Tanggal Praktikum : 19 Maret 2013

Jam Praktikum : 14.30 - 17.00 WIB

Dosen Pembimbing : Drh. Usamah Afiff, M.Sc

Kelompok Praktikum : 8 (Delapan)

IDENTIFIKASI BAKTERI

Anggota kelompok:

1. Eling Purwanto (B04100163)

2. Wiwit Widiawati (B04100160)

BAGIAN MIKROBIOLOGIS MEDIK

DEPARTEMEN ILMU PENYAKIT HEWAN DAN KESEHATAN

MASYARAKAT VETERINER

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2013

PENDAHULUAN

Mikroorganisme yang akan dilakukan identifikasi harus berupa isolate

murni. Dalam identifikasi bakteri praktikum ini, praktikan mencoba

mengidentifikasi bakteri dalam media agar miring. Cara untuk mengidentifikasi

bakteri dilakukan pewarnaan Gram untuk mengetahui bakteri tersebut Gram

Negatif atau Gram Positif.

Identifikasi bakteri tidak hanya melihat berdasarkan bentuk, ukuran, dan

penataan, karena mikroba tidak memiliki ciri anatomis yang nyata. Hal yang perlu

diperhatikan juga adalah sifat pewarnaan, pola pertumbuhan koloni, reaksi

pertumbuhan pada karbohidrat, dan penggunaan asam amino. Untuk bakteri Gram

positif terdiri atas bentuk kokus dan batang.

Uji Triple Sugar Iron agar (TSIA) merupakan metode yang digunakan

untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam memfermentasikan gula.

Medium TSIA mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa,

terdapat juga indikator fenol merah, serta FeSO4 untuk memperlihatkan

pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam. Konsentrasi

glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa

saja yang terlihat. Medium TSIA diinokulasikan dengan menusukkan ose sedalam

¾ medium lalu menggoreskannya pada bagian slant media. (Referensi : Schiegel,

H.G. dan Karin S. 1994. Mikrobiologi Umum. UGM Press, Jogjakarta).

Uji penggunaan sitrat bertujuan untuk membedakan bakteri usus

berdasarkan kemampuan dalam memfermentasikan sitrat sebagai satu-satunya

sumber karbon. Media yang digunakan dalam uji sitrat ini adalah media agar

miring yang padat. Dalam pelaksanaan uji media yang dipakai harus mengandung

asam sitrat, NH4+ dan bromtimol biru sebagai indikator, dan sebelum diinokulasi

berwarna hijau. (Referensi : http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/diktat-

praktikum.html). Uji indol bertujan untuk menentukan kemampuan bakteri dalam

memecah asam amino triptofan. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena

tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan,

artinya bakteri ini  tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber carbon,

yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan

merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga

asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat

penguraian protein(Anonim, 2008). 

Uji urease bakteri bertujuan untuk menentukan mikroorganisme yang

mampu menguraikan urea oleh enzim urease. Media yang digunakan dalam

pelaksanaan uji urea berupa media padat berbentuk agar miring. (Referensi :

http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/diktat-praktikum.html. Uji Fermentasi

karbohidrat bertujuan untuk menguji kemampuan bakteri dalam memfermentasi

glukosa, laktosa, xilosa, arabinosa dan sukrosa. Media yang digunakan pada uji

ini bersifat cair yang berisi pepton, karbohidrat dan merah fenol sebagai

indikator, serta merah jingga sebelum diinokulasi. Hasil proses fermentasi berupa

asam akan menurunkan pH media dan mengubah warna indikator merah fenol

menjadi kuning. (Referensi : http://bakteriologi.blogspot.com/2008/12/uji-

biokimia.html)

METODOLOGI

Menentukan bakteri masuk dalam Gram positif atau Gram negatif

dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Gram. Tahapan-tahapan dalam

pewarnaan Gram, yaitu: di buat preparat ulas yang difiksasi di atas api, berikan

larutan Kristal violet selama 1 menit, kemudian cuci dengan air. Tahap

selanjutnya diberikan larutan lugol selama 1 menit dan di ikuti dengan pemberian

larutan pemucat 10-20 detik. Lalu cuci dengan air. Tahap terakhir, diberikan

larutan safranin selama 15 detik, kemudian cuci dengan air dan keringkan.

Setelah diketahui bakteri tersebut Gram positif, kemudian di lakukan uji

selanjutnya, yaitu meliputi penanaman bakteri pada media TSIA. Selain itu,

dilakukan juga uji urea, uji sitrat, uji indol, dan uji fermentasi gula ( glukosa,

galaktosa, sukrosa, maltosa, laktosa).

Penanaman bakteri pada media TSIA dilakukan dengan cara mengambilm

sedikit sampel bakteri yang tertanam dalam media agar miring menggunakan ose

yang sudah disterilisasi. Tusukkan bagian ujung ose pada dasar media agar miring

lalu tarik dan digoreskan secara zig-zag pada permukaan media agar miring.

Reaksi akan ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi merah jika

basa, dan berwarna bening jika asam. Uji kedua yaitu penanaman bakteri pada

media urea. Ambil sedikit sampel bakteri dengan menggunakan ose, kemudian

digoreskan diatas permukaan bagian yang miring dari media agar. Hasil positif

ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi merah muda. Pada uji sitrat,

bakteri ditanamkan pada daerah miring dari media agar miring secara zig-zag dan

perlahan. Reaksi akan positif jika warna yang muncul adalah berwarna biru.

Uji indol, bakteri ditanamkan pada media yang bersifat semisolid.

Penanaman bakteri dilakukan pada daerah tengah dari media sedalam 2/3

permukaan media. Uji ini dilakukan untuk mengamati motilitas bakteri, jika

pertumbuhan bakteri menyebar maka reaksi tersebut positif artinya bakteri motil.

Sedangkan jika pertumbuhan bakteri hanya pada bagian tusukkan, maka bakteri

tidak motil. Pada uji fermentasi gula, disediakan lima buah tabung yang masing-

masing berisi gula yang berberda yaitu glukosa, galaktosa, sukrosa, maltosa, dan

laktosa, serta dilengkapi dengan tabung Durham. Secara aseptik, masukkan

bakteri menggunakan ose. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna

dan terbentuknya gas yang dapat dilihat pada tabung Durham.

DIAGRAM IDENTIFIKASI BAKTERI

GRAM POSITIF

Kokus

Susunan bergerombol

Katalase Positif (+)Famili Micrococcacea

Staphylococcus

Koagulase positif (+)

Staphylococcus aureusStaphylococcus

intermediusStaphylococcus hycus

Koagulase negatif (-)

Staphylococcus non patogen

micrococcus

Susunan berantai Katalase negatif (-)

Famili Streptococcacea

Alpha hemolisisStreptococcus

agalactiae

Gamma hemolisisStreptococcus

faecalis

Beta hemolisisStreptococcus

equi

Batang

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Pewarnaan GramEscherichia coli

Pengamatan Referensi

(Referensi : AnneAhira.com)

Bentuk sel : Basil (batang)Susunan sel : diplokokusSifat gram : Gram negatif (merah)

2. Uji Fermentasi Karbohidrat

Bakteri Gambar Macam karbohidratG M L S Mi

Escherichia coli

A/G A/G A/G A/G A/-

Keterangan : A/G = karbohidrat difermentasi dan terbentuk asam dan gas A/- = karbohidrat difermentasi, terbentuk asam tanpa adanya gas

3. Uji TSIA

Bakteri Gambar pengamatan Slant Butt H2S Gas

Escherichia coli + + - -

Keterangan : (+) = ada ruang kosong, terbentuk endapan hitam ( H2S).

4. Uji Sitrat

Escherichia coli

Hasil pengamatan : negatif (-), warna hijau kekuningan.

5. Uji Indol

Bakteri Hasil Pengamatan Motilitas IndolEscherichia coli - + (cincin

merah pada permukaan media)

Keterangan : (+) pada motilitas = motil (pertumbuhan sepanjang daerah tusukan dan menyebar(-) pada motilitas = non-motil(+) pada indol = terjadi penguraian triptofan(-) pada indol = tidak terhadi penguraian triptofan

6. Uji Urea

Gambar indikatorEscherichia coli

Hasil pengamatan :Positif, warna merah muda.

keterangan : (+) = bakteri menghasilkan urea, (-) = tidak menghasilkan urea

Praktikum identifikasi bakteri minggu ini, praktikan melakukan uji-uji meliputi uji

pewarnaan gram, uji fermentasi karbohidrat, uji sitrat, uji urea, uji indol, dan uji

TSIA. Pada pewarnaan gram didapatkan hasil yang negatif, warna bakteri tersebut

adalah merah dengan bentuk basil dan strukturnya diplokokus. Saat dilakukan uji

fermentasi gula terjadi perubahan menjadi kuning (karbohidrat difermentasi) pada

semua media, terbentuk asam dan gas pada tabung Durham. Hanya satu tabung

yang tidak terbentuk gas yaitu pada media manitol. Saat uji sitrat diamati, terlihat

adanya perubahan warna menjadi hijau kekuningan pada permukaan media. Hal

ini disimpulkan bahwa uji sitrat negatif.

Hasil pada uji TSIA didapatkan adanya pertumbuhan bakteri pada bagian

slant dan butt, tetapi tidak terlihat adanya gas dan tidak terbentuk endapan hitam

(H2S). Identifikasi motilitas bakteri menggunakan uji indol didapatkan hasil yang

negatif, artinya bakteri tersebut non-motil karena terlihat pertumbuhan bakterinya

hanya pada daerah tusukan. Pada uji indol terjadi penguraian triptofan dibuktikan

dengan adanya cincin merah yang terbentuk pada permukaan media. Sedangkan

pada uji urea, didapatkan hasil yang positif dengan adanya perubahan warna

menjadi merah muda, dengan kata lain bakteri ini menghasilkan urea.

KESIMPULAN

Berdasarkan uji-uji yang praktikan lakukan yaitu uji pewarnaan gram, uji

fermentasi karbohidrat, uji sitrat, uji indol, uji urea, dan uji TSIA dapat

disimpulkan bahwa bakteri tersebut adalah Escherichia coli. Hal ini dibuktikan

dengan hasil negatif pada saat dilakukan pewarnaan gram, karena warna yang

terbentuk adalah merah. Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif yang

mempunyai struktur diplokokus dan bentuk basil.

DAFTAR PUSTAKA

Cohen-Poradosu, Ronit; Dennis L. Kasper (2007). "Group A

Streptococcus Epidemiology and Vaccine Implications". Clinical

Infectious Diseases.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka Utama:

Jakarta)

Harris L.G, Foster S.J, Richards S. G. (2002). "An introduction to

Staphylococcus aureus, and techniques for identifying and

quantifying S. aureus adhesins in relation to adhesion to

biomaterials: review". European cells and materials 4: 39–60.

Schiegel, H.G. dan Karin S. 1994. Mikrobiologi Umum. UGM Press,

Jogjakarta

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah

Malang: Malang