Laporan Praktikum Penyakit Infeksius 1

Tanggal : Selasa, 17 Februari 2015

Kelompok: 7 (11.00-13.30 WIB)

Ruangan : RP. Kitwan 2

Dosen : drh. Usamah Afif, M.Sc

IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM NEGATIF (Salmonella

sp.) DAN GRAM POSITIF (Micrococcus sp.) PADA

SAMPEL SUSU SAPI

Kanti Rahmi Fauziyah B04120125

Sarah Minarni Tampubolon B04120126

Noor Ihsan Anzary B. B04120127

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2015

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Susu merupakan salah satu bahan pangan yang kaya akan zat gizi. Kandungan

protein, glukosa, lipida, garam mineral, dan vitamin dengan pH sekitar 6,80

menyebabkan mikroorganisme mudah tumbuh dalam susu. Produksi susu secara

nasional belum memenuhi permintaan susu dikarenakan produktivitas sapi perah di

Indonesia yang masih rendah secara kuantitas maupun kualitas (Rosena 2010).

Pencemaran pada susu terjadi sejak proses pemerahan, dapat berasal dari berbagai

sumber seperti kulit sapi, ambing, air, tanah, debu, manusia, peralatan dan udara

(Rombaut. 2005). Mikroorganisme yang masuk ke susu mampu berkembang biak

dengan cepat. Salah satu penyebab penyakit yang berdampak pada produksi susu sapi

adalah mastitis.

Mastitis merupakan suatu peradangan pada jaringan interna ambing yang

disebabkan oleh berbagai penyebab diantaranya karena trauma atau gangguan

fisiologis, infeksi bakteri diantaranya Staphylococcus aureus, Streptococcus

agalctiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis (Quin et al. 2002).

Penyebab mastitis subklinis yang paling sering terdeteksi adalah Staphylococcus

aureus (S. aureus) dan beberapa jenis bakteri lain seperti Streptococcus agalactiae

dan Eschericia coli (Wibawan et al., 1997). Isolasi dan identifikasi merupakan

metode konvensional dalam pemeriksaan bakteri yang didasarkan pada reaksi

biokimia. Dalam isolasi dan identifikasi bakteri diperlukan media yang selektif.

Setelah dilakukan pewarnaan Gram dilanjutkan dengan uji biokimia pada berbagai

media seperti karbohidrat. Bakteri yang sudah diisolasi dan diidentifikasi selanjutnya

diuji secara serologis untuk menentukan serotipenya.

Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa mengetahui cara identifikasi

bakteri pada susu serta mengetahui jenis bakteri yang di identifikasi pada susu yang

diduga dari ambing sapi mastitis.

BAHAN DAN METODE

Alat & Bahan

Alat yang digunakan untuk identifikasi adalah ose, needle, mikroskop, api

bunsen, larutan kristal violet, larutan safranin, lugol, aquadest, larutan pemucat,

minyak emersi, xylol, kaca objek, media pertumbuhan bakteri berupa berbagai

macam sediaan agar. Bahan yang digunakan adalah susu sapi.

Metode

Tahap pertama yang harus dilakukan dalam identifikasi ini adalah mengisolasi

bakteri dari sediaan susu untuk dibuat preparat ulas. Cara yang dilakukan ialah

mengambil sampel susu dengan ose, kemudian menggoreskan pada kaca objek.

Preparat kemudian difiksasi dengan dilewatkan di atas api bunsen.

Tahap kedua adalah melakukan pewarnaan Gram pada kaca objek yang telah

diberi sampel susu. Larutan kristal violet diteteskan pada sampel yang telah difiksasi

dan dibiarkan selama 1 menit, lalu dibersihkan dengan aquadest. Selanjutnya,

preparat ditetesi dengan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit, lalu diberi

larutan pemucat (aseton alkohol) dan dibiarkan selama 10-20 detik. Kaca objek

dibilas dengan aquadest, diberi safranin selama 15 detik. Dibilas lagi dengan aquadest

dan keringkan. Setelah kering, hasil pewarnaan dapat diamati dengan mikroskop

perbesaran 100 x 10.

Setelah dilakukan pewarnaan gram, identifikasi dilanjutkan dengan

membiakkan sampel pada media MCA dan BA. Beberapa hari kemudian hasilnya

diamati, dan bakteri tersebut dibiakkan dalam agar miring untuk kemudian diuji

dengan berbagai uji biokimiawi. Setelah beberapa hari hasil dapat diamati, kemudian

dilakukan identifikasi lebih lanjut dengan uji-uji kimiawi. Uji kimiawi yang

dilakukan pada bakteri gram negative adalah uji KIA/TSIA; uji fermentasi

karbohidrat meliputi glukosa, manitol, laktosa, sukrosa, dan maltosa; uji motilitas dan

uji Indol; ujia urea; dan uji sitrat. Sedangkan pada gram positif, uji kimiawi yang

dilakukan adalah uji katalase, uji fermentasi glukosa, uji koagulase, dan membiakkan

pada Mannitol Salt Agar (MSA).

Pada uji fermentasi karbohidrat sub kultur pada agar diambil dengan mata ose

dan dimasukkan ke dalam cairan glukosa yang berwarna merah. Hal yang sama

diulangi pada cairan manitol, laktosa, sukrosa, dan maltosa. Untuk uji urea, sub kultur

diambil dengan ujung ose, kemudian dioleskan pada agar miring urea yang berwarna

kekuningan. Uji sitrat dilakukan dengan mengoleskan sub kultur pada ujung mata ose

pada agar miring sitrat berwarna hijau. Uji KIA/TSIA dilakukan dengan cara

mengambil biakan dari agar miring menggunakan needle kemudian ditusukkan pada

media agar KIA/TSIA dan dilanjutkan dengan goresan pada bagian miring media

tersebut. Untuk uji motilitas, dilakukan penusukan pada media agar lalu dialnjutkan

dengan uji Indol, yaitu menuangkan reagen Ehrlich pada biakan hasil uji motilitas.

Media yang digunakan untuk uji indol adalah media agar tegak. Setelah semua media

uji berisi sub kultur dari agar miring. Selanjutnya media uji tersebut dibiarkan dan

dilakukan identifikasi dan pemeriksaan terhadap seluruh media uji pada hari ketiga.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Jenis Uji/Teknik Identifikasi

Hasil Uji Gambar Keterangan

Pewarnaan gram

Gram positif (+) dan Gram negatif (-)

Terlihat bakteri berwarna ungu

berbentuk coccus dan terlihat pula bakteri

merah dengan bentuk basil pendek

Media Mac Conkey Agar

(MCA)

Tumbuh koloni bakteri bewarna

seperti media/bening.

Ukuran koloni besar, bentuk koloni bulat,

permukaan koloni halus, aspek koloni mengkilat, tepi koloni rata, elevasi timbul, bersifat tembus

cahaya, pigmentasi berwarna bening/sama

dengan media

Media Blood Agar (BA)

Tumbuh koloni berwarna pucat

Ukuran koloni sedang, bentuk koloni bulat,

permukaan koloni halus, aspek koloni mengkilat, tepi koloni bersemak, elevasi timbul, bersifat

opaque, pigmentasi berwarna putih

Uji Oksidase Positif Terbentuk cincin berwarna ungu

Uji KIA/TSIA Positif Bagian slant dan butt berwarna kuning; ada

gas

Uji Indol Negatif Tidak terbentuk cincin merah muda setelah direaksikan dengan

pereaksi Erlich

Uji Sitrat Positif Warna media berubah dari hijau menjadi biru

Uji Urea Positif Warna media berubah dari kekuningan

menjadi pink

Uji Fermentasi Karbohidrat

Fermentasi Gas

a. Glukosa + + Terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning;

terdapat gelembung gas.

b. Maltosa + + Terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning;

terdapat gelembung gas.

c. Manitol + + Terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning;

terdapat gelembung gas.

d. Sukrosa + + Terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning;

terdapat gelembung gas.

e. Laktosa - + Tidak terjadi perubahan warna; terdapat gelembung gas.

Uji Katalae Positif Terdapat gelembung gas

Uji Fermentasi

Glukosa

Negatif Tidak terjadi perbuahan warna

Uji Koagulase Negatif Plasma tetap cair

Membiakkan pada Mannitol

Salt Agar (MSA)

Positif Tetapi warna seperti media

Pada tahap pertama identifikasi bakteri dalam sampel susu dari sapi yang

diduga mastitis, dilakukan bakteri dari sampel susu ditanam terlebih dahulu pada

media Blood Agar dan Mac Conkey Agar (MAC). Koloni yang didapatkan dari

sampel susu yang ditanam di media Blood Agar adalah ukuran koloni sedang, bentuk

koloni bulat, permukaan koloni halus, aspek koloni mengkilat, tepi koloni bersemak,

elevasi timbul, bersifat opaque, pigmentasi berwarna putih. Pada penanaman pada

media Mac Conkey Agar (MCA) dan didapatkan koloni dengan ukuran besar, bentuk

koloni bulat, permukaan koloni halus, aspek koloni mengkilat, tepi koloni rata,

elevasi timbul, bersifat tembus cahaya, dan pigmentasi berwarna bening/sama dengan

media. Koloni yang terpisah dibiakkan pada agar miring untuk kemudian diuji

dengan berbagai uji biokimiawi. Selanjutnya dilakukan uji pewarnaan Gram. Hasil

yang didapatkan adalah terlihat adanya bakteri berwarna ungu berbentuk coccus yang

sementara menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan gram positif. Terdapat

juga bakteri merah dengan bentuk basil pendek yang sementara menunjukkan bahwa

bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif.

Berdasarkan pewarnaan Gram yang sementara menunjukkan bahwa bakteri

tersebut termasuk dalam bakteri gram positif, dilakukan uji lanjut yaitu uji katalase

untuk membedakan bakteri yang berebntuk coccus dan basil. Hasil yang didapatkan

dari uji katalase adalah positif dengan adanya gelembung udara dan dapat ditentukan

bahwa bakteri tersebut termasuk dalam Micrococcaceae. Selanjutnya dilakukan uji

fermentasi glukosa untuk mengidentifikasi genus bakteri tersebut. Dari uji yang

dilakukan didapatkan hasil bahwa tidak terjadi perubahan warna. Pada uji

pembiakkan pada MSA menunjukkan bahwa warna koloni seperti media dan koloni

bakteri tetap tumbuh. Hasil ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk dalam

genus Micrococcus.

Pada pewarnaan Gram didapatkan juga bakteri merah dengan bentuk basil

pendek yang diduga merupakan bakteri gram negatif. Untuk mengidentifkasi bakteri

tersebut dilakukan beberapa uji lanjut. Pertama, uji oksidase dilakukan untuk

mengetahui apakah bakteri tersebut dapat menguraikan enzim oksidase atau tidak dan

hasil yang didapatkan adalah positif dengan terbentuk cincin berwarna ungu.

Terdapat beberapa uji lanjut untuk mengidentifikasi bakteri tersebut. Uji KIA/TSIA

untuk membedakan genus bakteri dalam famili Enterobacteriaceae dan membedakan

Enterobacteriaceae dengan bakteri batang halus Gram negatif yang bersifat non-

fermenter. Dari uji KIA/TSIA didapatkan hasil bagian slant dan butt berwarna kuning

dan ada gas yang berarti glukosa dan laktosa difermentasi. Pada uji indol tidak terjadi

penguraian triptofan hal ini dapat terlihat dari tidak terbentuknya cincin merah muda

setelah direaksikan dengan pereaksi Erlich.

Kemudian dilakukan uji sitrat yang menunjukkan warna media berubah dari

hijau menjadi biru, artinya bakteri tersebut menggunakan sitrat sebagai satu-satunya

sumber karbon. Untuk mengetahui apakah bakteri tersebut urease maka dilakukan uji

urea dan didapatkan hasil positif yaitu warna media yang kekuningan berubah

menjadi pink. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut menghasilkan urease yang

mampu menghidrolisa urea. Uji terakhir yaitu uji fermentasi karbohidrat, pada

glukosa, sukrosa, maltosa, dan manitol terjadi perubahan warna dari merah menjadi

kuning; terdapat gelembung gas. Sedangkan pada laktosa tidak terjadi perubahan

warna pada media.

Berdasarkan uji yang telah dilakukan terutama pada uji fermentasi glukosa,

bakteri yang ditanam pada media MCA, dan uji sitrat. Pertama pada uji fermentasi

karbohidrat diketahui bahwa bakteri tersebut memfermentasikan glukosa yang berarti

bukan termasuk kelompok bakteri Gram negatif yang bersifat non-fermenter

melainkan famili Enterobacteriaceae. Terdapat beberapa bakteri yang termasuk

dalam famili tersebut diantaranya Escherichia coli, Salmonella sp., Proteus sp., dan

lain-lain. Pada MCA dikethaui bahwa warna koloni bakteri seperti warna media yang

merupakan ciri khas dari Salmonella Typhimurium (laktosa negatif). Pada hasil uji

sitrat menunjukkan bahwa media tersebut berubah warna dari biru menjadi hijau yang

berarti bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Contoh

bakteri sitrat positif adalah Salmonella sp.

Haghkhah, Ahmadi, Gheisari dan Kadivar (2011) menyatakan bahwa bakteri

mastitis subklinis yang ditemukan pada 68 peternakan sapi sapi perah yang ada di

sekitar Shiraz yaitu Staphylococcus aureus (27,94%), Streptococcus agalactiae

(20,59%), Streptococcus dysgalactiae (10,29%), Corynebacterium bovis (7,35%),

Staphylococcus epidermis (5,88%), Escherichia coli (4,41%), Bacillus lentus

(4,41%), Micrococcus spp (4,41%), Enterococcus faecalis (4,41%), Bacillus cereus

(2,94%), Corynebacterium psudotuberclosis (2,94%), Lactobacillus spp(1,47%),

Streptococcus bovis (1,47%), dan Corynebacterium renale (1,47%). Jadi

kemungkinan penyebab bakteri mastitis pada sapi yang di uji melalui sampel susunya

adalah Micrococcus sp.

KESIMPULAN

Hasil yang diperoleh dari isolasi dan identifikasi bakteri ditemukan dua

bakteri Gram negatif dan positif. Identifikasi bakteri tersebut dilakukan dengan

serangkaian uji untuk bakteri Gram positif diantaranya adalah uji katalase, uji glukosa

mikroaerofilik, uji koagulase, dan uji pada MSA. Berdasarkan serangkaian uji

tersebut dapat disimpulkan bahwa bakteri penyebab mastitis merupakan Micrococcus

sp.

DAFTAR PUSTAKA

Haghkhah M, MR Ahmadi, HR Gheisari and A Kadivar. 2011. Preliminary Bacterial

Study on Subclinical Mastitis and Teat Condition in Dairy Herds Around

Shiraz. Jurnal of Veterinary Animal Science 35(6): 387-394

Quinn PJ, BK Markey, ME Carter, WJ Donnely and FC Leonard. 2002. Veterinary

Microbiology and Microbial Disease. UK: Blackwell Science Ltd.

Rombaut R. 2005. Dairy Microbiology and Starter Cultures. Belgium: Gent

University.

Roosena Yusuf. 2010. Kandungan Protein Susu Sapi Perah Friesian Holstein Akibat

Pemberian Pakan yang Mengandung Tepung Katu (Sauropus androgynus (L.)

Merr) yang Berbeda. Samarinda: Jurusan Peternakan Fakultas Pertanian

Universitas Mulawarman

Wibawan IWT, Ch. Lämmler, and FH Pasaribu. 1997. Role of hydrophobic surface

proteins in mediating adherence of group B streptococci to epithelial cells. J.

Gen Microbiol. 138:1237-1242.