Laporan Praktikum Hari/tanggal: Senin, 15 April 5Mei 2014Struktur Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIBPJP: Syaefudin, SSi, MSiAsisten: Deva Krisna Kadarani Mustika Weni Puji Rahmadani

FRAKSINASI SUBSELULER(PREPARASI HOMOGENAT, ISOLASI FRAKSI INTI, ISOLASI FRAKSI MITOKONDRIA DAN ISOLASI MIKROSOM)

Kelompok 26

Khairika Helyuputri G84120093

Navia Belladina G84120059

Saepul Rahmat G84120029

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT\ PERTANIAN BOGORBOGOR2014PENDAHULUANFraksinasi subselular adalah pemecahan sel melalui homogenisasi dan pemisahan organel-organel dari satu jenis dengan lainnya menggunakan alat sentrifus. Bentuk sederhana dari sentrifus terdiri dari rotor dengan lubang untuk memasukkan wadah atau tabung berisi cairan dan sebuah motor untuk memutar rotor pada kecepatan yang dikehendaki. Prinsip kerja dari sentrifus adalah memfraksinasi organel-organel dalam suspensi sesuai dengan densitasnya. Kerja sentrifus untuk memfraksinasi suspensi didasarkan pada pengaturan pergerakan dan kecepatan rotor maupun suhu dalam sentrifus. Langkah awal untuk melakukan fraksinasi subseluler adalah menhomogenisasi sampel. Homogenisasi sampel dilakukan dengan menghancurkan sampel secara mereta dengan ditambahkan EDTA. Homogenat yang dihasilkan dari homogenisasi selanjutnya disentrifugasi menggunakan sentrifugasi diferensial kecepatan tinggi berpendingin untuk memisahkan komponen sel hati tikus menjadi fraksi-fraksi tertentu berdasarkan perbedaan densitasnya. Sentrifugasi pada percobaan ini dilakukan secara bertahap sampai diperoleh fraksi inti dan fraksi mitokondria. Sentrifius adalah sebuah alat yang digunakan untuk memisahkan partikel-partikel yang terdapat pada suatu bahan berdasarkan massa jenisnya (Palha 2002). Dalam proses pemisahan partikel ini, sentrifius menggunakan prinsip perputaran tabung dengan memanfaat gaya sentrifugal. Pada saat perputaran ini, bahan yang di sengtrifugasi tadi akan terbagi menjadi dua lapisan, yaitu supernatan yang memiliki massa jenis ringan dan pelet yang memiliki massa jenis lebih besar (Nizar dan Santoso 2007).Sentrifius terdiri atas sebuah rotor, yaitu tempat untuk meletakkan tabung-tabung yang akan disentrifugasi. Rotor ini nantinya akan berputar dengan kecepatan tertentu yang diinginkan dan perputaran inilah yang mengakibatkan partikel-partikel pada suatu bahan akan terpisah berdasarkan massa jenisnya. Semakin cepat perputaran yang dilakukan, semakin banyak pula organel sel yang dapat diendapkan begitu juga sebaliknya (Nizar dan Santoso 2007).Kecepatan sentrifus diukur dalam rpm yang tidak menggambarkan daya pemisah alat tersebut. Percobaan ini bertujuan melatih mahasiswa melakukan preparasi homogenat sel hati tikus dari hewan uji yang akan digunakan untuk fraksinasi subselular. Selain itu terampil melakukan fraksinasi pada kecepatan gravitasi sentrifus yang berbeda untuk isolasi inti dan mitokondria dari homogenate yang telah disiapkan sebelumnya.

METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat PraktikumPraktikum ini dilakukan di Laboratorium Pendidikan 1 Biokimia Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Waktu praktikum dimulai tanggal 15 April -24 Mei 2014.Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah erlenmeyer, gelas piala, gunting dan pisau bedah, alat penggerus manual (homogenizer), kain blacu, tabung reaksi, pipet volumetrik, pipet mohr, pipet tetes, tabung plastik kecil (vial), dan sentrifuse Beckman model J2-21. . Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain tikus percobaan dengan bobot 100-200 gram, larutan sukrosa 0,25 M-EDTA 1 mM dingin, larutan sukrosa 0,25 mM-CaCl2 3 mM dingin, dan eter.Prosedur Percobaan Preparasi homogenat sel hati tikus. Tikus percobaan dengan bobot 100-200g disiapkan dan diperlakukan dengan kasih sayang. Lalu tikus dibius dengan eter berlebih. Setelah tikus terbius, tikus ditelentangkan dan dibedah bagian perutnya menggunakan pisau dan gunting dengan sayatan memanjang kearah dada. Organ hati diambil perlahan dan dimasukkan kedalam larutan 0,25 M-EDTA 1mM (sukrosa-EDTA) yang sebelumnya telah didinginkan. Organ hati didinginkan dan ditimbang. Organ hati tikus dipotong-potong dan dibilas dengan larutan sukrosa-EDTA hingga bersih. Lalu sekitar 3-5g hati tikus di homogenasi dan ditambahkan xxx ml larutan sukrosa-EDTA. Sebagian homogenat disimpan dalam beberapa tabung kecil dan sisa homogenat lainnya ditambahkan larutan 0,34M-EDTA 1mM lalu dimasukkan dalam tabung sentrifius. Setelah itu homogenat di sentrifugasi dengan kecepatan 700g selama 10 menit.Isolasi fraksi inti. Bagian pelet hasil sentrifugasi homogenat hati tikus di sespensikan menggunakan sukrosa 0,25mM-CaCl2 3mM. Suspensi disaring menggunakan kain blacu lalu dicuci menguakan larutan sukrosa-CaCl2. Filtrat di sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang sedangkan pelet yang dihasilkan disuspensi dengan larutan sukrosa-CaCl2. Lalu suspensi dibagi kedalam dua tabung yang berbeda.Isolasi fraksi mitokondria. Supernatan yang diperoleh dari sentrifugasi homogenat hati tikus disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Setelah terbentuk supernatan dan pelet, pelet diambil dan ditambahkan 10ml 0,34M-EDTA 1mM lalu dimasukkan kedalam tabung sentrifius dan dihomogenisasi. Lalu campuran ditambahkan 30ml larutan sukrosa-EDTA sehingga volumenya mecapai 40ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. Bagian pelet hasil sentrifugasi di resuspensi dengan 10 ml larutan sukrosa-EDTA dan dibagi kedalam dua tabung yang berbeda lalu disimpan.Isolasi fraksi mikrosom. Supernatan hasil isolasi mitokondria di sentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh ditimbang dan dibagi kedalam empat tabung yang berbeda, disimpan dan diberi label sitoplasma. Pelet yang dihasilkan ditambahkan 30ml larutan sukrosa-EDTA lalu disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 15 menit. Lalu dibagi kedalam empat tabung yang berbeda.

HASIL DAN PEMBAHASANPraktikum kali dilakukan dengan melakukan fraksinasi subseluler dengan menggunakan hati tikus sebagai homogenatnya yang dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu preparasi, isolasi fraksi inti, isolasi fraksi mitokondria serta fraksinasi mikrosom. Berdasarkan percobaan didapat data sebagai berikut:Tabel 1 Fraksinasi subselulerMejaBobot hati tikus (g)Bobot homogenat (g)

17,1130,64

26,7931,93

35,4631,43

48,1834,62

58,3247,03

67,3247,10

78,6247,23

Contoh Perhitungan :RCF = 1,19 x 10-5x rpm2 x r700 = 1,19 x 10-5x rpm2 x rpm =Tabel 2 Isolasi fraksi intiMejaBobot tabung kosong (g)Bobot tabung dan isi (g)Bobot fraksi inti (g)

113,5221,479,95

212,2422,3510,11

314,6025,1810,58

412,4023,4511,05

512,0023,0011,00

614,7025,0710,37

714,9226,8111,89

Contoh Perhitungan :Bobot fraksi inti meja 6 = (bobot tabung dan isi) (bobot tabung kosong)= 35,83 g 16,36 g= 19,47 gTabel 3 Isolasi fraksi mitokondriaMejaBobot tabung kosong (gram)Bobot tabung dan isi (gram)Bobot fraksi mitokondria (gram)

116,1526,3510,20

217,8628,1710,31

315,7526,1610,41

415,2226,4211,20

515,8325,55 9,72

615,7225,45 9,73

715,8826,6410,76

Contoh Perhitungan :Bobot fraksi mitokondria meja 6 =(bobot tabung dan isi) (bobot tabung kosong)= 46,65 g 15,88 g= 30,77 gTabel 4 Isolasi fraksi mikrosomMejaBobot tabung kosong (g)Bobot tabung dan isi (g)Bobot fraksi mikrosom (g)

116,3322,005,67

215,2518,683,43

316,5622,045,48

416,7838,600,43

516,3638,1621,80

616,2118,352,14

715,5821,626,04

Contoh Perhitungan :Bobot fraksi mikrosom meja 6 = (bobot tabung dan isi) (bobot tabung kosong)= 18,35 g 16,21 g= 2,14 gTabel 5 Isolasi fraksi sitosolMejaBobot tabung kosong (g)Bobot tabung dan isi (g)Bobot fraksi sitosol (g)

161,30113,2151,91

290,43133,4643,03

396,88156,2359,35

495,90148,2952,39

5Tidak dihitungTidak dihitungTidak dihitung

6121,79176,3254,53

7Tidak dihitungTidak dihitungTidak dihitung

Contoh Perhitungan :Bobot fraksi sitosol meja 6 = (bobot tabung dan isi) (bobot tabung kosong)= 176,32 g 121,79 g = 54,53 gPraktikum kali ini melakukan fraksinasi subseluler terhadap hati tikus. Prinsip dari fraksinasi subseluler yang dilakukan adalah pemisahan organel sel dari hati tikus dengan berdasarkan massa partikel, ukuran partikel, panjang partikel serta densitas partikel menggunakan metode sentrifugasi. Setelah dilakukan sentrifugasi, bagian sel akan terpisah berdasarkan densitasnya. Bila suatu organel sel memiliki densitas yang lebih tinggi, maka ia akan mengendap dibawah atau disebut sebagai pelet. Sedangkan bila suatu organel sel memiliki densitas yang lebih rendah, maka organel sel tersebut akan berada di lapisan atas atau yang disebut sebagai supernatan.Homogenat hati tikus

Sentrifugasi 700 g selama 10 menit.

Supernatan

Pelet

Resuspensi sukrosa-CaCl2. Sentrifugasi 3000 rpm selama 10 menitSentrifugasi 8000 rpm selama 10 menit

Fraksi intiBuang supernatanSupernatan Pelet

Sentrifugasi 15000 rpm 15 menitResuspensi sukrosa-EDTA. Sentrifugasi 14.000rpm 10 menit

MitokondriaMikrosom

Buang supernatanSitosol

Gambar 1. Bagan alir fraksinasi subseluler

Fraksinasi subseluler yang dilakukan menggunakan dua jenis larutan, yaitu sukrosa-EDTA serta sukrosa-CaCl2. Fungsi dari sukrosa adalah sebagai larutan isotonik sehingga tekanan osmosis sel terjaga. Campuran EDTA berfungsi sebagai pengkelat logam yang terdapat pada hati. EDTA juga berfungsi mengendapkan protein pengotor yang tidak diinginkan. Pada isolasi fraksi inti digunakan larutan sukrosa-CaCl2. Larutan ini berfungsi sebagai buffer yang berperan sebagai pencegah rusaknya sel terhadap perubahan pH. Semua tahap dalam fraksinasi subseluler harus dilakukan pada suhu rendah. Hal ini dilakukan untuk meminimalisir degadrasi enzim-enzim yang ada terhadap komponen sel serta mempertahankan struktur dan fungsi dari organel sel (Carpette 2005)Percobaan ini menggunakan tikus, karena hewan ini termasuk mamalia. Jenis kelamin tikus yang diuji adalah jantan,bkan tikus betina dikarenakan tikus betina mengalami fase hormonal seperti menstruasi pada perempuan yang mempengaruhi keadaan organel-organel. Galur tikus yang biasa digunakan untuk fraksinasi subselular galur Whistar jantan yang merupakan cikal bakal galur tikus Sparangue Dawley. Tikus Whistar memiliki ciri-ciri kepala lebar, berdaun telinga panjang, dan berekor panjang. Tikus jenis ini dikembangkan oleh Wishtar University sebagai model percobaan mahluk hidup yang umum digunakan di laboratorium sejak tahun 1906 (Dahab dan Yesham 2005).Hati tikus digunakan dalam percobaan kali ini. Hati merupakan organ yang sangat penting dalam kehidupan. Hati terbagi menjadi lobus kanan dan kiri. Fungsi hati yaitu sekresi, metabolisme, penyimpanan detoksifikasi, produksi panas, dan penyimpan darah. Hati tikus yang digunakan mengandung organel seperti mitokondria yang berfungsi sebagai pembangkit tenaga sel karena dapat memproduksi energi dalam bentuk ATP (Sloane 2003). Mitokondria mempunyai dua lapis membran yaitu membran luar dan membran dalam. Membran dalam berlekuk-lekuk yang disebut Krista dan membran luar membatasi bagian dalam dengan matriks sel. Mitokondria memiliki DNA sendiri yang dikenal dengan mtDNA (Campbell 2002). Organ hati digunakan dalam praktikum ini disebabkan karena organ hati memiliki sel yang baik dan mempunyai metabolisme yang baik (Sloane 2003). Membran plasma dihancurkan karena membran plasma adalah penyusun utama membrane sel itu yaitu lipid, protein, juga karbohidrat. Tikus yang digunakan yaitu tikus jantan karena lebih mudah dianalisa dan kandungan hatinya lebih banyak dibandingkan dengan tikus betina. Selama percobaan dilakukan dalam kondisi dingin hal ini dilakukan guna mencegahsel agar tidak rusak serta memperlambat gerakan termal molekul enzim ( Poedjiadi 2007)Fungsi mitokondria adalah sebagai pembangkit tenaga sel karena mitokondria memproduksi energi dalam bentuk ATP. Energi ini diperoleh dari penguraian nutrient seperti glukosa, asam amino dan asam lemak (Sloane 2003). Mitokondria juga sebagai tempat respirasi sel berlangsung, Respirasi sel merupakan proses katabolisme atau perombakan untuk menghasilkan energi bagi berlangsungnya kehidupan sel (Campbell 2007). Inti sel berfungsi sebagai pusat pengendali sistem sel termasuk sistem metabolisme sel. Mikrosom merupakanorganel yang akan menghasilkan ribosom dalam sel, sehingga peran mikrosom dalam sel cukup penting agar tidak kekurangan ribosom. Sitosol merupakan cairan yang terdapat dalam sitoplasma yang sangat berperan dalam proses metabolisme.Bobot hati hasil penimbangan adalah 8.62 gram. Hati dipotong-potong dan dibersihkan dengan larutan sukrosa-EDTA dingin, kemudian dihomogenisasi agar organel utama dalam organ dapat terpisahkan tanpa merusak sel (Campbell 2002). Didapatkan bobot homogenat 47,23 g. Sentrifugasi dilakukan setelah homogenat dihasilkan dengan kecepatan yang berbeda-beda untuk homogenasi homogenate awal, isolasi fraksi inti, isolasi fraksi mitokondria. Homogenisasi homogenate awal dilakukan pada kecepatan 700g selama 10 menit menghasilkan pelet dan supernatan. Pelet disuspensi dengan larutan sukrosa-CaCl2 yang berfungsi sebagai buffer yang berperan dalam pencegahan rusaknya sel tehadap perubahan pH kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500g untuk mendapatkan fraksi ini. Supernatan hsil sentifugasi homogenat awal disentrifugasi dengan kecepatan 5000g selama 15 menit. Pelet mitokondria diresuspensi dengan larutan sukrosa-EDTA dan dibekukan di dalam vial. Superatan yang dihasilkan dapat disentrfugasi lebih lanjut untuk mendapatkan fraksi mikrosom. Bagan 1 merupakan bagan yang menggambarkan hasil yang akan didapatkan jika melakukan fraksinasi dengan kecepatan yang berbeda setiap sentrifugasi. Hal ini dilakukan guena mendapatkan fraksi sesuai dengan yang diinginkan.SIMPULANPrinsip fraksinasi subselular adalah pemisahan organel-organel sel dengan sentrifugasi pada kecepatan yang berbeda-beda. Homogenat berasal dari organ hati tikus jantan dengan bobot organ hati 8.62 gram dan bobot homogenat 47,23 g. sentifugasi dilakukan dengan kecepatan 700 rpm untuk homogenisasi awal, 3000 rpm untuk isolasi fraksi inti, dan 14000 rpm saat isolasi fraksi mitokondria. Larutan sukrosa-EDTA dan larutan sukrosa-CaCl2 yang digunakan dijaga dalam keadaan dingin agar organel-organel di dalam sel tidak rusak.

DAFTAR PUSTAKACampbell NA. 2002. Biologi jilid I, Edisi Kelima. Rahayu Lestari, penerjemah. Erlangga: Jakarta.Carpette. 2005. AnIntroductiontoPracticalBiochemistry. London(UK): McGraw HillBook Company Dahab GM, Hesham YD. 2005. Effect of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors Captopril and Lisinopril on Collagen Synthesis by Cultured rat liver Cell. Saudi Pharmaceutical Journal 37:39. [terhubung berkala]. http://www.biochemj.org.[9 Mei 2014]Nizar M, Santoso L. 2007. Pengembangan Metode Centrifuge Pemeriksaan Darah Tebal Manusia. Jurnal Dunia Kesehatan Masyarakat. Vol: 1 No. 2 hal (21-28).Palha F. 2002. The Influence of Centrifugation on Zymomonas mobilis Agregation. Journal of Biotechnology. Vol: 5 No. 3 hal (112-117).Poedjiadi A. 2007.Dasar Biokimia.Jakarta: UI PressSloane, Ethel. 2003. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: EGC.Volkov P. 2002. Effect of Design Parameters of the Centrifuge Rotor on Separation of Suspensions. Russian Journal of Applied Chemistry. Vol: 76. Hal (1094-1098).

..