18

III. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pangan

Universitas Muhammadiyah Malang selama bulan Maret 2019 sampai bulan Juli

2019.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian probiotic jelly drink antara lain

blender, cabinet dryer, panci, pengaduk, kompor, thermometer, gelas ukur, kain

saring, timbangan analitik (Pioneer Ohaus PA413), tabung reaksi, rak tabung

reaksi, erlenmeyer, bunsen, jarum ose, mikro pipet ukuran 1000 µl, kapas, plastic

wrap, laminary air flow, inkubator, refrigerator, botol plastik ukuran 250 ml,

sendok, loyang, hotplate, pipet ukur, pipet filler, baskom, kertas saring,

aluminium foil, beaker glass, pH meter tipe lab 875 (SI Analytics), viscometer

(VT-RiOn type t225), corong, hand refractometer, laminary air flow, colony

counter (Fungke Gerber Type 8500), blue tip, buret, autoklaf, vortex, cawan petri,

masker, sarung tangan, dan label.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian dan pembuatan probiotic jelly

drink antara lain daun cincau perdu (Premna oblingofilia Merr) bagian 5 ruas dari

pucuk cabang dahan cincau yang diperoleh dari daerah Tangkilsari, Tajinan,

Malang dengan umur panen dua minggu, karagenan komersial yang diperoleh dari

CV. Nurra Gemilang, aquades, susu skim, sukrosa (gula pasir), kultur bakteri

19

Lactobacillus casei yang diperoleh dari Laboratorium Pengujian Mutu dan

Keamanan Pagan Universitas Brawijaya, MRS broth dan MRS agar.

Adapun bahan kimia yang digunakan untuk analisis antara lain NaOH 0,1

N, indikator PP 1%, spirtus, dan etanol 96%.

3.3 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan satu tahapan penelitian dengan Rancangan

Acak Kelompok (RAK) faktorial yang terdiri dari dua faktor sebagai berikut.

Faktor (P) proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu terdiri dari 3 taraf

yaitu:

P1 = 1:5 (0,1% karagenan : 0,5% serbuk cincau perdu)

P2 = 1:10 (0,1% karagenan : 1% serbuk cincau perdu)

P3 = 1:15 (0,1% karagenan : 1,5% serbuk cincau perdu)

Faktor (K) konsentrasi kultur bakteri Lactobacillus casei dengan kerapatan

sel 107 CFU/ml (Widowati dan Misgiyarta, 2003) yang terdiri dari 3 taraf yaitu:

K1 = 2 %

K2 = 3 %

K3 = 4 %

Tabel 1. Desain Eksperimen

Proporsi karagenan:cincau perdu Konsentrasi kultur Lactobacillus casei

K1 K2 K3

P1 P1K1 P1K2 P1K3

P2 P2K1 P2K2 P2K3

P3 P3K1 P3K2 P3K3

Keterangan:

P1K1: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:5) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 2%

20

P1K2: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:5) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 3%

P1K3: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:5) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 4%

P2K1: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:10) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 2%

P2K2: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:10) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 3%

P2K3: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:10) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 4%

P3K1: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:15) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 2%

P3K2: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:15) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 3%

P3K3: Proporsi karagenan dan serbuk cincau perdu (1:15) + Konsentrasi kultur

Lactobacillus casei 4%

Tabel 2. Tabel Acak

Kelompok

U1 U2 U3

Per

lakuan

P2K1 P3K3 P2K3

P3K2 P1K2 P3K2

P2K3 P1K3 P2K1

P3K3 P2K3 P1K3

P1K1 P2K2 P1K1

P1K2 P2K1 P2K2

P1K3 P1K1 P3K1

P3K1 P3K1 P3K3

P2K2 P3K2 P1K2

Perlakuan kombinasi yang dilaksanakan ada 9 yang mana setiap perlakuan

kombinasi diulang sebanyak 3 kali dan pelaksanaan ulangan dijadikan sebagai

21

kelompok percobaan. Data yang diperoleh dari penelitian akan dianalisis

menggunakan Analysis of Variant (ANOVA) apabila perlakuan memberi

pengaruh pada parameter pengamatan, maka akan dilajutkan menggunakan uji

lanjut DMRT α = 5%.

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan serbuk cincau perdu (Nurdin dkk., 2004 dengan

modifikasi)

Daun cincau perdu dipetik dan tangkai daunnya dibuang, kemudian dicuci

dengan air bersih. Daun cincau dipotong dengan ukuran sekitar 3 cm x 1,5 cm.

Setelah itu, dikeringkan menggunakan cabinet dryer dengan 50 oC selama 24 jam.

Daun telah kering apabila terasa renyah jika diremas. Kemudian daun cincau

kering diblender hingga mejadi bubuk.

3.4.2 Ekstraksi pektin cincau perdu (Rachmawati dkk., 2010)

Ekstraksi pektin cincau hijau perdu ini dilkakukan untuk analisis bahan

baku. Ekstraksi pektin dilakukan dengan cara serbuk cincau perdu ditimbang

sebanyak 10 gram, kemudian ditambahkan aquades sebanyak 200 ml. Selanjutnya

dihomogenkan untuk membantu proses ekstraksi. Setelah itu disaring

menggunakan kain saring sehingga diperoleh filtrate. Filtrat kemudian

ditambahkan etanol 96% dengan perbandingan 1:1, sehingga diperoleh dua fraksi

yaitu gel fraksi gel diantara cairan supernatant. Kemudian dilakukan penyaringan

dengan kertas saring untuk memisahkan dua fraksi tersebut. Gel yang diperoleh

selanjutnya dikeringkan cabinet dryer dengan 50 oC selama 24 jam.

22

3.4.3 Persiapan kultur kerja Lactobacillus casei (Trivalianza (2004) dalam

Suharyono dkk. (2012))

Kultur stok Lactobacillus casei diambil 1 sampai 2 ose kemudian

dipindahkan ke media MRS Broth steril di dalam tabung reaksi dan diinkubasi

selama 24 jam dengan suhu 37 oC. Setelah itu 1 sampai 2 ose kultur Lactobacillus

casei dari media MRS broth diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi

media susu skim 5% (0,5 gram susu skim ke dalam 10 ml aquades) yang telah

disterilisasi dengan suhu 121 oC selama 15 menit, kemudian diinkubasi selama 48

jam dengan suhu 37 oC sehingga diperoleh kultur induk. Sebanyak 4% kultur

induk (v/v) diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi media susu skim

steril (0,4 ml kultur induk ke dalam 9,6 ml susu skim steril) kemudian diinkubasi

selama 48 jam dengan suhu 37 oC sehingga diperoleh kultur antara. Sebanyak 4%

kultur antara diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer yang berisi susu skim steril

dengan penambahan sukrosa 3% (4 ml kultur antara ke dalam 96 ml media susu

skim) kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 oC sehingga diperoleh

kultur kerja.

3.4.4 Pembuatan probiotic jelly drink (Suharyono dkk. (2009) dengan

modifikasi)

Serbuk daun cincau dicampurkan dengan 300 ml air panas (+ 100 oC)

sesuai dengan perlakuan yang telah ditentukan yaitu perbandingan 5, 10, 15

(0,5%; 1%; dan 1,5%) dari perbandingan karagenan. Kemudian diaduk selama 15

menit dan disaring menggunakan kain saring. Setelah itu ditambahkan 2% susu

skim dan 4% sukrosa, kemudian diaduk hingga homogen. Selanjutnya

ditambahkan karagenan sesuai dengan perlakuan yaitu 0,1%, kemudian diaduk

dan dipanaskan dengan suhu 80-85 oC selama 5 menit. Setelah itu dimasukkan ke

23

dalam botol dan didinginkan, lalu diinokulasikan kultur kerja Lactobacillus casei

sesuai perlakuan yaitu 2%, 3%, dan 4%. Kemudian diinkubasi selama 16 jam

dengan suhu 37 oC.

3.5 Prosedur Analisa

3.5.1 Analisa Rendemen (AOAC, 1995)

1. Daun cincau hijau segar yang telah dicuci bersih ditimbang

2. Dilakukan pengeringan dan diperkecil ukurannya

3. Serbuk cincau hijau kering ditimbang

4. Besarnya rendemen dapat di peroleh dengan rumus :

Rendemen (%) =berat bahan kering

berat bahan segar×100%

3.5.2 Total Asam Tertitrasi (TAT) (AOAC, 1995)

1. Sampel diambil sebanyak 5 ml

2. Diencerkan dengan aquades pada labu ukur 100 ml hingga batas tera dan

dihomogenkan

3. Disaring menggunakan kertas saring

4. Filtrat diambil sebanyak 10 ml dan ditambahkan 2-3 tetes indicator PP 1%

5. Dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga berwarna merah muda tipis

6. Perhitungan dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

Total Asam Tertitrasi (Asam Laktat) (%) =V NaOH x N NaOH x Fp x BM

V Sampel x 1000×100%

3.5.3 pH (AOAC, 1995)

1. Sampel disiapkan di dalam beaker glass 100 ml

2. Sebelum dilakukan pengukuran, pH harus distandarisasi dahulu dengan

menggunakan larutan buffer 7,0.

24

3. Elektroda pH dicelupkan ke dalam sampel yang berada di dalam beaker glass

4. Dibiarkan sampai diperoleh pembacaan yang stabil dan hasil pengujian dicatat

3.5.4 Total Bakteri Asam Laktat (BAL) (Johnson dkk., 2005)

1. Sampel diambil sebanyak 1 ml

2. Sampel diencerkan dalam aquades steril dengan perbandingan 1:9 yang

dilakukan dari 10-1-10-7

3. Pada pengenceran pertama sebanyak 1 ml sampel diencerkan ke dalam 9 ml

aquades steril, pengenceran kedua dilakukan dengan 1 ml yang sudah

diencerkan pada pengenceran pertama dimasukkan ke dalam 9 ml aquades

steril begitu seterusnya hingga pengenceran ke tujuh.

4. Media biakan dibuat dengan Man Rogosa and Sharpe (MRS) agar dengan

aturan MRS agar sebanyak 68,2 gram dilarutkan ke dalam 1000 ml aquades

kemudian disterilisasi

5. Pencawanan dilakukan dengan 1 ml sampel hasil pengenceran 10-7 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah disterilisasi kemudian dituangkan MRS agar

yang hangat hangat kuku ± 20 ml

6. Cawan petri digerak-gerakkan membentuk angka 8 agar homogen

7. Setelah padat, cawan tersebut diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37°C

selama 24 jam

8. Total bakteri asam laktat dihitung dengan rumus:

Total BAL = Jumlah koloni x 1

Faktor pengenceran

3.5.5 Daya Sineresis (Yuwono dan Susanto, 1998)

1. Sampel ditimbang sebanyak 1 gram

2. Ditimbang kertas saring (A)

25

3. Sampel diletakkan pada kertas saring dan dibiarkan selama 60 menit

4. Sampel diambil dari kertas saring

5. Kertas saring ditimbang (B)

6. Perhitungan dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

Sineresis (mg/menit) =B

A

3.5.6 Viskositas (Yuwono dan Sukardi, 2001)

1. Spindle dipilih sesuai dengan konsentrasi bahan atau tingkat kekentalan bahan

2. Pangkal spindle dimasukkan pada lubang penghubung rotator

3. Sampel diletakkan pada penyangga sampai spindle masuk ke dalam sampel

4. Tombol ON ditekan sampai spindle berputar dan menunggu sampai

menunjukkan angka yang konstan, angka tersebut merupakan viskositas yang

dicari

5. Viskositas dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :

Viskositas= Skala x Faktor konversi (nomor spindle 2 dan kecepatan putar 12)

3.5.7 Total Padatan Terlarut (Yuwono dan Susanto, 1998)

1. Alat dan bahan disiapkan, penutup kaca prisma dibuka, lalu aquades diteteskan

sebanyak satu tetes, kaca prisma ditutup perlahan dan memastikan aquades

memenuhi kaca prisma

2. Refraktometer diarahkan ke cahaya terang, pembacaan skala dilihat dapat

melalui lubang teropong, jika skala kabur, putar lubang teropong dan pastikan

garis biru pada 0° Brix

3. Kaca prisma dibuka dan dibersihkan menggunakan bahan lembut dan kering

dengan cara satu arah

26

4. Kaca prisma dibuka kembali kemudian sampel diteteskan sebanyak 1 tetes

kemudian tutup kaca prisma

5. Skala dilihat melalui lubang teropong, batas garis skala adalah antara garis

putih dan biru

3.5.8 Organoleptik (Krissetiana, 2014)

Pengujian organoleptik yang dilakukan yaitu uji hedonik atau kesukaan

dengan menggunakan 25 panelis untuk mengetahui respon terhadap sifat-sifat

produk yang lebih spesifik seperti keasaman, aroma, tekstur dan kesukaan.

Masing-masing uji terdiri dari Sembilan sampel probiotic jelly drink dengan

perlakuan yang berbeda. Pada setiap meja panelis disediakan probiotic jelly drink

yang akan diuji. Disamping sampel yang diuji, disediakan satu gelas air minum

untuk menetralkan indera pengecap setiap kali sesudah merasakan sampel yang

diuji. Selain itu, disediakan pula formulir isian uji sensoris. Panelis secara

bergantian dan berurutan diwajibkan merasakan probiotic jelly drink yang diuji

dan menilai sampel tersebut sesuai dengan selera masing masing. Skor penilaian

organoleptik disajikan pada Tabel 6.

27

Tabel 3. Skor Penilaian pada Analisa Organoleptik Probiotic Jelly Drink

Skor Aroma Rasa Kenampakan Daya Hisap

1 Sangat tidak

khas

Sangat tidak

asam

Sangat tidak

menarik

Sangat sulit

dihisap

2 Tidak khas Tidak asam Tidak menarik Sulit dihisap

3 Agak tidak

khas

Agak tidak

asam

Agak tidak

menarik

Agak sulit

dihisap

4 Agak khas Agak asam Agak menarik Agak mudah

dihisap

5 Khas Asam Menarik Mudah

dihisap

6 Sangat khas Sangat asam Sangat menarik Sangat

mudah

dihisap

7 Amat sangat

khas

Amat sangat

asam

Amat sangat

menarik

Amat sangat

mudah

dihisap

Gambar 1. Diagram Alir Pembuatan Serbuk Cincau Perdu

Dicuci bersih dan dipotong 3

cm x 1,5 cm

Dikeringkan (T=50 oC, t= 24

jam)

Serbuk cincau perdu

Daun cincau perdu

Pengecilan ukuran

Air Air kotor

28

Gambar 2. Diagram Alir Persiapan Kultur Kerja Lactobacillus casei

Kultur kerja L.casei

Kultur Lactobacillus

casei

Dipindahkan ke media MRS Broth steril

Inkubasi (T=37 oC, t=24 jam)

1-2 ose kultur L.casei diinokulasikan ke media susu skim steril 5%

Kultur induk 4% (v/v) diinokulasikan ke media susu skim steril 5%

Inkubasi (T=37 oC, t=48 jam)

Kultur induk

Inkubasi (T=37 oC, t=48 jam)

Kultur antara

Kultur antara 4% (v/v) diinokulasikan ke media susu skim steril 5% +

sukrosa 3%

Inkubasi (T=37 oC, t=24 jam)

29

Gambar 3. Diagram Alir Pembuatan Probiotic Jelly Drink

Ampas

cincau

Analisa:

- TAT

- pH

- Total BAL

- Daya

sineresis

- Viskositas

- TPT

- Organoleptik

0,5%; 1%; dan 1,5%

serbuk cincau perdu

Homogenisasi (t=15 menit) Air panas

(T= + 100 oC)

Penyaringan

Pencampuran 2% susu skim, 4%

sukrosa, 0,1%

karagenan

Pemanasan dan

homogenisasi

(T= 80 oC, t=5 menit)

Filling ke dalam botol

Inkubasi (T= 37 oC, t=16 jam)

2%, 3%, 4%

kultur L.casei

Probiotic jelly

drink