I

l)Kelompok Penelitian Keanekaragaman Hayati Laut dan Konservasi, Pusat Penelitian Oseanografi - LIPI

Ilmu genetika merupakan salah satucabang ilmu dari Biologi. Semua hal yangberkaitan dengan materi genetik, mulai dariasam nukleat (DNA dan RNA) hinggapeojelasanmengenaiteori evolusiyangpertamakali dicetuskan oleh CharlesDarwin dipelajaridan diungkap menggunakan ilmu genetika.Sejalan dengan perkembangan ilmupengetahuan dan teknologi, pengetahuanmengenai ilmu genetika semakin dibutuhkandan banyak digunakan sebagai dasar danacuan. Sebagaicontoh, dalam hal pemanfaatanDNA,dapat digunakanuntuk mengidentifikasikelainan genetik atau penyakit binggapenemuanobatnya,dengan caramemanipulasidan bereksperimen dengan DNA tersebut

P'ENDABULUAN (Oanie, 2005). Para ahli geoetik juga dapatmemanupulasi beberapa orgaoisme untukmeoghasilkao hal-hal yang bermaofaat,cootohnya pada kasus terapi gen untukhormon insulin (Pulungan&Herqutanto,2009;Roberts, 2004). Gen penghasil hormon insulindimanipulasi, sehingga penderita diabetesdapatbidup IOOiblama.Selain itu, dalam kajiantaksonomi, taksonom juga dapatmengidentifikasidan mengklasifikasikansecaraakurat suatu organisme ke dalam kelompoktakson tertentu dengan lebih mudah berdasarkarakter DNA tertentu, sehingga dapatditentukan bahwa suatu organisme berbedadengan organisme yang lain (Hebert el al.,2003;Holmesetai., 2009;Marshall, 2005;Wardet al., 2005).

DNA EXTRACTION OF MUSCLE TISSUE SAMPLES. DNA extraction is the initialpart of the molecular analysis process. The extract is very important so that it needs to bemaintained for its quality and quantity by using an appropriate and efficient method. Theaccuracy and efficiency of the methods need to be adapted to several things, such as sampleform, type of the organism, sample origin. sample condition. and the character of the sample.Therefore. the description of DNA extraction method is indispensable, regarding to the dearthof information on this matter. And, the information is generally still limited to the geneticresearchers, who are daily struggling with them. The author hopes that the paper may provideadditional information. especially about DNA extraction process.

ABSTRACT

Onny Nurrahman Marwayana I)

Oleh

EKSTRAKSI ASAM DEOKSIRIBONUKLEAT (DNA)DARI SAMPEL JARINGAN OTOT

ISSN 0216-18nOseana, Volume XL, Nomor 2, Tahun 2015 : 1-9

2

Persiapan Ekstraksi DNA

Sebelum masuk dalam proses ekstraksiDNA, sampel biota yang diperoleh darilapangan harus dipersiapkan secara khususterlebih dahulu. Disarankan, sebaiknyamemisahkan sampel menjadi dua bagian, yaitusampel yang akan diekstrak dan sampel yangakan disimpan sebagai koleksi yang ataupundiproses untuk tujuan yang lain. Sebagaicatatan penting, ukuran sampeJ yang perludisiapkan untuk analisis DNA rata-rata hanyasekitar 50-100 mg (tergantung tujuanpenelitian). Ukuran ini relatif kecil yaituseukuran 2 bulir beras. Proses pemisahan inidimaksudkan untuk menjaga kesegaran dankebersihan sampel, serta meminimalkan resikokontaminasi dari organisme lain maupun dariberbagai jenis reagen kimia, seperti formalinyang dapat mengganggu proses ekstraksiDNA. Sampel yang telah terpisahkan,selanjutnya disimpan dalam larutan Ethanol(99,99%) atau minimal 96% untuk menjagakuaJitas sampel dan kualitas DNA yang akandiekstrak. Proses tersebut dinamakan preservasisampel untuk ekstraksi DNA.

Menurut Srinivasan et al. (2002)larutan Ethanol 96%-100% mampu meojagakestabilan kondisi DNA di dalam sel untukwalctu yang relatif lama. Hal ini disebabkanlarutan Ethanol tersebut akan langsungterserap dan mengawetkan DNA yang terdapatdi dalam sel dengan cepat, mengingat ukuransampel yang akan digunakan relatifkecil (30-50 mg), sehingga kualitas DNAnya dapat

proses ekstraksi DNA, dimulai dari persiapansampel, pemilihan metode ekstraksi yang tepat,hingga didapatkan ekstrak DNA. Keberhasilanproses ekstraksi DNA dapat diukur melaluibeberapa proses, diantaranya adalah melaluipeogecekan keberadaan band DNA denganmetode elektroforesis atau melalui pengukurankonsentrasi DNA terlarut dengan metodespektrofotometri (phillips et al., 2012).

Ekstraksi DNA adalah proses dantahapan pertama yang dilakukan untukmendapatkan total DNA dari suatu biota. Secaraumum, ekstraksi DNA meliputi beberapatahapan proses penting, yaitu dari mulai tahappersiapan hingga akhirnya diperoleh ekstrakDNA yang terlarut dalam suatu larutanpenyangga (buffer) khusus. Larutan tersebutdigunakan untuk menyimpan danmempertahankan kondisi DNA secara kualitatifdan kuantitatif dalam jangka waktu yang relatiflama. Seeara kualitatif, berarti larutanpenyangga tersebut harus dapatmempertahankan kualitas DNA yang terlaruttetap dalam kondisi baik. Sedangkan secarakuantitatif berarti larutan penyangga tersebutharus mampu mempertahankan jumlah DNAyang terlarut, sehingga jumJahnya tetap (tidakterdegradasi/rusak) dan cukup untukdigunakan dalam tahapan selanjutnya tanpamengalami penurunan kualitas maupunkuantitas DNA terlarut. Adapun tahapan

EKSTRAKSI DNA

Adapun salah satu material yang akandikaji dalam tulisan ini adaJah jaringan ototatau sering disebut dengan daging olehmasyarakat awam. Penggunaan jaringan ototsebagai sampel berkaitan dengan jumlahmitokondria di dalamnya. Mitokondriamerupakan salah satu organela sel yangmemiliki susunan gen tersendiri yang seringdigunakan dalam analisis DNA. Kajianpenggunaan jaringan otot sebagai salah satujaringan yang sering digunakan dalam ekstraksiDNA akan dijabarkan seca.ra lebih detail Selainitu, tulisan ini juga akan mempertelakan satuper satu dari beberapa konsep dan teknislaboratorium lainnya dalam kajian geoetikaseeara ilmiah yang ditinjau deoganmenggunakan pendek:atan bio-molekular terkaitdengan tahap ekstraksi DNA. Oleh karena itu,tuJisan ini diharapkan mampu memberikantambahan informasi mengenai kajian genetika.

3

merupakan bagian kecil DNA dalam suatu seleukariotik di mana sebagian besar DNA terdapatdi dalam inti sel. Adapun beberapa perbedaankarakter tersebut di antaranya adalah mtDNAmemiliki laju mutasi yang Iebih tinggi, yaitusekitar 10-17 kali dari pada DNA inti. Selainitumt DNA terdapat dalam jumlah banyak (lebihdari 1000 kopi) dalam tiap sel, sedangkan DNAinti hanya berjumlah dua kopi. DNA intimerupakan hasil perpaduan DNA dari keduaorang tua (bapak-ibu/pejantan-betina),sementara rot DNA banya diwariskan dari ibu/betina (maternally inherited) (Wallace et 01.,1999).DNA tersebut menghasilkan asam aminoyang kemudian terangkai membentuk proteinyang digunakan dalam proses metabolisme sel.Sejumlah DNA yang terdapat dalam mitokondriainilah yang lebih sering digunakan dalamanalisis genetik untuk tujuan tertentu, sepertiidentifikasi molekular, DNA barcoding dananalisis struktur populasi suatu spesiesmeskipun analisis tersebut juga dapat dilakukandengan menggunakan data sekuens DNAlainnya, seperti data sekuens DNA inti.

Hal inilab yang menjadi alasanmengapa dipilih jaringan otot untuk digunakandalam proses ekstrasi DNA, karena jumlahmitokondria dalam jaringan otot Iebih banyakdaripada jaringan yang lain. Hal ini berkaitandengan tingkat aktifitas geraknya yang lebihtinggi daripada jaringan lainnya, sebinggamembutuhkan suplai energi yang lebih besar.Suplai energi yang besar mampu disokong olebjumlah mitokondria yang banyak. Jumlahmitokondria yang banyak mempermudabproses ekstraksi DNA, sehingga diharapkandapat diperoleh ekstrak DNA dengankonsentrasi tioggi yang diekstrak dari jaringanotol Selain itu, DNA inti tentunya juga bisadiekstrak dari inti sel dari sel otot yangmenyusun jaringan otot, sebingga selainekstrak mt DNA, ekstrak DNA inti juga dapatdiperoleb selama proses ekstraksi DNA darijaringan otot. Hal ini tentunya dapat

Jaringan otot merupakan salah satujaringan tubuh yang berfungsi untukmenggerakkan sistem rangka tubuh yangtersusun dari jaringan tulang, sehingga jaringanotot merupakan jaringan yang sangat aktifbergerak dalam tubuh suatu individu. Sel-seldalam jaringan otot membutuhkan energi yanglebih besar daripada sel-sel dalam jaringanlainnya untuk mendukung aktifitas geraknya(Neumann, 2013). Kebutuhan energi dalamsistem selular disokong oleh salah satuorganela sel yang dinamakan mitokondria, yangjuga dikenal sebagai house of power. Sebagaipusat pembentukan energi, mitokondriamengendalikan proses metabolisme sel yangberarti bahwa pembentukan molekul proteinyang digunakan sebagai bio-katalis dalamproses metabolisme sci sebagian besardiproduksi di dalam mitokondria (Cooper &Hausman, 2000). Hal ini terjadi karenamitokondriamenyimpan sejumlah materi genetik:(DNA) tersendiri yang karakteristik:nyaberbedadengan materi genetik yang terdapat di dalaminti sel. Sejumlah DNA tersebut selanjutnyadikenal sebagai DNA mitokondria (mtDNA)(Giles et 01., 1980). DNA mitokondria hanya

DNAMitokondria, DNAinti, dan JaringanOtot

terjaga dengan baik. Hal ini tidak dapatdilakukan oleh larutan Ethanol 70%, karenaproses penyerapannya relatif lebih lambat yangdisebabkan kandungan airnya lebih besar(30%). Selain itu, kandungan air dalam larutanEthanol 70% yang lebih besar dibandingkandengan larntan Ethanol 100% atau 96% dapatmemicu terjadinya proses pembusukan sampelyang Iebih cepat oleh bakteri resisten alkoholsehingga sampellebih cepat rusak. Oleh karenaitu, larutan Ethanol 70010 tidak: direkrmendasikanuntuk digunakan untuk menyimpan sampelorganisme yang terkait dengan prosesekstraksi DNA dalam wak:tu yang relatif lama.

4

Gambar 1. Larutan Phenol-Chloroform danLarutan Isoamyle Alcohol yangdigunakan dalam metode PCIA[sumber: Anonim 1 (2015), http://www.piercenet.com/J

2 Metode Ion Exchange Resin ChelexIstilah Chelex merupakan siogkatan

kata dari Chelating Ion Exchange Resinyang kemudian oleh sebuah perusahaanbiokimia digunakan menjadi sebuah namadagang suatu produk ekstraksi DNA, yaitu

mempermudah peneliti untuk memastikankeberadaan ekstrak DNA di akhir prosesekstraksi. Adapun kelemahan metode iniadalah larutan fenol dan larutan kloroformmerupakan dua larutan beracun dankarsinogenik yang dapat mengganggusaluran pernafasan, dan dalam kasustertentu dapat menyebabkan kematian.Selain itu, kedua larutan tersebut sangatvolatile (mudah menguap), mudah terbakar,dan proses biodegradasinya di alammemerlukan waktu yang lama. Walaupunmetode tersebut masih digunakan sampaisekarang, namun penggunaannya sudahmulai berkurang dan tidakdirekomendasikan mengingat efek sampingyang dapat mengganggu kesehatanpenggunanya (Gross Bellard et 01., 1973;Matsunaga et 01., 1999; Strauss, 1998).

I. Metode Phenol Chloroform IsoamlyAlcohol (PClA)

Pada dasamya, metode ini merupakanmetode ekstraksi DNA yang konvensional(tanpa kit) dengan menggunakan perpaduanreaksi kimia dari berbagai macam reagenkimia yang digunakan dalam metode ini,PClA merupakan serangkaian larutan yangterdiri dari larutan phenol, klorofrom, danisoarnil-alkohol yang digunakan untukmengekstrak DNA yang kemudian dikenalsebagai salah satu metode ekstraksi DNA,yaitu. Metode tersebut sering digunakanuntuk mengekstrak DNA dari beberapamacam wujud sampel, antara lain berupadaging/otot, sirip, darah, dan beberapawujud sampel lainnya. Kelebihan utamapenggunaao metode ini adaIah ekstrak DNAyang diperoleh berupa pelet DNAtransparan yang dapat teramati, sehingga

Metode Ekstraksi DNA

Proses ekstraksi DNA dapat dilakukandengan menggunakan berbagai macam metodedan dengan berbagai jenis reagen. Masing­masing metode memiliki kelebihan dankelemahan, sehingga hal ini dapat menjadibahan pertimbangan dalam pemilihan metodeyang akan digunakan untuk proses ekstraksiDNA. Narnun, hal ini tentunya tidak terlepasdari tujuan awal sebuah penelitian dimanasuatu metode yang dipakai akan sangattergantung pada tujuan yang akan dicapai, danakan sangat berpengaruh terhadap hasil yangakan diperoleh di dalam suatu penelitian. Secaraumum, metode dan reagen yang digunakandapat dibedakan antara lain berdasarkan wujudsampel, jenis organisme, wujud dan karaktersampel, dan kondisi sampel. Beberapa metodetersebut antara lain adalah:

menyingkat waktu dan mengefisienkanpenggunaan bahan.

5

Adapun kelebihan dari proses ekstraksimenggunakan resin Chelex yakni hanyamembutuhkan waktu yang relatif singkat (30-45 men it), proses pembuatan larutan resinChelex sangat praktis (tidak rumit). Chelexmerupakan resin stabil yang marnpu bekerjasecara efektif pada kisaran pH yang luas, yaituantara pH 2 - 14, dan juga dianggap sebagaipilihan reagen yang sangat ekonomis untukproses ekstraksi DNA, karena harganya relatifmurah. Selain itu, metode ini merupakan metodeyang paling am an jika dilihat dari sisipenggunakan larutan-larutan yang berbahaya,seperti yang ada dalarn metode PClA. Di sisilain, proses ekstraksi mengguoakan resinChelex juga memiliki kelemahan, antara lainDNA dan RNA yang dihasilkan relatif sedikit,

Gambar 2. Chelex® 100MolecularBiologyGradeResin (Bio-Rad, USA) yang digu­nakan dalam metode ion exchangeResin Chelex [sumber: Anonim 2(2015), hlto://www.bio-rad.coml)

komponen seluler akan berada di bawah(endapan) (Walsh er al., 1991). Dengandemikian, ekstrak DNA dapat diambildengan mudah, meskipun perlu pengalamandan ketrampilan agar hanya ekstrak DNAsaja yang terambil.

Chelex". Reagen yang tcrkandung dalamproduk tersebut adalah sebuah resin yangdapat digunakan untuk roengekstrak DNAyaitu resin Chelex. Resin Chelex digunakanuntuk mengekstrak DNA dengan earamemanaskannya pada suhu tertentu (hotshock), biasanya dilakukan denganmenggunakan hot plate pada suhu 95 -100°C selama 30-45 menit. Selama prosesekstraksi, resin Chelex mampu melindungisampel dari eozim DNAse yang mung kintetap aktif selama proses ekatraksi. Hal inidilakukan melalui pengikatan ion dankation, salah satunya adalah pengikatan ionMagnesium (Mg2+).

Seeara alami, enzim DNAse terdapatpada semua jaringan tubuh. Enzim inimampu memotong DNA menjadi fragmenkecil, hingga mampu menghancurkan DNA,sebingga keberadaan cnzim ini dapatmengurangi kuantitas ekstrak DNA yangdihasilkan. Jika jumlah DNA di dalamekstrak DNA kurang, maka hal ini akanberpengaruh terhadap keberbasilan prosesselanjutnya, seperti proses PCR(Polymerase Chain Reaction). Terkaitdengan ion Magnesium (Mg2+), Mg2+adalah kofaktor penting untuk DNAse.Resin Chelex akan mengikat erat ion dankation yang terlarut dalam larutan resintersebut, termasuk ion Mg2<. Denganpengikatan tersebut, resin Chelex membuatDNAse tidak bereaksi, sehingga akanmelindungi DNA dari aktivitas enzimtersebut. Setelah mendidih, resin ChelexDNA akan berada dalam kondisi stabil danselanjutnya dapat disimpan pada suhu 4°Cselama 3-4 bulan. Setelah proses ekstraksi,komponen seluler bersama dengan DNAdan RNA akan terlarut di kolom larutanChelex, dimana DNA akan berada dipermukaan kolom laeutan (supernatant).Setelah proses sentrifugasi, DNA dan RNAakan tetap berada di permukaan sedangkan

6

Gambar 3. DNeasy® Blood and Tissue Kit (QIAGEN, Jerman) yang diguunakandalam metode doublespin columndandiagram alirnya[sumber: Anonim3(2015), http://www.giagen.com/)

-- 0::::-- -.-I

_I,- eyauaa,-1

If- 8--to ...!- ,--_.-)-... ..-r- -• ...-- --

digunakan untuk mengekstrak sampeldalam bentuk sampel yang telahdipreservasi dalam parafin, contohnyaadalah sampel Human Pappiloma Viru,S(HPV). Metode tersebut secara komersialdiproduksi oleh beberapa pabrikan denganbeberapa merek dagang antara lainDNeasy® Blood &Tissue Kit (QIAGEN,Jerman) dan Wizard" Genomic DNAPurification Kit (Promega, USA).

Reaksi enzimatis dari proteinase Kyang digunakan dalam metode ini mampumelisiskan DNA dari dalam seinya, sehinggamempermudah proses ekstraksi DNA.Penggunaan reagen khusus untuk mengikatdan membersihkan sisa alkohol danpengotor lainnya, seperti beberapa enziminhibitor, protein, dan kation bivaleo yangmasih tersisa dari proses preservasi sampel.Proses pembilasan yang lebih dari sekalidengan menggunakan reagen khusus, danproses sentrifugasi dengan kecepatantinggi (8000 rpm hingga 14000 rpm) yangditerapkan dalam metode tersebut, mampumenghasilkan ekstrak DNA yang lebihbersih, lebih mumi, dan dengan konsentrasiyang lebih tinggi. Dengan demikian, ekstrakDNA yang dihasilkan diharapkan mampu

3. Metode Double Spin ColumnDi antara kedua metode yang telab

dijelaskan di atas, metode double spincolumnmenawarkan hal yang berbeda yaitudengan penggunaan membran silika untukmemerangkap DNA yang telah keluar darisel. Selain itu, penggunaan kit denganreagen khusus yang biasanya digunakandalam metode ini mampu rneningkatkankuantitas dan kualitas DNA yangdihasilkan. Chan et al. (2001) menyebutkanbahwa metode double spin columnmerupakan metode yang paling efisiendalam penggunaannya, bahkan dapat

tabap pemanasan yang dilakukan selama prosesekstraksi dapat merusak struktur rantai gandaDNA (denaturasi)yang dihasilkan, sehinggadibutuhkan pula freeze shock setelah prosespemanasan untuk menormalkan kembalistruktur DNA. dan juga diperlukan ketrampilanyang handal untuk mengambil ekstrak DNAagar tidak terkontaminasi oleh molekul ataupunsenyawa lainnya. Selain itu, molekul DNAmaupun RNA yang dihasilkan dengan metodeini akan kurang stabil selama prosespenyimpanan dengan rentang waktu yang lama(Phillips et al., 2012; Walsh et al., 1991).

7

optimal dalam proses ekstraksi DNA. Namunfaktanya, masib banyak masalah dan kendalayang muncul dalam proses ekstraksi DNA,sehingga DNA tidak dapat terekstrak secaraoptimal. Masalah dan kendala tersebut dapatdiakibatkan karena kesalahan manusia (humanerror), seperti eerobob (tidak hati-hati), kurangtrampil, hingga kesalahan yang sangat fatalyaitu kesalahan penggunaan reagen kimia. HalLainyang biasanya juga menjadi masalah dankendala , adalah kondisi alat di laboratoriwnyang kurang memadai dan kondisi lain yangtidak terduga dan tidak mampu diatasi (jorcemajor).

Pada artikel ini lebih menekanan padahal-hal yang berkaitan dengao kcsalabanmanusia (human error), yang biasanya dansangat mungkin terjadi, namun masih dapatdiatasi dengan penguJangan proses ekstraksi.Oleh karena itu, beberapa bal teknis di bawahini perlu diperbatikan untuk meminimalkanresiko kegagalan dalam proses ekstraksi DNA,yakni sebagai berikut:1. Seeara umum, semua peralatan yang

digunakan harus dalam kondisi steril. Bilaperlu, lakukan sterililasi ulang selama prosesekstraksi, eontobnya dengan menggunakanlampu spirtus. Hal ini dapat dilakukansesering mungkin untuk menghindarikontaminasi.

2 Diperlukan kebati-hatian dan ketrampilandalam pengambilan ekstrak DNA, khususnyasaat menggunakan metode ionexchangeresin Chelex karena banya bagianpermukaan kolom Jaturan (supernatan) yangmengandung ekstrak DNA, sedangkan resinChelex yang merupakan bagian endapanjustru dapat menghambat aktifitas enzimTaq-polymerase di dalam reaksi PCR.

3. Ukuran sampel yang dimasukkan harusterukur, terutama terkait dengan penggunaanmetode ion exchange resin Chelex. Sampelyang perlu dimasukkan dalam resin Chelexhanya sekitar 0,2 - 0,5 mm. sedangkan

Beberapa catatan penting yang perludiperbatikan

Pada dasarnya, semua metode yangtelah dijelaskan di atas dapat digunakan secara

Penyimpanan Ekstrak DNA

Setelah ekstrak DNA didapatkan,tahapan selanjutnya yaitu penyimpanan ekstrakDNA. Ekstrak DNA yang telah diperoleh danterlarut daLam larutan bufeer (buffer TE atausejenisnya), selanjutnya disimpan di dalamfreezer yang bersuhu -200C. Dalam pernbahasanini, satu hal yang penting dan harus dicatatadalah semakin rendah temperatur di dalamfreezer, maka ekstrak DNA semakin lama dapatdisimpan. Adapun suhu ideal untukpenyimpanan ekstrak DNA menurut Lahiri &Schnabel (1993) adalah -70°C, dan saat ini telahmemungkinkan untuk menyimpan sampelekstrak DNA dalam freeze: k:husus (moleculargrade) dengan suhu -86°C.

mendukung kesuksesan proses selanjutnya(amplifikasi DNA dan sequensing DNA).Selain itu, penggunaan beberapa Iarutanbuffer khusus dalam kit terse but, yangbekerja dengan mengikat DNA mampumenjaga kualitas ekstrak DNA untukpenyimpanan yang lebih lama (lebib dari 2-3 tabun). Hal inilah yang menjadi beberapakelebiban dari metode ini. Di sisi lain,kelemahan utama penggunaan metodetersebut adalah seeara umum prosesekstraksinya memerlukan waktu yang relatiflama, yaitu sekitar 2 jam babkan mungkinlebih dari 24 jam, mulai dari prosespemecahan sel hingga diperoleh ekstrakDNA, sehingga dianggap kurang praktis.Selain itu, barga kit yang masih mahaldibanding dengan harga reagen yangdipakai dalam metode yang lain, dianggapmenjadi kendaia tersendiri dalampenggunaan metode ini (Demeke & Jenkins,2010; Phillips eJ al., 2012;Tan &Yiap, 2009).

8

Giles, R E.,H. Blanc, H. M. Cann, and D. C.Wallace. 1980. Maternal inheritance ofhuman mitochondrial DNA.Proceedings of the National academyof Sciences,77(11), 6715-6719.

Gross Bellard, M., P.Oudet, and P. Chambon.1973. Isolation of High MolecularWeight DNA from Mammalian Cells.European Journal of Biochemistry,36(1),32-38.

Hebert, P.,A. Cywinska, S. Ball, and 1. deWaard.2003. Biological identifications throughDNA barcodes. Proc. Bioi. Sci.,270(1512),313 - 321.

Holmes, B. H., D. Steinke, and R D. Ward.2009. Identification of shark and ray fins

Ganie, R A. 2005. Thalassemia:permasalahandan penanganannya, GelanggangMahasiswa Universitas Sumatra Utara.Pidato Pengukuhan Jabatan GuruBesarTetap. Medan pada Tanggal, 16November 2005.

Chan, P.,D. Chan, K.To,MYu, 1. Cheung,andA Cheng. 2001. Evaluatioo of extractionmethods from paraffin wax embeddedtissues for PCR amplification of humanand viral DNA. Journal of ClinicalPathology, 54(5),401-403.

Cooper, G M.and R E.Hausman. 2000. Thecell: a molecular approach. FifthEdition. Sinauer Associates Sunderland,Boston University, USA pp. 433-435

Demeke, T. and GR Jenkins. 2010. Influenceof DNA extraction methods, PCRinhibitors and quantification methodson real-time PCR assay ofbiotecbnology-derived traits. Analyticaland bioanalytical chemistry, 396(6),1977-1990.

Anonim 1. 2015. Phenol-Chloroform. http://www.piercenet.com/. Diakses pada 1710212015, pukulI3:10:27

Anonim 2. 2015. Chelex® 100 MolecularBiology Grade Resin. http://www.bio­rad.com/. Diakses pada 23/0212015,pukul10:21:15

Anonim 3.2015. DNeasy® Blood and TissueKit. http://www.giagen.coml. Diaksespada 10/0212015,pukul15:18:07

DAFfAR PUSTAKA

sampel yang diperlukan dalam metodedouble sipn column hanya seukuran Y, bulirberas. Hal ini perlu diperhatikan, karenaterlalu besar ulruran sampel yangdimasulckan justru dapat menghambat prosesekstraksi DNA dari sampel tersebut.

4. Penggunaan wujud sampel yang berbeda(misalkan daging, darah, ekor, atau rambut)terkadang memerlukan perlakukan khusus,karena kadang kala akan menampilkan hasilekstraksi yang berbeda, meskipunmenggunakan metode ekstraksi yang sama,khususnya ketika menggunakan resinChelex. Satu sampel mungkin dapatterekstrak DNAnya dengan sangat cepat,namun sampel yang lain hams menungguselama satu Malam. Di samping itu, hasilekstraksi dapat sangat bervariasi tergantungjenis biota yang digunakan.

5. Khusus selama penggunaan metode ionexchange resin Chelex, seaodainya tidakdidapatkan ekstrak DNA pada prosesesktraksi kali pertama, maka bukan berartisampel sudah tidak dapat dipakai kembali.Solusinya adalah semua tahap dalam metodeion exchange harus diulang dari awaldengao proses inkubasi yang perludiperpanjang, namun tanpa perlu menggantiresin Chelex dan sampeloya.

9

Strauss, W. M. 1998. Preparation of GenomicDNAfrom Mammalian TIssue.CurrentProtocols in Molecular Biology, JohnWiley and Sons, Inc. pp.221-223.

Tan, S. C.and B.C. Yiap, B. C. 2009. DNA,RNA, and protein extraction: the pastand the present. Journal ofBiomedicine andBiotechnology, Vo!.l.pp. 1-10. doi: 10.1155/2009/574398.

Wallace, D. C., M. D. Brown, and M. T. Lou.1999. Mitochondrial DNA variation inhuman evolution and disease. Gene,238(1), 211-230.

Walsh, P. S., D. A. Metzger, and R Higuchi.1991.Chelex 100 as a medium for simpleextraction of DNA for PCR-based typingfrom forensic material. Biotechniques,10(4),506-513.

Ward, RD., T. S. Zemlak, B. H. Innes, P. RLast and P. D. Hebert. 2005. DNAbarcoding Australia's fish species.Philosophical Transactions of theRoyal Society B:Biological Sciences360(1462): 1847-1857.

Roberts, J. P. 2004. Gene therapy's fall and rise(again). TheScientist, 18(18),22-24.

Srinivasan, M., D. Sedmak, and S. Jewell 2002.Effect of Fixatives and TissueProcessing on the Content and Integrityof Nucleic Acids. TheAmericanJournalof Pathology, 161(6), 1961-1971.

Matsunaga, T., K.. Chikuni, R. Tanabe, S.Muroya, K.. Shibata, J. Yamada, and Y.Shirunura. 1999. A quick and simplemethod for the identification of meatspecies and meat products by PCRassay. Meat science, 51(2), 143-148.

Neumann, D. A. 2013. Kinesiology of themusculoskeletal system: foundationsfor rehabilitation.2l1liEditiond ElsevierHealth Sciences, Mosby Elsevier,Missouri, USA. pp. 28-46. ISBN 978-0-323-03989-5

Phillips, K.., N. McCallum, and L.Welch. 2012.A comparison of methods for forensicDNA extraction: Chelex-IOO and theQIAGEN DNA investigator kit (manualand automated). Forensic ScienceInternational: Genetics,6(2), 282-285.

Pulungan, A.and H.Herqutanto. 2009. DiabetesMelitus Tipe 1:"Penyakit Baru" yangakan Makin Akrabdengan Kita, MajalahKedokteran Indonesia,Vol. 59, No. 10,hal. 455-458.

Marshall, E. 2005. Taxonomy: will DNA barcodes breathe life into classification?Science,307(5712), 1037.

using DNA barcoding. FisheriesResearch,95(2), 280-288.

Lahiri, D.and B. Schnabel. 1993.DNA isolatiooby a rapid method from human bloodsamples: effects of MgCI2, EDTA,storage time, and temperature on DNAyield and quality.BiochemicalGenetics,31(7-8),321-328. doi: 10.1007/BF02401826

10