ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA...
56
ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA DARI DAUN KETAPANG (Terminalia catappa L.) TERHADAP BAKTERI PATOGEN RESISTEN SITTI INAYYAH ARISTA N111 09 103 PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2013
Transcript of ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA...
ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA DARI DAUN KETAPANG (Terminalia
catappa L.) TERHADAP BAKTERI PATOGEN RESISTEN
SITTI INAYYAH ARISTA N111 09 103
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR
2013
ii
ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA DARI DAUN KETAPANG (Terminalia
catappa L.) TERHADAP BAKTERI PATOGEN RESISTEN
SKRIPSI
untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana
SITTI INAYYAH ARISTA N111 09 103
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR
2013
iii
PERSETUJUAN
ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA DARI DAUN KETAPANG (Terminalia catappa L.) TERHADAP
BAKTERI PATOGEN RESISTEN
SITTI INAYYAH ARISTA
N111 09 103
Disetujui oleh:
Pembimbing Utama Pembimbing Pertama
Dr. Herlina Rante, M.Si, Apt Abd. Rahim, S.Si, M.Si., Apt NIP.19771125 200212 2 003 NIP.19771111 200812 1 001
Pada tanggal, November 2013
iv
PENGESAHAN
ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA DARI DAUN KETAPANG (Terminalia catappa L.) TERHADAP
BAKTERI PATOGEN RESISTEN
Oleh :
SITTI INAYYAH ARISTA N111 09 103
Dipertahankan Dihadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin Pada tanggal : Oktober 2013
Panitia Penguji Skripsi :
1. Drs. Abd. Muzakkir Rewa, M.Si., Apt. (Ketua) : ..........................
2. Dra. Hj. Nursiah Hasyim, CES., Apt. ( Sekretaris ) : ..........................
3. Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt. ( Ex officio ) : ..........................
4. Abdul Rahim, S.Si., M.Si., Apt. ( Ex officio ) : ..........................
5. Prof.Dr.H.Tadjuddin Naid, M.Sc., Apt. ( Anggota) : ..........................
Mengetahui : Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt.
NIP. 19560114 198601 2 001
v
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini adalah karya saya sendiri, tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu
dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Apabila dikemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak
benar, maka skripsi dan gelar yang diperoleh, batal demi hukum.
Makassar, Oktober 2013
Penyusun
Sitti Inayyah Arista
vi
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena
atas nikmat, berkat dan kuasa-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
tugas akhir ini sebagai persyaratan untuk menyelesaikan studi di Fakultas
Farmasi, Universitas Hasanuddin.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini banyak
rintangan dan hambatan yang dihadapi, namun dengan doa dan bantuan
dari berbagai pihak, skripsi ini dapat terselesaikan. Oleh karena itu,
perkenankanlah penulis mengungkapkan rasa terima kasih dan
penghargaan yang tulus kepada ayahanda Drs. H. Tadjuddin Pata, M.Si
dan ibunda tersayang Dra. Hj. Sutrisna Karim yang telah menjadi sumber
semangat dan inspirasi dan telah banyak memberikan pengorbanan baik
moril maupun materil yang tidak akan mampu penulis balas sampai akhir
hayat, serta dukungan doa yang senantiasa dipanjatkan demi kelancaran
studi penulis. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada adik
tercinta Sitti Syuhada Dwi Arista dan Muhammad Rezki Pata, serta
seluruh sanak famili yang selalu memberikan curahan kasih sayang yang
sebesar-besarnya dan tak henti-henti memberikan semangat dan
dukungan.
Tiada kata yang dapat penulis ucapkan selain terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada ibu Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt. selaku
pembimbing utama, dan bapak Abdul Rahim, S.Si., M.Si., Apt. selaku
vii
pembimbing pertama yang telah meluangkan waktu selama ini untuk
memberi petunjuk, membagi ilmu dan menyumbangkan ide-ide dalam
membimbing penulis selama melakukan penelitian hingga terselesainya
skripsi ini.
Pada kesempataan kali ini pula, penulis menyampaikan terima
kasih kepada:
1. Ibu Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin.
2. Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si, Apt. selaku Wakil Dekan I, Prof. Dr. Rer-
nat. Hj. Marianti A. Manggau, Apt. selaku Wakil Dekan II, dan Drs.Abd.
Muzakkir Rewa, M.Si., Apt. selaku Wakil Dekan III.
3. Prof. Dr. Hj. Asnah Marzuki, M.Si, Apt. selaku Pembimbing Akademik
penulis, yang telah membimbing dan memberikan banyak masukan
selama perjalanan studi penulis di Fakultas Farmasi.
4. Drs. Abd. Muzakkir Rewa, M.Si., Apt.; Dra. Hj. Nursiah Hasyim, CES.,
Apt.; dan Prof.Dr.H.Tadjuddin Naid, M.Sc., Apt. selaku penguji penulis
5. Seluruh dosen dan staf Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas
bantuannya dalam penyelesaian skripsi ini
6. Teman-teman Ginkgo 09, khususnya Asmira Azisa Nur, S.Si., Cahyani
Purnasari, Haflah, S.Si., Hijrah Al Kautsar, Iin Fitriana Pakata, S.Si.,
Merliana Mansyur, Oei Sherly Wijoyo, Sallmia, S.Si., Subaedah Bahri
dan Suhariani La Suda, S.Si.
7. Teman seperjuangan dalam penelitian fungi endofit, Siti Hira Wahyuti.
viii
8. Kak Haslia S.Si, selaku Laboran Laboratorium Mikrobiologi Farmasi
Universitas Hasanuddin
9. Semua pihak yang tidak sempat disebutkan namanya atas bantuan
dan kerjasamanya kepada penulis selama penelitian dan menjalani
penelitian.
Penulis menyadari skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Maka
dari itu saran dan kritik membangun sangat penulis harapkan guna
tambahan wawasan agar dalam pelaksanaan penelitian selanjutnya dapat
lebih baik.
Akhirnya semoga karya kecil ini dapat bermanfaat bagi
pengembangan ilmu pengetahuan terutama di bidang farmasi, amin.
Makassar, Oktober 2013
Sitti Inayyah Arista
ix
ABSTRAK
Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk memperoleh isolat fungi endofit dari daun Ketapang (Terminalia catappa L.) dan mengetahui aktivitas antimikroba fungi endofit tersebut terhadap bakteri patogen resisten. Diperoleh 2 isolat fungi endofit yang menunjukkan aktivitas antimikroba yang diberi kode TC1 dan TC2. Isolat murni selanjutnya difermentasi kemudian diekstraksi dengan etil asetat. Hasil pengujian dengan metode difusi agar menunjukkan ekstrak dari fungi endofit TC1 masih dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus yang telah resisten antibiotik hingga konsentrasi 0,625% sebesar 7,81 mm dan Escherichia coli yang telah resisten antibiotik hingga konsentrasi 1,25% sebesar 6,73 mm. Sementara ekstrak dari fungi endofit TC2 masih dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus yang telah resisten antibiotik hingga konsentrasi 1,25% sebesar 10,35 mm dan Escherichia coli yang telah resisten antibiotik hingga konsentrasi 0,625% sebesar 7,63 mm. Ekstrak etil asetat isolat fungi endofit daun ketapang diduga mengandung senyawa golongan terpenoid, dan tannin. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fungi endofit dari daun ketapang memiliki potensi yang cukup baik untuk dikembangkan menjadi sumber baru bahan baku obat.
x
ABSTRACT
The ability of endophytic microbes to produce secondary metabolites according to the host plant is a huge opportunity and reliable to produce secondary metabolites from endophytic microbes isolated from the host plant. The purpose of this study was to obtain endophytic fungi isolated from leaf Ketapang (Terminalia catappa L.) and determine the antimicrobial activity of endophytic fungi against pathogenic resistant bacterial. Two isolates of endophytic fungi obtained which showed antimicrobial activity were coded TC1 and TC2. Pure isolates were fermented and extracted with ethyl acetate. The results of the antimicrobial test with the agar diffusion method showed extracts from endophytic fungi TC1 can inhibit the growth of Staphylococcus aureus that was resistant to the antibiotic from concentration 0.625% with diameter of inhibition zone 7.81 mm and Escherichia coli that were resistant to the antibiotic from concentration 1.25% with diameter of inhibition zone 6.73 mm. While extracts of endophytic fungi TC2 can inhibit the growth of Staphylococcus aureus that was resistant to the antibiotic from concentration 1.25% with diameter of inhibition zone 10.35 mm and Escherichia coli that were resistant to the antibiotic from concentration 0.625% with diameter of inhibition zone 7.63 mm. Ethyl acetate extract of endophytic fungi isolated from leaf Ketapang suspected contains class of terpenoids, and tannins compound. These results indicate that endophytic fungi from leaves ketapang has good potential to be developed into a new source of pharmaceutical raw materials.
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN SAMPUL ............................................................................ i
HALAMAN PENUNJUK ....................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN ................................................................ iii
HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. iv
HALAMAN PERNYATAAN .................................................................. v
UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................... vi
ABSTRAK ........................................................................................... ix
ABSTRACT ......................................................................................... x
DAFTAR ISI ........................................................................................ xi
DAFTAR TABEL ................................................................................. xiii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................. xiv
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... xv
BAB I PENDAHULUAN ....................................................................... 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................. 4
II.1 Uraian Tanaman ....................................................................... 4
II.1.1 Klasifikasi Tumbuhan ............................................................ 4
II.1.2 Morfologi Tumbuhan .............................................................. 4
II.2 Tumbuhan sebagai penghasil metabolit sekunder .................... 6
II.3 Mikroba endofit .......................................................................... 7
II.4 Patogenitas, virulensi dan infeksi .............................................. 8
II.5 Antimikroba ................................................................................ 9
II.6 Mekanisme kerja antimikroba .................................................... 10
II.7 Resistensi antimikroba ............................................................... 12
II.8 Uraian umum uji mikrobiologi .................................................... 14
II.9 Kromatografi lapis tipis ............................................................. 15
II.10 Mikroba Uji ............................................................................... 16
BAB III METODE PENELITIAN .......................................................... 18
xii
III.1 Alat dan bahan yang digunakan ............................................... 18
III.1.1 Alat ....................................................................................... 18
III.1.2 Bahan ................................................................................... 18
III.2. Prosedur penelitian .................................................................. 18
III.2.1 Sterilisasi Alat ...................................................................... 18
III.2.2 Pengambilan dan Pengolahan Sampel ............................... 19
III.2.3 Pembuatan Medium ............................................................ 19
III.2.3.1 Pembuatan Medium Nutrient Agar (NA) ........................ 19
III.2.3.2 Pembuatan Medium Potato Dextrosa Agar (PDA) .......... 19
III.2.3.3 Pembuatan Medium Potato Dextrosa Yeast (PDY) ........ 20
III.2.4 Isolasi dan pemurnian fungi endofit ..................................... 20
III.2.5 Penyiapan mikroba uji ........................................................ 21
III.2.6 Uji aktivitas fungi endofit ..................................................... 21
III.2.7 Fermentasi isolat ................................................................ 21
III.2.8 Ektraksi isolat ...................................................................... 22
III.2.9 Uji aktivitas terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus
aureus .................................................................................. 22
III.2.10 Identifikasi komponen kimia................................................ 22
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 24
IV.1 Hasil isolasi fungi endofit ......................................................... 24
IV.2 Hasil uji antagonis fungi endofit ............................................... 25
IV.3 Fermentasi dan ekstraksi metabolit sekunder fungi endofit ...... 26
IV.4 Karakterisasi senyawa .............................................................. 29
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................... 31
V.1 Kesimpulan .............................................................................. 31
V.2 Saran ....................................................................................... 31
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................ 32
LAMPIRAN ......................................................................................... 35
xiii
DAFTAR TABEL
TABEL Halaman
1. Karakterisasi makroskopik isolat fungi endofit daun
ketapang (Terminalia catappa L.) .......................................... 25
2. Hasil pengujian aktivitas antimikroba ekstrak isolat fungi
endofit dari daun ketapang (Terminalia catappa L.) .............. 28
3. Hasil karakterisasi senyawa ekstrak etil asetat dari fungi
endofit daun ketapang (Terminalia catappa L.) .................... 30
xiv
DAFTAR GAMBAR
GAMBAR Halaman
1. Pertumbuhan fungi endofit pada sampel daun ketapang
setelah hari ke-3 dan air bilasan sebagai kontrol ................. 24
2. Uji antagonis isolat TC1 dan TC2 dari daun ketapang ......... 25
3. Uji aktivitas antimikroba ekstrak etil asetat isolat TC1 daun
ketapang ............................................................................... 28
4. Uji aktivitas antimikroba ekstrak etil asetat isolat TC2 daun
ketapang ................................................................................ 29
5. Foto tanaman Ketapang (Terminalia catappa L.) .................. 36
6. Fermentasi isolat fungi endofit dari daun Ketapang
(Terminalia catappa L.) .......................................................... 36
7. Kromatogram lapis tipis ekstrak etil asetat isolat TC1 daun
Ketapang ............................................................................... 37
8. Kromatogram lapis tipis ekstrak etil asetat isolat TC2 daun
Ketapang ............................................................................... 38
xv
DAFTAR LAMPIRAN
LAMPIRAN Halaman
1. Skema isolasi fungi endofit .................................................... 35
2. Gambar hasil penelitian ........................................................ 36
3. Komposisi reagen ................................................................ 39
4. Bukti Hasil Pemeriksaan Bakteriologi .................................... 40
1
BAB I
PENDAHULUAN
Istilah antibiotik untuk pertama kali digunakan digunakan oleh
Waksman (1945) sebagai nama dari suatu golongan substansi yang
berasal dari bahan biologis yang kerjanya antagonistik terhadap
mikroorganisme. Istilah itu berarti “melawan hidup”. Dengan kata lain
maksud dari antibiotik adalah zat yang dihasilkan oleh organisme
(mikroorganisme) hidup, yang dapat menghambat pertumbuhan
mikroorganisme lain, bahkan dapat memusnahkannya (1).
Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan
tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk
koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Setiap
tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba endofit yang
mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang
diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic
recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit (2).
Di asia tenggara, daun dan kulit pohon Ketapang atau biasa dikenal
sebagai almond India secara luas digunakan sebagai pengobatan
tradisional untuk mengobati dermatosis, hepatosis, sariawan dan infeksi
mulut lainnya, dan penyakit pencernaan pada anak-anak. Rebusan daun
Ketapang digunakan untuk mengobati gangguan pencernaan, bronchitis
dan tuberkolosis (3).
2
Di sisi lain, dalam kedokteran modern, banyak studi farmakologi
pada berbagai ekstrak daun dan kulit batang Ketapang telah dilaporkan
memiliki aktivitas anti kanker (4), antioksidan (5), anti HIV reverse
transcriptase (6), hepatoprotektor (7), antiinflamasi (8), afrodisiaka (9), anti
fungi terhadap Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, dan
Aspergillus fumigates (10), dan antibakteri terhadap Staphylococcus
epidermidis, S. aureus, Bacillus cereus, B. subtilis, dan Pseudomonas
aeruginosa (11).
Komposisi kimia dari tanaman Ketapang terdiri dari tanin
(punicalagin, punicalin, terflavin A dan B, tergallagin, tercatain, chebulagic
acid, geranin, granatin B, corilagin), flavonoid, isovitexin, vitexin,
isoorientin, rutin dan triterpenoid (asam ursolat, 2α, 3β, 23-trihydroxyurs-
12-en-28 oic acid) (12). Tannin, senyawa polifenol yang umum ditemukan
di sebagian besar herbal, memiliki komponen antibakteri (13).
Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit
sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang
sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit
sekunder dari mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya
tersebut (2). Dengan kata lain apabila endofit yang diisolasi dari suatu
tanaman dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman
aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka tidak perlu
mengambil tanaman secara keseluruhan (14).
3
Berdasarkan uraian di atas, timbul permasalahan apakah dapat
dilakukan isolasi fungi endofit dari daun Ketapang (Terminalia catappa L.)
dan apakah fungi endofit tersebut dapat menghasilkan senyawa antibiotik
yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen resisten.
Sehubungan dengan itu maka akan dilakukan penelitian mengenai uji
aktivitas antimikroba dari isolat fungi endofit yang diisolasi dari daun
Ketapang (Terminalia catappa L.) terhadap mikroba uji Escherichia coli,
dan Staphylococcus aureus yang telah resisten antibiotik.
Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk memperoleh isolat
fungi endofit dari daun Ketapang (Terminalia catappa L.) dan mengetahui
aktivitas antimikroba fungi endofit tersebut terhadap bakteri patogen
resisten.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Uraian tanaman
II.1.1 Klasifikasi tumbuhan (15)
Kerajaan : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Bangsa : Myrtales
Suku : Combretaceae
Marga : Terminalia
Jenis : Terminalia catappa L.
II.1.2 Morfologi tumbuhan
Tropical almond (Terminalia catappa L.) adalah pohon besar,
tersebar di seluruh daerah tropis di lingkungan pesisir. Pohon ini toleran
terhadap angin kencang, terpaan garam, dan kadar garam cukup tinggi di
zona akar. Tanaman ini tumbuh terutama di tanah kering, tanah teraerasi,
maupun tanah berpasir. Terdistribusi secara alami pada daerah subtropis
dan tropis di samudera Hindia dan Pasifik dan secara luas tumbuh di
daerah tropis (16).
Tinggi pohon 25-40 m, habitat di iklim maritim subtropis dan tropis
dengan curah hujan tahunan umumnya 1000-3500 mm, ketinggian di
bawah 300-400 m (16).
5
a. Daun
Memiliki bentuk daun obovate, dengan tulang daun menyirip,
panjang daun 8-12 inci, warna daun hijau (17). Ujung daun bulat dan
tumpul, dan meruncing ke arah pangkal. Daun baru tertutupi oleh rambut-
rambut halus berwarna coklat. Daun dewasa kebanyakan licin
(mengkilap), kasar, dan berwarna hijau gelap, berubah menjadi kuning
cerah kemudian menjadi merah gelap sebelum gugur. Tanaman ini
menggugurkan daunnya selama musim kemarau, atau dalam lingkungan
tertentu 2 kali dalam setahun (16).
b. Bunga
Bunga kecil (4-6 mm), berwarna putih atau krem, berbau khas agak
tidak menyenangkan. Tanaman biasanya mulai berbunga dan berbuah
dari usia muda, dalam waktu 2-3 tahun dari penanaman, namun hal ini
tergantung pada lokasi tumbuh dan genotipnya (16).
c. Buah
Biasanya satu sampai lima buah berkembang pada bagian basal
dari spike bunga. Buah sesil, berbentuk pipih di bagian tepinya, berbentuk
ovoid atau ovate, kulit buah halus. Selama pematangan, buah berubah
warna dari hijau menjadi kuning hingga merah terang atau ungu gelap
kemerahan pada saat masak. Ukuran buah bervariasi, misalnya 3,5-7 x 2-
5,5 cm (16).
6
II.2 Tumbuhan sebagai penghasil metabolit sekunder
Proses metabolisme pada tumbuhan akan menghasilkan berbagai
senyawa metabolit yang berupa senyawa organik. Senyawa metabolik
pada umumnya dapat dibedakan menjadi dua kelompok yaitu, metabolit
primer dan metabolit sekunder. Metabolit primer merupakan senyawa-
senyawa utama penyusun tumbuhan (makhluk hidup), senyawa yang
tergolong dalam metabolit primer mencakup polisakarida, protein, lemak
dan asam nukleat. Senyawa metabolit sekunder merupakan senyawa
kimia yang mempunyai kemampuan bioaktifitas yang berfungsi sebagai
mekanisme adaptasi kimia terhadap cekaman lingkungan, pertahanan diri
bagi tanaman dan dapat membunuh insekta, herbivora, dan
mikroorganisme. Senyawa metabolit sekunder meliputi terpenoid, steroid,
kumarin, flavonoid dan alkaloid (18).
Senyawa metabolit pada tumbuhan dapat disimpan pada berbagai
organ tanaman seperti akar, batang, daun, bunga, dan biji. Senyawa
tersebut dapat dilepaskan ke lingkungan dengan cara penguapan eksudat
akar, pencucian, dan hasil dekombinasi organ tumbuhan yang telah mati.
Senyawa metabolit sekunder dapat berpengaruh menghambat
pertumbuhan melalui beberapa mekanisme, misalnya senyawa terpenoid
dapat berikatan dengan molekul protein dan lipid sehingga dapat
memperngaruhi fisiologis protein membran sel dan protein enzim (18).
7
II.3 Mikroba endofit
Mikroba endofit merupakan istilah untuk organisme-organisme baik
jamur maupun bakteri yang hidup dalam jaringan tanaman dan tidak
bersifat patogenik. Endofit merupakan organisme yang hidup selama satu
periode siklus hidup dalam jaringan tanaman, tidak termasuk
mokroorganisme yang hidup di permukaan tanaman, organisme yang
menyebabkan penyakit pada tanaman, mikrozoa maupun rhizobium (18).
Bakteri endofit telah diketahui mampu memacu pertumbuhan
tanaman, sebagai pengendali biologi yang bersifat antagonis langsung
atau dengan cara menambah ketahanan sistematis tanaman terhadap
serangan patogen. Pada umumnya bakteri endofit mengendalikan
patogen dengan cara kolonisasi; bersifat antagonis secara langsung
melalui senyawa-senyawa metabolit; dan dengan cara memacu atau
meningkatkan ketahanan sistematik tanaman inangnya. Cara pertama
biasanya dilakukan oleh bakteri endofit yang berada dalam jaringan
pembuluh. Bakteri tersebut bersifat antagonis terhadap patogen pembuluh
seperti Verticillium, Fusarium, atau Ralstonia. Sedangkan cara kedua dan
ketiga biasanya dilakukan oleh bakteri endofit untuk mengendalikan
patogen yang menyerang melalui jaringan korteks pada akar (18).
Model interaksi mikroba endofit dengan tanaman inangnya antara
lain:
a. Tanaman inang menyediakan nutrisi bagi mikroba endofit yang
hidup di dalamnya.
8
b. Tanaman inang menyediakan substrat dan zat yang penting bagi
mikroba endofit untuk menyelesaikan siklus hidupnya, untuk
tumbuh, serta untuk pertahanan diri.
c. Mikroba endofit khususnya jamur berperan melalui proses
biodegradasi tanaman inangnya setelah tanaman inang mati.
Proses biodegenerasi ini memiliki peran sentral di dalam siklus
nutrisi.
d. Ditinjau dari kajian biologi molekuler, interaksi antara mikroba
dengan tanaman inangnya melibatkan transfer materi genetik. Hal
tersebut berdasarkan fakta bahwa zat-zat bioaktif langka yangg
dihasilkan oleh tanaman tertentu, dihasilkan pula oleh mikroba-
mikroba endofit yang hidup di dalamnya (18).
II. 4 Patogenitas, Virulensi dan Infeksi
Kemampuan suatu mikroorganisme untuk menimbulkan penyakit
disebut daya patogen, apabila mikroorganisme menyerang inang yaitu
apabila mikroorganisme memasuki jaringan tubuh dan berkembang biak
dan melakukan kolonisasi, maka terjadilah infeksi.
Respon inang terhadap infeksi adalah terganggunya fungsi tubuh
dan inilah yang disebut penyakit. Jadi patogen adalah mikroorganisme
atau makroorganisme mana saja yang mampu menyebabkan penyakit.
Kemampuan suatu mikroorganisme patogenik untuk menyebabkan infeksi
(patogenitasnya) dipengaruhi tidak hanya oleh sifat-sifat mikroorganisme
9
itu sendiri, tetapi juga oleh kemampuan inang untuk menahan infeksi.
Namun derajat kemampuan suatu mikroorganisme infeksi inilah yang
disebut virulensi, jadi pengertian virulensi mengacu pada jangkauan daya
patogen tersebut. Jadi dalam arti yang terbatas, virulensi merupakan
ukuran daya pathogen suatu mikroorganisme, namun banyak orang sering
menggunakan arti keduanya bergantian (19).
II. 5 Antimikroba
Antimikroba adalah bahan-bahan atau obat-obat yang digunakan
untuk memberantas infeksi mikroba pada manusia (19). Istilah antibiotik
untuk pertama kali digunakan digunakan oleh Waksman (1945) sebagai
nama dari suatu golongan substansi yang berasal dari bahan biologis
yang kerjanya antagonistik terhadap mikroorganisme. Istilah itu berarti
“melawan hidup”. Dengan kata lain maksud dari antibiotik adalah zat yang
dihasilkan oleh organisme (mikroorganisme) hidup, yang dapat
menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain, bahkan dapat
memusnahkannya (1).
Antimikroba dapat bersifat:
1. Bakteriostatika, yaitu zat atau bahan yang dapat menghambat atau
menghentikan pertumbuhan mikroorganisme (bakteri). Dalam
keadaan seperti ini jumlah mikroorganisme menjadi stasioner, tidak
dapat lagi multiplikasi dan berkembang biak.
10
2. Bakteriosida, zat atau bahan yang dapat membunuh
mikroorganisme (bakteri). Dalam hal ini jumlah mikroorganisme
(bakteri) akan berkurang atau bahkan habis, tidak dapat lagi
melakukan multiplikasi atau berkembang biak (19).
II.6 Mekanisme Kerja Antimikroba
Antimikroba mempunyai mekanisme kerja sebagai berikut:
1. Penginaktifan enzim tertentu
Penginaktifan enzim tertentu adalah mekanisme umum dari
senyawa antiseptika dan desinfektansia, seperti turunan aldehida,
amida, karbanilida, etilen-oksida, halogen, senyawa-senyawa
merkuri dan senyawa ammonium kuarterner.
2. Denaturasi Protein
Turunan alkohol, halogen, dan halogenator, senyawa merkuri,
per-oksida, turunan fenol dan senyawa ammonium kuarterner
bekerja sebagai antiseptika dan desinfektan dengan cara
denaturasi dan konyugasi protein sel bakteri.
3. Mengubah permeabilitas membrane sitoplasma bakteri
Cara ini adalah model kerja dari turunan amin dan guanidine,
turunan fenol dan senyawa ammonium kuarterner. Dengan
mengubah permeabilitas membrane sitoplasma bakteri, senyawa-
senyawa tersebut dapat menyebabkan bocornya konstituen sel
yang essensial, sehingga bakteri mengalami kematian.
11
4. Intekalasi ke dalam DNA
Beberapa zat warna seperti turunan trifenilmetan dan turunan
akridin, bekerja sebagai antibakteri dengan mengikat secara kuat
asam nukleat, menghambat sintesis DNA dan menyebabkan
perubahan kerangka mutasi pada sintesis protein.
5. Pembentukan khelat
Beberapa turunan fenol, seperti heksaklorofen dan
oksikuinolin dapat membentuk khelat dengan Fe dan Cu, kemudian
bentuk khelat tersebut masuk ke dalam sel bakteri. Kadar yang
tinggi dari ion-ion logam dalam sel menyebabkan gangguan fungsi
enzim-enzim, sehingga mikkroorganisme mengalami kematian.
6. Bersifat sebagai antimetabolit
Antimikroba bekerja memblok tahap metabolik spesifik
mikroba, seperti trimetoprim dan sulfonamid , yang memblokir
enzim penting dari metabolisme folat.
7. Penghambatan terhadap sintesa dinding sel
Antimikroba golongan ini dapat menghambat sintesis atau
menghambat aktivitas enzim yang dapat merusak dinding sel
mikroorganisme. Yang termasuk kelompok ini antara lain: penisilin,
sefalosporin, vankomisin, sikloserin, basitrasin.
12
8. Penghambatan fungsi permeabilitas membran sel
Antimikroba bekerja secara langsung pada membran sel yang
mempengaruhi permeabilitas dan menyebabkan keluarnya
senyawa intraseluler mikroorganisme.
9. Penghambatan sintesis protein
Antimikroba mempengaruhi fungsi ribosom pada
mikroorganisme yang menyebabkan sintesa protein terhambat.
10. Penghambatan asam nukleat
Agen yang mempengaruhi metabolisme asam nukleat bakteri,
seperti para rifamycins ( misalnya , rifampisin dan rifabutin ) , yang
menghambat polimerase RNA , dan kuinolon , yang menghambat
topoisomerase (19, 20).
II.7 Resistensi Antimikroba
Resisten adalah ketahanan suatu mikroorganisme terhadap suatu
antimikroba tertentu. Penyebab terjadinya resistensi mikkroorganisme
adalah penggunaan antimikroba yang tidak tepat, misalnya penggunaan
dengan dosis yang tidak memadai, pemakaian yang tidak teratur atau
tidak kontinyu, demikian juga waktu pengobatan yang tidak cukup lama,
sehingga untuk mencegah atau memperlambat terjadinya resisten
tersebut, maka cara pemakaian antibiotika perlu diperhatikan (19).
13
Suatu mikroorganisme dapat resisten terhadap suatu obat dengan
salah satu atau lebih mekanisme dibawah ini:
1. Memproduksi enzim yang melumpuhkan
Diantara enzim ini termasuk beta-laktamase (penisilase) yang
menghidrolisa penisilin dan enzim transferase yang melumpuhkan
aminoglikosida.
2. Perubahan struktur reseptor atau molekul target
Dalam hal ini termasuk perubahan komponen ribosom yang
diperlukan dalam infeksi seperti eritromisin dan aminoglikosida
3. Perubahan permeabilitas obat
Tetrasiklin mampu mengakumulasi mikroorganisme yang
dapat dipengaruhi, tetapi tidak dapat untuk mikroorganisme yang
resisten.
4. Mengubah jalur metabolik membentuk jalan pintas metabolik
alternatif
Hal ini dapat timbul pada bakteri yang resisten terhadap
sulfonamide, dan fungi yang resisten terhadap flusitosin.
5. Mengubah jumlah respon obat
Beberapa mikroorganisme menjadi resisten terhadap
trimetoprim dengan mensintesis sejumlah besar enzim dehidrofolat
reduktase yang merupakan tujuan dari kerja obat.
14
6. Menurunkan afinitas reseptor terhadap obat
Resistensi terhadap aminoglikosida mungkin berhubungan
dengan hilangnya atau adanya perubahan protein spesifik pada
ribosom 30S bakteri (19).
II.8 Uraian Umum Uji Mikrobiologi
1. Metode Difusi
Metode difusi termasuk teknik agar-overlay seperti disk, strip,
sumur (lubang) dan silinder. Uji difusi disk adalah salah satu metode yang
paling umum digunakan uji kerentanan antimikroba. Di Amerika Serikat ini
adalah metode resmi untuk deteksi kualitatif penghambatan zat kimia
dalam susu. Filter kecil kertas disk (sekitar 1 cm diameter) diresapi
dengan sejumlah zat standar antibakteri ditempatkan ke plate agar yang
telah diinokulasi sebelumnya untuk metode ini. Piring dibalik dan
diinkubasi. Kadang-kadang, sebelum inkubasi, piring dengan disk yang
tersisa pada suhu mendekati 00C selama beberapa jam untuk
memungkinkan difusi. Waktu inkubasi bervariasi dari sekitar 48 jam.
Diameter zona penghambatan pertumbuhan bakteri adalah ukuran
kerentanan. Metode Difusi biasanya digunakan untuk zat murni (21).
2. Metode Dilusi
Metode dilusi terutama digunakan untuk menentukan konsentrasi
hambat minimum (KHM) dari zat murni dan ekstrak. Sampel harus
homogen terdispersi dalam air. Hal ini biasanya dicampur dalam berbagai
15
pengenceran dengan media diinokulasi. Setelah inkubasi, sifat
penghambatan sampel dapat diperkirakan dengan perbandingan
turbidimetri atau visual dengan biakan kontrol. Dalam uji tabung berbagai
konsentrasi analit dicampur dalam serangkaian tabung dengan suspensi
bakteri. Jumlah terkecil menyebabkan penghambatan pertumbuhan
bakteri, media tetap jernih, memberikan nilai MIC. Dalam pengenceran
agar dengan berbagai konsentrasi zat antibakteri yang dicampur dengan
ntien agar. plat agar diinokulasi dan diinkubasi. Konsentrasi terendah dari
antibiotik menunjukkan tidak ada pertumbuhan dibaca sebagai nilai MIC.
Uji microdilution kaldu dilakukan dalam piring microtitre. Setelah inkubasi
pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan adanya putih "pellet" di bagian
dasar sumur (21).
II.9 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi adalah suatu metode analisis yang terdiri dari fase
gerak dan fase diam. Fase gerak akan melewati fase diam sehingga
campuran zat dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya.
Meskipun dasar kromatografi adalah suatu proses pemisahan namun juga
digunakan untuk analisis kuantitatif. Jenis-jenis kromatografi yang
bermanfaat untuk analisis kualitatif dan analisis kuantitatif adalah
kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), kromatorafi kolom,
kromatografi gas, dan kromatografi cair kinerja tinggi (22, 23).
16
Prinsip KLT adalah pemisahan komponen kimia berdasarkan
prinsip adsorpsi dan partisi. Pada pemisahannya fase gerak akan
membawa komponen campuran sepanjang fase diam pada pelat
sehingga terbentuk kromatogram (22).
II.10 Mikroba Uji
II.10.1 Eschericia coli
a. Klasifikasi
Divisi : Procaryota
Kelas : Gammaproteobacteria
Bangsa : Enterobacteriaes
Suku : Enterobacteriaceae
Marga : Escherichia
Jenis : Escherichia coli
b. Sifat dan Morfologi
Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang
lurus, 1,1-1,5 µm x 2,0-6,0 µm, motil dengan flagelum peritrikus atau non
motil. Tumbuh dengan mudah pada medium nutrien sederhana. Laktose
difermentasi oleh sebagian besar galur dengan produksi asam dan gas
(24, 25).
17
II.10.2 Staphylococcus aureus
a. Klasifikasi
Kerajaan : Protophyta
Kelas : Bacilli
Bangsa : Bacillales
Suku : Staphylococcaceae
Marga : Staphylococcus
Jenis : Staphylococcus aureus
b. Sifat dan Morfologi
Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif , sel-sel
berbentuk bola, berdiameter 0,5-1,5 µm, terdapat tunggal dan
berpasangan, dan secara khas membelah diri lebih dari satu bidang
sehingga membentuk gerombol yang tidak teratur. Dinding sel
mengandung dua komponen utama ; peptidoglikan dan asam teikoat.
Metabolisme secara respiratif dan fermentatif. Tumbuh lebih cepat dan
lebih banyak dalam keadaan aerob. Suhu optimum 35-40oC. Terutama
berasosiasi dengan kulit, dan selaput lendir hewan berdarah panas.
Kisaran inangnya luas, dan banyak galur merupakan patogen potensial
(24, 25).
18
BAB IIII
METODE PENELITIAN
III.1 Alat dan Bahan yang Digunakan
III.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu alat-alat gelas, alat
sentrifuge (model DKC-1006T), autoklaf (All American Model 25x-2),
cawan petri, enkas, Inkubator (WTB Binder), Jangka sorong, Laminar Air
Flow (Envirco), lemari pendingin (Panasonic), mikropipet (Nesco), oven
(Fisher), shaker (Gemmy orbit model VRN-480).
III.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
aluminium foil, aquades, etanol 70%, etil asetat, kertas timbang, larutan
NaOCl 5,25%, media NA , media NB , media PDA, media PDY, mikroba
uji (Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang telah resisten
antibiotik), paper disc, dan sampel daun Ketapang (Terminalia catappa L.)
III.2 Prosedur penelitian
III.2.1 Sterilisasi alat
Alat-alat yang terbuat dari gelas direndam dan dicuci hingga bersih
dengan menggunakan detergen. Cawan petri dan alat-alat gelas lainnya
dibungkus dengan kertas dan disterilkan dalam oven pada suhu 180°C
selama 2 jam. Adapun alat-alat gelas yang berskala dan tidak tahan
19
terhadap pemanasan dan yang terbuat dari plastik disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. Ose
disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen.
III.2.2 Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Sampel yang digunakan berupa daun Ketapang (Terminalia
catappa L.) diperoleh dari kampus Universitas Hasanuddin, jalan Perintis
Kemerdekaan Km. 10, Kelurahan Tamalanrea Jaya, Kecamatan
Tamalanrea, Kota Makassar. Sampel daun Ketapang (Terminalia catappa
L.) dibersihkan dari kotoran-kotoran yang melekat dengan menggunakan
air yang mengalir dan dipotong kecil dengan ukuran + 2 cm2. Lalu sampel
dikeringkan di atas cawan petri
III.2.3 Pembuatan Medium
III.2.3.1 Pembuatan Medium Nutrient Agar (NA)
Media Nutrient Agar ditimbang sebanyak 23 gram dan dilarutkan
dalam 1 L air suling lalu didihkan sampai larut sempurna. Selanjutnya
media yang sudah jadi disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC
dengan tekanan 2 atm selama 15 menit (26).
III.2.3.2 Pembuatan Medium Potato Dextrosa Agar (PDA)
Media Potato Dextrosa Agar ditimbang sebanyak 39 gram dan
dilarutkan dalam 1 L air suling lalu didihkan sampai melarut sempurna.
20
Selanjutnya media yang sudah jadi disterilkan dalam autoklaf pada suhu
121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 menit (26).
IIII.2.3.3 Pembuatan Potato Dekstrosa Yeast (PDY)
Media PDB ditimbang sebanyak 26,5 gram dan media ekstrak
yeast ditimbang sebanyak 4 gram kemudian dilarutkan hingga 1 L dengan
air suling dan dipanaskan. Selanjutnya media yang sudah jadi disterilkan
dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (26).
III.2.4 Isolasi dan Pemurnian Fungi Endofit Penghasil Antimikroba
Sampel yang telah dicuci dengan air mengalir kemudian
dimasukkan dalam erlenmeyer 250 ml, tambahkan etanol 70% sampai
terendam. Kocok pelan dan lakukan perendaman selama 2 menit. Buang
etanol 70%, lanjutkan perendaman dengan larutan natrium hipoklorit
(NaClO) 5,25% selama 2 menit. Bilas dengan akuades steril sebanyak 3
kali, masing-masing selama 1 menit. Lakukan sterilisasi dengan
erlenmeyer steril secara aseptis di dalam enkas. Tiriskan bahan-bahan
tersebut dalam cawan petri steril. Potong potong dengan pisau skalpel
steril menjadi ukuran + 1 cm2. Tempelkan bagian-bagian tersebut dalam
media PDA di dalam cawan petri steril dan diinkubasi pada suhu kamar
(25oC) selama 3 hari. Sebagai kontrol, inokulasikan air bilasan terakhir
pada media PDA. Setelah 3 hari terjadi pertumbuhan fungi, diisolasi untuk
mendapatkan biakan murni. Biakan murni fungi endofit ditumbuhkan pada
media PDA dalam cawan petri.
21
III.2.5 Penyiapan mikroba uji
Mikroba uji yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bakteri
Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang telah resisten antibiotik.
Stok bakteri dan jamur yang berasal dari stok kultur koleksi Laboratorium
Mikrobiologi Farmasi Universitas Hasanuddin diremajakan dalam media
NB serta diinkubasi pada suhu 37C selama 1 x 24 jam.
III.2.6 Uji Aktivitas Fungi Endofit
Identifikasi awal dari daun Ketapang yang menghasilkan senyawa
antimikroba dilakukan dengan cara uji hayati sebagai berikut: semua isolat
daun Ketapang ditumbuhkan ke dalam media PDA, kemudian cakram
yang mengandung isolat fungi endofit daun Ketapang ditempatkan pada
permukaan media NA yang telah berisi mikroba uji. Selanjutnya diinkubasi
selama 1 hari pada suhu 37oC. Masing-masing isolat diamati
kemampuannya menghambat pertumbuhan bakteri uji yang ditandai
dengan terbentuknya zona jernih di sekitar cakram uji.
III.2.7 Fermentasi Isolat
Isolat aktif dibuat prekultur pada labu erlenmeyer 500 mL yang
mengandung 100 mL media cair PDY dan diinkubasi pada suhu 25° C
selama 3 hari. Prekultur (starter) dipindahkan ke dalam erlenmeyer 500
mL yang mengandung 100 mL media yang sama. Fermentasi dilakukan
selama 12 hari pada suhu kamar.
22
III.2.8 Ekstraksi Isolat
Setelah dilakukan fermentasi hingga hari ke-12, media
pertumbuhan mikroba disaring untuk memisahkan biomassa dan cairan
fermentasi. Cairan fermentasi diekstraksi 2 kali dengan pelarut etil asetat
(1:1 v/v) dalam corong pisah selama 20 menit. Ekstrak yang diperoleh
diuapkan lalu disimpan pada desikator untuk digunakan pada uji
selanjutnya.
III.2.9 Uji aktivitas terhadap Escherichia coli, dan Staphylococcus
aureus.
Dimasukkan 20 µl dispersi mikroba uji ke dalam botol steril, lalu
ditambahkan 20 ml media NA, dihomogenkan dan dituang di cawan petri,
dibiarkan hingga memadat. Sebanyak 20 µL ekstrak dimasukkan ke dalam
kertas cakram (diameter 6 mm). Setelah semua pelarut menguap
selanjutnya kertas cakram diletakkan pada permukaan media.
Diinkubasikan selama 1 hari pada suhu 37 oC, lalu diamati dan diukur
zona hambatan yang terbentuk.
III.2.10 Identifikasi Komponen Kimia
1. Lieberman-Burchard
Pereaksi Lieberman-Burchard disemprotkan pada kromatogram lalu
dipanaskan. Setelah dipanaskan menunjukkan senyawa terpen jika
23
noda yang tampak berwarna merah, dan jika noda berwarna hijau-biru
atau ungu menunjukkan senyawa steroid.
2. Feri klorida
Pereaksi FeCl3 disemprotkan pada kromatogram menunjukkan
senyawa tannin jika noda yang tampak berwarna biru-hitam atau hijau-
biru, dan jika noda berwarna hijau-hitam menunjukkan senyawa
fenolik.
3. Aluminium klorida
Pereaksi AlCl3 disemprotkan pada kromatogram menunjukkan
senyawa flavanoid jika noda yang tampak berwarna kuning pucat.
4. Asam sitroborat
Pereaksi Asam sitroborat disemprotkan pada kromatogram
menunjukkan senyawa flavanoid jika noda yang tampak kuning pendar
pada UV 366 nm.
24
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil Isolasi Fungi Endofit
Pada penelitian ini dilakukan isolasi fungi endofit dari daun
ketapang (Terminalia catappa L.) sebagai penghasil senyawa antimikroba.
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, peneliti berhasil
menemukan beberapa fungi endofit dari daun ketapang yang ditumbuhkan
pada medium Potato Dekstrosa Agar (PDA), fungi endofit dari daun
ketapang dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1. Pertumbuhan fungi endofit pada sampel daun ketapang setelah hari ke-3 dan air bilasan sebagai kontrol Keterangan: a) fungi endofit, b) implan daun ketapang
Isolat fungi endofit yang dihasilkan dari daun Ketapang setelah
dilakukan pemurnian, berdasarkan bentuk dan warna koloni yang tampak
secara makroskopik diperoleh 2 macam isolat fungi endofit yang diberi
kode TC1 dan TC2. Isolat yang diperoleh berbeda berdasarkan ciri
a
b
25
makroskopik yang teramati meliputi warna, permukaan, dan bentuk koloni
(tabel 1).
Tabel 1. Karakterisasi makroskopik isolat fungi endofit daun ketapang (Terminalia catappa L.)
Sampel / kode isolat
Pengamatan Makroskopik
TC1 Warna koloni putih berbintik merah, miselium menyebar teratur, pertumbuhan koloni datar, halus, melebar
TC2 Warna koloni putih berbintik merah dan hitam, miselium tebal menyebar teratur, pertumbuhan koloni datar, melebar
IV.2 Hasil Uji Antagonis Fungi Endofit
Isolat fungi endofit dari daun Ketapang yang diperoleh selanjutnya
diuji antagonis terhadap mikroba uji, yaitu Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli yang telah resisten antibiotik. Uji antagonis adalah untuk
melihat aktifitas langsung terhadap organisme uji dan menyeleksi isolat-
isolat yang memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri. Hasil positif
ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitaran isolat. Isolat TC1
dan TC2 dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus
aureus, dan Eschericia coli yang telah resisten terhadap antibiotik.
Gambar 2.Uji Antagonis Isolat TC1 dan TC2 dari daun Ketapang TC1
TC2 TC1 TC2
TC1
26
IV.3 Fermentasi dan ekstraksi metabolit sekunder fungi endofit
Isolat yang aktif terhadap mikroba uji (TC1 dan TC2) kemudian
diproduksi senyawa antimikroba menggunakan metode fermentasi dengan
medium PDY (Potato Dekstrosa Broth dan Ekstrak Yeast). Sebelum
fermentasi terlebih dahulu dibuat starter pada medium PDY (Potato
Dekstrosa Broth dan Ekstrak Yeast) selama 3X24 jam pada suhu kamar,
setelah itu dilakukan fermentasi pada medium PDY selama 12 hari pada
suhu kamar. Pada penelitian-penelitian yang telah dilakukan sebelumnya,
waktu fermentasi bervariasi antara 7 hingga 18 hari, dan diperkirakan
produksi senyawa metabolit sekunder dari fungi endofit terjadi antara hari
ke-11 dan hari ke-12 (27,28,29).
Sistem fermentasi yang digunakan adalah sistem batch. Sistem ini
adalah sistem yang paling sederhana dan sering digunakan di
laboratorium untuk mendapatkan produk sel atau metabolitnya.
Fermentasi sistem batch adalah sistem tertutup, artinya semua nutrisi
yang dibutuhkan mikroba selama pertumbuhan dan pembentukan produk
berada di dalam satu fermentor. Jadi tidak ada penambahan bahan atau
pengambilan hasil selama fermentasi berlangsung. Keuntungan sistem ini
adalah mudah, sederhana, dan kecil kemungkinan adanya kontaminasi
(30).
Hasil fermentasi kemudian dipisahkan supernatan dan
biomassanya. Tetapi sebelumnya dilakukan proses sonikasi yang
bertujuan untuk memecah sel sehingga senyawa metabolit berdifusi ke
27
pelarut. Cairan supernatan kemudian diekstraksi 2 kali dengan pelarut etil
asetat (1:1 v/v) dalam corong pisah selama 20 menit. Pelarut etil asetat
yang bersifat semipolar digunakan dengan maksud untuk mendapatkan
komponen yang bersifat polar sekaligus nonpolar selain itu yang akan
diekstraksi adalah air yang bersifat polar sehingga digunakan pelarut yang
tidak bercampur dengan air (31). Ekstrak yang diperoleh diuapkan lalu
disimpan pada desikator. Ekstrak yang diperoleh yaitu sebanyak 120 mg
dari isolat TC1 dan sebanyak 140 mg dari isolat TC2.
Ekstrak yang diperoleh diuji aktivitas antimikroba terhadap mikroba
uji dengan metode difusi agar sebanyak 20 µL dengan menggunakan
paper disk. Metode difusi agar memiliki beberapa kelebihan yaitu
sederhana untuk dilakukan dan dapat digunakan untuk melihat sensitivitas
berbagai jenis mikroba terhadap antimikroba pada konsentrasi tertentu
(31). Ekstrak dibuat variasi konsentrasi sebanyak 5%, 2,5%, 1,25%, dan
0,625%.
Hasil pengujian ekstrak isolat TC1 pada bakteri uji menunjukkan
kemampuan menghambat dengan diameter hambatan 10,5 mm, 9,28 mm,
dan 6,73 mm pada Eschericia coli. Sementara pada Staphylococcus
aureus diameter hambatannya sebesar 18,68 mm, 11,73 mm, 8,86 mm,
dan 7,81 mm. Hasil pengujian ekstrak isolat TC2 pada bakteri uji
menunjukkan kemampuan menghambat dengan diameter hambatan
17,58 mm, 11,53 mm, 8,95 mm, dan 7,63 mm pada Eschericia coli.
28
Sementara pada Staphylococcus aureus diameter hambatannya sebesar
18,25 mm, 13,9 mm, dan 10,35 mm (tabel 2).
Tabel 2. Hasil pengujian aktivitas antimikroba ekstrak isolat fungi endofit dari daun ketapang (Terminalia catappa L.)
Ekstrak Diameter hambatan (mm)
Staphylococcus aureus Eschericia coli
TC1 5% 18,68 10,5
2,5% 11,73 9,28
1,25% 8,86 6,73
0,625% 7,81 0
Etil asetat 0 0
TC2 5% 18,25 17,58
2,5% 13,9 11,53
1,25% 10,35 8,95
0,625% 0 7,63
Etil asetat 0 0
A B
Gambar 3.Uji aktivitas antimikroba ekstrak etil asetat isolat TC1 daun Ketapang Keterangan : A = Ekstrak Isolat TC1 dan pelarut etil asetat terhadap bakteri Eschericia coli B = Ekstrak Isolat TC1 dan pelarut etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus aureus 1 = ekstrak 5% 2 = ekstrak 2,5% 3 = ekstrak 1,25% 4 = ekstrak 0,625% 5 = pelarut etil asetat
29
A B
Gambar 4.Uji aktivitas antimikroba ekstrak etil asetat isolat TC 2 daun Ketapang Keterangan : A = Ekstrak Isolat TC2 dan pelarut etil asetat terhadap bakteri Eschericia coli B = Ekstrak Isolat TC2 dan pelarut etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus aureus 1 = ekstrak 5% 2 = ekstrak 2,5% 3 = ekstrak 1,25% 4 = ekstrak 0,625% 5 = pelarut etil asetat
IV.4 Karakterisasi senyawa
Karakterisasi senyawa dilakukan untuk mengetahui golongan
senyawa yang terkandung dalam ekstrak etil asetat dari isolat fungi endofit
daun Ketapang (Terminalia catappa L.). Karakterisasi senyawa dilakukan
dengan menggunakan lempeng KLT yang telah dielusi lalu disemprot
dengan pereaksi identifikasi.
Pereaksi Lieberman-Burchard menunjukkan adanya kandungan
senyawa terpenoid apabila setelah dipanaskan terlihat noda berwarna
merah. Pereaksi FeCl3 menunjukkan kandungan senyawa tannin dengan
noda berwarna biru hitam atau hijau biru. Pereaksi AlCl3 menunjukkan
senyawa flavonoid dengan noda berwarna kuning pucat. Pereaksi asam
30
sitroborat menunjukkan adanya senyawa flavonoid dengan adanya noda
berwarna kuning pucat yang berpendar pada UV 366 nm.
Tabel 3. Hasil karakterisasi senyawa ekstrak etil asetat dari fungi endofit daun ketapang (Terminalia catappa L.)
Berdasarkan hasil yang diperoleh, diduga ekstrak etil asetat dari
kedua isolat fungi endofit daun ketapang mengandung senyawa terpenoid,
dan tannin (tabel 3).
Pereaksi Ekstrak etil asetat Golongan senyawa
Lieberman-Burchard Merah Terpenoid
FeCl3 Biru hitam Tannin
AlCl3 - -
Asam sitroborat - -
31
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
V.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat
disimpulkan:
1. Hasil isolasi fungi endofit dari daun ketapang (Terminalia catappa
L.) diperoleh 2 isolat fungi dengan kode TC1 dan TC2 yang
menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Eschericia
coli, dan Staphylococcus aureus yang telah resisten antibiotik.
2. Ekstrak etil asetat dari isolat TC1 masih dapat menghambat
pertumbuhan Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang
telah resisten antibiotik hingga pada konsentrasi masing-masing
1,25% dan 0,625%. Sedangkan ekstrak etil asetat dari isolat TC2
masih dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus yang telah resisten antibiotik hingga pada
konsentrasi 0,625% dan 1,25%.
3. Hasil identifikasi golongan senyawa dengan KLT menunjukkan
bahwa ekstrak etil asetat dari isolat fungi endofit daun ketapang
diduga mengandung senyawa golongan terpenoid, dan tannin.
V.2 Saran
Perlu dilakukan karakterisasi isolat fungi endofit TC1 dan TC2, dan
isolasi senyawa bioaktifnya.
32
DAFTAR PUSTAKA
1. Irianto, K. 2007. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung: Yrama Widya. Hal. 91
2. Radji, M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam
Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian, II (3): 118 3. Nantarika, C., Nongnut, A. 2008. The in vitro Antibacterial Activity and
Ornamental Fish Toxicity of the Water Extract of Indian Almond Leaves (Terminalia catappa Linn.). KKU Vet J, 18(1): 36-45.
4. Zhai, Y.F., Yao, J., Fan, Y.M., Xu, L.Z., Gao, J., Zhao, X.N. 2001. Inhibitory effects of LR-98 on proliferation of hepatocarcinoma cells. J Nanjing Univ (Natural Sciences), 37(2): 213-217.
5. Masuda, T., Yonemori, Y., Oyama, Y., Takeda, T., Tanaka, T. 1999.
Evaluation of the antioxidant activity of environmental plants: activity of the leaf extracts from seashore plants. J Agric Food Chem, 47: 1749-1754.
6. Tan, G.T., Pezzulo, J.M., Kinghom, A.D., Hughes, S.H. 1991.
Evaluation of natural products as inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcriptase. J Nat Products, 54: 143-154.
7. Jing, G., Huan, D., Xin-Hui, T., Li-Zhi, X., Yi-Mei, F., Xiao-Ning, Z.
2004. Inhibitory Effect of TCCE on CCl4-induced Overexpression of IL-6 in Acute Liver Injury. ACTA, 36(11): 767-772.
8. Fan, Y.M., Xu, L.Z., Gao, J., Wang, Y., Tang, X.H., Zhao, X.N., et al.
2004. Phytochemical and anti-inflammatory studies on Terminalia catappa. Fitoterapia, 75(3-4): 253-260.
9. Ratnasooriya, W.D., Dharmansiri, M.G. 2000. Effects of Terminalia
catappa seeds on sexual behavior and fertility of male rats. Asian j. androl, 2(3): 213-219.
10. Goun, E., Cunningham, G., Chu, D., Nguyen, C., Miles, D. 2003. Antibacterial and antifungal activity of Indonesian ethnomedical plants. Fitoterapia, 74(6): 592-596.
11. Kloucek, P., Polesny, Z., Svobodova, B., Vlkova, E., Kokoska, L. 2005.
Antibacterial Screening of some Peruvian Medicinal Plants used in Calleria District. J Ethnopharmacol, 99(2): 309-312.
33
12. Ahmed, S.M., Swamy, V., Dhanapal, P.G.R., Chandrashekara, V.M. 2005. Anti-Diabetic Activity of Terminalia catappa Linn. Leaf Extracts in Alloxan-Induced Diabetic Rats. Iranian J Pharmacol & Therapeutics, 4(1): 36-39.
13. Chung, K.T., Lu, Z., Chou, M.W. 1998. Mechanism of Inhibition of Tannic Acid and Related Compounds on the Growth of Intestinal Bacteria. Food and Chemical Toxicology, 36(12): 1053-1060.
14. Agustina. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit Penghasil
Antimikroba dari Rumput Laut (Eucheuma cottonii) Asal Kabupaten Bantaeng Sulawesi Selatan. Skripsi. Makassar: Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin. Hal. 3-4
15. Jones, S.B., Luchsinger, A.E. 1987. Plant systematics (2nd ed). New York: McGraw-Hill Companies, Inc.
16. Thomson Lex A.J., Evans, B. 2006. Terminalia catappa (tropical
almond). Species Profiles for Pacific Island Agroforestry, 2(2): 2-4
17. Gilman, E.F., Watson, D.G. 1994. Terminalia catappa Tropical Almond. Fact Sheet ST-626: 2
18. Fatiqin, A. 2009. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Endofit dari Daun dan Kulit Pulai (Alstonia scholaris) sebagai penghasil Senyawa Antibakteri terhadap Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Skripsi. Malang: Universitas Islam Negeri.
19. Djide, N., Sartini. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi Farmasi. Makassar:
Lembaga Penerbitan Unhas. Hal. 328, 339-342, 367-370 20. Brunton, L.L. 2006. Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis
of Therapeutics 11th Ed. New York: McGraw-Hill.
21. Choma, I. 2005. The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct Bioautography for Antimicrobial Analysis. LCGC Europe, (Online), Vol. 18, Issue 9, (http://www.chromatographyonline.com/lcgc/Features/The-Use-of-Thin-Layer-Chromatography-with-Direct-B/ArticleStandard/Article/detail/177453, diakses 5 November 2012).
22. Deinstrop, E.H. 2007. Applied Thin-Layer Chromatography. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Hal. 1-3
23. Yazid, E. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Yogyakarta : Penerbit Andi. Hal. 193, 209
34
24. Pelczar, Jr. M. J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Diterjemahkan oleh: Ratna Siri Hadioetomo, dkk. Jakarta: UI-Press. Hal. 949, 954
25. Holt, J. G. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Baltimore: The Williams & Wilkins Company.
26. Phyllis, E. (Ed.). Dicfo Manual (11th ed). Sparks, Maryland: Difco
Laboratories, Division of Becton Dickinson and company. 27. Huang, Y., Wang, J., Li, G., Zheng, Z., Su, W. 2001. Antitumor and
Antifungal Activities in Endophytic Fungi Isolated from Pharmaceutical Plants Taxus mairei, Cephalataxus fortunei, and Torreya grandis. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 31: 163-167
28. Liu, C., Liu, T., Yuan, F., Gu, Y. 2010. Isolating Endophytic Fungi from Evergreen Plants and Determining their Antifungal Activities. African Journal of Microbiology Research, 4(21): 2243-2248
29. Prihatiningtias, W., Widyastuti, S.M., Wahyuono, S. Aktivitas Antibakteri Fungi Endofit Thievalia polygonoperda, Isolat dari Tumbuhan Akar Kuning (Fibraurea chloroleuca Miers). Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada. Hal. 1-7
30. McNeil, B, Harvey, L.M. 2008. Practical Fermentation Technology. England: John Wiley & Son Ltd. Hal. 70-90
31. Mawaddah, R. 2008. Kajian Hasil Riset Potensi Antimikroba Alami dan Aplikasinya Dalam Bahan Pangan Di Pusat Informasi Teknologi Pertanian Fateta IPB. Skripsi. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian IPB. Hal. 1-114.
35
LAMPIRAN
LAMPIRAN 1. SKEMA ISOLASI FUNGI ENDOFIT
Sampel Terminalia catappa L.
- Dicuci dengan air mengalir, dipotong-potong
- Direndam dalam etanol 70% 1 menit, Na hipoklorit 5,3% 1 menit dan dibilas dengan air steril.
- Dipotong-potong kecil hingga ukuran + 1cm
Pembuatan Medium PDA
- Bahan ditimbang sesuai perhitungan
- Bahan dilarutkan dan dicukupkan
- Medium dipanaskan lalu disterilkan di autoklaf
Medium PDA
Diinkubasi 3 hari suhu 25C
Isolat fungi endofit
Isolat Aktif
Uji aktivitas antimikroba
Medium starter inkubasi
3x24 jam
Fermentasi
Disentrifuse
Ekstraksi dengan Etil asetat
Massa Sel Supernatan
Sampel Terminalia catappa L.
Ekstrak Etil asetat
Ekstrak aktif
Uji aktivitas antimikroba
metode difusi agar
Karakterisasi ekstrak
Hasil
36
LAMPIRAN 2. GAMBAR HASIL PENELITIAN
a b
Gambar 5. Foto tanaman Ketapang (Terminalia catappa L.)
Ket: a) foto pohon Ketapang (Terminalia catappa L.); b) daun Ketapang (Terminalia
catappa L.)
a b
Gambar 6. Fermentasi isolat fungi endofit dari daun Ketapang (Terminalia
catappa L.)
Ket: a) fermentasi isolat TC1 dari daun Ketapang, b) fermentasi isolat TC2 dari daun
Ketapang
37
1 2 3 4 5 6 7
Gambar 7. Kromatogram lapis tipis ekstrak etil asetat isolat TC1 daun ketapang Fase diam : Silika gel GF-254 Fase gerak : kloroform : etil asetat (4:2) 1. UV 254 nm 2. UV 366 nm 3. Pereaksi H2SO4 4. Pereaksi AlCl3 5. Pereaksi Lieberman-Burchard 6. Pereaksi FeCl3 7. Pereaksi Asam Sitroborat
38
1 2 3 4 5 6 7
Gambar 8. Kromatogram lapis tipis ekstrak etil asetat isolat TC2 daun ketapang Fase diam : Silika gel GF-254 Fase gerak : kloroform : etil asetat (4:2)
1. UV 254 nm 2. UV 366 nm 3. Pereaksi H2SO4 4. Pereaksi AlCl3 5. Pereaksi Lieberman-Burchard 6. Pereaksi FeCl3
7. Pereaksi Asam Sitroborat
39
LAMPIRAN 3. KOMPOSISI REAGEN
1. Asam Sulfat
Asam sulfat pekat : 10 mL
Air : 100 mL
2. Lieberman-Burchard
Asam asetat anhidrat : 1 mL
Asam sulfat pekat : 1 mL
Metanol : 10 mL
3. Feri Klorida
FeCl3 : 1 g
Air : 100 mL
4. Aluminium Klorida
FeCl3 : 1 g
Metanol : 100 mL
5. Asam Sitroborat
Asam borat : 0,5 g
Asam sitrat : 0,5 g
Etanol : 50 mL
40
LAMPIRAN 4. BUKTI HASIL PEMERIKSAAN BAKTERIOLOGI
41
