Elektroforesis (SDS-PAGE)Langkah SDS-PAGE

1. Pembuatan gel pemisah (sepating gel)2. Pembuatan gel pengumpul (stacking gel)3. Pemanasan sampel4. Dilarutkan. Runing pada plate 1 dengan arus 28A dengan tegangan 110V dan pada plate 2 dengan arus 30A dan teganagan 130 V.5. Gel direndam dalam staining untuk proses pewarnaan selama 20 menit6. Gel direndam dalam destaining untuk proses pencucian 20 menit

Pesiapan Gel

1. Separating gel 12,5% dibuat dengan cara :a) Siapakan tabung polipropilen 50 mlb) Masukan 3,125 ml stock akrilamid dalam tabungc) Masukan 2,75 1M tris pH 8,8 tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahand) Masukan aquabides 1,505 ml, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahane) Masuka 75 l SDS 10%, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahanf) Masukan 75 ml APS 10%, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahang) Masukan 6,25 l TEMED, tabung ditutup lalu digoyang secara perlahanh) Segera tuang larutan kedalam plate pembentuk gel menggunakan mikro pipet I ml (dijaga jangan sampai terbentuk gelembung udara) sampai batas yang terdapat pada plate.i) Perlahan tambahkan aquades diatas larutan gel dalam plate agar permukaan gel tidak bergelombang.2. Biarkan gel memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan terbentuknya garis transparan diantara batas

air dangel yang terbentuk) setelah itu, air yang menutup separating gel dibuang.3. Setelah separating gel memadat, stacking gel 3% disipakan dengan cara yang sama pada prosedur diatas dengan

volume larutan:a) 30% acrylamide-bis 0,45 mlb) 1M tris pH 6,8 0,38mlc) Aquabidest 2,11 mld) 10% SDS 30 le) TEMED 5 lf) 10% APS 30 l4. Kemudian tuang staking gel5. Pasang sisir tempat penyuntikan sampel, kemudian biarkan beberapalamahingga gel memadat6. Lepas sisir7. Gel dalam plate dipasang pada alat elektroporesis setminiprotein gel8. Tuang running buffer

Injeksi Sampel dan Runing

1. Enzim murni dipipet sebanyak 15 l kemudian dimasukan kedalam eppendorf2. Tambahkan dengan 15l RSB dan panaskan pada suhu 1000C selama 2 menit3. Dinginkan pada suhu kamar.4. Suntikan sampel sebanyak 10-20 l kedalam sumur secara hati-hati dengan menggunakan Hamilton syringe.5. Syringe dibilas dengan air atau runing buffer sebelum dipakai untuk memasukan sampel yang berbeda pada sumur gel

berikutnya.6. Untuk memulai running, hubungkan perangkat elektroporesis denganpower supplydengan arus pada plate I 28 mA

tegangan 110 V dan Plate 2 30 mA dengan arus 130V

Pewarnaan Gel

1. Untuk tahap ini diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada gel dan larutan destaining untuk

pencucian atau menghilangkan warna pada gel dan memperjelas band protein yang terbentuk.a) Untuk membuat larutan staining 1 liter diperlukani. Coomassie Blue R-250 1,0 gii. Methanol 450 mliii. Aqudes 450 mliv. Asam asetat glasia 100 mlb) Untuk membuat larutan destaining 1 liter diperlukani. Methanol 100 mlii. Asam asetat glasial 100 mliii. Aquades 800 ml2. Gel direndam didalam 20 ml larutan staining solution sambil digoyang selama 20 menit, kemudian larutan

staining dituang kembali kewadahnya.3. Kemudian dicuci dalam 150 ml asam asetat4. Gel direndam dalam larutan destaining sambil digoyang selama 20 menit5. Cuci dengan asam asetat sampai bening