III

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1 Bahan Penelitian

3.1.1 Objek Penelitian

Objek yang digunakan dalam penelitian ini adalah semen dari satu ekor

kambing Peranakan Etawah (PE) yang berumur sekitar 3 tahun, yang setiap harinya

diberi pakan rumput, leguminosa, dan konsentrat. Semen akan ditampung 2 kali per

minggu pada hari Senin dan Kamis pukul 07.00 WIB.

3.1.2 Bahan dan Peralatan Penelitian

Adapun bahan dan peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

sebagai berikut:

a. Penampungan Semen

Proses penampungan semen menggunakan bahan dan peralatan sebagai berikut,

vaselin, air hangat, label kertas, vagina buatan khusus untuk kambing, tabung

koleksi semen segar, alumunium foil, pompa udara, dan kandang jepit.

b. Evaluasi Semen

Proses evaluasi semen menggunakan bahan dan peralatan sebagai berikut,

semen segar hasil penampungan, NaCl fisiologis, pewarna eosin, tabung koleksi

semen, rak tabung, pH indikator, object glass, cover glass, counter, bunsen, batang

pengaduk, pipet thoma hemocytometer dan kamar hitung neubaeur, mikroskop, dan

tisu.

c. Pengenceran Semen

Proses pengenceran semen menggunakan bahan dan peralatan sebagai berikut,

semen segar kambing PE, Brackett–Oliphant (BO), kuning telur, asam sitrat,

17

gliserol, aquabidestilata, tabung reaksi, timbangan analitik, gelas ukur, spatula,

alumunium foil, rak tabung, pipet mikro, batang pengaduk, kertas saring, kertas

label, dan tisu.

d. Separasi dan Pencucian Spermatozoa

Proses separasi dan pencucian spermatozoa menggunakan bahan dan peralatan

sebagai berikut, semen, Bovine Serum Albumin (BSA-Sigma), media Brackett –

Oliphant (BO), tris kuning telur, Penicillin (Procaine Penicillin-G) dan

Streptomycin (Streptomycin Sulfate), aquabidestilata, water bath, tabung reaksi,

rak tabung, tabung sentrifugasi, alat sentrifugasi, mikro pipet, dan kertas label.

e. Pengemasan Semen Cair

Proses pengemasan semen cair menggunakan bahan dan peralatan sebagai

berikut semen hasil sexing, mini straw volume 0,25 mL, selang plastik penghisap,

pompa penghisap, dan tepung polyvinyl alcohol (sealing straw).

f. Pembekuan Semen Cair

Proses pembekuan semen cair menggunakan bahan dan peralatan sebagai

berikut, N2 cair, mini straw volume 0,25 ml yang berisi semen hasil sexing, rak besi,

styrofoam, penjepit besi, termometer, goblet, canister, container, dan pinset.

g. Thawing Semen Cair

Proses Thawing semen cair menggunakan bejana berisi air hangat dengan suhu

38°C, gunting, pinset, dan tisu.

h. Pengamatan Rasio Sperma X:Y

Proses pengamatan Rasio Sperma X:Y menggunakan bahan dan peralatan

sebagai berikut, semen cair, tabung reaksi, object glass, cover glass,counter, dan

mikroskop.

18

i. Pengamatan Keutuhan Akrosom

Proses pengamatan keutuhan akrosom menggunakan bahan dan peralatan

sebagai berikut, semen kambing PE, formalin 1%, NaCl fisiologis, aquabidestilata,

mikroskop, bunsen, object glass, cover glass, dan tabung reaksi.

3.2 Metode Penelitian

3.2.1 Prosedur Penelitian

Adapun prosedur yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai

berikut:

a. Peracikan Media BO (Brackett–Oliphant)

Media BO dibuat sehari sebelum pelaksanaan separasi spermatozoa, karena

larutan BO yang digunakan dalam separasi spermatozoa harus dalam keadaan

segar. Media BO digunakan dengan melarutkan dua larutan stok A yang terdiri dari

0,1 M NaCl, 0,005 M KCl, 0,001 M NaH2PO4.H2O, 0,004 M CaCl2.2H2O, 0,01 M

MgCl2.6H2O yang dilarutkan dalam aquabidestilata dan stok B yang terdiri dari

0,06 M NaHCO3 juga dilarutkan ke dalam aquabidestilata. Volume BO yang

digunakan untuk separasi dalam satu kali ulangan adalah 100 ml, yang terdiri dari

76 ml stok A dan 24 ml stok B.

b. Penampungan Semen

Penampungan semen segar dilakukan dengan menggunakan Artificial Vagina

(AV) khusus kambing yang terdiri dari corong karet, silinder, selongsong karet, dan

tabung kolektor. Langkah pertama adalah AV diisi dengan air hangat dengan suhu

berkisar antara 38°C - 40°C, udara ditiupkan ke selongsong karet dengan

menggunakan pompa udara, selanjutnya selongsong karet yang telah berisi udara

dioles dengan menggunakan vaselin (Toelihere, 1981). Penampungan semen segar

19

akan dilaksanakan 2 kali dalam seminggu pada hari Senin dan Kamis pada pukul

07.00 WIB.

Pemancing atau teaser yang digunakan adalah kambing PE betina yang diikat

pada kandang jepit. Penampungan dilakukan pada mounting kedua, setelah semen

segar terkumpul di tabung koleksi, kemudian pada bagian badan tabung kolektor

ditutupi oleh alumunium foil untuk segera dibawa ke laboratorium.

c. Evaluasi secara Makroskopis

Evaluasi makroskopis pada semen segar meliputi :

1) Volume Semen Segar

Volume semen segar kambing PE diketahi dengan melihat skala yang tertera

pada tabung koleksi. Volume yang dihasilkan dalam satu kali penampungan

berkisar antara 0,5 mL – 1,5 mL.

2) Konsistensi Derajat Kekentalan

Konsistensi derajat kekentalan pada semen segar kambing PE diketahui dengan

cara memiringkan tabung koleksi alu segera menegakannya kembali, apabila

jatuhan semen lambat menunjukkan konsistenti semen tinggi (kental), dan apabila

jatuhan semen cepat menunjukkan konsistensi semen rendah (cair).

3) Warna Semen Segar

Warna semen segar kambing PE diketahui dengan cara melihat langsung pada

tabung koleksi. Semen segar kambing PE normal memiliki warna putih krem.

4) Bau Semen Segar

Bau pada semen segar kambing PE diketahui dengan mencium langsung bau

semen pada tabung koleksi. Semen segar kambing PE normal memiliki bau khas

semen kambing.

20

5) pH Semen Segar

Derajat keasaman atau pH diketahui dengan cara menempelkan pH indikator

pada semen hasil penampungan. Derajat keasaman atau pH normal dari semen

kambing PE rata-rata berkisar di angka 7,0.

d. Evaluasi secara Mikroskopis

Evaluasi secara mikroskopis pada semen meliputi :

1) Gerakan Massa Spermatozoa

Gerakan massa diamati dengan cara semen segar kambing PE hasil

penampungan diteteskan ke atas object glass kemudian diletakan di bawah

mikroskop dengan perbesaran 10x10 untuk diamati pergerakan spermatozoa dalam

satu kelompok yang memiliki kecenderungan bergerak ke satu arah secara

bersamaan membentuk gelombang yang tebal tipis.

Penilaian gerak massa ditentukan berdasarkan kecepatan berpindah gerak

sperma dengan klasifikasi sebagai berikut (Toelihere, 1981) :

a) (+++) atau sangat baik, bila terlihat gelombang-gelombang besar, banyak,

gelap, tebal, dan bergerak cepat.

b) (++) atau baik, bila terlihat gelombang-gelombang kecil, tipis, jarang, kurang

jelas, dan bergerak lamban.

c) (+) atau cukup, bila tidak terlihat gelombang melainkan hanya gerakan-

gerakan individual aktif progresif.

d) (N, necrospemia atau O) atau buruk, bila hanya sedikit atau tidak ada

gerakan-gerakan individual.

2) Konsentrasi Total Spermatozoa

Konsentrasi total spermatozoa dihitung menggunakan Hemacytometer dan

kamar hitung Neubauer. Langkah pertama adalah semen yang belum diencerkan

21

dihisap perlahan menggunakan pipet Thoma Erythrocyte sampai tanda 0,5 yang

tertera pada Hemacytometer kemudian hisap kembali laruran NaCl 3% 0,1 M

hingga tanda 101. Langkah berikutnya adalah menggocok pipet selama 1-2 menit

membentuk angka delapan horizontal. Buang satu tetes pertama larutan yang

terdapat pada pipet Erythrocyte, baru setelah itu teteskan larutan tersebut pada sisi

cover glass kamar hitung Neubauer.

Perhitungan sel spermatozoa dilakukan secara diagonal dengan menghitung

pada 5 kamar di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x40. Setiap kamar

memiliki 16 ruangan kecil, sehingga total keseluruhan terdapat 80 ruangan kecil.

Hemacytometer memiliki total 400 ruangan kecil, volume dari setiap ruangan kecil

adalah 0,1 mm3 dan pengenceran 200 kali, maka dapat dihitung konsentrasi sperma

dengan perhitungan sebagai berikut (Toelihere, 1981) :

Konsentrasi Total = Jumlah spermatozoa × 107 sperma per ml

3) Motilitas Sperma

Perhitungan motilitas sperma dihitung menggunakan Hemacytometer dan

kamar hitung Neubauer. Perhitungan motilitas spermatozoa dilakukan setelah

mendapatkan konsentrasi total spermatozoa kemudian setelah itu menghitung

konsentrasi spermatozoa mati. Motilitas spermatozoa dapat dihitung menggunakan

rumus (Toelihere, 1981) :

%M =KT-KM

KT×100%

Keterangan:

M : Motilitas

KT : Konsentrasi Total

KM : Konsentrasi Sperma Mati/ Non Motil

22

4) Rasio Sperma X:Y

Perhitungan rasio sperma X:Y dilakukan dengan membuat preparat ulas

spermatozoa dari masing-masing fraksi semen dengan pewarnaan diferensial

menggunakan larutan eosin 2%, Langkah berikutnya adalah pengukuran panjang

dan bagian terlebar kepala spermatozoa dilakukan di bawah mikroskop cahaya

pembesaran 10 x 100 dengan menggunakan lensa mikrometer. Jumlah spermatozoa

yang dihitung dari masing-masing fraksi adalah 200 sel spermatozoa, yang

berukuran kepala lebih besar dari rata-rata dikategorikan sebagai spermatozoa X,

sedangkan bila ukuran kepala lebih kecil dari rata-rata dikategorikan sebagai

spermatozoa Y.

Ilustrasi 1. Perhitungan Luas Kepala Spermatozoa

Keterangan :

A : Bagian Terpanjang Kepala Spermatozoa

B : Bagian Terlebar Kepala Spermatozoa

Sumber : Putra, dkk. 2012

23

5) Keutuhan Akrosom

Keutuhan akrosom pada spermatozoa kambing PE diamati dengan melihat

kondisi kesempurnaan kepala spermatozoa menggunakan mikroskop fase kontras

pada pembesaran 10x40. Langkah pertama adalah menyiapkan sperma kambing PE

hasil sexing post thawing sesuai dengan perlakuan yang diamati, kemudian

sebanyak 0,9 gram NaCl dilarutkan dengan aquabidestilata hingga mencapai 100

mL, dan 1 mL formalin ke dalam larutan NaCl fisiologis. Kedua larutan yang telah

dibuat kemudian dicampurkan hingga homogen. Langkah selanjutnya, semen yang

telah ditempatkan pada object glass diteteskan dengan larutan campuran formalin

dan NaCl untuk kemudian dibuat preparat ulas.

Pengamatan dilakukan dengan melihat total 200 sel spermatozoa dengan

tudung akrosom menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10x40. Tudung

akrosom utuh ditandai dengan penutup bagian ujung spermatozoa berwarna hitam,

dan tudung akrosom yang rusak bagian ujung spermatozoa berwarna putih

mengkilat.

Ilustrasi 2. Pengamatan Tudung Akrosom Utuh Spermatozoa

Sumber : Situmorang, 2013

24

e. Separasi dan Pencucian Spermatozoa

Separasi dilakukan dengan cara memasukan larutan BSA 10% dan 5% masing-

masing 2 ml kedalam tabung, kemudian masukan 1 ml semen yang telah diencerkan

dengan BO dengan perbandingan semen dan BO yaitu 1:3 pada tabung yang sama.

Inkubasi tabung yang telah berisi larutan BSA dan semen dalam water bath pada

suhu 38oC selama 45, 60 dan 75 menit, setelah diinkubasi 1 ml larutan bagian atas

dibuang karena dianggap sebagai spermatozoa mati dan 4 ml larutan berikutnya

dipisahkan berdasarkan batas antara konsentrasi larutan 5% dan 10%, lapisan

bagian atas diberi label X dan lapisan bawah diberi label Y. Tambahkan larutan BO

sebanyak 3 ml pada masing-masing tabung dan sentrifugasi dengan kecepatan 1800

rpm selama 10 menit, setelah disentrifugasi cairan supernatan dibuang sedangkan

bagian bawah yang berbentuk pellet merupakan spermatozoa hasil separasi. Pellet

tersebut kemudian diencerkan dengan tris kuning telur sebanyak 1 ml yang telah

mengandung antibiotik penicillin dengan dosis 1000 IU/ml pengencer dan

streptomycin dengan dosis 1 mg/ml pengencer juga penambahan gliserol dengan

konsentrasi 6% dari total pengencer untuk selanjutnya dilakukan pengemasan

semen cair.

f. Pengemasan Semen Cair

Pengemasan semen cair menggunakan straw model IMV Prancis dengan

volume 0,25 mL. Bagian straw yang memiliki sumbat pabrik dihubungkan dengan

selang plastik, sedangkan ujung selang plastik lain dihubungkan dengan pompa

penghisap. Semen cair kemudian dituangkan ke dalam cawan untuk pengisian

straw. Pompa penghisap yang telah terhubung ke selang plastik dan straw

kemudian dihidupkan. Ujung straw yang telah berisi semen ditutup dengan

25

menggunakan tepung polyvinyl alcohol. Pengemasan semen cair dilakukan pada

suhu 5°C.

g. Equilibrasi

Straw yang telah berisi semen cair kemudian disimpan ke dalam lemari es

dengan temperatur 5°C selama 2-4 jam, proses ini dinamakan proses equilibrasi.

Proses ini bertujuan agar spermatozoa menyesuaikan diri dengan pengencer dan

persiapan sebelum proses pembekuan.

h. Pembekuan Semen Cair

Proses pembekuan semen cair dilakukan secara dua tahap. Tahap pertama

adalah prefreezing yaitu proses menguapi straw dengan uap Nitrogen cair di dalam

stryofoam dengan suhu -80°C sampai dengan suhu -100°C selama 7-8 menit dengan

jarak straw dengan permukaan Nitrogen cair setinggi 3-5 cm. Tahap kedua adalah

freezing yaitu proses pembekuan semen cair dengan cara meletakan straw yang

telah melewati proses prefreezing di dalam goblet dengan menggunakan pinset,

goblet kemudian ditempatkan ke dalam canister untuk kemudian diletakan ke

dalam container berisi Nitrogen cair. Suhu container mencapai -196°C.

i. Thawing Semen Beku

Proses thawing semen beku dilakukan dengan cara memasukan straw ke dalam

bejana air dengan suhu 38°C selama 30 detik. Semen yang telah dibekukan

dicairkan kembali setelah satu hari untuk kemudian dilakukan evaluasi semen beku.

j. Evaluasi Semen Beku

Proses evaluasi semen beku dilakukan setelah proses thawing selesai. Proses

evaluasi semen beku dilakukan secara mikroskopis dengan peubah yang diamati

berupa rasio sperma X:Y dan keutuhan akrosom sperma kambing PE.

26

3.2.2 Perlakuan Percobaan

Terdapat tiga perlakuan yang dicobakan dalam penelitian ini, yaitu :

P1 = 45 menit waktu inkubasi

P2 = 60 menit waktu inkubasi

P3 = 75 menit waktu inkubasi

3.2.3 Peubah yang Diamati

Adapun peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

a. Rasio Sperma X:Y (%)

Morfometri adalah metode pendugaan sperma X dan Y dengan mengetahui

luas kepala spermatozoa (μm2). Luas kepala spermatozoa dihitung dengan metode

integral Riemann (Purcell dan Varberg, 1987 dalam Mardiyah, 2006) dan metode

analisis regresi (Steel dan Torie, 1995 dalam Mardiyah, 2006) untuk mengetahui

hubungan antara ukuran panjang dan lebar dengan luas kepala sperma, dari hasil

perhitungan didapatkan nilai dari setiap ukuran yang selanjutnya akan

dibandingkan dengan rata-rata nilai ukuran spermatozoa semen segar (kontrol) dari

masing-masing ulangan sebanyak 200 spermatozoa. Nilai yang lebih besar dari

rata-rata luas kepala spermatozoa pada masing-masing kontrol digolongkan

spermatozoa X, sedangkan yang lebih kecil digolongkan spermatozoa X. Rumus

perhitungan luas kepala spermatozoa adalah sebagai berikut :

LKS = (0,8988 x P x L) – 1,63

Keterangan :

LKS : Luas Kepala Spermatozoa

0,8988 : Faktor koreksi dari data integral untuk menentukan luas kepala

sperma dari setiap satuan ukuran dan metode regresi untuk

27

menentukan hubungan ukuran panjang dan lebar dengan luas kepala

sperma.

P : Bagian terpanjang dari kepala sperma

L : Bagian terlebar dari kepala sperma

1,63 : Nilai konstanta regresi

Hasil perhitungan luas kepala spermatozoa setelah sexing kemudian akan

dibandingkan dengan rata-rata luas kepala spermatozoa kontrol untuk mendapatkan

persentase dari spermatozoa X dan Y. Persentase Spermatozoa X dan Y akan

dihitung menggunakan rumus :

Spermatozoa X (%) =Jumlah Spermatozoa X

Jumlah spermatozoa yang dihitung (200 sperma)×100%

Spermatozoa Y (%) =Jumlah Spermatozoa Y

Jumlah spermatozoa yang dihitung (200 sperma)×100%

b. Keutuhan Akrosom (%)

Evaluasi keutuhan akrosom dilakukan dengan melihat bagian kepala

spermatozoa yang menunjukkan warna hitam pada bagian ujung kepala

spermatozoa, hal tersebut menunjukkan tudung akrosom dari spermatozoa yang

diamati masih dalam keadaan utuh. Jumlah spermatozoa yang diamati sebanyak

200. Perhitungan yang dilakukan menggunakan rumus sebagai berikut (Ichwandi,

2004 dalam Samsudewa, dkk. 2007) :

TAU (%) =Jumlah spermatozoa bertudung akrosom utuh

Jumlah spermatozoa yang dihitung (200 sperma)×100%

3.2.4 Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Metode yang digunakan adalah metode eksperimental. Rancangan

percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga

28

perlakuan dan enam kali ulangan. Model matematika Rancangan Acak Lengkap

(RAL) yang digunakan adalah:

Yij = µ + αi + εij

Keterangan:

Yij : respon hasil pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

µ : rata-rata perlakuan

αi : pengaruh perlakuan ke-i

εij : pengaruh galat yang timbul dari perlakuan ke-i pada ulangan ke-j

Selanjutnya untuk mengetahui pengaruh perlakuan dilakukan analisis ragam

dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Sidik Ragam

Sumber Keragaman db JK KT Fhitung Ftabel

Perlakuan t - 1 = 2 JKP KTP KTP

Galat t (r - 1) = 15 JKG KTG KTG

Total tr – 1 = 17 JKT

Keterangan:

db : Derajat Bebas

JK : Jumlah Kuadrat

KT : Kuadrat Tengah

t : Total Perlakuan

r : Banyaknya Ulangan

Hipotesis:

H0 : P1 = P2 = P3

H1 : P1 ≠ P2 ≠ P3 atau minimal ada sepasang perlakuan yang tidak sama.

Kaidah keputusan:

a. Bila F hitung < F tabel, maka terima H0 artinya tidak ada perbedaan yang nyata

(non significant).

29

b. Bila F hitung ≥ F tabel, maka tolak H0 dan terima H1 artinya ada perbedaan yang

nyata (significant).

Setelah menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) selanjutnya

penelitian diuji menggunakan metode Orthogonal Polynomial. Metode ini

merupakan suatu uji yang berfungsi untuk mengukur respon (hubungan fungsional

antar tanggapan) dan perlakuan-perlakuan yang terlibat dalam kisaran taraf faktor

penelitian yang diuji. Berikut model matematika yang digunakan :

Ƴ = ∝+ 𝛽1𝑥+ 𝛽2𝑥2+ ... + 𝛽𝑛𝑥n

Keterangan :

α : Intersepsi

βi : (i =1 ,2,…, n) = koefisien regresi parsial yang berasosiasi dengan derajat

polynomial ke- i

Y : Respon

X : Perlakuan

Gomez dan Gomez (1995) telah menguraikan perhitungan untuk

mendapatkan koefisien ortogonal polinomial untuk derajat polinomial pertama

(linier), derajat polinomial kedua (kuadratik), dan derajat polinomial ketiga (kubik),

sebagai berikut:

L = a+ Xi

Qi b cXi + Xi2

Ci = d+ eXi + fXi2 + Xi3

Tabel 2. Analisis Ragam Sesuai Dengan Pembandingan Ortoghonal Polynomial

Sumber

Keragaman

Derajat Bebas

(db)

Jumlah

Kuadrat (JK)

Kuadrat

Tengah (KT)

Statistik Uji F

Perlakuan

Linier

Kuadratik

Galat

Percobaan

t – 1

1

1

Sisa

JKP

JKP1

JKP2

JKG

KTP

KTP1

KTP2

KTG

F

F1

F2

Total n-1 JKT

30

Pengambilan keputusan dapat dilihat dari hasil pembandingan nilai

statistik uji F yang telah dihitung dengan nilai kritis. Penentuan derajat polinomial

didasarkan pada kontras-kontras ortogonal yang nyata, sehingga akan didapatkan

hubungan fungsi respon antar perlakuan sesuai dengan derajat polinomial yang

signifikan (Widhiarih, 2001).

3.2.5 Tata Letak Percobaan

Ilustrasi 3. Pengacakan Perlakuan

Tabel 3. Data Pengamatan

Penampungan Perlakuan

P1 P2 P3

1 P1U1 P2U1 P3U1

2 P1U2 P2U2 P3U2

3 P1U3 P2U3 P3U3

4 P1U4 P2U4 P3U4

5 P1U5 P2U5 P3U5

6 P1U6 P2U6 P3U6

Keterangan

P : Perlakuan ke (1,2,3)

U : Ulangan ke (1,2,...,6)

P3U1 P2U1 P1U1

P1U3 P1U2 P3U2

P2U2 P2U3 P1U4

P2U5 P1U5 P2U4

P3U3 P1U6 P3U4

P3U5 P2U6 P3U6

1 2 3

4 5 6

7 8 9

10 11 12

13 14 15

16 17 18