PENGarUH IMUNOstIMULaN OUTER MEMBRAN PROTEIN (OMP) Vibrio alginolyticus DaN INfEKsI Vibrio harveyi tErHaDaP DNa

MItOKONDrIa UDaNG WINDU (Penaeus monodon fabricus)Mohamad Rozik1), Fariedah F.1), Maftuch2), Darius2) dan Marsoedi2)

1) Mahasiswa Program Pascasarjana Universitas Brawijaya, Malang.2) Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang.

Perum Purimas Blok J-5 ,Tulungagung Jatim.Rozi_raha@yahoo.com

ABSTRACT

Infectious disesases constitute the main barrier to continuation of shrimp aquaculture. Immunostimulants were substances, which enhance the non-specific defence mechanism and provide resistance againts the imvading pathogenic microorganism. Outer Membran Protein (OMP) V. alginolyticus was a prospective immunostimulant for shrimp aquaculture. The purpose of this research was to study the effect of OMP V. alginolyticus and V. harveyi infection on mitochondria DNA of Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon Fabr.). This research used completely randomized design with five treatmen, 10, 20, 30 µg/kg bw, negative and positive control. Each treatmen was 3 replications. Parameters observed were clinical symptom and 16s rRNA gene of Black tiger shrimp. The results showed that 16s rDNA F and 16s rDNA R could amplified 16s rRNA gene 530 bp on fragment size. Based on RFLP analysis used Mbo I and hae III restriction anzymes showed that shrimp which given immunostimulant (A, B, and C treatment) showed the polymorphism than both of control negative and positive. Based on the research result the conclusion was 20 µg/kg bw OMP concentration gave an optimal immunostimulant role that supported shrimp to respons the infection.

Key words: OMP, Vibrio harveyi, Mitochondria DNA, Penaeus monodon

PENGANTAR

Udangwindu(Penaus monodonFabr.)merupakansalahsatukomoditiunggulanpadausahabudidayaperikanandibeberapanegara.Berbagaimacamcaradilakukanagardapatmeningkatkankapasitasproduksiudang,mulaidaripembukaantambakbaruhinggapemanfaatanteknologidalambidangbudidaya.Permasalahanyangdihadapiadalahterjadinyadegradasilingkungandanmunculnyaberbagaimacampenyakit(VandeBraak,2002).

Penyelesaian atau penanggulangan penyakitmenggunakanantibiotiksangattidakdianjurkankarenapenggunaanantibiotikdapatmenimbulkanresistensi,penumpukanresidupadadagingudangdanpencemaranlingkungan(WudanChang,1981).SedangkanKurmaly(1992)menyatakanbahwapenggunaanantibiotikhanyaefektif terhadapinfeksibakteridantidakmempunyaiaktifitas terhadap virus.

Untukmengatasihaltersebut,penanggulanganpenyakitsecarapreventifdapatdilakukanmelaluipeningkatanmekanismekekebalantubuhudangnonspesifikyaitumelaluipemberian immunostimulan. Imunostimulanmerupakansekelompoksenyawabiologidansintetisyangdapat meningkatkan sistem imun non spesifik (Johnny danRosa,2008).Imunostimulandapatdiperolehdariberbagaisumberantaralaindaridindingselbakteri,dindingsel

yeast,cangkangudang(crustacea)dandarimiseliajamur(Almendras, 2001).

OMPbakteriVibrio alginolyticusmerupakansalahsatubahanpotensial yangdapat digunakan sebagaiimunostimulankarenabahanaktifnyamampumeningkatkansistemkekebalan tubuhdalammenghadapiseranganpatogenpadaikankeraputikus(Maftuch,2006).BetaGlukan dan LPS merupakan salah satu jenis protein dan polisakaridayangmelimpahpadadindingselbakteriyangmampu meningkatkan aktifitas fagositosis makrofage dan kekebalantubuhikanMas(Cyprinus carpio)menghadapiinfeksibakteri(Fujikiet al.,1997).

Padasaatterjadinyaseranganpatogen,yangpertamakaliberperandalamsistempertahanantubuhudangadalahkutikulayangmemilikikemampuanantimikrobamelaluilendiryangdihasilkan.Pertahananselanjutnyaadalahhemosityangmemilikiperananpentingdalamsistempertahananinternaludang(VandeBraak,2002).

16s rRNA merupakan salah satu gen yang terdapat di DNA mitokondria dan termasuk gen yang tidak mudah mengalami mutasi karena 16s rRNA mempunyai daerah yangtermasuklambatberkembang,karenaitulahgen-gen yang mengkode rRNA banyak yang disekuen untuk mengidentifikasi taksonomiorganismedalam suatukelompok,mengkalkulasikelompokyangberhubungan

Berk. Penel. Hayati Edisi Khusus: 6B (27–32), 2011

PengaruhImunostimulanOuter Membran Protein(OMP)Vibrio alginolyticusdanInfeksiVibrio harveyi��

danmerata-rataperbedaanantarspesies(MurphydanAustin, 2003 dalam Kumar et al,2007).

Adanya polimorfisme pada gen 16s rRNA dapat dikarenakan adanya mutasi titik yang berpengaruhpada sintesis protein (16s rRNA merupakan gen DNA mitokondriaberperandalamproduksiprotein)danmutasitersebutbisadisebabkanfaktorluarsepertiobat-obatan,racundaninfeksi.

UjitantangolehbakteriVibrio harveyi didugadapatberpengaruh pada DNA mitokondria (16s rRNA) yang berperanpadaproduksiproteinkarena terganggunyametabolismeenergiyangdisebabkanolehadanyainfeksidanberpengaruhpadagangguanproduksiprotein,makatujuanpenelitianiniadalahuntukmengetahuipengaruhimmunostimulanOMPVibrio alginolyticusdaninfeksiVibrio harveyi terhadap DNA mitokondria 16s rRNA udang windu(Penaeus monodon Fabr.).

BAHAN DAN CARA KERJA

Penelitianinidilaksanakandibeberapatempatyaitu:Laboratorium Parasit dan Penyakit Ikan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, dan Laboratorium Bioteknologi BBRPBL Gondol Bali. Waktu penelitian dilaksanakan mulai Bulan April sampai dengan Bulan Juli 2010.

Rancangan percobaan yang digunakan adalahRancangan Acak Lengkap (RAL). Variabel bebas berupa perlakuanpemberianimunostimulanOuter Membrane Protein(OMP)Vibrio alginoloticusdengandosis10µg/kg bw (Perlakuan A), 20 µg/kg bw (Perlakuan B), dan 30 µg/kgbw(PerlakuanC)sertaujitantanginfeksibakteriVibrio harveyi dengancaraperendaman107sel/ml. Setiapperlakuandiulangsebanyaktigakali.

Variabel terikat yang diamati adalah DNA mitokondria (16s rRNA) udang windu (Penaeus monodon Fabr.).Pengamatanparameterdilakukan24jampascainfeksibakteriVibrio harveyiyangsebelumnyatelahdiimunisasidenganOMP.

Materi Penelitian

Bahan

Bahanyangdigunakandalampenelitianiniantaralain:udangwindu(Penaeus monodonFabr.),airlaut,OMP,Nafisiologis, complete Adjuvant, incomplete Adjuvant,Vibrio harveyi,pakanudangkomersial,bahan-bahanuntukanalisislaboratorium (aquabidestilata, 10% chelex-100 BIORAD, protein kinase (20 mg/L), Enzim restriksi Nla III,Hae III,danMbo I. Primer 16s rDNA F (5’-CGC CTG TTT AAC AAA AAC AT-3’) dan 16s rDNA R (5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ATG T-3’), DNA ladder 1000bp, PCR kit

ReadytoGo,gelagaroseuntukelektroforesis,1xbufferTBE,ethidiumbromide.

Alat

Peralatanyangdigunakanantaralainsyringe1ml,Erlenmeyer, tabung reaksi, silica film, stopwatch, gelas ukur, thermoblock (RKJ Ikemoto scientific-Tokyo), thermometer compact(eppendorf),mikropipet,eppendorftube,tip,danmesinelektroforesisgenephore(Pharmacia Biotech).

Cara Kerja

Persiapan Hewan Uji

UdangwindudiperolehdaritambakdisekitarlokasiUPT Pengembangan Budidaya Air Payau Bangil, dengan berat20,14±3,69grsebanyak150ekor.Untukprosesaklimatisasi, udangdipeliharadalambakperlakuandengan kapasitas 30 L air laut. Masing-masing bak diisi 10ekorudangyangdiadaptasiselama7hari.Selamamasapemeliharaandiberikanpakankomersilberupapeletsebanyak2×perhari5%totalbiomass.

Imunisasi dan Uji Tantang

OuterMembraneProtein(OMP)yangtelahdiketahuiabsorbansinyadilarutkanpadaNa fisiologishinggamencapaikonsentrasi10,20,dan30µg/kgbw,selanjutnyadicampurdengancomplete Adjuvantperbandingan1:1.Pemberianimunostimulandilakukandengancarainjeksidibagianventraludangpadaabdomenkeduasebanyak100µl(boosterpertama). Injeksikedua dilakukandenganincomplete Adjuvantdenganselangwaktusatuminggudariinjeksipertamadengandosisyangsama.

Ujitantangdilakukansatuminggusetelahimunisasiudangwinduboosterkeduadengancaraperendaman.Vibrio harveyidipaparkanpadaairlautmediaperlakuandengankepadatan107sel/ml.Setelahperendamanselama24jam,airmediaperlakuandigantidenganairyangbaru.

Analisis DNA mitokondria

Sampel untuk analisis DNA mitokondria diambil dari hepatopankreasudangdarimasing-masingsatuanunitpercobaan.Sampelhepatopankreas±20mgdimasukkankedalameppendorf tubeyangtelahberisi10%chelex-100dalamTEbufferpH8.0sebanyak250µl,selanjutnyadigerusdanditambahproteinaseK(PK)sebanyak5µl,kemudiandiflushing.Sampelkemudiandiinkubasiselama2,5jampadasuhu55°C(tiap1jamdivortex),dandiinkubasilagipadasuhu89°Cselama8menit.Sampeldisentrifugasidengankecepatan13000rpmselama5menit.Supernatantyangterbentukkemudiandiambilsebanyak±250µldansupernatant ini merupakan genom DNA.

Rozik,Fariedah,Maftuch,DariusdanMarsoedi ��

Purifikasi genome DNA menggunakan Kit QIAquick Purification (Cat. No. 28104 QIAGEN). Genome DNA hasil ekstraksidiambilsebanyak100µlkemudiandimasukkankedalameppendorf tube,danditambah500µlbindingbuffer(PB),selanjutnyadifinger vortex dandiflushing,dandibiarkanselama5menitpadasuhuruang.Selanjutnyalarutan tersebut dimasukkan ke dalam column QIA quick purificationdandisentrifusekecepatan13000rpmselama1menit. Larutan yang terfilter dibuang dan kedalam column ditambahkanlarutanwash buffer(PE)sebanyak750µl,selanjutnyadisentrifuseselama1menitdengankecepatan13000 rpm. Larutan yang terfilter dibuang dan ke dalam columnditambahkandenganlarutanelutionbuffer50µlyang diteteskan tepat di bagian tengah filter column dan disentrifuse kecepatan 13000 rpm selama 1 menit. Larutan yang terfilter merupakan genom DNA murni dengan konsentrasiyangtinggi.

Amplifikasi PCR menggunakan Ready To Go, sehingga hanyadiperlukanH2O 20,75 µl, genom DNA 3 µl, dan primer 16s rDNA F (5’-CGC CTG TTT AAC AAA AAC AT-3’) dan 16s rDNA R (5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ATG T-3’) masing-masing 0,625 µl kemudian tube Ready To GodimasukkankedalammesinspeedyPCRdenganthermal cycler:suhuinitialdenaturation93°Cselama2menit,suhudenaturation93°Cselama30detik,suhuannealing50°Cselama30detik,suhuextention72°Cselam 45 detik. Amplifikasi PCR dilakukan sebanyak 30siklus,dilanjutkandenganfinal extentionsuhu72°Cselama5menit,setelahitusampeldiinkubasipadasuhu4°C.

Untuk mengetahui adanya polimorfisme yang dihasilkan dari amplifikasi mtDNA dilakukan pengamatan pada gel agarose,yaitudenganmemasukkan1%gelagarosekedalamelektroforesis,kemudianditambahkan1×TBEkedalamelektroforesishinggagelagaroseterendam.KemudiansampelhasilPCRdiambilsebanyak5µldanditambahdenganloading dyesebanyak1µl,kemudiandisuntikkankedalamlubangsumuran.

Setelahsemuasampeldisuntikkantutupelektroforesisdipasangdanlistrikdihidupkandenganvoltasediatur150V,apabilageltelahberjalansampaibariske7makaproseselektroforesisdihentikandangelagarosedirendamdalamlarutanethidiumbromide(5µg/ml)15menit,kemudiangelagarosedirendamdalamaquadesselama10menit.HasilnyadiamatidenganUVtransiluminatordandidokumentasikan.

Hasilelektroforesisyangmenunjukkanpitatunggalmakadilakukanpemotongandenganenzimrestriksi;Nla III, Mbo I dan Hae III.a. Persentase lokus polimorfik:

% lokus pelimorfik = ∑ lokus pelimorfik ×100%∑ total lokus yang teramati

b. Heterozigositas

H= ∑ individu yang heterozigot∑ sampel × ∑ lokus yang diamati

Heterozigositasrata-ratamenggambarkanbesar-nyaproporsilokusheterozigotyangteramatidirata-ratakanterhadapsemualokusyangdiujipadasuatupopulasi.

HASIL

Amplifikasi PCR

Semuasampeludangwindu(Penaeus monodon Fabr.)berhasil teramplifikasi menggunakan primer 16s rDNA F dan 16s rDNA R. Hal ini menunjukkan bahwa primer tersebut dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah 16s rRNA di DNA mitokondria dengan ukuran fragmen 530bpsepertiterlihatpadaGambar1,sehinggaanalisisdapatdilanjutkanpadatahapberikutnyayaitupemotongandengan tiga enzim restriksi untuk melihat polimorfisme di antaraperlakuan.

Gambar 1. Produk amplifikasi PCR DNA mitokondria 16s rRNA. Garis 1: marker 100 bp; Garis 2-4: perlakuan A; Garis 5-7: perlakuan B; Garis 8-9: perlakuan C; Garis 10-12: kontrol negatif; Garis 13-15: kontrol positif; Garis 16: Uncut.

Pemotongan dengan Enzim Restriksi Mbo I

HasilelektroforesissetelahdilakukanpemotongandenganenzimrestriksiMboIdapatdilihatpadagambar2yangmenunjukkanadanyapemotonganolehenzimtersebutpadafragmen200bp(band1)dan410(band2)bp.

PengaruhImunostimulanOuter Membran Protein(OMP)Vibrio alginolyticusdanInfeksiVibrio harveyi�0

Gambar 2. Elektroforesis hasil pemotongan dengan enzim restriksi Mbo I. Garis 1: marker 100 bp; Garis 2-4: perlakuan A; Garis 5-7: perlakuan B; Garis 8-9: perlakuan C; Garis 10-12: kontrol negatif; Garis 13-15: kontrol positif; Garis 16: Uncut

Hasilelektroforesismenunjukkanbahwapadatigasampel kelompok perlakuan A, dua diantaranya terlihat duabandyaituband1dan2,sedangkansatusampelyanglainhanyaterlihatband3saja.PadaperlakuanBdaritigasampelduadiantaranyaterlihatband1dan3,sedangkansatusampelyanglainterlihatband1dan2.KelompokperlakuanCdariduasampelsatudiantaranyaterlihatband3sajadansatusampellainnyahanyaterlihatband1dan2.Kontrolnegatifdaritigasampelkesemuanyahanyamenunjukkanadanyaband3saja,sedangkanpadakontrolpositifdaritigasampelyangdianalisishanyasatuyangmenunjukkanadanyaband1dan2.

Polimorfismejugaterlihatpadasemuakelompokperlakuan,sedangkanpadakontrolnegatiftidakterlihatadanyapolimorfisme.Perbedaantersebutmemberikanpenjelasanbahwaterdapatperbedaanantaraperlakuandankelompokkontrol.Kelompokperlakuanyaitukelompokyangmenerimaimunostimulandaninfeksimenunjukkanlebihbanyakbandyangmunculdaripadakelompokkontrol.Haltersebutdapatdipahamibahwapenggunaanimunostimulandaninfeksiyangdiberikanberpengaruhpada DNA mitokondria (16s rRNA) yang ditandai dengan banyaknyabandyangterlihat,lebihbervariatifnyabandyangmunculdapatdiartikanbahwaimmunostimulanmemberikanperanyangbesardalamupayamenangkaladanyainfeksidalamtubuhudang.

Berbedapadakelompokkontrolnegatifyangtidakmenerimaperlakuanyanghanyamenunjukkansedikitvariasidalammunculyaband,demikianjugapadakontrolpositifyangtidakmenerimaimunostimulantetapidiinfeksidenganbakterisehinggadaritigasampelyangdianalisishanyasatusampelyangmenunjukkanterlihatnyaband2dan3.

Hasil elektroforesis juga menunjukkan bahwaketiga perlakuan (A, B dan C) menunjukkan pengaruh

apabiladianalisismenggunakanenzimrestriksiMboI.Terlihatnyaband2dan3padakelompokkontrolpositifyang menunjukkan pola yang sama dengan kelompok A dan B dapat disebabkan dari kekebalan non spesifik dari udang itusendiriyangsecaraalamiahmunculdalammeresponadanyainfeksitanpadibantuadanyaimunostimulan.

Padagaris4,8,10,11,12,13,dan14menunjukkanpolayangsama,halinidimungkinkanadanyamutasiyangdisebabkanolehimunostimulandaninfeksisehinggasisirestriksiyangseharusnyaadamenjadihilang,demikiansebaliknyasisiyangseharusnyatidakadamenjadiada.Sedangkanperbedaanpolapitadiantarasampelpadasatuperlakuanbisadisebabkanadanyaresponindividudariudangitusendiriyangberbeda-bedadalammeresponadanyaimunostimulanatauinfeksi.

HasilperhitunganvariasigenetikmenunjukkanbahwavariasigenetiktertinggiditunjukkanpadaperlakuanBsebesar 1, kemudian disusul perlakuan A sebesar 0.66, kemudianperlakuanCsebesar0.33danEsebesar0.25sedangkanuntukperlakuankontrolnegatif (D) tidakmenunjukkanadanyavariasigenetik.

Pemotongan dengan Enzim Restriksi Hae III

Hasilelektroforesisyang telahdilakukansetelahpemotongandenganenzimrestriksiHaeIIImenunjukkanadanyapemotonganolehenzimtersebutpadafragmen290bp (band 1) dan 400 bp terlihat di band 2 padaGambar3.

Gambar 3. Elektroforesis hasil pemotongan dengan enzim restriksi Hae III. Garis 1: marker 100 bp; Garis 2-4: perlakuan A; Garis 5-7: perlakuan B; Garis 8-9: perlakuan C; Garis 10-12: kontrol negatif; Garis 13-15: kontrol positif; Garis 16: Uncut

Hasilelektroforesisjugamenunjukkanbahwapadakelompok perlakuan A, C, kontrol (-) dan kontrol (+) hanyaterlihatband2,sedangkanpadakelompokperlakuanB,diantaraketiga sampel terdapatduasampelyangmenunjukkanadanyaband1dan2.

HasilrestriksitersebutberbedadenganhasilrestriksiyangdilakukandenganmenggunakanenzimMboI.

Rozik,Fariedah,Maftuch,DariusdanMarsoedi �1

PerbedaanfragmenyangdihasilkanantaraenzimrestriksiMboIdanHaeIIIdikarenakankeduaenzimtersebutmempunyaisisi-sisirestriksiyangberbeda.PadaenzimMbo I sisi yang dipotong adalah ̂ GATC^, sedangkan pada enzimHaeIIIsisiyangdipotongadalahGG^CC.

Enzim Restriksi Nla III

HasilelektroforesisyangdilakukansetelahdilakukanpemotongandenganenzimrestriksiNlaIII tidakbisamemberikaninformasi,haliniditunjukkandengantidakadanyapemotonganpadahasilelektroforesis.Sehinggapadahasilelektroforesishanyamenunjukkanpitatunggalpadaukuran530bpsepertiterlihatpadaGambar4.

Halinibisadikarenakanbahwaimunostimulandaninfeksiyangdiberikanmenjadipenyebabhilangnyasisi-sisipemotonganyangseharusnyaada,sehinggapadasaatdigunakanenzimrestriksiNlaIIItidakdijumpailagisisi-sisiyangakandipotong.

Gambar 4. Elektroforesis hasil pemotongan dengan enzim restriksi Nla III. Garis 1: marker 100 bp; Garis 2-4: perlakuan A; Garis 5-7: perlakuan B; Garis 8-9: perlakuan C; Garis 10-12: kontrol negatif; Garis 13-15: kontrol positif; Garis 16: Uncut

PEMBAHASAN

Amplifikasi PCR yang dilakukan menggunakan primer 16s rDNA F dan 16s rDNA R menunjukkan bahwa primer tersebut dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah 16s rRNA di DNA mitokondria dengan ukuran fragmen 530 bp. Mitokondriamerupakankomponenpentingpadasemuaselberinti,olehkarenaitugen-genyangmempengaruhimitokondriamempunyaiperansentralyangberhubungandengankesehatandanterjadinyapenyakit.Padamanusia,hampir seluruh gen DNA mitokondria berhubungan dengan penyakit.Meskipunpenyakit-penyakitmitokondriadapatdisebabkanolehterjadinyamutasigenintikarenabanyaknyaproteinmitokondriadikodediintidankemudiandikirimkeorganel-organel(Guix,2007).

Penyakit-penyakit yang berhubungan dengan DNA mitokondriadapatjugadisebabkankarenamutasigenyangterjadi secara spontan pada DNA mitokondria atau DNA

inti,ataujugadikarenakanfaktorluarsepertiobat-obatan,racun,daninfeksi.

Mutasi pada DNA mitokondria secara patologi telahdiketahuilebihdarisatudekadeyanglalu,tetapimekanismenyabelumdiketahuisecarapasti.Namunsaatinilebihdari100mutasititikdan200delesidanterjadinyapengaturan kembali DNA mitokondria telah dihubungkan dengan penyakit. Sayangnya, tingginya nilai polimorfisme pada DNA mitokondria melengkapi dugaan adanya mutasi padaindividutersebut(Guix,2007).

Lebih lanjut Guix (2007) menyatakan bahwa, mutasi DNA mitokondria dapat diklasifikasikan menjadi 3 klasifikasi, yaitu: (i) mutasi titik yang berpengaruh pada gen yangmengkodeprotein,(ii)mutasititikyangberpengaruhpadasintesisprotein,dan(iii)adanyadelesiyangcukupbesar.

PadapenelitianinidapatdiketahuibahwaimunostimulandanadanyainfeksiolehbakteriVibrio harveyimemberikanpengaruh pada DNA mitokondria terutama pada gen 16s rRNA. Adanya polimorfisme pada gen 16s rRNA dapatdikarenakanadanyamutasititikyangberpengaruhpada sintesis protein (16s rRNA merupakan gen DNA mitokondriaberperandalamproduksiprotein)sepertiyangtelahdikatakansebelumnyabahwamutasidapatdisebabkanfaktorluarsepertiobat-obatan,racundaninfeksi.

Adanya polimorfisme dapat juga disebabkan adanya hambatandalammemperolehmateridari luar tubuhuntuk digunakan sebagai bahan metabolisme atausintesisproteinkarenaseranganVibrio harveyipadamulanyaakanmenyeranginsangdanhepatopankreasyangkemudiandicirikandenganproduksilendiryangberlebihan. Polimorfik dapat terjadi dari perubahan genetik yangdihasilkandarimutasititik,delesidaninsersisertaperubahanlainnya.

InfeksiolehVibrio harveyi dapatmelaluiinsang,kulitdanhepatopankreas.Gejalaklinisyangtelahdiamatipadaudangyangterserangakantampakdenganperubahanwarnakulityangmenjadikusamataupucat,adanyalukasepertibekasterpotongpadaekorataurostrumdenganwarnamerahsepertitelahterbakar,tubuhudangmenjadilunak,hilangnyanafsumakan.Jikadilakukanpembedahandandilakukanpengamatanakantampakpembengkakandankerusakanpadaorgan,sepertiinsangdanhepatopankreas(Ingliset al,1993).

Infeksi Vibrio harveyi pada 16s rRNA udang windu diduga berpengaruh pada sintesis protein (16s rRNA berperandalamsintesisprotein).Prosestranslasiyangmelibatkan mRNA, tRNA, dan dua subunit ribosoom dimungkinkantidakterjadisecaranormal.Kerusakanataugangguan pada 16s rRNA yang disebabkan adanya infeksi

PengaruhImunostimulanOuter Membran Protein(OMP)Vibrio alginolyticusdanInfeksiVibrio harveyi��

dapatmenyebabkanribosomtidakdapatmengenalidantidakdapatmelekatpadasisiperlekatanyangterdiridariurutan basa tertentu di mRNA (ribosom binding site)yangpadaprokariotdisebutsebagaiShine-dalgarno,sedangkanpada eukariot dilakukan oleh ujung 5'. Apabila masih dapat mengenalimakadapatterjadipenempelanpadaribosom binding sitetersebut,kerusakanlainyangmungkindapatterjadiadalahtidakmampunyasubunitribosombesarmelekat pada gabungan sub unit ribosom kecil dan mRNA, sehingga secara otomatis tRNA yang akan berdatangan satu demi satu ke kompleks ribosom-mRNA ini dengan urutan sesuaidenganantikodondanasamaminoyangdibawanyatidakdapatbekerjasesuaifungsinya,karenapadasubunitbesarribosomtersebutterdapatduatempatperlekatanuntuktRNA yaitu sisi A dan sisi P.

Gangguanpadaprosestranslasi jugadapat terjadiapabila ribosom yang menempel pada mRNA tidak bergeser, sehingga triplet kodon yang semula berada di sisi A tidak dapatberpindahkesisiPuntukmemperpanjangrantaipolipeptida yang dibawa tRNA yang sebelumnya terikat di sisi A. Kemungkinan terjadinya kerusakan yang telah dijelaskandiatasdapatdipastikanakanmenggangguataumerusaksintesisproteinyangdiharapkanyangpadaakhirnyaberpengaruhpadaekspresigenetikpadasuatuindividu.

PerbedaannilaiheterozigositasmemberikanpenjelasanbahwakelompokperlakuanByaituperlakuandenganimunostimulan20µg/kgbwtampaklebihmemberikanpengaruh terhadap DNA mitokondria (16s rRNA) bila dibandingkan dengan kelompok perlakuan A dan C, nilai tersebutdapatdiartikanbahwakonsentrasiOMP20µg/kgbwmerupakankonsentrasioptimalbiladibandingkandenganperlakuanBdanC.KelompokKontrol(-)tidakmenunjukkanadanyavariasikarenamemangtidakdiberiperlakuanbaikberupaimunostimulanatauinfeksi.

Populasidenganvariasigenetikyanglebihtinggiakanmemlikipeluanghidupyangsemakintinggijugauntukberadaptasiterhadapkondisilingkungan,sedangkanvariasigenetikyangrendahakanmelemahkanketahananindividu-individutersebutterhadapperubahanlingkungandanseranganpenyakit(Haryantiet al,2003).

Hasilpenelitianyangtelahdilakukandapatdiambilkesimpulan bahwa amplifikasi gen 16s rRNA menggunakan primer 16s rDNA F dan 16s rDNA R mampu mengamplifikasi daerah 16s rRNA dengan ukuran 530 bp. Kemudian

pemberianimunostimulanOMPVibrio alginolyticusdaninfeksiVibrio harveyi memberikan pengaruh pada DNA mitokondriaudangwindu(Penaeus monodonFabr.)ukuran20,14±3,69gdengankonsentrasiOMPoptimaladalah20µg/kgbwdankepadatanbakteriVibrio harveyi107.Sedangkanenzimrestriksiyangdapatdigunakanuntukmelihat adanya polimorfisme pada penelitian ini adalah MboIdanHaeIII.

KEPUSTAKAAN

Almendras JME, 2001. Immunity and Biologycal Methods of DiseasePreventionandControl.InHealthManagementAquaculture. p. 137–158

FujikiK,ShinDH,NakaoM,YanoT,1997.EffectsofN-Carrageenan on The Non-Specific Defense System of Carp Cyprinuscarpio.Fish Science62,934–938.

Guix EB, 2007. Molecular Basis of Deafness Linked to Mitochondrial DNA Mutation. Doctoral Thesis .Barcelona.

HaryantiMSB,MahardikaKdanPermanaIGNg,2003.StandartMutu Benih Udang Penaeus monodon dan Lithopenaeus vannamei melalui analisis morfologi dan rasio RNA/DNA. Laporan Teknis Proyek Riset Perikanan Budidaya Laut, GondolBali.

InglisV,RobertsJ,andBromageNR,1993.BacterialDiseaseof Fish. Instintute of Aquaculture. Blackwell Science Ltd. Oxford.

Johnny Z dan Rosa D, 2008. Pemisahan Bahan Aktif Imunostimulan dari Dinding Sel Bakteri Vibrio harveyii dan UjiEfektifitasnya pada Benih Ikan Kerapu Bebek, Cromileptis altivelis. Jurnal Riset Akuakultur. �(1):19–25

Kumar N, Wazir SL, Kshitish C, Mukunda G dan Kondhadhasula R,2007.GeneticdiversityinTheIndianPopulationofPenaeus monodon (Fabricus, 1798) as Revealed by mtDNA Sequence Analysis. Aquaculture Research. 852–869. India.

KurmalyK,1992.Mikro-IngredientdanReseptorKekebalan.Roche Aquaculture Center for East. Bangkok. Thailand.

Maftuch,2006.OuterMembranProtein(Omp)VibrioalginolyticusSebagaiVaksinUntukMengendalikanPenyakitVibriosisYangDisebabkanV.alginolyticusPadaIkanKerapuTikusDiPerairan.Disertasi.ProgramPascasarjanaUniversitasBrawijaya.Malang.

VandeBraakK,2002.HaemocyticDefenceinBalckTigerShrimp(Penaeusmonodon).PhDThesis,WageningenUniversity.Netherland.

Wu J and Chang Lin, 1981. Biological Control of Fish Bacterial Pathogen Aeromonas Hydrophilla By Bacteriophage. Fish Pathology.