Fer teknik-fermentasi

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II

Departemen Teknik Kimia ITB

-1/24-

MODUL 1.07 Teknik Fermentasi

I. Pendahuluan

Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba untuk

menghasilkan metabolit promer dan metabolit sekunder dalam suatu lingkungan yang

dikendalikan. Proses pertumbuhan mikroba merupakan tahap awal proses fermentasi

yang dikendalikan terutama dalam pengembangan inokulum agar dapat diperoleh sel

yang hidup. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan kondisi medium, komposisi

medium, suplai O2, dan agitasi. Bahkan jumlah mikroba dalam fermentor juga harus

dikendalikan sehingga tidak terjadi kompetisi dalam penggunaan nutrisi. Nutrisi dan

produk fermentasi juga perlu dikendalikan, sebab jika berlebih nutrisi dan produk

metabolit hasil fermentasi tersebut dapat menyebabkan inhibisi dan represi. Pengendalian

diperlukan karena pertumbuhan biomassa dalam suatu medium fermentasi dipengaruhi

banyak faktor baik ekstraselular maupun faktor intraselular. Kinetika pertumbuhan secara

dinamik dapat digunakan untuk meramalkan produksi biomassa dalam suatu proses.

Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan fermentor bervolume 5 L dengan

volume kerja 2 L. Sebagai biakan digunakan Saccharomycess cereviceae dengan substrat

glukosa 1% pada pH 4,5. Fermentasi dilakukan secara aerobik dengan laju aerasi dijaga

antara 7 sampai 8 v/v/m. Praktikan bertugas mengamati profil pertumbuhan biomassa sel.

Pengamatan dilakukan dengan pengambilan sampel setiap satu jam. Pada sampel

dianalisis konsentrasi sel/biomassa dan konsentrasi glukosa. Setlah serangkaian tahap

penyiapan sampel, konsentrasi sel dan glukosa dilakukan secara spektrofotometri

terhadap absorbansi, kemudian dengan korelasi pada kurva baku akan diketahui

konsentrasi sel dan glukosa yang sebenarnya. Data-data ini kemudian diplot menjadi

sebuah grafik pertumbuhan sel. Dari grafik ini dapat diamati yield dan µmax.

Dalam percobaan ini diasumsikan laju pertumbuhan pada setiap bagian fermentor

sama untuk waktu tertentu. Pengadukan dianggap sempurna sehingga konsentrasi

komponen sama di setiap bagian fermentor.



Modul 1.07 Teknik Fermentasi Halaman 2 dar 24

II. Tujuan

Dengan melaksanakan praktikum Modul Teknik Fermentasi, praktikan akan

mengenal teknik pelaksanaan fermentasi dalam produksi biomassa.

III. Sasaran

Praktikum ini dilakukan agar praktikan dapat mengoperasikan fermentasi mulai

dari penyiapan medium, pelaksanaan dan pengakhiran fermentasi. Pada akhirnya

praktikan dapat menggambarkan kurva pertumbuhan mikroorganisme dan konsumsi

substratnya pada suatu proses fermentasi

IV. Tinjauan Pustaka

Fermentasi berasal dari bahasa Latin fervere yang berarti mendidihkan. Seiring

perkembangan teknologi, definisi fermentasi meluas, menjadi semua proses yang

melibatkan mikroorganisme untuk menghasilkan suatu produk yang disebut metabolit

primer dan sekunder dalam suatu lingkungan yang dikendalikan. Pada mulanya istilah

fermentasi digunakan untuk menunjukkan proses pengubahan glukosa menjadi alkohol

yang berlangsung secara anaerob. Namun, kemudian istilah fermentasi berkembang lagi

menjadi seluruh perombakan senyawa organik yang dilakukan mikroorganisme yang

melibatkan enzim yang dihasilkannya. Dengan kata lain, fermentasi adalah perubahan

struktur kimia dari bahan-bahan organik dengan memanfaatkan agen-agen biologis

terutama enzim sebagai biokatalis. Produk fermentasi dapat digolongkan menjadi 4 jenis:

1. produk biomassa

2. produk enzim

3. produk metabolit

4. produk transformasi

Dalam bioproses fermentasi memegang peranan penting karena merupakan kunci

(proses utama) bagi produksi bahan-bahan yang berbasis biologis. Bahan-bahan yang

diuhasilkan melalui fermentasi merupaklan hasil-hasil metabolit sel mikroba, misalnya

antibiotik, asam-asam organik, aldehid, alkohol, fussel oil, dan sebagainya. Di samping

hasil-hasil metabolit tersebut, fermentasi juga dapat diterapkan untuk menghasilkan




biomassa sel mikroba seperti ragi roti (baker yeast) yang digunakan dalam pembuatan

roti. Untuk menghasilkan tiap-tiap produk fermentasi di atas dibutuhkan kondisi

fermentasi yang berbeda-beda dan jenis mikroba yang bervariasi juga karakteristiknya.

Oleh karena itu, diperlukan keadaan lingkungan, substrat (media), serta perlakuan

(treatment) yang sesuai sehingga produk yang dihasilkan optimal.

Pada percobaan ini digunakan ragi Saccharomycess cereviceae, yang bersifat

fakulktatif anaerobik. Pada kondisi aerobik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur

reaksi bioenergetik adalah oksigen. Pemanfaatan pada keadaan ini menghasilkan

penambahan biomassa sel dengan persamaan reaksi sebagai berikut:

C6H12O6 → CO2 + H2O + biomassa sel

Pada kondisi anaerobik, Saccharomycess cereviceae menggunakan senyawa

organik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik. Dalam hal ini

yang digunakan adalah glukosa dari substrat dengan hasil akhir perombakan berupa

alkohol (etanol), aldehid, asam organik, dan fussel oil. Reaksi yang berlangsung dalam

keadaan anaerobik tersebut adalah sebagai berikut:

C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 + produk samping

Pada percobaan ini digunakan glukosa sebagai substrat utama. Hal ini

disebabakan struktur model glikosa yang sederhana sehingga mudah digunakan oleh

Saccharomycess cereviceae. Glukosa digunakan sebagai sumber energi dan sumber

karbon yang digunakan untuk membentuk material penyusun sel baru.

Glukosa disebut juga reducing sugar sehingga pemanfaatannya oleh

Saccharomycess cereviceae dilakukan dengan mengoksidasi glukosa yaitu dengan cara

pemutusan ikatan rangkap pada gugus karbonil glukosa.

Media yang digunakan di dalam fermentasi harus memenuhi syarat-syarat

sebagai berikut:

1. mengandung nutrisi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan sel Saccharomycess

cereviceae

2. mengandung nutrisi yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi sel

Saccharomycess cereviceae

3. tidak mengandung zat yang menghambat pertumbuhan sel

4. tidak terdapat kontaminan yang dapat meningkatkan persaingan dalam penggunaan

substrat.

Oleh karena itu, selain glukosa, ke dalam medium fermentasi juga ditambahkan zat-zat

lain yang berfungsi sebagai sumber makronutrien dan mikronutrien serta growth factor.




Proses pertumbuhan mikroba sangat dinamik dan kinetikanya dapat digunakaan

untuk meramal produksi biomassa dalam suatu proses fermentasi. Faktor utama yang

mempengaruhi pertumbuhan dan perilaku mikroba dapat digolongan dalam faktor

intraseluler dan faktor ekstraselular. Faktor intraselular meliputi struktur, mekanisme,

metabolisme, dan genetika. Sedangkan faktor ekstraselular meliputi kondisi lingkungan

seperti pH, suhu, tekanan.

Proses pertumbuhan mikroba merupakan proses yang memiliki batas tertentu.

Pada saat tertentu, setelah melewati tahap minimum, mikroba akan mengalami fasa

kematian. Faktor-faktor yang dapat menyebabkan berhentinya pertumbuhan mikroba

antara lain:

1. Penyusutan konsentrasi nutrisi yang dibutuhkan dalam pertumbuhan mikroba

karena habis terkonsumsi.

2. Produk akhir metabolisme yang menghambat pertumbuhan mikroba karena

terjadinya inhibisi dan represi.

Pertumbuhan kultur mikroba umumnya dapat digambarkan dalam suatu kurva

pertumbuhan. Pertumbuhan mikroba dapat terbagi dalam beberapa tahap seperti pada

Gambar 1, antara lain:

1. Fasa stationer adalah fasa yang disebut fasa adaptasi/ lag phase. Pada saat ini

mikroba lebih berusaha menyesuaikan diri dengan lingkungan dan medium baru

daripada tumbuh ataupun berkembang biak. Pada saat ini mikroba berusaha

merombak materi-materi dalam medium agar dapat digunakan sebagai nutrisi

untuk pertumbuhannya. Bila dalam medium ada komponen yang tidak dikenal

mikroba, mikroba akan memproduksi enzim ekstraselular untuk merombak

komponen tersebut. Fasa ini juga berlangsung seleksi. Hanya mikroba yang dapat

mencerna nutrisi dalam medium untuk pertumbuhannya lah yang dapat bertahan

hidup.

2. Fasa pertumbuhan dipercepat adalah fasa dimana mikrioba sudah dapat

menggunakan nutrisi dalam medium fermentasinya. Pada fasa ini mikroba

banyak tumbuh dan membelah diri sehingga jumlahnya meningkat dengan cepat.

Laju pertumbuhan dtdX

=µ meningkat mencapai nilai maksimumnya.

µ = laju pertumbuhan mikroba (sel/detik)

X = jumlah mikroba hidup




3. Fasa eksponensial adalah akhir fasa pertumbuhan dipercepat. Pada fasa ini laju

pertumbuhan tetap pada laju pertumbuhan maksimum (µmaks). Nilai µmaks ini

ditentukan oleh konstanta jenuh/ saturasi substrat. Nilai µmaks untuk setiap

mikroba juga tertentu pada masing-masing substrat.

4. Fasa pertumbuhan diperlambat mulai pada akhir fasa eksponensial. Pertumbuhan

mikroba yang begitu cepat tidak diimbangi tersedianya nutrisi yang cukup. Jika

fermentasi dilakukan secara batch, dimana umpan nutrisi dimasukkan hanya pada

awal proses fermentasi, pada waktu tertentu saat jumlah mikroba yang

mengkonsumsi nutrisi tersebut melebihi daya dukung nutrisi akan terjadi

kekurangan nutrisi. Hal lain yang memperlambat pertumbuhan mikroba adalah

terjadinya inhibisi ataupun represi yang terjadi karena terakumulasinya produk

metabolit sekunder hasil aktifitas fermentasi mikroorganisme.

5. Fasa kematian terjadi apabila nutrisi sudah benar-benar tidak dapat lagi

mencukupi kebutuhan mikroorganisme. Keadaan ini diperparah oleh akumulasi

produk metabolit primer dan sekunder yang tidak dipanen sehingga terus

menginhibisi ataupun merepresi pertumbuhan sel mikroorganisme. Selain itu

umur sel juga sudah tua, sehingga pertahan sel terhadap lingkungan yang berbeda

dari kondisi biasanya juga berkurang.

Gambar 1 Kurva Karakteristik Pertumbuhan Sel dalam Medium Fermentor




. Dalam percobaan ini, proses fermentasi ragi tersebut melalui 4 tahapan:

1. tahap persiapan medium fermentor

2. tahap sterilisasi

3. tahap pembuatan inokulum dan pengembangan starter

4. tahap pelaksanaan fermentasi

Tahap Persiapan Medium Fermentasi

Medium yang digunakan adalah medium cair yang terdiri dari 2 macam larutan.

Larutan pertama berisi garam-garam nutrisi untuk pertumbuhan ragi, sedangkan larutan

kedua adalah substrat yang umumnya berupa latutan glukosa dalam air. Nutrisi yang

diperlukan dalam medium petumbuhan ragi antara lain unsur N, S, O, H, Mg, K, Ca.

Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon dan sumber energi. Kadar senyawa-senyawa

yang diperlukan supaya medium dapat mendukung pertumbuhan ragi secara optimal

harus ditentukan berdasarkan komposisi masing-masing unsur dalam sel ragi yang telah

banyak diteliti dan dibukukan.

Adapun komponen dari media yang digunakan adalah sebagai berikut:

a. Substrat utama

Sebagai substrat utama digunakan larutan glukosa. Karena glukosa adalah substrat

utama, maka pertumbuhan biomassa sel Saccharomycess cereviceae merupakan

fungsi dari konsentrasi glukosa. Hasil perombakan glukosa oleh sel adalah berupa

CO2 dan H2O.

b. Sumber makronutrien, mikronutrien, dan growth factor.

Sebagai sumber makronutrien, mikronutrien, dan growth factor umumnya

Laboratorium Mikrobiologi dan teknologi Bioproses Dept. Teknik Kimia ITB

menggunakan zat-zat sebagai berikut:

1. (NH4)2SO4 sebagai sumber nitrogen yang berguna bagi pembentukan asam

nukleat dan asam-asam amino.

2. K2SO4 sebagai sumber K+ yang merupakan kofaktor enzim

3. Na2HPO4.2H2O sebagai sumber Na dan P. Na berfungsi sebagai kofaktor dan P

berguna untuk sintesis asam nukleat, ATP, fosfolipid, dan senyawa yang

mengandung fosfor lainnya.

4. MgSO4 sebagi sumber Mg yang berperan di dalam stabilisasi ribosom,

stabilisasi membran dan dinding sel, serta berfungsi sebagai kofaktor enzim.

5. CaCl2 sebagai sumber Ca untuk stabilisasi dinding sel




6. ZnSO4 sebagai sumber Zn yang berfungsi sebagai regulator enzim

7. Fe(NH4)(SO4) sebagai sumber Fe, makronutrien pembentuk sitokrom pembawa

elektron dalam jalur transportasi elektron.

8. CuSO4 sebagai sumber Cu yang berperan penting dalam reaksi redoks

metabolisme.

9. yeast extract sebagai penyedia asam-asam amino tunggal, growth factor dan

berbagai vitamin yang dibutuhkan sel

10. aqua dm, sebagai media pelarut dan pengaduk dalam transportasi senyawa.

Setelah medium substrat dan medium nutrisi dicampurkan, diusahakan pH tetap 4-5

yang merupakan pH optimal pertumbuhan sel ragi.

Tahap Sterilisasi

Sterilisasi dilakukan terhadap bahan dan alat sehingga terbebas dari kontaminasi

mikroorganisme lain. Sterilisasi perlu dilakukan karena kontaminasi mikroba lain akan

memberikan dampak yang tidak menguntungkan sebagai berikut:

1. kontaminan meningkatkan persaingan di dalam mengkonsumsi substrat sehingga

akan mengurangi perolehan

2. kontaminan dapat menghambat proses metabolisme sel sehingga akan mengurangi

perolehan

3. kontaminan meningkatkan turbiditas sehingga dapat mengacaukan pengukuran

terhadap jumlah sel setiap saat.

Pada percobaan ini proses sterilisasi dilakukan di laboratorium dengan

menggunakan autoclave. Autoclave melakukan sterilisasi dengan menggunakan panas

lembab. Keuntungan penggunaan panas lembab dalam proses sterilisasi adalah

kelembaban mempermudah proses denaturasi protein sel kontaminan. Autoclave

dioperasikan pada tekanan 15 psia dan temperatur 121 oC selama 15 menit.

Pada saat sterilisasi beberapa lubang pada fermentor ditutup dengan kapas.

Tujuannya adalah untuk mengalirkan udara panas dari dalam fermentor sehingga tidak

terjadi tekanan yang terlalu tinggi di dalam fermentor selama sterilisasi. Sedangkan

tujuan lain penggunaan kapas adalah agar kehilangan uap air selama sterilisasi minimal.

Hal yang perlu ditekankan pada sterilisasi medium ini adalah larutan nutrisi tidak

boleh disterilisasi bersamaan dengan larutan glukosa agar tidak terjadi proses

karamelisasi. Karamelisasi disebut juga proses reduksi Maillard. Proses ini terjadi karena

gugus karbonil pada glukosa bereaksi dengan gugus amonium atau protein dari medium




sehingga membentuk nitrogen hitam. Senyawa ini tidak dapat dioksidasi mikroba dan

disebut unfermented substrate. Akibat reaksi ini glukosa tidak dapat diuraikan oleh sel

ragi, bahkan menjadi inhibitor terhadap sel ragi tersebut.

Reaksi karamelisasi glukosa ini berlangsung sebagai berikut:

R-COH + NH2-R’ → R-COH-NH2 + produk lain

Karena itu, proses sterilisasi dilakukan terpisah. Larutan nutrisi dimasukkan

dalam fermentor dan disterilisasi sekaligus bersama fermentornya. Larutan glukosa

disterilisasi sendiri dalam erlenmeyer. Setelah fermentor dan medium steril dingin,

larutan glukosa steril dimasukkan secara aseptik ke dalam fermentor. Kemudian pH

diatur sampai 4,5 dengan menambahkan HCH steril 1 N. Nilai 4,5 adalah pH optimum

pertumbuhan ragi.

Tahap Penyiapan Inokulum

Setelah seluruh alat dan bahan steril, dilakukan inokulasi Saccharomycess

cereviceae dari biakan murni. Yang digunakan sebagai inokulum adalah biakan ragi pada

agar miring. Komposisi medium starter adalah sama dengan komposisi media fermentasi

dengan penambahan growth factor. Inokulum tersebut dimasukkan dalam campuran

larutan nutrisi dan substrat yang diambil sebagian dari fermentor dan dimasukkan dalam

labu erlenmeyer 150 mL. Tujuan dibiakkannya ragi dalam starter adalah

mengadaptasikan sel terhadap media fermentasi. Dengan adanya adaptasi pada starter ini

diharapkan lag phase sebagai tahap awal fermentasi dilewati. Biakan diusahakan tepat

berada pada akhir fasa logaritmik. Dengan demikian pertumbuhan sel ragi akan

maksimum dalam waktu yang relatif singkat.

Inokulasi Sacchromycess cereviceae dilakukan secara aseptis untuk menjaga

kemurnian biakan. Setelah dimasukkan dalam medium, inokulum tersebut diletakkan

dalam alat shaker selama, paling cepat, 16 jam. Fungsi shaker adalah mempermudah

difusi oksigen ke dalam medium sehingga kontak antara dan inokulum makin banyak dan

homogen. Hal ini penting dilakukan untuk menjaga kondisi biakan tetap aerobik. Jika

difusi oksigen dalam medium lancar, kadar DO (oksigen terlarut) dalam medium akan

cukup mendukung pertumbuhan sel secara aerobik. Jika sel hidup secara aerobik,

biomassa baru akan lebih banyak terbentuk daripada etanol. Dengan demikian pada akhir

masa inkubasi shaker ini diharapkan juga sel sudah berada pada akhir fasa logaritmik.




Tahap Pelaksanaan Fermentasi

Tahap ini dimulai saat inokulum yang telah beradaptasi dalam medium

dimasukkan dalam medium di fermentor. Pada praktikum ini fermentor yang dipakai

bervolume 5 liter. Fermentor adalah suatu reaktor yang dipersiapkan untuk melakukan

reaksi fermentasi yang dilengkapi dengan pengaduk, saluran aerasi, dan perlengkapan

lainnya.

Pelaksanaan fermentasi dilakukan dengan cara sebagai berikut:

1. Nutrisi, substrat, dan inokulan dimasukkan ke dalam fermentor yang dilakukan

secara aseptis. Nutrisi dimasukkan ke dalam fermentor sebelum disterilisasi

dalam autoclave. Substrat dan inokulan dimasukkan dengan cara memanaskan

mulut inlet dengan kapas yang dibakar kemudian medium dan inokulum

dimasukkan ke dalam fermentor.

2. Kemudian dilakukan kecepatan aerasi dan agitasi.

Aerasi berfungsi sebagai penyuplai oksigen untuk sel ragi dalam bentuk

gelembung gas. Aerasi diatur pada kecepatan skala 9. Laju oksigen yang disuplai ke

dalam fermentor dijaga stabil. Fluktuasi laju alir oksigen ini dapat menurunkan unjuk

kerja fermentor karena laju transfer O2 tidak tetap sehingga metabolisme sel ragi

terganggu karena kadar DO yang tidak stabil. Agitasi berfungsi sebagai alat

penghomogen larutan fermentasi. Agitasi dilakukan pada kecepatan 600 rpm.

Pengadukan dilakukan oleh impeller yang berjumlah 3 buah. Semakin banyak impeller di

dalam fermentor semakin homogen larutan tersebut.

Laju alir udara dan pengadukan saling terkait satu sama lain. Pengaliran udara

berfungsi untuk menjaga suplai oksigen agar tetap sedangkan pengadukan akan

meningkatkan laju dispersi oksigen ke dalam larutan dan meratakan kadar oksigen di

seluruh medium fermentasi.

Di pinggiran fermentor juga terdapat baffle yang berfungsi mencegah terjadinya

vortex (pusaran air) sehingga dapat meningkatkan efisiensi aerator. Pengaturan udara

keluar dan masuk fermentor dilakukan sedemikian rupa sehingga kontaminasi dapat

diminimalkan, yaitu dengan cara menggunakan filter mikroba kapas pada aliran masuk

dan menggunakan larutan CuSO4 yang bersifat oligodinamik dan mampu membunuh

mikroba kontaminan.

Pencampuran inokulum ke dalam medium fermentor dilakukan secara aseptik

dengan menyalakan api di sekitar tempat pemasukan inokulum. Sebaiknya, sebelum

proses fermentasi dimulai, ke dalam medium fermentor ditambahkan zat antifoam yang




berfungsi mencegah terjadinya foaming. Zat antifoam yang banyak digunakan di industri

adalah silicon. Foaming terjadi karena protein terdenaturasi dalam medium fermentasi.

Selain menggunakan zat kimia, foaming juga dapat dicegah secara mekanik dengan

mengatur putaran agitator. Hal ini lebih sering dilakukan karena zat kimia yang terlalu

banyak ditambahkan ke dalam medium dapat menjadi inhibitor bagi pertumbuhan

mikroba.

Pada awal fermentasi diusakan pH medium adalah 4,5 yang optimal bagi

pertumbuhan ragi. Selama fermentasi pH medium sangat mungkin mengalami penurunan

karena terbentuknya asam organik sebagai produk samping fermentasi. Karena itu pH

medium harus dipantau, jangan sampai terlalu drop yang akan mengakibatkan sel ragi

mati.

Pengambilan dan Pengujian Sampel

Dalam percobaan fermentasi ini sampel untuk analisis diambil dari outlet sample

yang disebut sampling point. Untuk mencegah kontaminasi udara luar dan menjamin

bahwa sampel yang dianalisis adalah medium yang representatif pada kondisi tepat saat

pengambilan sampel tanpa terpengaruh kotoran dan sampel sebelumnya yang mungkin

ada di aliran sampling point, maka 5 mL pertama dari sampel harus dibuang. Analisis

yang diperlukan untuk percobaan ini adalah konsentrasi glukosa dan konsentrasi ragi

setiap waktu.

Penentuan konsentrasi sel ragi dan glukosa dilakukan dengan analisis

spektrofotometri. Prinsip spektrofotometeri adalah analisis turbidometri. Prinsip

turbidometeri adalah menganalisis konsentrasi suatu zat berdasarkan kekeruhannya

dibanding sampel blanko yang dianggap nilai 0 absorban atau full scale transmitan, atau

tidak mengandung konsentrasi zat yang dianalisis.

Pada penentuan konsentrasi sel ragi kekeruhan disebabkan oleh suspensi sel ragi.

Blanko yang digunkan adalah larutan medium yang persis sama dengan medium

fermentor, tetapi yang tidak dipakai sebagai medium pertumbuhan ragi. Analisis

dilakukan dengan mengambil data absorbansi. Untuk membuat kurva pertumbuhan

diperlukan kurva baku untuk mengkorelasikan antara konsentrasi sel terhadap absorbans.

Panjang gelombang yang digunakan untuk menganalisis konsentrasi sel adalah 600 nm.

Sampel untuk analisa konsentrasi glukosa harus disentrifugasi terlebih dahulu

untuk mengendapkan semua sel ragi sedemikian sampai larutan medium terlihat jernih

sehingga tidak mengganggu pancaran sinar saat diperiksa dengan spektrofotometri.




Sentrifugasi dilakukan selama 15 menit dengan kecepatan putaran 5000 rpm. Hasil

sentrifugasi adalah supernatan di bagian atas yang berupa cairan yang mengandung

glukosa residu (belum terkonsumsi sel ragi) dan endapan sel ragi di bagian bawah.

Jangkauan konsentrasi sampel yang dapat dideteksi akurat oleh spektrofotometri

sangat pendek. Karena itu larutan supernatan glukosa yang telah terpisah dari sel ragi

harus diencerkan dahulu. Data absorbansi spektofotometri dengan reagen Somogyi-

Nelson baru akurat pada konsentrasi 20-150 ppm.

Analisis pertama dilakukan dengan penambahan Somogyi 1 (yang mengandung

Na2SO4 anhidrat, KNa tartrat, Na2CO3, NaHCO3 ) yang berfungsi memberi kondisi basa,

dan larutan Somogyi 2 yang mengandung Cu SO4. Saat bereaksi dengan Somogyi 2

glukosa akan teroksidasi. Gugus karbonil glukosa akan teroksidasi menjadi karboksilat

sementara Cu2+ akan tereduksi menjadi Cu+. Reaksi redoks tersebut dalam kesetimbangan

akan menjadi:

Karbonil + Cu2+ + basa → Karboksilat + Cu2O + H+

Reaksi redoks ini hanya dapat berlangsung pada kondisi panas. Karena itu setelah

supernatan ditambahi Somogyi 2 campuran harus dipanaskan sampai reaksi mencapai

kesetimbangan. Reaksi oksidasi dihentikan dengan mendinginkan secara tiba-tiba

campuran tersebut dalam es batu. Analisis dilanjutkan dengan penambahan reagen

Nielson yang mengandung ansenomolibdate berwarna kuning. Penambahan Nielson

dimaksudkan untuk mengubah karboksilat yang ada menjadi gas CO2. Untuk

mengeluarkan gas ini, campuran harus dikocok. Setelah penambahan Nielson, larutan

akan berubah warna dari biru menjadi kuning. Campuran yang telah bebas CO2 tersebut

dianalisis dengan spektrofotometri. Untuk penentukan konsentrasi glukosa digunakan

panjang gelombang 520 nm. Panjang gelombang ini sesuai dengan intensitas warna

larutan yang berwarna hijau. Konsentrasi glukosa ditentukan dengan bantuan kurva baku

absorbasn terhadap konsentrasi glukosa.

Penentuan Growth Yield

Perolehan biomassa yang menunjukkan produktivitas proses fermentasi

dinyatakan sebagai perolehan (Yield). Growth yield ini dinyatakan dengan persamaan:

SSXX−−

=∆∆

=0

0

SX-Y

dimana: X = massa sel saat t

X0 = massa sel awal




S = massa glukosa saat t

S0 = massa glukosa awal

Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum (µmaks)

Laju pertumbuhan spesifik mikroorganisme (µ) diformulasikan sebagai:

dtdX

X1

=µ

Nilai µ akan bernilai maksimum bila dtdX

bernilai maksimum. dtdX

adalah gradien kurva

pertumbuhan yang mununjukkan jumlah sel ragi setiap waktu. Nilai dtdX

maksimum pada

fasa logaritmik, dimana terlihat jumlah mikroba paling tinggi dan konstan selama

beberapa saat.

V. Rancangan Percobaan

V.1 Perangkat dan Alat Ukur

1. Fermentor batch seperti pada Gambar 2

2. Labu erlenmeyer

3. Spektrofotometer

V.2 Bahan/ Zat Kimia

1. Glukosa

2. Bahan-bahan nutrisi

3. Biakan mikroba dalam agar miring




Sensorsuplaiudara

AeratorOutlet Hole/Sampling Point

Motor

SensorPutaran

InletHole

Liquid level

1

2Impeller

3 Sparger4 Filter

Mikroba

5Baffle

7InletUdara

Gambar 2 Perangkat Alat dan Instrumentasi Modul Fermentasi

Keterangan Gambar:

1. Inlet adalah tempat memasukkan inokulan dan medium

2. Pengaduk/impeller adalah alat untuk mendispersikan semua komponen di dalam

larutan sehingga larutan dalam fermentor menjadi homogen

3. Sparger adalah alat pemecah gelembung-gelembung udara agar gelembung udara yang

terbentuk berukuran kecil sehingga luas permukaan interfasanya lebih besar sehingga

laju difusi oksigen ke dalam lerutan labih cepat dan kadar oksigen terlarut meningkat

4. Filter mikroba adalah penyaring kontaminan mikroba dari udara kompresor yang

masuk. Filter yang digunakan adalah kapas.

5. Baffle adalah lempengan tipis di dinding fermentor yang bertujuan menghasilkan aliran

turbulen dan mencegah terbentuknya vorteks.

6. Sampling point adalah saluran tempat sampel diambil.

7. Inlet udara adalah tempat udara aerasi masuk ke dalam fermentor.




V.3 Prosedur Kerja

V.3.1 Penyiapan Medium

Proses penyiapan medium dilakukan mengikuti diagram kerja yang ditunjukkan

pada Gambar 3

Komponen-komponenNutrisi

Masukkan

Labu Kocok

Campurkan, Larutkandalam air, Aduk

Larutan Nutrisi untukMedium

Tambah asam/basa, atursampai pH 4,5

Larutan Nutrisi pH 4,5

Masukkan

Fermentor

Masukkan

Autoclave

Atur suhu 121 oC dan tekanan 15 psiSterilisasi fermentor+medium danlarutan glukosa

Fermentor + Medium steril

Autoclave shut down

DinginkanKeluarkan fermentor

Glukosa

Labu Kocok

Larutan Substratuntuk Medium

Lar. Substrat steril

Gambar 3 Penyiapan Medium




V.3.2 Pengembangan Kultur Ragi dalam Labu Kocok

Pengembangan kultur ragi dalam labu kocok untuk fasa adaptasi dikerjakan

sesuai prosedur kerja yang ditunjukkan pada Gambar 4.

2 Labu Erlenmeyer 500 mL

Isikan perlahan

@ 135 mL lar Nutrisi

2 Labu Erlenmeyerberisi 135 mL lar Nutrisi

Autoclave

Masukkan

Glukosa

Labu Kocok

Larutan Substrat untuk Medium

Atur suhu 121 oC dan tekanan 15 psiSterilisasi lar. nutrisi dalamerlenmeyer dan larutan glukosa

Lar. nutrisi steril

Autoclave shut down

DinginkanKeluarkan lar. nutisi dan lar. glukosa

Lar. glukosa steril

Masukkan 10 mLLar. nutrisi dengan

glukosa steril

Biakan ragi dalamagar miring

Inokulasikan

Dinginkan

Lar. nutrisi denganglukosa steril dingin

Inokulum

Kocak pada shaker 30 0C

Kultur siapdigunakan

Gambar 4 Proses Pengembangan Kultur Ragi




V.3.3 Proses Fermentasi

Proses fermentasi ini adalah percobaan utama. Fermentasi dilakukan sesuai

prosedur yang ditunjukkan pada Gambar 5

FermentorInstalasikan dengan benaratur T = 30 0C, r =600rpm, laju aerasi 1,5 v/v/m

Fermentor siap pakai Kultur ragi yang telahdidiamkan 16 jam

Tuangkan secara sterildan aseptik (dekat api)

Fermentasi dimulai

catat waktuatur pH 4,5Lakukan prosedur pengambilan sampel dari sampling point

Sampel

Gambar 5 Fermentasi Ragi dalam Fermentor




V.3.4 Pengujian Sampel

Pada sampel akan dianalisis konsentrasi sel ragi dan konsentrasi glukosanya. Analisis

tersebut dilakukan sesuai prosedur pada Gambar 6.

Fermentor

Catat waktu setiap 1 jamAtur pH 4,5

Sampling Point

Ambil sampel tiap 1 jam,teknik aseptik

Sample

Ambil 5 mL, buang

Sample

Ambil 10 mL

Ambil 6 mL Ambil 4 mL

Sampel untukPengukuran

Konsentrasi Sel

Spektrofotometer

Tunggu 15 menit agarpanasAtur Ambil 6 mL panjanggelombang 600 nMJaga agar absorbansitetap 0,2 - 0,7

Spektrofotometer siappakai

Sampel untukPengukuran

Konsentrasi Glukosa

Ukur absorbansi sampelData absorbansi sel

pada sampelPenentuan konsentrasi sel

Kurva baku absorbansivs konsentrasi sel

Ambil 2 mL

Sentrifugasi pada 5000rpm, 15-20 min.

Supernatan

Encerkan hingga kadarglukosa dalam larutanberkisar 20-120 mg/L

Supernatan Encer

1,6 mL Somogyi I

0.4 mL Somogyi II

Kocok, TutupPanaskan 10 mLDinginkan secara cepatMasukkan ke dalam es5 min.

Campuran reaksi

Campuran reaksiAnalisis

2 mL Nielson

4 mL Aqua DM Kocok, hingga semuaCO2 keluar

Supernatan bebas CO2

Spektrofotometer

Tunggu 15 menit agar panasAtur Ambil 6 mL panjang gelombang 520 nmJaga agar absorbansi tetap 0,2 - 0,7

Spektrofotometer siappakai

Data absorbansi KonsentrasiGlukosa pada sampel

Kurva baku absorbansivs kons. glukosa

Ukur Absorbasnsi Lar.Glukosa

Konsentrasi Glukosa

Konsentrasi Sel

Gambar 6 Prosedur Pengujian Sampel




V.4 Data Pengamatan

Data yang diambil untuk mendapatkan kurva pertumbuhan mikroba dan

kurva konsentrasi glukosa setiap waktu adalah:

1. Absorbansi / % transmitan suspensi ragi

t (jam) %trans. Absorbansi [sel] (g/mL) log [sel] Agitasi

(rpm) pH Aerasi

2. Absorbansi / % transmitan larutan glukosa

t (jam) %trans. Absorbansi [gluksosal] (g/mL)

log [glukosa]

Agitasi (rpm) pH Aerasi

V.5 Data Literatur

Data literatur yang dibutuhkan untuk praktikum Modul teknik fermentasi

antara lain:

1. Kurva baku absorbansi terhadap konsentrasi sel kering (mg/mL)

2. Kurva baku absorbansi terhadap konsentrasi glukosa (mg/mL)

V.6 Langkah Perhitungan

V.6.1 Pembuatan Kurva Baku Absorbansi terhadap Konsentrasi Sel dan Kurva

Baku Absorbansi terhadap Konsentrasi Glukosa

Sebagai contoh berikut adalah data berat sel kering terhdap absorbansi pada

panjang gelombang 600 nm

Berat sel kering (mg/mL) Absorbansi 0.4 0.06 1.09 0.18 1.81 0.28 2.5 0.39 3.72 0.57 5.31 0.83 5.89 0.92 6.9 1.08 7.79 1.21 8.48 1.34




Pengaluran data absorbansi terhadap berat sel kering tersebut ditunjukkan pada

grafik berikut.

Kurva Baku Konsentrasi Sel

y = 6.379x + 0.013R2 = 0.9997

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 0.5 1 1.5Absorbansi

Kon

sent

rasi

Sel

(mg/

mL)

Dari grafik tersebut terlihat bahwa hubungan antara absorbansi dan konsentrasi

sel kering cenderung linear mengikuti persamaan:

Konsentrasi sel kering = 6.379 Absorbansi + 0.013

Misalkan data hubungan absorbansi terhadap konsentrasi glukosa adalah:

Konsentrasi glukosa (mg/mL) Absorbansi 0 0 20 0.198 40 0.403 60 0.595 80 0.8 100 1 120 1.213 140 1.403

Maka kurva baku bsorbansi terhadap konsentrasi glukosa adalah:

Kurva Baku Konsentrasi Glukosa

y = 99.447x + 0.2381R2 = 0.9999

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0.5 1 1.5

Absorbansi

Kon

sent

rasi

Glu

kosa

(mg/

mL)




V.6.2 Perhitungan Absorbansi

Perhitungan ini dilakukan jika yang terbaca pada spektrofotometer adalah %

transmitan.

Persamaan yang dipakai: A = - log T

V.6.3 Penentuan Konsentrasi Sel

Persamaan yang dipakai: C = Faktor Kalibrasi . Absorbansi

V.6.4 Penentuan Konsentrasi Glukosa

Persamaan yang dipakai ;C = Faktor Kalibrasi . Faktor Pengenceran. Absorbansi

V.6.5 Contoh Perhitungan

Misalkan setalah 3 jam fermnetasi didapat data:

- % transmitan suspensi sel adalah 64.4, tanpa pengenceran

- % transmitan larutan glukosa adalah 59.4 setelah pengenceran 250 kali.

Maka:

- Absorbansi suspensi sel = -log 0.644 = 0.1911

- Konsentrasi suspensi sel berdasarkan kurva baku tersebut adalah:

6.379.0.1911+0.013 = 1.221 mg/mL

- Absorbansi larutan glukosa = -log 0.594 = 0.2262

- Konsentrasi larutan glukosa berdasarkan kurva baku diatas dan sebelum

diencerkan adalah:

250.(99.447.0.2262+0.2381)=5.6325 mg/mL

V.6.6 Pembuatan Kurva Pertumbuhan Sel dan Kurva Konsentrasi Glukosa Tiap

Saat

Kurva pertumbuhan sel dibuat dengan mengalukan data waktu (jam) di

sumbu x terhadap konsentrasi suspensi sel (mg/mL) pada sumbu y. Sedangkan

Kurva pertumbuhan sel dibuat dengan mengalukan data waktu (jam) di sumbu x

terhadap konsentrasi larutan glukosa (mg/mL) pada sumbu y.




Misalkan diperoleh data fermentasi berikut:

t (jam) %trans. Absorbansi [sel]

mg/mL log [Sel] pH Aerasi Agitasi (rpm)

0 99 0.0043648 0.0408431 -1.388881 4.5 9 600 1 76 0.1191864 0.7732901 -0.1116576 4.5 7 600 2 66 0.1804561 1.1641292 0.0660012 4.5 9 600 3 61 0.2146702 1.382381 0.1406278 4.5 9 600 4 57 0.2441251 1.5702743 0.1959755 4.5 6.5 600 5 54 0.2676062 1.7200602 0.2355436 4.5 9 600 6 47 0.3279021 2.1046878 0.3231877 4.5 7.5 600 7 41 0.3872161 2.4830518 0.3949858 4 7 600 8 33 0.4814861 3.0843996 0.4891706 4 8.5 600 9 26 0.5850267 3.744885 0.5734385 4 8 600 10 21 0.6777807 4.3365631 0.6371457 4 6.5 600 11 18 0.7447275 4.7636167 0.6779368 4 7 600 12 16 0.79588 5.0899186 0.7067108 4 8 600 13 15 0.8239087 5.2687139 0.7217046 4 8 600 14 15 0.8239087 5.2687139 0.7217046 4 6.5 600

Maka Kurva Pertumbuhan Biomassa Sel adalah:

Kurva Pertumbuhan Sel

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Waktu (jam)

Kon

sent

rasi

Sel

(mg/

mL)




Dan berikutnya adalah hasil pengujian konsentrasi glukosa yang tertinggal dalam

medium dan yang terkonsumsi.

t (jam) %trans. Absorbansi Pengencaran

[glukosa] residu mg/mL

[glukosa] konsumsi mg/mL

log [glukosa]

residu mg/mL

log [glukosa] kopsumsi mg/mL

0 30 0.5228787 500 0.1044736 0 -0.9810 1 32 0.49485 500 0.0988989 0.0055747 -1.0048 -2.2538 2 35 0.455932 500 0.0911583 0.0133153 -1.0402 -1.8756 3 36 0.4436975 500 0.088725 0.0157487 -1.0520 -1.8028 4 38 0.4202164 500 0.0840547 0.0204189 -1.0754 -1.6900 5 40 0.39794 500 0.0796241 0.0248496 -1.0990 -1.6047 6 42 0.3767507 500 0.0754097 0.029064 -1.1226 -1.5366 7 44 0.3565473 500 0.0713913 0.0330823 -1.1464 -1.4804 8 45 0.3467875 500 0.0694502 0.0350235 -1.1583 -1.4556 9 55 0.2596373 500 0.0521165 0.0523571 -1.2830 -1.2810 10 56 0.251812 500 0.0505601 0.0539136 -1.2962 -1.2683 11 60 0.2218487 500 0.0446006 0.0598731 -1.3507 -1.2228 12 64 0.19382 500 0.0390258 0.0654478 -1.4086 -1.1841 13 78 0.1079054 500 0.0219379 0.0825357 -1.6588 -1.0834 14 98 0.0087739 500 0.0022213 0.1022524 -2.6534 -0.9903

Dan kurva Konsentrasi Glukosa (Residu dan Konsumsi) adalah:

Konsentrasi Residu dan Konsumsi Glukosa

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 2 4 6 8 10 12 14 16Waktu (jam)

Kon

sent

rasi

Glu

kosa

(mg/

mL)




V.6.7 Penentuan Growth Yield

Persamaan yang digunakan:

SSXX−−

=∆∆

=0

0

SX-Y

Dari hasil percobaan diperoleh konsumsi total glukosa selama fermentasi adalah:

10 mg/L –(500*0.0022 mg/L) = 8.9 mg/mL

Sedangkan pertumbuhan total sel ragi adalah:

5.2687 mg/mL – 0.0408 mg/mL = 5.228 mg/mL

Maka yield pertumbuhan proses fermentasi ini adalah:

587.09.8

228.5-Y ==

V.6.8 Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum

Persamaan yang digunakan:

logaritmik fasa

akhirawalmaks t

lnX-lnX

∆=µ

Pada kurva logaritmik pertumbuhan sel berikut ini terlihat bahwa fasa

logaritmik berlangsung pada jam ke-4 sapai jam ke-11. Saat itu ln X4 = 0.1959

dan ln X11 = 0.6779.

Kurva Pertumbuhan Sel

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Waktu (jam)

Log

Kon

sent

rasi

Sel




Maka dapat diperkirakan:

sel/jam 0.0697

0.1959-0.6779maks =

=µ

Daftar Pustaka

1. Bailey, J.E., and Ollis, D.F., Biochemical Enginering Fundamentals, McGraw-Hill

Kogakusha Ltd., Tokyo, 1987

2. Soeryo, W, Kinetika Pertumbuhan Mikroba.

Fer teknik-fermentasi

Food

Transcript of Fer teknik-fermentasi