarosa 1 %. Dari kultur bakteri yang sudah tumbuh, selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid.

PCR KoloniPCR koloni dilakukan dengan mesin PCR

Biometra T-Personal. Kit yang digunakan adalah dari BIORON. Tabung mikro yang berisi 5 µL koloni dalam 10 µL mQ dijalankan pada mesin PCR untuk perlakuan lisis terlebih dahulu. Kemudian program dhentikan dan ditambahkan 1.5 µL bufer komplit, 0.3 µL dNTPs, 0.15 primer M13forward, 0.15 µL primer M13 reverse, 0.15 Taq, dan 2.75 µL mQ ke dalam tabung. Program PCR dilanjutkan ke program initial denaturation pada suhu 95 °C selama 4 menit, denaturasi pada suhu 95 °C selama 30 detik, annealing pada suhu 50 °C selama 30 detik, extention pada suhu 72 °C selama 2 menit (35 siklus), dan final extention pada suhu 72 °C selama 5 menit. Hasil PCR koloni selanjutnya diamati dengan elektroforesis gel agarosa 1%.

Isolasi DNA Plasmid RekombinanIsolasi DNA plasmid dilakukan dengan

High Pure DNA Isolation Kit (Roche). Koloni bakteri berwarna putih yang mengandung DNA rekombinan diambil dan dikultur over night pada suhu 37 °C dalam 5 mL media LB yang mengandung ampisilin. Selanjutnyasejumlah 1.5 mL kultur dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf dan disentrifus pada kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan ke dalam pelet ditambahkan 1.5 mL kultur E. coli. Selanjutnya disentrifus kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama. Supernatan dibuang, pelet ditambah dengan 200 µL cell resuspension dan dihomogenkan dengan pipet. Larutan kemudian dipindahkan ke

Eppendorf dan ditambahkan 250 µL neutralization solution. Tabung kemudian dibolak-balik sebanyak 10 kali dan disentrifus pada kecepatan 7000 rpm selama 5 menit.

Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambah dengan 250 µL quantum prep matrix dan dihomogenkan dengan pipet. Supernatan dipindahkan ke spin filter dan disentrifus dengan kecepatan 6000 rpmselama 1 menit. Filtrat dibuang dan ke dalam spin filter ditambahkan 500 µL wash water solution. Selanjutnya larutan disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama dua menit. Sentrifugasi dilakukan dua kali, lalufiltrat dibuang dan spin filter dipindahkan ke tabung Eppendorf baru. Air deionisasi hangat (70 °C) sejumlah 100 µL ditambahkan ke dalam Eppendorf dan disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 2 menit. Filtrat yang mengandung plasmid rekombinan disimpan pada suhu -20 °C.

Pengurutan dan Analisis Basa NukleotidaPengurutan dilakukan untuk mengetahui

urutan basa nukloetida dan hasilnya kemudian dianalisis dengan perangkat lunak Softberry.Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam tahapan pengurutan antara lain cetakan DNA utas tunggal, primer, DNA polimerase, dan nukleotida yang telah dilabel. Pelabelan dilakukan baik pada primer, dNTPs, maupun pada ddNTPs (Gambar 5).

Sampel kemudian dipisahkan ke dalam 4 tabung reaksi yang masing-masing mengandung keempat dNTPs yang salah satunya dilabel dengan radioaktif dan salah satu ddNTPs. Dideoksinukleotida yang kekurangan nukleotida pada gugus 3’-OH inilah yang merupakan chain-terminating. Sejumlah ddNTPs ditambahkan pada konsentrasi yang lebih rendah dari dNTPs, halini bertujuan agar tercapai perpanjangan rantai yang cukup (Devlin 2006).

Penentuan urutan DNA ini tidak dilakukan sendiri, namun mengacu ke PT Charoen Pokphand, Jakarta. Prinsip pengurutan yang digunakan oleh PT Charoen Pokphand pada dasarnya adalah proses pelabelan basa nukloetida sehingga dapat dibedakan antara basa adenin, guanin, timin, atau cystein (Gambar 6). Metode pengurutan ini lebih menguntungkan karena pengurutan dapat dilakukan dengan reaksi tunggal. Pewarna berfluoresensi yang digunakan untuk tiap ddNTPs adalah berbeda, masing-masing akan berfluoresensi pada panjang gelombang yang berbeda (Devlin 2006).

10

Gambar 5 Pelabelan pada primer, dNTP, dan ddNTP pada metode

Sanger.

Gambar 6 Gambaran metode pengurutan secara umum.

Pemotongan Gen LFY dan pCambia 1303Digest dilakukan menggunakan kit dari

Biolabs. Plasmid yang mengandung promotor gen LFY dipotong menggunakan enzim BamHI dan NotI. Digest dilakukan dengan cara sejumlah 7 µL DNA plasmid digabungkan dengan 8.8 µL dH2O, 0.2 µL BSA, 2 µL buffer 2 (BamHI), 1 µL enzim BamHI dan 1 µL enzim NotI sehingga volum akhir adalah 20 µL. Larutan campuran ini kemudian diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 0.6%. Hasil gel diamati di bawah sinar UV. Fragmen promotor gen LFY yang nampak pada gel kemudian dipotong dan dielusi menggunakan Pure LinkTM Quick Gel Extraction dari Invitrogen. Hasilnya kemudian diamati pada elektroforesis menggunakan gel agarosa 0.6%.

Sedangkan vektor pCambia 1303 dipotong pada situs 35S. Situs ini dipilih karena posisinya yang berada sebelum gen gus.Setelah promotor ini dipotong selanjutnya digantikan oleh promotor gen LFY yang diperoleh dari penelitian ini. Gen gus inilah

yang menjadi penanda keberhasilan ekpresi promotor gen LFY pada vektor ekspresi pCambia 1303.

Ligasi Promotor gen LFY ke pCambia 1303Ligasi dilakukan sesuai prosedur dari

Promega. Sejumlah 1 µL hasil elusi pada tahap sebelumnya dimasukkan ke dalam tabung steril 500 µL. Selanjutnya ditambahkan 5 µL bufer ligase, 3 µL vektor pCambia, dan 1 µL T4 ligase. Volum total yang diperoleh adalah 10 µL. Campuran kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang atau semalaman pada suhu 4oC. Berikutnya hasil ligasi ditransformasi ke sel kompeten (XL-1 Blue). Sel disebarkan diatas medium LB agar yang sebelumnya diberikanamisin 25 ppm dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC.

Pengamatan dilakukan terhadap koloni yang terbentuk. Koloni yang berwarna putih adalah koloni transfoman. Koloni tersebut dikultur dalam media LB yang mengandung kanamisin 25 ppm. Media dikocok pada kecepatan 150 rpm selama semalaman pada suhu 37oC. Isolasi DNA plasmid kembali dilakukan terhadap kultur bakteri yang tumbuh. Prosedur isolasi DNA plasmid sama dengan isolasi DNA plasmid sebelumnya. Hasil isolasi diperiksa kembali pada gel agarosa.

Sifat komplementer hasil restriksi dari enzim restriksi yang sama merupakan hal yang sangat penting dalam proses ligasi ini. Enzim ligase memiliki efisiensi lebih tinggi untuk menempelkan ikatan fosfodiester yang putus pada pasangan ujung lancip daripada ujung tumpul (Turner et al. 2000). Itulah sebabnya dipilih NotI dan BamHI yang memiliki ujung lancip.

Persiapan Transformasi ke Agrobacterium tumefaciens Strain AGLO

Setelah dipastikan hasil pada agarosa sesuai dengan yang diharapkan, tahap selanjutnya adalah digest menggunakan enzim restriksi yang sama. Tujuan langkah ini adalah memastikan promotor gen LFY sudah masuk ke dalam vektor. Tahapan yang dilakukan adalah transformasi DNA rekombinan ke dalam Agrobacterium. Prosedur langkah ini yaitu sejumlah 5-10 μL DNA plasmid dimasukkan ke dalam 500 μL sel kompeten, diamkan di dalam es selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan inkubasi di dalam es, diinkubasi kembali selama 5 menit di dalam N2 cair dan 5 menit pada suhu 37oC. Sejumlah 1 mL YEP (Yeast Exctract Pepton)

11

ditambahkan ke dalamnya dan dikocok selama 3 jam pada suhu 28oC. Larutan kemudiandisentrifugasi pada kecepatan 6000 rpmselama 3 menit.

Sejumlah 200 μL supernatan diresuspensikan dengan pelet yang terbentuk, dipipet, dan dimasukkan ke dalam media LA yang telah diberi antibiotik kanamisin 25 ppmdan rifampisin 50 ppm. Inkubasi dilakukanselama 2 hari pada suhu 28oC dan dalam kondisi gelap. Hasil yang diperoleh ini siap untuk ditransformasikan ke tanaman melalui Agrobacterium tumefaciens.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Desain PrimerLangkah pertama yang dilakukan dalam

percobaan untuk mendapatkan promotor suatu gen adalah desain primer yang sesuai. Primer spesifik didesain berdasarkan sekuen gen LFYyang telah diperoleh pada penelitian sebelumnya. Berbagai primer yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1. Primer pada penelitian ini tidak didesain berpasangan karena nantinya akan dipasangkan dengan Adaptor Primer (AP) dari Genome Walking. Selanjutnya dilakukan langkah amplifikasi sesuai protokol Genome WalkerTM. Setelah hasil sekuen didapatkan dan dikaji, dilakukan kembali desain primer untuk tahap amplifikasi lanjutan atau secondary PCR. Primer spesifik yang berhasil didesain diberi nama R 1 hingga 4. Huruf R mengacu pada istilah reverse, karena primer yang didesain hanya primer reverse (3’ → 5’).

Tabel 1 Berbagai jenis primer yang digunakan

Nama Primer

Urutan basa nukleotida

R1 CCAGTAGTGAAAGCCTCAGGGTCCATTC

R2 TAGACCTTTCACGTACCTGATCCCACGA

R3 AGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCAT

R4 AACAAACCTTCCTGGGAGAGGGCATCA

AP-1 GTAATACGACTCACTATAGGGCAP-2 ACTATAGGGCACGCGTGGT

M13-F GTAAAACGACGGCCAGTM13-R CAGGAAACAGCTATGACCPV F GCTTAAGCGGCCGCTCTCTCTCT

CTCTCTCAAGAPV R TTTACCAGCCCGGGCCGTCGGG

ATCCTTAAGC

Isolasi DNA Daun Kakao(modifikasi Chaidamsari et al. 2005)Isolasi DNA merupakan tahap awal yang

penting dan menentukan keberhasilan dari penelitian. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode Chaidamsari et al. (2005). Hasil dari tahap ini kemudian diuji lebih lanjut sesuai prosedur Genome Walking.

Genome Walking TM (Clontech 2007)

Pengecekan Kemurnian DNA Daun KakaoPenentuan kemurnian DNA daun kakao

hasil isolasi dilakukan dengan dua cara. Pertama, menggunakan spektrofotometer ultra violet. Rasio nilai serapan (A) pada panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm (A260/280) adalah 1.754 dan 1.696 sedangkan nilai A260/230 sebesar 1.896 dan 1.854. Hal ini menunjukkan bahwa DNA sudah cukup murni sesuai dengan Sambrook et al. (1989).

Selanjutnya dilakukan cara kedua menggunakan elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi 0.5%. Hasil uji kualitas DNA dengan elektroforesis menunjukkan adanya smear yang berkisar pada ukuran 2000pb hingga 12000 pb (Gambar 7). Hal ini juga menunjukkan bahwa hasil isolasi belum murni, kemungkinan masih terdapat RNA karena terlihat smear pada ukuran 2000 pb yang merupakan ukuran RNA.

Untuk menghilangkan RNA, dilakukan perlakuan dengan RNase. Hasil elektroforesissetelah diberi RNase adalah Gambar 8 yang menunjukkan pita dengan ukuran 12000 pb. Konsentrasi DNA yang diperoleh dari sampel daun kakao dengan bobot 1 gram berada pada kisaran 1.280 hingga 1.330.

M 1

Gambar 7 Hasil elektroforegram isolasi DNA ;(M) marker, (1)DNA daun kakao.

2000 pb

12000 pb12000 pb

5000 pb

2000 pb1650 pb

1000 pb850 pb650 pb500 pb400 pb300 pb200 pb100 pb

12

M 1Gambar 8 Hasil elektroforegram isolasi DNA kakao setelah perlakuan dengan RNase; (M)adalah marker dan (1) adalah DNA daun kakao.

Pengecekan Kemurnian DNA Menggunakan Enzim Dra I

Selain kedua cara tersebut, pengecekan kemurnian DNA juga dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi Dra I. Hasil elektroforesis menunjukkan DNA daun kakao telah terpotong secara sempurna oleh enzim Dra I. Pemotongan ini menghasilkan smearsangat tipis yang berukuran 500 pb hingga12000 pb (Gambar 9, lajur 1). Sedangkan lajur dua adalah DNA diberi perlakuan yang sama namun tanpa enzim restriksi. Lajur ini merupakan kontrol negatif. Hasilnya adalah DNA terdegradasi namun tidak sempurna. Kontrol positif berupa DNA utuh yang tidak terpotong terlihat pada lajur tiga, yaitu DNA utuh tanpa penambahan enzim restriksi. Hasil ini relatif sama jika dibandingkan denganpenelitian Chaidamsari et al. (2005). Tahapan ini bertujuan untuk memastikan kemampuan enzim restriksi memotong DNA yang diperoleh dengan sempurna.

M 1 2 3

Gambar 9 Hasil elektroforegram digest dengan Dra I; (M) marker,

(1)DNA yang telah dipotong dengan Dra I, (2) DNA tanpa

enzim (kontrol -), (3) DNA 100 ng (kontrol +).

Pemotongan DNA Genomik Daun KakaoDNA genomik yang telah murni kemudian

dipotong dengan empat enzim restriksi yang berbeda yaitu Dra I, EcoR V, Pvu II, dan Stu I yang diberi kode DL 1 hingga 4. Hasil elektroforesis gel agarosa pada Gambar 10menunjukkan pada lajur 1 terbentuk pita yang berukuran 12000 pb yang berarti DNA masih utuh atau belum terpotong. Lajur 2 hingga lajur 5 menunjukkan DNA genomik telah terpotong menjadi empat fragmen dengan panjang yang berbeda. Pemotongan dengan keempat enzim menghasilkan smear yang berukuran antara 500 pb hingga 12000 pb. Tahap ini menghasilkan 4 buah pustaka DNA yang diharapkan di dalam salah satunya atau keempatnya akan terdapat promotor gen LFY.

M 1 2 3 4 5Gambar 10 Hasil elektroforegram digest oleh enzim restriksi; (M) adalah marker,

(1) tanpa enzim, (2) Dra I, (3) EcoR V, (4) Pvu II, dan (5) Stu I.

Purifikasi DNAFragmen DNA yang telah diperoleh

selanjutnya dimurnikan. Hasil elektroforesis gel agarosa 0.5% menunjukkan DNA berukuran sekitar 1000 hingga 3000 pb, hal ini berarti sudah tidak terdapat kontaminan lain atau DNA yang diperoleh sudah murni (Gambar 11).

M 1Gambar 11 Hasil elektroforegram purifikasi

DNA; (M) adalah marker dan (1) adalah hasil purifikasi DNA.

smear yangterbentuk

12000 pb5000 pb2000 pb1650 pb


12000 pb

500 pb

12000 pb

5000 pb

2000 pb1650 pb


12000 pb12000 pb

5000 pb

2000 pb1650 pb


12000 pb

5000 pb

2000 pb1650 pb


13

Kandidat promotor LFY (1650 pb)

Ligasi DNA ke Adaptor Genome WalkingTM

Tahap ini adalah tahap persiapan sebelum memasuki tahap amplifikasi menggunakan PCR. Hasil dari tahap ini adalah menempelnya DNA hasil isolasi ke AP.

Primary dan Secondary PCR Genome Walking TM

Hasil elektroforesis menunjukkan terbentuknya pita dengan ukuran dan konsentrasi yang berbeda-beda. Keterangan (a) hingga (f) pada gambar tersebut menunjukkan pita-pita yang terbentuk. Pita dengan kode (b) pada Gambar 12 merupakan pita yang paling kuat. Konsentrasi tertinggi nampak pada lajur (1) yang merupakan hasil PCR dari fragmen DNA yang dipotong menggunakan enzim Dra I (DL-1). Besarnya konsentrasi sebanding dengan tingkat kejelasan pita yang terbentuk. Uji selanjutnya akan fokus akan ditujukan pada fragmen PCRhasil pemotongan DL-1 (Gambar 12, bagian b). Fragmen ini dipilih karena fragmen DL-1bmemberikan hasil pita paling kuat yang diduga mengandung promotor gen LFY. Hasil primary PCR ini kemudian dilanjutkan dengan secondary PCR yang menggunakan cetakan berupa hasil primary PCR, sedangkan primer yang digunakan adalah R4 dan AP-2.

Program PCR yang digunakan pada tahap ini adalah ‘touchdown PCR’. Amplifikasi dilakukan berulang (nested) hingga didapat ujung awal promotor gen LFY. Untuk penelitian ini didesain 4 primer yang berbeda,yang berarti dilakukan 4 kali amplifikasi untuk mendapat promotor gen LFY yang utuh. Namun ternyata hasil didapatkan sebelum keempat primer digunakan. Oleh karena itutahap amplifikasi dihentikan saat telah diperoleh promotor gen LFY yang utuh. Untuk memastikan, dilakukan pengecekan pada gel agarosa setiap selesai amplifikasi.

Kloning ke Vektor pGEM-T EasyHasil amplifikasi dari fragmen DL-1B

kemudian diklon. Kloning hasil PCR Genome Walking dilakukan ke vektor pGEM-T Easy. Sebelumnya dilakukan elusi gel agarosa menggunakan Pure Link TM Quick Gel Extration dari Invitrogen. Hasil elusi ini kemudian diligasi ke vekor kloning pGEM-TEasy. Ukuran vektor yang relatif kecil, yaitu sekitar 3015 pb (Gambar 13) memungkinkan vektor membawa DNA target dalam jumlah cukup besar dan memudahkan tranformasi plasmid ke sel kompeten. Ilustrasi penempelan promotor dapat dilihat pada Gambar 14.

M 1 2 3 4

Gambar 12 Hasil Genome Walking tahap pertama; (M) marker, (1) fragmen pemotongan oleh DL-1, (2) fragmen pemotongan oleh DL-2, (3) fragmen pemotongan oleh DL-3, (4) fragmen pemotongan oleh DL-4, (a) – (f) pita yang terbentuk (b) pita yang paling terang.

Gambar 13 Peta restriksi vektor pGEM-T Easy.

Gambar 14 Ilustrasi ligasi promotor ke vektor pGEM-T Easy.

(c)(d)

(e)(f)

(b)

(a)12000 pb

5000 pb2000 pb1650 pb

1000 pb850 pb

650 pb500 pb

400 pb

300 pb

200 pb

100 pb

Transformasi ke XLPlasmid yang telah mengandung insert,

atau yang umum disebut DNA rekombinan kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten. Sel kompeten yang digunakan dalam penelitian ini adalah jenis E. coli. Seleksi transforman dilakukan berdasarkan perbedaan warna koloni. Hasil yang diperoleh yaitu terdapat koloni berwarna putih dan biru pada cawan petri (Gambar 15). Koloni yang diinginkan adalah koloni berwarna putih yang diharapkan telah tersisipi oleh DNA rekombinan.

Gambar 15 Hasil koloni yang terbentuk pada media seleksi; (1) koloni sel

transforman yang berwarna putih dan (2) koloni plasmid kosong yang berwarna biru.

PCR Koloni dan Isolasi DNA PRekombinan

PCR koloni menggunakan primer universal M13 forward (17reverse (18 nukleotida) dilakukan terhadap koloni putih. Profil elektroforegram produk PCR koloni dapat dilihat pada Gambar 16Berdasarkan gambar tersebut terlihat pita berukuran 1850 pb. Pita ini menunjukkan adanya vektor pGEM-T Easytersisipi. Hal ini dibuktikan dari terjadinya penambahan ukuran sekitar 200 pb dari fragmen asli promotor yaitu 1650 pb. dari langkah ini adalah untuk memastikakoloni tersebut mengandung plasmid rekombinan. PCR. Koloni yang diyakini mengandung DNA rekombinan selanjutnya diisolasi. Isolasi dilakukan menggunakan High Pure Plasmid Isolation

Pengurutan dan Analisis Basa Nukleotida

Setelah didapat fragmen DNA yang diduga merupakan promotor gen Fragmen ini kemudian ditelusuri urutan DNAnya menggunakan metode Sanger.dari metode ini adalah penggunaan dideoksinukleotida trifosfat (ddNTPs) sebagai terminator rantai DNA.

XL-1 bluePlasmid yang telah mengandung insert,

atau yang umum disebut DNA rekombinan kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten. Sel kompeten yang digunakan dalam penelitian ini adalah XL-1 blue dari

Seleksi transforman dilakukan rbedaan warna koloni. Hasil

yang diperoleh yaitu terdapat koloni berwarna putih dan biru pada cawan petri (Gambar 15). Koloni yang diinginkan adalah koloni berwarna putih yang diharapkan telah tersisipi

Hasil koloni yang terbentuk padamedia seleksi; (1) koloni seltransforman yang berwarna putih

dan (2) koloni plasmid kosong yang berwarna biru.

PCR Koloni dan Isolasi DNA Plasmid Rekombinan

koloni menggunakan primer (17 nukloetida) dan

(18 nukleotida) dilakukan terhadap ofil elektroforegram produk

oni dapat dilihat pada Gambar 16. Berdasarkan gambar tersebut terlihat adanya pita berukuran 1850 pb. Pita ini menunjukkan

Easy yang telah tersisipi. Hal ini dibuktikan dari terjadinya penambahan ukuran sekitar 200 pb dari fragmen asli promotor yaitu 1650 pb. Tujuan

untuk memastikan koloni tersebut mengandung plasmid

Koloni yang diyakini mengandung DNA rekombinan selanjutnya diisolasi. Isolasi dilakukan menggunakan

dari Roche.

dan Analisis Basa Nukleotida

didapat fragmen DNA yang diduga merupakan promotor gen LFY. Fragmen ini kemudian ditelusuri urutan DNA-nya menggunakan metode Sanger. Prinsip dari metode ini adalah penggunaan dideoksinukleotida trifosfat (ddNTPs) sebagai

Gambar 16 Profil elektroforegram produk PCR menggunakan primer

universal M13

Fragmen DNA yang ditelusuri urutan DNA-nya adalah fragmen DNA hasil pemotongan oleh enzim DL-1B. Hal ini sesuai dengan keterangan di atas yang menyatakan bahwa fragmen hasil pemotongan dengan DL1B inilah yang memberikan hasil elektroforesis paling baik.

Hasil pengurutan ini kemudian diolah lebih lanjut. Pengolahan data hasil ini meliputi penemuan kembali urutan basa yang merupakan vektor, AP spesifik, dan primer spesifik. Vektor pGEM-Tdigunakan dalam penelitian ini ditempada basa nomor 1 hingga 58 (warna biru) yang berada pada fragmen DNA (Gambar 17). Hal ini sesuai dengan teori bahwa vektor yang berfungsi sebagai pembawa gen biasanya berada pada awal.

> DL-1B F CGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCAGTAGTGAAAGCCTCAGGGTCCATTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAGAAAAATGGAGTGAACAAAAACAACAAAAAAAAACACTTTCTTTCCTCTTTATGTTTTGTAGGGTTAGTTGGCGAGGGAAGCTGTCGGTTGCTATAAAGACAGGAATTTCGGAATCCCCAAACTACCCTCGCATGACTGGTTTTTTTGCGTTCAACCAAACTTTTGGAACCCAACCAGTAACCAGCGAGGGGCAGTCATTCGGCTTACCCTTCCCTTGCAGTTAATGTTGCATTTCCGTCGGTTTGTAGTGTGACCAATAGGAACTCGACACGTCGTGGAAGCGAAAATGATTAGACCTTTCACGTACCTGATCCCACGAAGGGGTACGGCGGATTTCGGTGATTTAGATGAGGTTTAGGACTTTAATGTGGAATGTTTTGAGCCATCTGATTGGTGATTAGAGAGATCCGTAGGGTAATATTGATGCATCTGAGGAGTGCCAGATACTGTTCCCTTGACTTTTCTTGTTGAGCATGGGTTTTCGTTTTAAATTCCTCTTCTCTAGAAACATTGCTTGTCAAACATTCTCCAGGAGCAATTCAACCTGGTTATTTTTGGGTGGGAAATAAAACATCAGATAAAATCTTGATTCTATTGAGGAAGTTTGCATCTCAATAATGCATCATCATGTAGACAGGAGACTCTCAGGGCTTCNTTCTTCNTTGACTGCCTGGGNGATCTGANCTANGGTCGAATTTTTGANCTGAGCTGCCCATAGCGAAGCCNCTCANATAAGNANANTTCCCCTGAACNATTTACCCATGATTTGANCCCTGGGNTCATTNTGGTGGTCAGCAAAAGNCTACTGTAAACCTTGGGATGTCGGAGNACAATCCACNGGTCNCNATTCGGATCCANATATGCTAGAATAAAGAANTNCCAACGCTNGCGTTNACTCGNTGCTGGGGGGNAACGCTCNGACNTGCANCCCCTNCTCAAAACTTTA

Gambar 17 Data hasil pengurutan fragmen DNA forward.

1

2

± 2000

14

Gambar 16 Profil elektroforegram produkPCR menggunakan primer

Fragmen DNA yang ditelusuri urutan nya adalah fragmen DNA hasil

1B. Hal ini sesuai dengan keterangan di atas yang menyatakan bahwa fragmen hasil pemotongan dengan DL-1B inilah yang memberikan hasil

ini kemudian diolah lebih lanjut. Pengolahan data hasil pengurutan

kembali urutan basa yang merupakan vektor, AP spesifik, dan

T Easy yang digunakan dalam penelitian ini ditemukan pada basa nomor 1 hingga 58 (warna biru) yang berada pada fragmen DNA forward

. Hal ini sesuai dengan teori bahwa vektor yang berfungsi sebagai

sanya berada pada awal.

CGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATCCAGTAGTGAAAGCCT

TCTCTCTCTCTCTCTCAAGAAAAATGGAGTGAACAAAAACAACAAAAAAAAACACTTTCTTTCCTCTTTATGTTTTGTAGGGTTAGTTGGCGAGGGAAGCTGTCGGTTGCTATAAAGACAGGAATTTCGGAATCCCCAAACTACCCTCGCATGACTGGTTTTTTTGCGTTGTTAGGGGGCAACCAAACTTTTGGAACCCAACCAGTAACCAGCGAGGGGCAGTCATTCGGCTTACCCTTCCCTTGCAGTTAATGTTGCATTTCCGTCGGTTTGTAGTGTGACCAATAGGAACTCGACACGTCGTGGAAGCGAAAATGATTAGACCTTTCACGTACCTGATCCCACGAAGGGGTACGGCGGATTTCGGTGATTTAGATGAGGTTTAGGACTTTAATGTGGAATGTTTTG

TAGAGAGATCCGTAGGGTAATATTGATGCATCTGAGGAGTGCCAGATACTGTTCCCTTGACTTTTCTTGTTGAGCATGGGTTTTCGTTTTAAATTCCTCTTCTCTAGAAACATTGCTTGTCAAACATTCTCCAGGAGCAATTCAACCTGGTTATTTTTGGGTGGGAAATAAAACATCAGATAAAATCTTGATTCTATTGAGGAAGTTTGCATCTCAATAATGCATCATCATGTAGACAGGAGACTCTCAGGG

NTTCTTCNTTGACTGCCTGGGNGATCTGANCTANGGTCGAATTTTTGANCTGAGCTGCCCATAGCGAAGCCNCTCANATAAGNANANTTCCCCTGAACNATTTACCCATGATTTGANCCCTGGGNTCATTNTGGTGGTCAGCAAAAGNCTACTGTAAACCTTGGGATGTCGGAGNACAATCCACNGGTCNCNATTCGGATCCANATATGCTAGAATAAAGAANTNCCAACGCTNGCGTTNACTCGNTGCTGGGGGGGTGTATANAACGCTCNGACNTGCANCCCCTNCTCAAAACTTTA

pengurutan fragmen

12000 pb

5000 pb

2000 pb1650 pb1000 pb850 pb650 pb500 pb400 pb300 pb200 pb100 pb

15

Adaptor ditemukan pada fragmen DNA reverse (Gambar 18) untuk memastikan hasil sekuen di atas adalah hasil amplifikasi metode Genome Walking yang menggunakan Adaptor Primer spesifik (warna hijau). Primer spesifik R1 juga ditemukan (warna merah) pada sekuen DNA forward yang menunjukkan bahwa primer yang didesain adalah benar karena cocok dan menempel pada hasil amplifikasi primer R4. Hasil pengurutan kembali menunjukkan bahwa posisi F dan R adalah terbalik. Hal ini diketahui dari penemuan kembali urutan primer R1 pada DL-1B forward yang seharusnya ditemukan pada posisi reverse.

Data hasil pengurutan berupa urutan basa selanjutnya diproses menggunakan programbioedit. Melalui program ini, urutan basa yang diperoleh disejajarkan baik forward maupun reverse. Hasil analisis Softberry menunjukkan bahwa fragmen yang diperoleh merupakan promotor gen LFY (Gambar 19) dan berukuran 1650 pb berdasarkan ilustrasi pada Gambar 20.

>DL-1B R TGACCTATAGAATCTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTAAAGTGAATTAACTTAAGCTAAATGAATTTCATTGTGGTACCTAATACAAGCAGTGTGCGAGAATATGAACAGAGGAAGCCTGATTGCAAAGCATTGGCAAGTGAAACGAGATAAAAAAGAACAGAATGAGAGAAGAATACAGACATGGGGTCTGAGGATTGATCCATGGTTAATGAAATAAGAAGATTATTAATTATGATGAAATGGCAAAAAGGAAGAGATGGAATTTAGACATAACTGAGTTCAATAGGAATGACAGCTTATTGTATTAAATTAACACATACAACAGCCTTGCATCAAGAGCAACTGCAGGAATGCTATAAAAACAGGCAGTAATGCAGGCTTCTGGGGCAATTTCTCCTTTTTAATACTCCTAAGCAAATAATTTGTTGAGAATCACAGAAAATATGACGAAACCAGACTGAGAACTTAGTTACATTCACGAACAATCCACATAGCGTTCTTAACAGCTATGACTTTTTATGCATGAACCAACCAATAAATGACTCACAAGGTGCTACNAAATCAATAGAGTAAAATTAGATTCCAGAGGAAAATCTTACTTAATATGAAGAGGCTTTCGCTTATGAGGCAGCTCANATTCNAAAATTCGAACATTAGTTCANAATCNCCCNNGCCAGTCAAGTGAAAAAGGANCCCTGAAAGTCTCNGTCTTCNTGATGATGCATTTTGAGAGCNACTNCTCCATANATCAGATTTTTTCTGAGNTTTNTTCCCCCCAAATACCNGTTGATTGCNCNGGAANGTTGACANCATGTTCTAAAAAAGATTTAACGANCCCGCCNCANAAGCAGGACGTTCGGCCCCCAAGCCCAATNCNCGATCCCTATCCACAAGGCANATCCTTAGCTACNCNATCCANCCGACCTNGGAGGCGAGCANTTCTCCNGGGTCTGCCNNCCGAGNTNTGGNGACAGNCC

Gambar 18 Data hasil pengurutan fragmen DNA reverse.

Pemotongan Promotor Gen LFY danpCambia 1303

Setelah promotor berhasil diperoleh, dilakukan pemeriksaan ekspresi promotor gen LFY. Pemeriksaan ini dilakukan dengan cara memasukkan fragmen promotor ke dalam vektor ekspresi. Pemotongan vektor ekspresi, yaitu pCambia 1303 dengan enzim NotI dan BamHI menghasilkan pita yang berukuran

sekitar 12000 pb. Pemotongan dilakukan pada daerah 35S promoter (Gambar 21). Hasil purifikasi plasmid tersebut menunjukkan bahwa pada sumur kedua terlihat adanya pita yang cukup tebal dengan ukuran 12000 pb (Gambar 22). Hal ini menggambarkan bahwa plasmid pCambia 1303 hasil digest telah murni didapatkan. Pemotongan vektor ekspresi dan vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama, yaitu NotI yang memiliki situs pemotongan GC↓GGCC↑GC dan BamHI yang memiliki situs pemotongan G↓GATC↑C.

Gambar 19 Hasil pengecekan pada Softberry.

Gambar 20 Ilustrasi posisi hasil terhadap primer dan gen LFY.

Gambar 21 Peta restriksi vektor pCambia 1303.

11881

R1

1650 pb

R2

R4

DL-1B F complement

DL-1B R

1 MGambar 22 Hasil elektroforegram purifikasi

digest PCAMBIA enzim NotI dan

Ligasi Promotor LFY dengan 1303

Hasil ligasi ditransformasikan ke sel kompeten XL-1 blue. Kemudian sel kompeten ditumbuhkan pada media tumbuh. Media tumbuh berupa LB yang diberi antibiotik kanamisin. Pemberian antibiotik ini sesuai dengan gen resisten kanamisin yang ada pada pCambia 1303.

Seleksi dilakukan terhadap koloni berwarna putih. Selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid pCambia 1303. plasmid dilakukan menggunakan Plasmid Isolation Kitpengecekan pada elektroforesis gel agarosa menunjukkan adanya pita yang berukuran sekitar 13650 pb. Ukuran ini merupakan ukuran pCambia 1303 (12000 pb) yang mengandung promotor LFY (1650 pb).

Digest kembali dilakukan terhadap hasil isolasi DNA plasmid. DigestNotI dan BamHI. Hasil digestadanya dua pita yang berukuran sekitar 12000 pb dan 1650 pb. Hal ini membuktikan bahwa plasmid yang diisolasi adalah yang mengandung promotor terlihat pada Gambar 23.

Persiapan Transformasi ke tumefaciens Strain AGLO

Transformasi pCambia 1303 yangmengandung promotor LFY ke

tumefaciens dilakukan dengan menggunakan sel kompeten kimia strain AGLO. Seleksi transforman dilakukan dengan cara menumbuhkannya dalam medium yang mengandung kanamisin dan rifampisin. transforman akan mampu tumbuh dan membentuk koloni sedangkan sel yang bukan transforman tidak akan tumbuh.

12000 pb

Hasil elektroforegram purifikasi PCAMBIA 1303 oleh

dan BamHI.

dengan pCambia

Hasil ligasi ditransformasikan ke sel . Kemudian sel kompeten

ditumbuhkan pada media tumbuh. Media tumbuh berupa LB yang diberi antibiotik kanamisin. Pemberian antibiotik ini sesuai dengan gen resisten kanamisin yang ada pada

Seleksi dilakukan terhadap koloni berwarna putih. Selanjutnya dilakukan isolasi

1303. Isolasi DNA plasmid dilakukan menggunakan High Pure

(Roche). Hasil foresis gel agarosa

menunjukkan adanya pita yang berukuran sekitar 13650 pb. Ukuran ini merupakan

1303 (12000 pb) yang (1650 pb).

kembali dilakukan terhadap hasil Digest ini menggunakan

digest menunjukkan adanya dua pita yang berukuran sekitar 12000 pb dan 1650 pb. Hal ini membuktikan bahwa plasmid yang diisolasi adalah pCambia 1303 yang mengandung promotor LFY seperti yang

ke Agrobacterium

1303 yangke Agrobacterium

dilakukan dengan menggunakan sel kompeten kimia strain

eleksi transforman dilakukan dengan cara menumbuhkannya dalam medium yang mengandung kanamisin dan rifampisin. Sel transforman akan mampu tumbuh dan membentuk koloni sedangkan sel yang bukan transforman tidak akan tumbuh.

1 MGambar 23 Hasil elektroforegram pCambia 1303 rekombinan; (M) adalah marker dan (1) adalah hasil digest oleh NotI BamHI.

Antibiotik yang digunakan adalah kanamisin dan rifampisin karena plasmid pCambia 1303 membawa marka seleksi berupa gen resistensi terhadap antibiotik kanamisin (Gambar 19) sedangkan antibiotik rifampisin digunakan untuk menyortir sel sebelum dimasukkan ke dalam Agrobacterium. Ada beberapa hal yang perlu diingat dalam melakukan transformasiekspresi gen resistensi umumnya tidak langsung terbentuk setelah sel mengalami transformasi. Sel memerlukan waktu untuk menghasilkan enzim dalam jumlah yang cukup untuk menangkal pengaruh antibiotik. Oleh karena itu, setelah proses transformasi sel tidak langsung ditumbuhkan ke dalam medium selektif (mengandung antibiotika) tetapi terlebih dahulu ditumbuhkan dalam medium cair tanpa antibiotik.inkubasi juga dilakukan dalam keadaan gelap, hal ini sesuai dengan kondisi asli Agrobacterium yang hidup di dalam tanah

Selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid dari setiap kultur menggunakan Pure Plasmid Isolation kit. Langkah terakhir adalah pemotongan DNA plasmmenggunakan NotI dan Bammemastikan promotor LFY telah masuk ke dalam Agrobacterium melalui pCambia

SIMPULAN DAN SARAN

SimpulanHasil dari penelitian ini merupakan

dari penelitian lebih lanjut. Promotor telah berhasil diisolasi dari daun kakao menggunakan metode Genome Walking

12000 pb

1650 pb

12000 pb

5000 pb


16

Hasil elektroforegram digest1303 rekombinan; (M)

adalah marker dan (1) adalah tI dan

Antibiotik yang digunakan adalah kanamisin dan rifampisin karena plasmid

membawa marka seleksi berupa gen resistensi terhadap antibiotik kanamisin (Gambar 19) sedangkan antibiotik rifampisin digunakan untuk menyortir sel sebelum dimasukkan ke dalam

da beberapa hal yang perlu melakukan transformasi, yaitu

ekspresi gen resistensi umumnya tidak langsung terbentuk setelah sel mengalami transformasi. Sel memerlukan waktu untuk menghasilkan enzim dalam jumlah yang cukup untuk menangkal pengaruh antibiotik. Oleh karena itu, setelah proses transformasi

tidak langsung ditumbuhkan ke dalam medium selektif (mengandung antibiotika) tetapi terlebih dahulu ditumbuhkan dalam

m cair tanpa antibiotik. Selain itu inkubasi juga dilakukan dalam keadaan gelap,

ini sesuai dengan kondisi asli g hidup di dalam tanah.

Selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid dari setiap kultur menggunakan High

Langkah terakhir pemotongan DNA plasmid

BamHI untuk telah masuk ke pCambia 1303.

SIMPULAN DAN SARAN

merupakan dasar dari penelitian lebih lanjut. Promotor LFY

berhasil diisolasi dari daun kakao Genome WalkingTM.

12000 pb

5000 pb


17

Ukuran promotor LFY yang diperoleh adalah sekitar 1650 pb dan telah berhasil diklon pada vektor ekspresi pCAmbia 1303.

SaranPerlu dilakukan penelitian lanjutan untuk

mengetahui fungsi promotor gen LFY dalam proses pembungaan. Selanjutnya perlu diteliti faktor-faktor apa saja yang mempengaruhi kerja promotor gen LFY tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Berg JM, Tymaczko JL, Stryer L. 2007. Biochemistry. Ed ke-7. New York: WH Freeman.

Blazquez MA, Soowal LN, Lee I, Weigel D. 1997. LEAFY expression and flower initiation in Arabidopsis. Development 124: 3835-3844.

Boyer R. 2006. Concepts in Biochemistry. Ed ke-3. New York: J Wiley.

Brian 2003. Developmental biology. [terhubung berkala]. http://www. mun.ca/biology/desmid/ BIOL3530W2003/DB Ch07/DBNPlant.html [26 Agu 2009].

Campbell MK, Farrell SO. 2006. Biochemistry. Ed ke-5. Belmont: Thomson Brooks/Cole.

Chaidamsari T, Weemen M, Santoso J, de Maagd RA. 2005. Characterization of a cocoa pod all-specific gene, TcLea5, a comparison with its tomato homologue and characterization of its promoter in heterologous systems [thesis]. Wageningen: WUR.

Clontech. 2007. GenomeWalker TM Universal Kit User Manual. California: Clontech.

Coen E, Henrico S, Meyerowitz EM. 1991. The war of the worlds: Genetic interactions controlling flower development. Nature 353: 31-37.

Dean C, Simpson GG. 2002. Recent advances in flowering time control research in Arabidopsis. Science 296: 285-289.

[Deptan] Departemen Pertanian. 2007. Ekspor hortikultura Indonesia: Nilai dan volume ekspor buah-buahan. [terhubung berkala]. http://www.deptan.go.id [12 Juni 2009].

Devlin TM, editor. 2006. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. New York: J Wiley.

Doyle K. 1996. Promega Protocol and Application Guide. Tird Edition. USA: Promega Corporation. hlm 41-54.

Glover DM. 1984. Gene Cloning, The Mechanism of DNA Manipulation. London: Chapman & Hall.

Jack T. 2004. Molecular and genetic mechanisms of floral control. Plant Cell 16: S1- S17.

Irish VF. 1999. Patterning the flower. Developmental Biology 209: 211-220.

Iswanto A, Winarno H, Suhendi D. 1999. Kajian stabilitas hasil dan komponen buah beberapa hibrida. J Warta Puslit Kopi & Kakao 15: 81-90.

Kornberg A. 1961. Enzymatic Synthesis of DNA. New York: J Wiley.

Lehninger AL. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Ed ke-3. Maggy Thenawidjaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Basic of Biochemistry.

McKelvie AD. 1956. Cherelle Wilt of cacao: pod development and its relation to Wilt. J Expp Bot 7: 250-263.

Okayama H, Inoue H, Nojima H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene96: 23-28.

18

Primose DJ, Old RW. 1989. Principles of Genes Manipulation. Ed ke-4. London: Blackwell Scientific.

Promega. 1999. pGEM-Tand pGEM-T Easy Vector System (Technical Manual No. 042). Wisconsin: Promega.

Roche. 2008. High pure plasmid isolation kit. [terhubung berkala]. http://www. roche-appliedscience.com/proddata /gpip/3_6_8_46_1_1.html [03 Jul 2009].

Rogers SO, Bendich AJ. 1994. Extraction of total celluler DNA from plants, algae, and fungi. Plant Mol Biol DI:1-81.

Samanhudi. 2006. Studi pembungaan dan isolasi gen Apetala 1 pada kakao [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

Sardjoko 1991. Bioteknologi: Latar Belakang dan Beberapa Penerapannya. Jakarta: Gramedia.

Sunanto H. 1992. Coklat: Budidaya, Pengolahan Hasil, dan Aspek Ekonomisnya. Yogyakarta: Kanisius.

Taylor BH, Manhart JR, Amasino RM. 1993. Isolation and Characterizations of Plants DNA, Methods in Plant Moleculer Biology and Biotechnology. London: CRC Pr.

Tjiptrosoepomo G. 1988. Taksonomi Tumbuhan (Spermathopyta). Yogyakarta: Gadjah Mada Univ Pr.

Turner et al. 2000. Instant Notes in Molecular Biology. Singapore: Springer-Verlag.

Tzfira T, Citovsky V. 2003. The agrobacterium plant cell interaction. Taking biology lessons from a bug. Plant Physiol. 133: 943-947.

Voet D, Voet JG. 1994. Biochemistry. Edisi ke-2. New York: J Willey.

William DA et al. 2004. Genomic identifiacation of direct target genes of LEAFY. PNAS 101: 1775-1780.

Wood GAR, Lass RA. 1989. Cocoa: Tropical Agriculture Series. Ed ke-4. New York: J Wiley.

19

LAMPIRAN

20

Lampiran 1 Tahap pelaksanaan penelitian

Isolasi DNA

Genome WalkingTM

Kloning ke pGEM-T Easy

Transformasi ke XL-1 blue

PCR koloni & isolasi DNA plasmid

Sekuensing dan analisis

Digest promotor gen LFY ke pCambia 1303

Ligasi promotor genLFY ke pCambia 1303

Persiapan transformasi ke Agrobacterium

tumefaciens

21

Lampiran 2 Pembuatan bufer ekstraksi

2.94 gram Sodium sitrat 0.1 M + 6.3056 gram glukosa 0.35 M

Larutkan dalam 50 mL akuades steril.

Letakkan di pengaduk magnetik

Setelah larut, tambahkan 1 mL

EDTA 0.5 M

Tambahkan 20 mL PVP 2%

Pindahkan ke labu takar 100 mL

Tera dengan akuades steril, homogenkan

Sesaat sebelum digunakan, tambahkan

500 µL ß-merkapto 0.5%

22

Lampiran 3 Pembuatan bufer lisis

23

Lampiran 4 Prosedur elektroforesis gel agarosa (Sambrook et al. 1989)

24

Lampiran 5 Kompisisi mix untuk primary PCR

Komposisi Mix (µL)

1. Buffer 2.5

2. dNTPs 0.5

3. MgCl2 1.0

4. AP-1 1.0

5. Tc LFY GW Rev 4 1.0

6. DNA 1.0

7. Taq 0.2

8. mQ 17.8

Total 25.0

Lampiran 6 Kompisisi mix untuk secondary PCR

Komposisi Mix (µL)

1. Buffer 2.5

2. dNTPs 0.5

3. MgCl2 1.0

4. AP-1 1.0

5. Tc LFY GW Rev 4 1.0

6. DNA 1.0

7. Taq 0.2

8. mQ 17.8

Total 25.0

25

Lampiran 7 Pembuatan Tris EDTA 0.5X pH 8

2 gr NaOH dilarutkan dalam 60 mL Akuades

Tambahkan 18.61 gr EDTA secara bertahap

Ukur pH hingga mencapai 8.0

Tera hingga 100 mL lalu autoklaf

26

Lampiran 8 :Pembuatan TBE 5X

Masukkan 27 gram Tris base dan 13.75 gram

asam borat ke dalam 100 mL akuades

Aduk dengan magnetik stirer hingga larut

Tambahkan 10 mL EDTA 0.5 M pH 8.0

Aduk hingga homogen

Lampiran 9 Pembuatan stok larutan PVP

5 gram serbuk PVP dilarutkan dalam 50 mL

ddH2O

Larutkan dalam waterbath 60 °C

Autoklaf

27

Lampiran 10 Pembuatan stok larutan CTAB

10 gram CTAB dan 4.1 gram NaCl dilarutkan dalam 100 mL ddH2O

Larutkan dalam waterbath 60 °C

Autoklaf

28

Lampiran 11 Sekuen DNA gen LFY dari daun kakao

>Tc LFY

AGTGATAACCACGCATTTTGACCATGAGTTACCGCCAATCCTATTTACAGTGACACTATANAATACTCAATGC

TATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTR3CTCCCATGATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATGCACTACTGATT

ACTATAGGGCACGCGTGGTCGACAGCCCGGGCTGGTAAAACGAAAACCCATGCTCAAACAAGAAAGTTCAA

GGAAACAGTATTTGGCACTCCTCAGATGCATCAATATTACCCTACGATCTCTCTAATCACCAATCAGATGGCT

CAAAACATTCCACATTAAAGTCCTAAACCTCATCTAAATCACCGAAATCCGCCGTACCCCTTCGTGGGATCA

GGTACGTGAAAGGTCR2TAATCATTTTCGCTTCCACGACGTGTCGAGTTCCTATTGGTCACACTACAAACCGAC

GGAAATGCAACATTAACTGCAAGGGAAGGGTAAGCCGAATGACTGTCCCTCGCTGGTTACTGGTTGGGTTCC

AAAAGTTTGGTTGCCCCCTAACAACGCAAAAAAACCAGTCATGCGAGGGTAGTTTGGGGATTCCGAAATTCC

TGTCTTTATAGCAACCGACAGCTTCCCTCGCCAACTAACCCTACAAAACATAAAGAGGAAAGAAAGTGTTTT

TTTTTTGTTGTTTTTGTTCACTCCATTTTTCTTGAGAGAGAGAGAGAGAGAATGGACCCTGAGGCTTTCACTAC

TGGR1GGGCTTCTTCAAGTGGGACCCAAGAGGAGTAGTGGCGCCAACGCCGGCGCGCTTGATGGAGGCTGTG

GCGCCTCCTCAGCCGCAGACGGCTGCTGCGGGTTGCGGCTGCTTACATGGGGAGGGCGCCTAGGGAGCTCGG

AGGGATAGAGGAGTTGTTTCAAGCTTATGGGATCAGATACTACACTGCTGCGAAGATAGCCGAGTTAGGGTT

CACTGTGAGCACCCTTTTAGGCATGAAGGAGGAGGAGTTAGATGAGATGATGAATAGCGTGTCGCAGATATT

CAGGTGGGAGCTGCTAGTGGGTGAGAGGTATGGTATTAAGGCGGCTGTTAGAGCTGAAAGGAGAAGGCTTG

AAGAAGAGGATTCTAGGCGGCGACACCTGGTTTCAGGTGACACCACCAACGCTCTTGATGCCCTCTCCCAGG

AAGGTTTGR4TTTATAAGTTTATAGAGTTATACTAATTAATTTACTTCCTATTACTATTGTGATTGCTCTCGCCT

GACGTAATAGACTCTAGAAATGACTTGTAAAAGGAGTATCATATCCAGTGACAGTTTTTTGTTCTTTTTCTTTC

TTTGGTAATATACATATATGATGTTCATTTTAGGACAGATACTATAACACGTAAATGTTGAGCAGCTGCTTTT

GAGGTCTGAGCTCATTTTCTGTACAAAACCCTGATCGTGATAGTTCTATAAAGTCGGCATGATCTGAATGGGA

AAATTGTTTCGAAGCAAGCTACATAACTTTGCTGGATGGTTTTGACTTTAGATTTTAAAAATTAACGTGTAGC

TCTTTATTTTATCTTGGCTGGTGCAACATTATCTTAACTTCTCGACCAAATAAAAAAATAATAATCTCTTAACT

TCAAATCTTATCCTGAGAGAGGAATCAATATTTTGATGTAGTAAAGTGTATGGAAGTAATATTTCTGTATGTT

TCTTTCTTCTTTCTTGCTGGGGGTGTTGAAAAGAGTGTGATGGACAGGTTTATCAGAGGAGCCAGTGCAGCAA

GAGAAAGAGACGGCAGGGAGCGGTGGAGGGGGCACGTGGCAGGTGGTAGTACCTGGGGGAAGGAAGAAAC

AGCGGCGCAGGAAGGGGCCGAAGAAACGTGGTAGAAGTTGATAATGAAGATAAATTAGAAGGTGCTGAAG

ATGATAAAAATGGTGATATTGGAGGCTACGAGAGACAGAGGGAGCACCCGTTCATTGTCACAGAGCCTGGT

GAGGTAGCACGAGGCAAAAAGAACGGTC

TCGATTACCTCTTCCATCTCTACGAGCAATGCCGGGAGTTCTTGATTCAAGTCCAAAACATTGCCAAGGAGCG

TGGGGAAAAATGCCCCACGAAGGTAACAAAATTAATACCCTTATCATCAAAATATTTGGACGGTTCAGATTT

ATACTATTTTTGTTCTCTTTTATGCAATCAAACGAGAAGAATTAACCGCTTTTAAGAGGTGGTTATTCATTGA

GGCTTTTTTAACCGAACAAGAAAGAAAACTTGGAAATTGATCACAATTGTGCATTTTGCACACTGCATACTGC

ACGAGGCTTGGCTCGTGACTAGCTGTAAAACATGGCTTTGTTAGAATCTTGGAATTGGACCCTCCCAATAAA

GCTACGGGTTCTAGCCAGCTGTTCCACAGAAAATGTGACAAGTCAGGTACGGGAGGGGTGGGGTCTGGGAA

ATGTGGGTCGAAATTTTTGCAGGGTAGGGTCCCTAAAGGGTACTTTGTCTTTCAATAATTTTCTGTCTTTTAGC

CATATTTTCCCTGTCAGAATGGGTTGAGGTGGCATGCCCCCCATGTGACAGCTGCACCATTTTAACGACGTTT

TCAGAACCAAGTCCTTTGCATTTTGGATCCTAGCTTGTCTTGGTTGTACAGCATGCCTATATGCTCCCTCTTCC

TCTCCTGCCCCGAGAAAAAAACTCTCAAGTCTAAACAAAATTCTATTATATGCTGTTGTACTAGCACTAGTCT

TTCACACAATCGTATGTTTGTTTCTTCGTTTAAATATACGGAATAAAGAGAAAGAATCAAATCTTCACGATTT

TCTATATTTGAATCTCATGTAAAAAGGTTGTACTCTACTCCTATTCAGCATAAGGAGAAAAAGATTTTTGGAC

ACATTTTATATGTGGGCAGCATCCAATTTAATGGGGTTGAAAATTTTATACAGGTGACCAATCAAGTTTTCAG

GTATGCTAAGAAGGCTGGGGCAAGCTACATTAACAAACCCAAGATGCGACACTACGTGCATTGCTATGCCCT

GCACTGCCTTGACGAGGAGGCATCGAATGCGCTGAGGAGAGCTTTCAAGGAGAGAGGCGAGAATGTTGGGG

CTTGGAGACAGGCCTGCTACAAGCCTCTTGTGGCCACAGCGGCGCGCCAGGGTTGGGACATTGATGCAATTT

TCAATGCTCATCGCCGTCTTGCTATTTGGTATGTTCCCACCAAGCTCCGTCAACTTTG

29

Lampiran 12 Elektroforegram fragmen DL-1B hasil sekuensing

ISOLASI PROMOTOR GEN LFY PADA TANAMAN Theobroma … · didapatkannya informasi mekanisme terjadinya...

Documents

Transcript of ISOLASI PROMOTOR GEN LFY PADA TANAMAN Theobroma … · didapatkannya informasi mekanisme terjadinya...