ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENAMBAT NITROGEN

DAN PENGHASIL INDOLE-3-ACETIC ACID ASAL SAMPEL

TANAH DARI JAMBI INDONESIA

ISMI ISTI’ANAH

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Seleksi

Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel

Tanah dari Jambi Indonesia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi

pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2014

Ismi Isti’anah

NIM G34100036

ABSTRAK

ISMI ISTI’ANAH. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil

Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia. Dibimbing oleh

NISA RACHMANIA MUBARIK dan ARIS TJAHJOLEKSONO.

Mikrob yang terdapat di dalam tanah memainkan peranan penting dalam

produktivitas tanaman, terutama dalam proses penambatan nitrogen bebas di

alam dan menghasilkan substansi zat pemacu tumbuh seperti Indole-3-Acetic Acid

(IAA) eksogen. Kedua ciri tersebut diperlukan untuk memacu pertumbuhan

tanaman. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat

nitrogen dan penghasil IAA asal sampel tanah di Taman Nasional Bukit Dua

Belas (TNBD) Jambi. Isolasi dilakukan pada 17 sampel tanah yang diambil dari

daerah rhizosfer tanaman kelapa sawit. Media yang digunakan untuk isolasi ialah

media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB). Isolat yang dipilih

merupakan isolat yang dapat membentuk pelikel berwarna putih pada permukaan

media semisolid tersebut dan mampu mengubah warna media dari hijau menjadi

biru karena terjadi peningkatan pH. Isolasi menghasilkan sepuluh isolat terpilih

yang kemudian diidentifikasi morfologinya. Identifikasi morfologi koloni dan sel

menghasilkan lima isolat. Isolat yang menunjukkan pertumbuhan yang baik yaitu

isolat A13.1 yang diidentifikasi sebagai Pseudomonas luteola dengan

menggunakan KIT API 20 NE. Isolat A13.1 menghasilkan IAA eksogen tertinggi

pada waktu inkubasi hari ke-5 di media NfB. Konsentrasi IAA yang terukur

sebesar 33,88 ppm.

Kata kunci: IAA (Indole-3-Acetic Acid), mikrob, nitrogen, Nitrogen Free

Bromthymol Blue (NfB), rhizosfer

ABSTRACT

ISMI ISTI’ANAH. Isolation and Selection of Nitrogen-Fixing and Producing

Indole-3-Acetic Acid Bacteria from Soil Samples of Jambi Indonesia. Supervised

by NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TJAHJOLEKSONO.

Soil microbes plays an important role in crop productivity, especially in the

process of nitrogen fixation in free nature and produces growth promoting

hormone substances such as Indole-3-Acetic Acid (IAA) exogenous. Both of these

character are needed to promote of plant growth. This study aimed to isolate and

select nitrogen-fixing and producing IAA bacteria from soil samples in Taman

Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi. Isolation was performed in 17 soil

samples taken from the area of oil palm plant rhizosphere. The medium used for

the isolation of semisolid medium is Nitrogen Free Bromthymol Blue (NFB).

Isolates were selected to form an isolated white pellicle on the surface of the

semisolid media and the media is able to change color from green to blue due to

increase of pH. Isolation produced ten selected isolates were then identified its

morphology. Identification of colony morphology and cell produces five selected

isolates. Isolate A13.1 showed the best growth and identified as Pseudomonas

luteola using KIT API 20 NE. The.isolate produced maximum exogenous IAA at

5 days incubation at medium NfB. The amount of IAA was 33.88 ppm.

Keywords: IAA (Indole-3-Acetic Acid), microbes, nitrogen, Nitrogen Free

Bromthymol Blue (NfB), rhizosfer

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biologi

ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENAMBAT NITROGEN

DAN PENGHASIL INDOLE-3-ACETIC ACID ASAL SAMPEL

TANAH DARI JAMBI INDONESIA

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

Judul Skripsi : Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil

Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia Nama : Ismi Isti’anah

NIM : G34100036

Disetujui oleh

Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi

Pembimbing I

Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA

Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir Iman Rusmana, MSi

Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Alhamdulillahirabbil’alamiin. Puji syukur kehadirat Allah SWT atas

limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga saya dapat menyelesaikan karya

ilmiah yang berjudul Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil

Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia. Terhitung dari

bulan Oktober 2013-Juni 2014 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen

Biologi IPB. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi

dan Bapak Dr. Aris Tjahjoleksono, DEA selaku pembimbing yang telah memberikan

pengarahan dan dukungan materi selama penelitian dan penyusunan skripsi. Ucapan

terima kasih disampaikan pula kepada Ibu Dra Hilda Akmal, M.Si selaku penguji,

atas saran dan diskusi yang diberikan. Tak lupa juga penulis ucapkan terima kasih

kepada Mba Eja, Kak Asril, Syifa, Suri, Rastya, Yuli, Ledy, Della, Yunita,

Sumayyah, Olip, Mita, Nisa, Epi, teman-teman asrama serta teman-teman

Laboratorium Mikrobiologi IPB yang tidak dapat disebutkan satu-persatu.

Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta, terutama

kedua orang tua (Ibu & Bapak), kakak-kakak (Mas Anifuddin, Mas Sofian, Mas

Iwan), kakak ipar (Mba Ika, Mba Mardha, Mba Ayu), dan keponakan-keponakan

(Yahya, Balqis, Sakhia, Salwa, Syahma, Arkaan) yang senantiasa memberikan

doa, dukungan, dan limpahan kasih sayang. Tak lupa penulis ucapkan terima

kasih kepada teman-teman Biologi 47 atas kerjasama, dukungan, dan

semangatnya.

Semoga karya ilmiah ini dapat menambah wawasan dan pengetahuan bagi

kita semua.

Bogor, Agustus 2014

Ismi Isti’anah

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL ix

DAFTAR GAMBAR ix

DAFTAR LAMPIRAN ix

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2

METODE 2

Waktu dan Tempat 2

Prosedur Penelitian 2

HASIL 3

Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas 3

Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA 5

Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas 6

PEMBAHASAN 7

SIMPULAN DAN SARAN 9

Simpulan 9

Saran 9

DAFTAR PUSTAKA 10

LAMPIRAN 12

RIWAYAT HIDUP 14

DAFTAR TABEL

1 Hasil seleksi bakteri penambat nitrogen bebas pada media Congo Red Agar (CRA) 4

2 Hasil pertumbuhan lima isolat bakteri terpilih pada media NfB 5 3 Hasil uji biokimia/fisiologi isolat A13.1 7

DAFTAR GAMBAR

1 Warna media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB) sebelum

dan setelah dilakukan isolasi 4

2 Isolat A13.1 pada media seleksi CRA dan hasil pewarnaan Gram 5

3 Pertumbuhan isolat A13.1 dan produksi IAA yang dihasilkannya 6

DAFTAR LAMPIRAN

1 Sampel tanah asal perkebunan kelapa sawit kawasan Hutan Taman

Nasional Bukit Dua Belas Jambi yang berhasil diseleksi pada media

CRA 12

2 Nilai absorbansi dan nilai log sel selama 7 hari inkubasi 12

3 Nilai absorbansi (OD 520 nm) isolat A13.1 dalam analisis IAA 12

4 Produksi IAA (ppm) selama 7 hari inkubasi 13

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Nitrogen merupakan kebutuhan pokok bagi seluruh organisme sebab

unsur nitrogen diperlukan dalam sintesis molekul-molekul protein yang

kompleks dan berpengaruh terhadap pertumbuhan dan reproduksi organisme.

Oleh karena itu, nitrogen juga merupakan unsur hara yang penting bagi tanaman

karena merupakan salah satu unsur pupuk yang diperlukan dalam jumlah paling

banyak, sehingga bila kekurangan atau jumlah unsur tersebut tidak cukup maka

tanaman tidak dapat tumbuh dengan normal (Sanchez 1993). Penggunaan pupuk

kimia yang berlebihan dapat menyebabkan terjadinya penurunan kualitas di

lahan pertanian (Las et al. 2006). Salah satu solusi yang dapat diterapkan, yakni

dengan menggunakan pupuk hayati.

Indole-3-acetic acid (IAA) yang dikenal dengan nama hormon auksin

berfungsi mengendalikan beberapa mekanisme fisiologi tumbuhan, seperti proses

pembelahan sel dan diferensiasi jaringan tumbuhan. Hormon auksin yang

dihasilkan oleh tumbuhan disebut IAA endogen, sedangkan IAA eksogen

merupakan hormon yang dihasilkan oleh organisme selain tumbuhan (Haq dan

Dahot 2007). IAA eksogen yang dihasilkan oleh jenis mikrob tertentu merupakan

salah satu faktor untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman (Alexander 1977).

Mikrob yang terdapat di dalam tanah memainkan peranan penting dalam

produktivitas tanaman, terutama dalam proses penambatan nitrogen bebas di

alam dan sintesis zat pemacu tumbuh seperti IAA (Tilak et al. 2005). Beberapa

bakteri yang diketahui mampu menambat nitrogen dan mensintesis Indole-3-

acetic acid (IAA) yaitu Azotobacter, Azospirillum, dan Pseudomonas. Produksi

IAA antarspesies sangat bervariasi serta dipengaruhi oleh kondisi lingkungan,

tingkat pertumbuhan, dan ketersediaan substrat seperti asam amino

(Frankenberger dan Arshad 1995).

Aplikasi bakteri penambat nitrogen bebas dan penghasil IAA belum

dilakukan secara maksimal padahal Indonesia merupakan negara

megabiodiversitas dengan keanekaragaman hayati yang melimpah di seluruh

wilayahnya. Kendala yang masih muncul yaitu masih kurang tersedianya biakan

mikrob unggul. Oleh karena itu, diperlukan upaya bioprospeksi agar dapat

melindungi serta memberdayakan sumberdaya genetik dan hayati yang ada

(Riyadi 2008). Salah satu contoh upaya bioprospeksi yang dapat dilakukan ialah

mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat nitrogen yang hidup bebas dan

penghasil IAA asal Taman Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi. TNBD

Jambi merupakan salah satu daerah yang mengalami deforestasi karena adanya

konversi lahan dari hutan hujan tropis menjadi perkebunan kelapa sawit dan karet.

Penelitian Purnamasari (2013) menyebutkan bahwa terdapat 40 isolat bakteri

selulolitik yang berhasil diisolasi dari sampel tanah perkebunan di sekitar kawasan

TNBD Jambi. Sedangkan publikasi mengenai mikrob penambat nitrogen yang

hidup bebas serta dapat mensintesis IAA di daerah TNBD Jambi belum ada,

sehingga eksplorasi di daerah tersebut sangat menarik untuk dilakukan.

2

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat

nitrogen yang hidup bebas dan penghasil Indole-3-acetic acid (IAA) asal sampel

tanah dari Jambi Indonesia.

METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2013-Juni 2014 bertempat

di rumah kaca dan Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB.

Prosedur Penelitian

Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas

Sebanyak 17 sampel tanah asal rhizosfer kelapa sawit masing-masing

diencerkan dari 10-1

hingga 10-4

menggunakan larutan garam fisiologis 0,85%.

Sebanyak 0,1 mL suspensi tanah tersebut diletakkan pada media semisolid NfB

(Nitrogen Free Bromthymol Blue) dan diinkubasi selama 7 hari. Komposisi media

NfB (dalam 1 liter) adalah sebagai berikut: asam malat 5,0 g, K2HPO4 0,5 g,

MgSO4.7H2O 0,2 g, NaCl 0,1 g, CaCl2

.2H2O 0,02 g, indikator bromthymol blue

0,5% dalam KOH 0,2 M 2 mL, larutan vitamin B 1 mL, dan larutan hara mikro 2

mL dengan komposisi sebagai berikut CuSO4.5H2O 40 mg, ZnSO4

.7H2O 0,12 g,

H2BO3 1,4 g, Na2MO4.2H2O 1,0 g, MnSO4

.H2O 1,175 g, FeEDTA 1,64% 4 mL,

KOH 4,5 g. pH disesuaikan menjadi 6,8 dan ditambahkan 1,75 g agar-agar (Okon

et al.1977). Isolat yang didapatkan dari hasil isolasi kemudian diseleksi

menggunakan media CRA (Congo Red Agar).

Media CRA (dalam 1 liter), terdiri atas: asam malat 5,0 g, K2HPO4 0,5 g,

MgSO4.7H2O 0,2 g, NaCl 0,1 g, CaCl2

.2H2O 0,02 g, indikator merah kongo

0,25% dalam akuades 10 mL, ekstrak khamir 0,05 g, dan larutan hara mikro 2 mL

dengan komposisi sebagai berikut CuSO4.5H2O 40 mg, ZnSO4

.7H2O 0,12 g,

H2BO3 1,4 g, Na2MO4.2H2O 1,0 g, dan MnSO4

.H2O 1,175 g, FeEDTA 1,64% 4

mL, KOH 4,5 g. pH disesuaikan menjadi 6,8 dan ditambahkan 15 g agar-agar

(Caceres 1982).

Karakter morfologi diidentifikasi dengan mengacu pada Holt et al. (1994).

Karakter morfologi yang diamati meliputi bentuk koloni, warna koloni, elevasi,

tepian, bentuk sel bakteri, dan pewarnaan Gram.

Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA

Isolat terpilih pada media seleksi CRA selanjutnya dibiakkan di dalam

media NfB pada suhu 30 oC sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm. Setiap 24

jam dilakukan pengambilan kultur untuk dilakukan pengukuran absorbansi pada

panjang gelombang 520 nm yang berlangsung sampai dengan 7 hari.

3

Analisis IAA dilakukan dengan metode kolorimetri menggunakan reagen

Salkowski (Gordon dan Weber 1950). Sebanyak 50 mL media cair NfB ditambah

dengan 1,0 mM triptofan (Trp). Media tersebut diinokulasi dengan 1 mL kultur

bakteri dalam media cair NfB yang telah berumur 24 jam. Kemudian diinkubasi

selama 7 hari pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 120 rpm. Kandungan

IAA di dalam media dihitung setiap 24 jam selama 7 hari berdasarkan kurva

standar IAA dengan perlakuan berupa media ditambah dengan Trp dan yang tidak

ditambah dengan Trp.

Kandungan IAA pada media kultur diuji dengan mengambil 1,5 mL kultur

ke dalam tabung mikro, kemudian kultur tersebut disentrifugasi selama 10 menit

dengan kecepatan 10.000 g. Sebanyak 1 ml supernatan direaksikan dengan 4 mL

reagen Salkowski (150 mL H2SO4 pekat; 7,5 mL FeCl3.6H2O 0,5 M; dan 250 mL

akuades steril), diinkubasi selama 15 menit tanpa paparan cahaya, kemudian

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm menggunakan

spektrofotometer Genesys. Kandungan IAA di dalam media dapat diketahui

dengan menggunakan kurva standar pengukuran IAA dengan konsentrasi 0-50

ppm.

Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas

Ciri fisiologi diamati menggunakan KIT API 20 NE bioMérieux®sa yang

merupakan sebuah sistem yang terstandarisasi untuk mengidentifikasi bakteri

gram negatif yang bersifat nonenterik. Bakteri yang akan diuji menggunakan alat

KIT API 20 NE bioMérieux®sa ini akan melalui 8 uji konvensional, 12 uji

asimilasi, serta sebuah basis data sehingga dapat diidentifikasi jenis bakteri yang

diujikan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas

Sebanyak 36 isolat didapatkan dari proses isolasi 17 sampel tanah asal

rhizosfer kelapa sawit menggunakan media NfB. Isolat yang diduga memiliki

kemampuan menambat nitrogen bebas menunjukkan perubahan warna media dari

hijau menjadi biru dan membentuk pelikel berwarna putih pada permukaan media

(Gambar 1). Isolat-isolat tersebut kemudian diseleksi pada media CRA.

4

Gambar 1 Warna media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB)

sebelum dilakukan isolasi (a) dan warna media semisolid setelah

dilakukan isolasi pada hari ke-7 serta pelikel putih yang terbentuk

pada permukaan media (tanda panah) (b)

Sepuluh isolat terpilih dari hasil seleksi pada media CRA diidentifikasi

secara morfologi. Bentuk kesepuluh isolat tersebut ialah bundar dengan warna

merah muda hingga merah, memiliki tepian licin beraturan atau tidak beraturan,

serta elevasi yang cembung (Tabel 1).

Tabel 1 Hasil seleksi bakteri penambat nitrogen bebas pada media Congo Red

Agar (CRA)

No Kode Isolat Ciri Koloni Ciri Sel

Bentuk Warna Tepian Elevasi Bentuk Gram

1 A4.1 Bundar Merah

muda

Licin,

tidak

beraturan

Cembung Batang Negatif

2 A6.0 Bundar Merah

muda

Licin,

beraturan

Cembung Batang Negatif

3 A6.1 Bundar Merah

muda

Licin,

beraturan

Cembung Batang Negatif

4 A12.0 Bundar Merah

muda

Licin,

tidak

beraturan

Cembung Bulat Negatif

5 A12.1 Bundar Merah

muda

Licin,

beraturan

Cembung Batang Negatif

6 A13.1 Bundar Merah

(Jingga)

Licin,

beraturan

Cembung Batang Negatif

7 N1.0 Bundar Merah

muda

Licin,

tidak

beraturan

Cembung Batang Negatif

8 N2.1 Bundar Merah Licin,

tidak

beraturan

Cembung Batang Negatif

9 N6.1 Bundar Merah

muda

Licin,

beraturan

Cembung Batang Negatif

10 N7.1 Bundar Merah

muda

Licin,

beraturan

Cembung Batang Negatif

Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa dari sepuluh isolat, sembilan

di antaranya memiliki bentuk sel batang (basil) dan satu isolat yaitu isolat A12.0

memiliki bentuk sel bulat (kokus). Sepuluh isolat terpilih tersebut termasuk ke

dalam Gram negatif yaitu ditandai dengan warna sel yang merah setelah diberi

5

perlakuan pewarnaan Gram. Morfologi salah satu isolat terpilih, yaitu isolat A13.1

dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 2 Isolat A13.1 pada media CRA (a) dan hasil pewarnaan Gram isolat

A13.1 pada perbesaran 1000x (b)

Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA

Sebanyak 5 dari 10 isolat terpilih, yaitu A6.0, A12.1, A13.1, N2.1, dan

N7.1 diuji kemampuan pertumbuhannya dalam media NfB selama masa inkubasi

24 jam. Pemilihan 5 isolat tersebut berdasarkan kemiripan morfologi dengan

kelompok bakteri penambat nitrogen dari genus Azospirillum. Isolat A13.1

memiliki nilai log sel tertinggi sebesar 10,924 pada waktu inkubasi 24 jam (Tabel

2).

Tabel 2 Hasil pertumbuhan lima isolat bakteri terpilih pada media NfB

*Keterangan : Produksi IAA dihitung setelah masa inkubasi 5 hari

Kelima isolat menghasilkan IAA eksogen masing-masing pada waktu

inkubasi 120 jam pertumbuhannya, namun berdasarkan hasil penentuan kurva

standar, isolat A13.1 menunjukkan nilai log sel tertinggi sehingga dipilih untuk

diuji lebih lanjut pertumbuhannya pada media NfB. Kurva tumbuh diperlukan

untuk mengetahui fase pertumbuhan dari isolat A13.1 tersebut. Penghitungan

jumlah sel dilakukan setiap 24 jam selama 7 hari. Hasil kurva tumbuh

menunjukkan bahwa isolat A13.1 memiliki jumlah sel hingga 108

pada akhir fase

log. Isolat A13.1 mengalami fase log dari hari ke-2 hingga hari ke-3, kemudian

memasuki fase stasioner pada hari ke-3 hingga ke-5. Pertumbuhan isolat A13.1

pada medium produksi pH 6,8, suhu 30 oC menunjukkan bahwa pada hari ke-3

terjadi kenaikan angka rapat optis yang diukur pada panjang gelombang 520 nm

(Gambar 3). Nilai log sel dari isolat A13.1 tertinggi pada waktu inkubasi 120 jam

(hari ke-5) sebesar 8,448.

Isolat Nilai Log Sel Produksi IAA

(ppm)*

A6.0 10,082 60

A13.1 10,924 33,88

N2.1 10,093 20

N6.1 10,892 20

N7.1 10,886 50

1 mm

1 µm

a b

6

Gambar 3 Pertumbuhan isolat A13.1 ( ) , produksi IAA pada media

dengan penambahan Trp ( ), dan tanpa penambahan Trp

( )

Proses seleksi selanjutnya yaitu menentukan kurva produksi sintesis IAA

eksogen oleh isolat A13.1. Pengukuran IAA dilakukan selama 7 hari dengan

menggunakan reagen Salkowski dengan pengukuran kurva standar IAA setiap

harinya. Nilai absorbansi tersebut diinterpolasikan pada persamaan garis dari

kurva standar IAA sehingga diperoleh konsentrasi antara 5 hingga 33,88 ppm

pada media dengan penambahan Trp. Sedangkan konsentrasi 0,041 hingga 0,93

ppm diperoleh pada perlakuan media tanpa penambahan Trp. Perlakuan dengan

menggunakan penambahan Trp menunjukkan sintesis IAA meningkat dari hari

pertama dan optimum pada hari ke-5 (Gambar 3).

Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas

Identifikasi secara fisiologi dilakukan menggunakan alat KIT API 20 NE

bioMérieux®sa. Kit API 20 NE terdiri atas 20 microtubes mengandung substrat

yang diinokulasi dengan larutan saline bacterial suspension. Selama masa

inkubasi 24 dan 48 jam, hasil reaksi metabolisme menghasilkan perubahan warna.

Reaksi yang berlangsung dibaca sesuai dengan Reading Table dan identifikasi

diperoleh dengan mengacu pada Indeks Analytical Profile pada perangkat lunak.

Berdasarkan identifikasi menggunakan alat KIT API 20 NE

bioMérieux®sa, isolat A13.1 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas luteola

sebesar 99%. Kesamaan ini meliputi bakteri yang termasuk ke dalam Gram

negatif, sel berbentuk batang, koloni berukuran 0,5-1,0 x1,5-5,0 μm. Ketika diuji

dengan KIT API 20 NE memberikan hasil oksidase negatif dan dapat

menggunakan asam malat sebagai sumber karbon (Tabel 3) serta suhu optimum

pertumbuhan pada 30-37oC.

7

Tabel 3 Hasil uji biokimia/fisiologi isolat A13.1

Reaksi pada KIT API 20 NE Hasil reaksi

Reduksi nitrat ke nitrit (NO3) -

Produksi indol (TRP) -

Kemampuan fermentasi (GLU) -

Arginine dihydrolase (ADH) +

Urease (URE) +

Hidrolisis β-glucosidase (ESC) +

Hidrolisis protease (GEL) +

β-glucosidase (PNG) +

Asimilasi glukosa (GLU) +

Asimilasi arabinosa (ARA) +

Asimilasi mannosa (MNE) +

Asimilasi mannitol (MAN) +

Asimilasi N-Asetil-Glukosamin (NAG) +

Asimilasi maltosa (MAL) +

Asimilasi potassium glukonat (GNT) +

Asimilasi capric acid (CAP) -

Asimilasi adipic acid (ADI) -

Asimilasi malat (MLT) +

Asimilasi trisodium sitrat (CIT) +

Asimilasi phenylacetic acid (PAC) -

Cytochrome oxidase (OX) -

Pembahasan

Isolasi bakteri yang dilakukan pada 17 sampel tanah rhizosfer di Jambi di

dalam media NfB bertujuan mengetahui kemampuan bakteri dalam proses

penambatan nitrogen bebas. Media NfB tidak mengandung unsur nitrogen pada

komposisi bahannya sehingga isolat yang dapat ditumbuhkan dalam media

tersebut ialah isolat yang mampu memfiksasi nitrogen bebas. Sebanyak 17 sampel

tanah yang diinokulasi ke dalam media semisolid NfB menghasilkan isolat-isolat

terpilih. Pemilihan isolat berdasarkan pada kemampuan dalam penambatan

nitrogen bebas. Adanya pelikel putih yang tumbuh di permukaan media

menunjukkan keberhasilan dari isolat yang memiliki kemampuan dapat menambat

nitrogen bebas (Kumar dan Pannerselvam 2013). Selain itu, bakteri yang diduga

dapat menambat nitrogen bebas juga memiliki kemampuan untuk mengubah pH

media menjadi lebih basa. Hal ini ditandai dengan perubahan warna media yang

semula berwarna hijau menjadi berwana kebiruan.

Isolat-isolat bakteri yang terpilih selanjutnya diseleksi menggunakan

media CRA (Congo Red Agar). Media CRA merupakan media modifikasi dari

NfB sehingga komposisi bahan yang menyusun media CRA sama dengan NfB.

Namun media CRA menggunakan indikator berupa merah kongo dan terdapat

ekstrak khamir. Penggunaan merah kongo sebagai indikator berperan dalam

membedakan serta memisahkan genus Rhizobium dari bakteri penambat nitrogen

bebas, seperti genus Azospirillum (Caceres 1982). Ekstrak khamir berfungsi

sebagai pemacu tumbuh sel di fase awal karena ekstrak khamir memiliki

Keterangan:

(+) = hasil positif, (-) = hasil negatif

8

kemampuan menyediakan faktor pertumbuhan, seperti asam malat yang

digunakan oleh bakteri dalam proses metabolisme serta menjaga pH media agar

tetap netral, yaitu 6,8-7,0 (Kung et al. 1996).

Hasil identifikasi secara fisiologi menggunakan alat KIT API 20 NE

bioMérieux®sa menunjukkan bahwa isolat A13.1 memilliki 99% kesamaan

dengan spesies Pseudomonas luteola. Isolat P. luteola memiliki karakteristik

sebagai PGPR (Planth Growth Promoting Bacteria), yaitu meningkatkan

pertumbuhan tanaman karena memproduksi fitohormon seperti auksin (Deshwal

et al. 2013). Ali dan Sabri (2010) menyatakan bahwa anggota dari genus

Pseudomonas sp. merupakan salah satu contoh dari bakteri tanah (rhizobakteria)

yang mampu menghasilkan IAA. Selain itu, Stieglmeier et al. (2009) melaporkan

bahwa P. luteola berhasil diisolasi dalam medium tanpa N sehingga diketahui

bahwa P. luteola merupakan bakteri penambat nitrogen bebas. Isolat ini termasuk

ke dalam kelompok Proteobacteria, yaitu kelompok dari Bacteria yang

anggotanya terdiri atas bakteri Gram negatif. Berdasarkan identifikasi 16S rRNA,

secara filogenetik filum Proteobacteria dibagi ke dalam 5 kelas, yaitu

Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria,

Deltaproteobacteria, dan Epsilonproteobacteria. Isolat A13.1 termasuk ke dalam

kelas Gammaproteobacteria. Isolat ini termasuk ke dalam kelas yang sama

dengan bakteri penambat nitrogen dari genus Azotobacter (Madigan et al. 2006).

Kurva tumbuh isolat A13.1 (Gambar 3) menunjukkan bahwa isolat A13.1

tersebut digolongkan sebagai bakteri yang tumbuh lambat karena pencapaian fase

log dari bakteri tersebut baru terjadi pada hari ke-3. Hal ini sesuai dengan

pernyataan bahwa bakteri yang hidup di rhizosfer umumnya merupakan bakteri

yang tumbuh lambat karena ketersediaan nutrisi yang terbatas (Rao 1994). Kurva

pertumbuhan bakteri juga berhubungan dengan kurva konsentrasi IAA yang

dihasilkan oleh isolat A13.1 (Gambar 3). IAA disintesis optimum sejak akhir fase

log dan mencapai konsentrasi tertinggi di akhir fase stasioner.

Produksi IAA pada media pertumbuhan isolat A13.1 didukung oleh

triptofan sebagai prekusor. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Zakharova

et al. (1999), Trp merupakan prekursor yang paling efisien digunakan bakteri.

IAA dapat disintesis dengan berbagai lintasan dan senyawa intermediet yang

berbeda. Menurut berbagai jalur sintesis IAA digunakan oleh prokariot, suatu

galur bakteri dapat menggunakan lebih dari satu jalur sintesis IAA. Jalur-jalur ini

dikelompokkan berdasarkan jenis senyawa antaranya, yaitu jalur indol asetamida

(IAM), asam indol-3-piruvat (IPA), triptamin (TAM), dan indol-3-asetonitril

(IAN) (Patten dan Glick 1996).

Jalur indol asetamida (IAM) merupakan jalur yang umum digunakan bakteri

dalam mensintesis IAA. Triptofan diubah menjadi indol asetamida oleh enzim

triptofan-2-monooksigenase. Gen yang terkait IAM telah terdeteksi pada berbagai

spesies Pseudomonas. Bakteri Pseudomonas luteola menggunakan triptofan

sebagai prekusor dalam proses produksi IAA melalui jalur indol asetamida (IAM).

Selain Pseudomonas luteola, bakteri-bakteri rhizosfer seperti Agrobacterium

tumefaciens, Rhizobium, dan Bradyrhizobium juga menggunakan jalur indol

asetamida (IAM) (Spaepen et al. 2007).

Produksi IAA diukur dengan metode kolorimetri yang mengindikasikan

adanya IAA dari tingkatan kepekatan warna yang terbentuk karena adanya cincin

indol (Lindow et al. 1998). Cincin indol terbentuk setelah supernatan isolat A13.1

9

direaksikan dengan reagen Salkowski. Salkowski merupakan reagen pewarna

yang dapat digunakan untuk menguji senyawa indol dan turunannya. Reagen

Salkowski akan mengoksidasi senyawa indol dan turunannya. Indol ialah senyawa

organik golongan aromatik yang memiliki struktur bisiklik yang terdiri atas cincin

benzena (Joule dan Mills 2000). IAA merupakan salah satu contoh senyawa yang

memiliki gugus indol sehingga akan memberikan konsentrasi warna merah muda.

Kepekatan warna berbanding lurus dengan peningkatan jumlah IAA yang

dihasilkan (Ehmann 1977).

Data mengenai kurva tumbuh serta konsentrasi IAA yang diperoleh dalam

penelitian dapat digunakan sebagai data awal sebelum isolat digunakan sebagai

formulasi pupuk hayati. Oleh karena itu, diperlukan pengujian lebih lanjut dari

isolat A13.1 dalam kemampuannya menambat nitrogen bebas. Kemampuan

penambatan jumlah nitrogen bebas dapat dilihat dari kemampuan isolat A13.1

dalam mereduksi asetilen dengan menggunakan metode Asetilene Reduction

Assay sehingga dapat diketahui keefektifan penggunaan isolat A13.1 dalam

pembuatan formulasi pupuk hayati. Proses identifikasi lebih lanjut dengan teknik

molekuler juga diperlukan agar isolat A13.1 dapat diidentifikasi sampai tingkat

spesies.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Bakteri penambat nitrogen yang hidup bebas dan dapat menghasilkan

Indole-3-Acetic Acid (IAA) dari Taman Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi

berhasil diisolasi. Isolat terpilih yaitu isolat A13.1 yang merupakan bakteri Gram

negatif serta menunjukkan kemiripan dengan Pseudomonas luteola sebesar 99%.

Isolat A13.1 optimum mensintesis IAA pada hari ke-5, yaitu pada fase

pertumbuhan stasioner.

Saran

Penelitian ini merupakan penelitian pendahuluan sehingga diperlukan

pengujian lebih lanjut pada isolat-isolat terpilih lainnya. Selain itu, identifikasi

molekuler menggunakan 16S rRNA juga diperlukan agar diketahui secara pasti

spesies bakteri yang akan digunakan untuk proses aplikasi di lapangan.

10

DAFTAR PUSTAKA

Alexander M. 1977. Introduction to Soil Microbiology. Ed ke-2. New York (US):

J Willey.

Ali B, Sabri AN. 2010. Rhizobacterial potential to alter auxin content and growth

of Vignata radiata (L.). World J Microbiol Biotech. 26(8):1397-1384.

Caceres EAR. 1982. Improved medium for isolation of Azospirillum spp. Appl

Environ Microbiol. 44(4):990-991.

Deshwal VK, Singh SB, Kumar P, Chubey A. 2013. Rhizobia unique plant

growth promoting rhizobacteria. Int J Life Sci. 2(2):53-55.

Ehmann A. 1977. The van urk-salkowski reagent- a sensitive and specific

chromogenic reagent for silica gel thin-layer chromatographic detection and

identification on indole derivatives. J Chrom. 132(1977):267-276.

Frankenberger M, Arshad WT. 1995. Phytohormones in Soils: Microbial

Production and Function. New York (US): Marcel Dekker Inc.

Gordon SA, Weber RP. 1950. Colorimetric estimation of indolacetic acid. Plant

Physiol. 26(1):192-195.

Haq I, Dahot MU. 2007. Micropropagation efficiency in banana (Musa spp.)

under different immersion systems. Pak J Biol Sci. 10(5):726-733.

Holt JG, Krig NR, Sneath P, Staley J, William S. 1994. Bergeys Manual of

Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Pennsylvania (US): Lipincott

Williams and Wilkins Company.

Joule JA, Mills K. 2000. Heterocyclic Chemistry. Oxford(UK): Blackwell Science

Kumar S, Pannerselvam A. 2013. Studies on Azospirillum isolated from the soils

of Thiruvarur Dt., Tamilnadu, India. Adv Appl Sci Res. 4(1):86-93.

Kung LJR, Kreck RST, Tung AO, Hession. 1996. Effect of a life yeast culture and

enzymes on in vitro ruminal fermentation and milk production of dairy

cow. J Dairy Sci. 80(5):2045-2051.

Las I, Setiyanto AP, Subagyono K. 2006. Isu dan pengelolaan lingkungan dalam

revitalisasi pertanian. J Litbang Pertan. 25(3): 1-8.

Lindow SE, Desurmont C, Elkins R, McGourty G, Clark E, Brandl MT. 1998.

Occurrence of indole-3-acetic acid producing bacteria on pear trees and

their association with fruit russet. Bacteriology 88(11):1151-1157.

Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2006. Brock: Biology of

Microorganisms. 12th Ed. San Fransisco (US): Pearson Education Inc.

Okon Y, Albrecht SL, Burris RH. 1977. Methods for growing Spirillum lipoferum

and for counting it in pure culture and in association with plants. Appl

Environ Microbiol. 33 (1):85-88.

Patten CL, Glick BR. 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Can J

Microbiol. 42(2):207-220.

Purnamasari D. 2013. Isolasi dan seleksi bakteri selulolitik penghambat

pertumbuhan cendawan pada tanaman kelapa sawit [skripsi]. Bogor (ID):

Institut Pertanian Bogor.

Rao NS. 1994. Mikrobiologi Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Susilo H,

penerjemah. Jakarta (ID): UI Press. Terjemahan dari: Soil Microorganisms

and Plant Growth. Ed ke-2.

11

Riyadi I. 2008. Potensi pengelolaan bioprospeksi terhadap pertumbuhan ekonomi

Indonesia. J Litbang Pertan. 27(2):69-73.

Sanchez PA. 1993. Sifat dan Pengelolaan Tanah Tropika. Bandung (ID) : ITB

Press.

Spaepen S, Jos V, Roseline R. 2007. Indole-3-acetic acid in microbial and

microorganism plant signaling. FEMS Microbiol Rev. 31:425–448

Stieglmeier M, Wirth R, Kminek G, Moisl-Eichinger C. 2009. Cultivation of

anaerobic and facultatively anaerobic bacteria from spacecraft-assosiated

clean rooms. Appl Environ Microbiol. 75(11): 3484-3491.

Tilak KVBR, Ranganayaki N, Pal KK, Saxena AK, Nautiyal CS. 2005. Diversity

of plant growth and soil health supporting bacteria. Curr Sci. 89(1):136-

150.

Zakharova E, Schcherbakov A, Brudnik V, Skripko N, Bulkhin N, Ignatov V.

1999. Biosynthesis of indole-3-acetic acid in Azospirillum brasilense.

Insight from quantum chemistry. Eur J Biochem. 259(2):572-576.

12

LAMPIRAN

Lampiran 1 Sampel tanah asal perkebunan kelapa sawit kawasan Hutan Taman

Nasional Bukit Dua Belas, Jambi yang berhasil diseleksi pada media

CRA

Plot CRC Plot No. Sub plot Kode

1 B03 N1 DE45 1261

B03 N2 HI23 1253

2 B03 A4 JJ45 -

B02 A6 B02 1310

B02 N6 JJ67 1306

B02 N7 FG07 1305

4 BR4 A12 BC23 637

BR4 A13 BO43 660

Lampiran 2 Nilai absorbansi dan nilai log sel selama 7 hari inkubasi

Waktu Inkubasi

(Hari ke-)

Nilai Absorbansi

OD520nm

Log Sel

0 0,296 0

1 0,595 2,612

2 0,607 2,857

3 0,868 8,18

4 0,872 8,265

5 0,881 8,448

6 0,718 5,122

7 0,684 4,427

Lampiran 3 Nilai absorbansi (OD 520 nm) isolat A13.1 dalam analisis IAA

Waktu Inkubasi

(Hari ke-)

(+) Trp (-) Trp

0 0,023 0,001

1 0,133 0,022

2 0,189 0,031

3 0,409 0,041

4 0,590 0,047

5 0,643 0,072

6 0,634 0,015

7 0,608 0,015

13

Lampiran 4 Produksi IAA (ppm) selama 7 hari inkubasi

Waktu Inkubasi

(Hari ke-)

(+) Trp (-) Trp

0 0 0

1 5 0

2 6,93 0

3 7,36 0,041

4 32 0

5 33,88 0,29

6 30,63 0

7 20,07 0,93

14

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Purbalingga pada tanggal 17 Mei 1992 dari ayah

Abdul Azis dan ibu Tumidjah. Penulis merupakan anak keempat dari empat

bersaudara. Tahun 2010 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Purwokerto. Pada tahun

yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi

Masuk IPB (USMI) di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam. Penulis mendapatkan beasiswa Peningkatan Prestasi

Akademik (PPA) dari DIKTI pada tahun 2011-2014. Pada tahun 2013 penulis

diterima sebagai mahasiswa program sinergi S1-S2 fast-track untuk program studi S2

Mikrobiologi. Penulis aktif mengikuti beberapa kegiatan dalam masa studi seperti

menjadi peserta kompetisi olimpiade biologi pada OSN Pertamina (2011-2012)

dan ON-MIPA DIKTI tingkat regional III (2012-2013) serta kegiatan Organisasi

Mahasiswa Daerah (OMDA) Banyumas. Penulis juga aktif mengikuti lomba baca

puisi SPIRIT FMIPA IPB (2012-2013) dan IAC (IPB Art Contest). Penulis juga

menjadi anggota divisi Tatib (Tata Tertib) dalam acara Masa Perkenalan Departemen

Biologi “MORFOLOGI” tahun 2012-2013, divisi Tim Khusus Lomba Cepat Tepat

Biologi (LCTB) Pesta Sains Nasional IPB tahun 2012, serta beberapa kepanitiaan

lainnya. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum

Biologi Dasar (2012) dan asisten responsi Sosiologi Umum (2012-2013). Tanggal

3-5 Juli 2012 penulis melaksanakan Studi Lapang di Taman Nasional Gunung

Gede-Pangrango (TNGGP) dengan judul Kekayaan Jenis Pinang di Kebun Raya

Cibodas. Setelah itu, pada bulan Juni hingga Juli 2013, penulis melaksanakan

Praktik Lapangan dengan topik Manajemen dan Proses Eksplorasi, Identifikasi,

serta Perawatan Fosil Hewan Famili Bovidae di Balai Pelestarian Situs Manusia

Purba (BPSMP) Sangiran.