Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA 60 l EDTA 50 mM 40 l larutan sukrosa 25% 21 l EDTA 0,5 M pH 8 1,5 l lisozim 10 mg/mL 18 l NaCl 5 M, 22,5 l SDS 20%, 1,5 l proteinase-K 5 mg/mL Etanol dingin 30 l buffer TE

Bahan-bahan yang digunakan untuk PCR Ekstrak DNA, PCR mix (100 mm Tris-hcl, ph 8,3, 1,5 mm MgCl , 50 mm KCl, 0,1% gelatin), Deoksinukleotida trifosfat (dntp) yaitu datp, dgtp, dttp, dctp, Enzim Taq DNA polymerase, Dua jenis primer (primer forward dan revers)

Bahan-bahan untuk elektroforesis Gel agarosa 1,5% yang mengandung 0,5 mg/L Ethidium bromide, Buffer elektroforesis tris acetic acid-edta (242 g tris base, 57 ml acetic acid, dan 100 ml dari 0,5 mol/l edta, ph 8,0) (Morin et al. 2004)

Alat-alat yang digunakan adalah sebagai berikut: Alat-alat gelas ( beaker glass, gelas ukur, pipet tetes) Mikropipet dan pasangan tip-nya Tube Botol sampel, Kotak es (cool box), Inkubator, Safety cabinet, Vortex shaker, Shaker incubator, Tabung eppendorf dan raknya, Sentrifugasi, Sarung tangan dispossibel, Mikropipet, Thermocycler machine, Freezer -20 c, Lemari pendingin 4c, Mesin elektroforesis, UV transilluminator

Sampel sebanyak 1,5 mL disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 40 menit,Selanjutnya disuspensikan kembali pelet yang didapat dengan 60 l EDTA 50 mM, dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 15 menit.40 l larutan sukrosa 25% dan 10,5 l EDTA 0,5 M pH 8 ditambahkan pada pelet yang diperoleh, lalu ditambahkan dengan 1,5 l lisozim 10 mg/mL dan diinkubasi pada suhu 37C selama 1 jam.Ditambahkan 18 l NaCl 5 M, 10,5 l EDTA 0,5 M, 22,5 l SDS 20%, dan 1,5 l proteinase-K 5 mg/mL dan divortex.Sediaan kemudian diinkubasi pada suhu 50C selama 1 jam dan ditambahkan kloroform (1:1) lalu dikocok perlahan selama 20 menit.Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 30 menit.Supernatan dipindahkan (larutan yang terlihat bening) ke tabung baru yang berisi 2x volume etanol dinginSelanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit dan kemudian ditambahka pelet dengan 30 l buffer TE.

Proses Kerja Isolasi DNA

Amplifikasi DNA dengan PCR (Morin et al. 2004)

Membuat campuran reaksi untuk PCR*

Menyiapkan vial yang telah diisi masing-masing 2,5 L sampel DNA.Masing-masing tabung diisi campuran reaksi PCR sebanyak 22,5 L.

Melakukan amplifikasi dengan menggunakan mesin PCR (Thermocycler machine) sebanyak 40 siklus (setiap siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 94 C selama 1 menit, annealing pada suhu 57 C selama 1 menit 15 detik, dan ekstensi pada suhu 72 C selama 30 detik.)

Deteksi produk PCR/ Elektroforesis (Morin et al. 2004)

Masing-masing 5 l produk amplifikasi dicampur dengan 2 l larutan loading.

Setelah tercampur dengan baik, masing-masing dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa 1,5% yang terendam dalam tanki yang berisi buffer Tris acetid acid-EDTA.

Keterangan:(*) = Setiap tabung PCR mengandung 16,9 L air steril, 2 L 10 mM deoxynucleotide triphosphate mixture (dNTP mix), 1 L 50 mM MgCl, 2,5 L 10X amplifikasi buffer, 0,5 L 10 M forward primer dan 0,5 L 10 M reverse primer, 0,1 L (0,25 U/L) Taq DNA polymerase dan air steril ditambahkan sampai volume akhir 22,5 L.

Memasukkan juga marker ke dalam sumur gel agarosa untuk mengetahui ukuran DNA produk PCR,

Mengelektroforesis selama 1 jam dengan tegangan konstan 75 volt.Setelah 1 jam, elektroforesis dihentikan dan gel diangkat untuk diamati di bawah sinar Ultra Violet (UV). Hasil yang diperoleh berupa pola pita DNA (band DNA) yang menunjukkan jumlah dan pola yang berbeda.

Data Pengamatan

Tabel 1. Data Pengamatan hasil PCR E.coli pada sampel susu murniNo.Kode sampelHasil PCR (+/-)Keterangan (terdeteksi/tidak terdeteksi)

1.

2.

3.

Gambar 1. Hasil PCR Deteksi E.coli pada sampel susu

Referensi:Febby Ester Fany Kandou. 2009. Analisis molekuler escherichia coli serotype o157:h7 pada air minum dalam kemasan dan isi ulang menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) DENGAN rfbE SEBAGAI GEN TARGET. Chem. Prog, 2:1, 8-14Morin, N.J., Gong, Z. and Xing-Fang, L. 2004. Reverse Transcription-Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Escherichia coli O157:H7, Vibrio cholerae O1, and Salmonella Typhi. Clinical Chemistry, 50:11, 2037-2044.