3/17/2011

1

EFISIENSI KOLOM

Pertemuan 3

Bentuk-bentuk kromatogram

- Linier (simetris, bentuk gaus), ideal(puncak sempit)

- Tidak linier dan tidak ideal

K = CS/Cm K < CS/Cm

K > CS/Cm

CS CS CS

Cm CmCm

3/17/2011

2

K = CS/Cm K < CS/Cm

K > CS/Cm

CS CS CS

Cm CmCm

Isoterm ideal isoterm konveks Isoterm Konkaf

Simetris peak tailing peak leading(overload)

Faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom

Difusi Eddy (A) Difusi longitudinal (B/V) Transfer massa (CV)

4

HETP = A + B/V + CV

Pers. Van Deemter:

3/17/2011

3

Persamaan Van Deemter:

Suku A

dp = diameter partikel isis kolomλ = faktor geometri (keseragaman partikel)

3/17/2011

4

7

Packing kolom tidak seragam, jalur yang dilalui analit berbeda, sampai di ujung kolom dalam waktu yang berbeda

1. Faktor Difusi Eddy

Suku B/V (difusi longitudinal)

Dg = koef difusi analit pada fasa pembawa (gas)= 105 DL

3/17/2011

5

2. Faktor Difusi Longitudinal

9

Arah aliran fasa gerak berbeda denganarah aliran (gas)

Suku C.V (efek perpindahan massa)

k’= faktor kapasitasdf = tebal lapisan cairan fasa diamDl = koef difusi komponen dalam fasa diamω = tetapan gasDp = diameter partikel isi kolomDg = koef difusi komponen dalam fasa gerak

diabaikan

3/17/2011

6

3. Faktor Efek perpindahan massa

11

Analit yang ada di pusat aliran bergerak lebih cepat dibandingkan dengan analit di dekat dinding kolom

12

Fasa diam

Fasa gerak

Distribusi Ideal Distribusi tidak ideal

3/17/2011

7

Grafik Van Deemter

13

V optimal

H min

HETP

V, Laju

Laju alir operasional : 2 Vopt

Berilah penjelasan:

Makna dari grafik Van Deemter:

Suku A ?

Suku B

Suku C

Kondisi optimum ?

3/17/2011

8

15

Mengapa kolom dapat memisahkan campuran

komponen ?

Karena perbedaan interaksi

komponen-komponen

dengan kolom/fasa diam

Komponen2 keluar dari kolom

Dalam waktu yang berbeda-beda

Waktu retensi (tr)

Berbeda-beda pula

16

Prinsip Pemisahan

Perbedaan distribusi komponen diantara fasa gerak dan fasa diamyang menyebabkan perbedaan migrasi diferensial komponen-komponen analit dalam kolom kromatografi

Selektivitas kolom

Kemampuan kolom untuk membedakan suatu

komponen dari komponen lain

Perbedaan k`

dasar

Faktor selektivitas,

3/17/2011

9

17

1. Faktor Selektivitas ( )

1

2

K

K K adalah Koef partisi komponen

1 dan 2

)0()1(

)0()2(

'1

'

2

rt

rt

rt

rt

rt

rt

Untuk Pemisahan:

>>1

18

Apakah parameter menjamin

pemisahan sempurna ??

Tr, menit

I 3,2 4,5T0= 0,99

:………………………………

menjamin pemisahan bagian atas (puncak)

kromatogram

Tidak memperhitungkan overlap puncak-

puncak

Parameter lain :

R (resolusi)

3/17/2011

10

19

2. Resolusi (Rs)

1 2

)(

(2

)(2

1

21

)1()2(

21

)1()2(

ww

tt

ww

ttRs

rr

rr

W = lebar puncak

w

20

w

W1/2

)(699,1

)(2

)2(2/1)1(2/1

)1()2(

ww

ttRs

rr

Rs ideal = 1,25

(97,5% terpisah)

3/17/2011

11

21

Cara lain menghitung Rs :

memperhitungkan

selektivitas

efisiensi

faktor kapasitas

Nk

kR )

1)(

`1

`(

4

1

Faktor

kapasitas

Faktor

selektivitas

Faktor

efisiensi

22

INSTRUMENTASI

HPLC

3/17/2011

12

23

KCKT

Teknik untuk pemisahan dan analisis zat

yang sukar dipisahkan dan termolabil

Teknik untuk kontrol ketakmurnian

Eluat

dikumpulkan

Tempatelue

npompa injektor

kolom

detektor

rekorder

Diagram blok alat KCKT

24

GAMBAR HPLC

3/17/2011

13

25

1. Tempat eluen/pelarut

Botol terbuat dari bahan yang bereaksi

dgn pelarut (gelas)

Dilengkapi dgn penyaring (stainless

steel)

Pipa kecil polietilen

eluen harus di degassing

Eluen harus disaring dengan saringan

26

2. Pompa eluen

Gambar Pompa

Gunanya memompa eluen ke dalam kolom

Terbuat dari stainless steel/teflon

Seals terbuat dari mas atau teflon/grafit

Tekanan sampai 400 bar

Memberikan laju alir sampai 5 mL/menit

Tidak memberikan pulsa

3/17/2011

14

27

Spesifikasi pompa yang baik:

Repeatability (keberulangan)

Presisi jangka pendek (short term precision)

Noise pompa (menyebabkan pulsa) karena

gerakan piston dan check valve

Drift (perubahan kecepatan alir pompa

karena waktu alir lama)3. Injektor

Valve

Injektor

Syringe injection

28

Syarat injektor:

dapat memasukkan contoh ke dalam kolom

dalam bentuk sesempit mungkin untuk

menghindari pelebaran puncak

Mudah digunakan

Keberulangan tinggi

Dapat bekerja meskipun ada tekanan balik

tinggi4. Kolom

Gambar kolom

3/17/2011

15

29

Kolom yang baik

bahan kolom kuat dan tidak mudah berkarat

partikel Isi kolom berdiameter kecil (5–10m), ukuran

seragam, bulat, berpori

Efisiensi kolom tinggi (N >>, H<<)

Tahan terhadap tekanan tinggi

Menghasilkan puncak simetri dan sempit

30

Karakteristik packing kolom untuk kromatografi

3/17/2011

16

31

Jenis kolom

1. Kolom polar : silika, amina

2. Kolom non polar : C-8, C-18

Struktur fasa diam silika Struktur fasa diam C-18 terikat pada

silika

silika C-18 yang terikat silika

Si

O O

Si

Si O

O H

Si O

Si

O R

Si

O R

Si

32

5. Detektor

Syarat detektor

• Tingkat noise dan drift rendah

• Sensitivitas tinggi

• respons cepat

•Tidak sensitiv terhadap perubahan tipe pelarut, laju alir pelarut dan

temperatur

• mudah pengoperasiannya

• awetDetektor dalam KCKT

• detektor spektrofotometrik (UV/VIS)

• detektor fluoresensi

•Detektor indeksrefraksi (Optis)

•Detektor elektrokimia

3/17/2011

17

33

Berdasarkan jenis kolom dan eluen :

1. Kromatografi fasa terbalik : Fasa diam lebih

nonpolar dari fasa gerak

2. Kromatografi fasa normal : Fasa diam lebih

polar dari fasa gerakPemeliharaan kolom

1. Saring eluen dgn saringan membran

2. Hindari pengaliran eluen ke dalam kolom dari arah yang sebaliknya

3. Gunakan kolom pengaman (column guard)

4. Simpan kolom dalam pelarut yang sesuai jika tidak digunakan (kolom polar

dalam metanol, kolom nonpolar dalam kloroform)

5. Jangan sampai kolom jatuh

6. Jangan menggunakan eluen yang terlalu asam

7. Cuci kolom sesudah digunakan.

8. Lakukan regenerasi kolom sesuai prosedur

34

Trouble shoot

Alat

Hasil pengukuranTrouble Shoot Penanggulangan

1. Pompa berhenti/tekanan

tinggi

Saring kembali fasa gerak

Periksa saringan fasa gerak

Periksa ujung-ujung kolom

periksa klep pompa (harus dgn

ahlinya.)

Bersihkan kolom dengan laju alir

minimal

ganti kolom

2. Keberulangan injeksi rendah Cuci kolom

Uji keberulangan pompa

Periksa detektor

3. Puncak tidak terpisah Perlambat laju alir

Ubah komposisi fasa gerak

Ganti fasa gerak

Ganti kolom

4. Puncak terlalu lebar dan tr >> - Percepat laju alir

3/17/2011

18

35

TIPE-TIPE PUNCAK KROMATOGRAM

36

TIPE-TIPE KROMATOGRAM

3/17/2011

19

37

Soal resolusi:

1. Dari kromaogram KCKT suatu campuran yang diketahui terdiri dari senyawa A dan B, diperoleh data sbb:

tr (A) = 13 menit, tr (B) = 21,5 menit, to = 2,0 menit

W(A)= 2,1 menit, W(B) = 4,1 menit.

Hitung Resolusi dan faktor pemisahannyaSoal efisiensi kolom:

Komponen x terelusi dalam KCKT dengan data sbb:

tr (x) = 21,5 menit , W = 4,1 menit, W1/2= 1,85 menit, to= 0,95 menit.

Hitung N , HETP, dan Faktor kapasitas, bila elusi dilakukan dalam kolom 12,5 cm

38

Analisis kualitatif

-Agak sukar dilakukan terutama bila

dalam campuran

-Dapat dilakukan bila pemisahan baik

dan tidak ada interferensi

-Dasar: membandingkan waktu retensi

analit dengan standar

-Kondisi elusi analit harus sesuai

dengan kondisi standar

- Kesulitan: sukar menemukan standar

3/17/2011

20

39

Analisis Kuantitatif

Tahapan kerja:

*Penyiapan fasa gerak :

Pelarutan, pencampuran, penyaringan, degasing

*Preparasi sampel :

Pemisahan dgn ekstraksi

Pengenceran/pelarutan ekstrak

penyaringan/degasing

*Penyiapan larutan standar :

Induk : larutan 1000 ppm

pengenceran dengan fasa gerak.

pembuatan larutan kerja:

40

*Pengukuran sampel

*Penentuan konsentrasi sebenarnya

analit dalam sampel

Pengukuran sampel:

-Teknik membandingkan area standar

dengan area analit

Area standar = As , konsentrasi = Cs

Area analit = Ac , konsentrasi analit = Cc

As/Ac = Cs/Cc

3/17/2011

21

41

C, ppm

Area

*

*

*

*

*

Cx

- Teknik kurva kalibrasi

Dibuat beberapa seri larutan standar, dari

konsentrasi kecil sampai besar ( minimal 4 larutan

standar)

Dibuat larutan sampel sedemikian sehingga area berada

dalam range konsentrasi standar

Larutan standar diinjeksikan mulai dari konsentrasi kecil

Larutan sampel diinjeksikan

Plot Area sampel dalam kurva kalibrasi

(C vs area standar)

Teknik analisis kuantitatif dengan kalibrasi adisi standar

Untuk mendekatkan kondisi sampel dengan kondisi larutan standar

Caranya: ke dalam sejumlah larutan standar (seri) ditambahkan sejumlah yang sama sampel, kemudian diperlakukan sesuai prosedur seperti pada cara kalibrasi biasa

42

C, ppm

Area

*

*

*

*

*

Cx

3/17/2011

22

43

Parasetamol adalah obat analgesik dan antipretikyang biasanya dikemas dalam bentuk cair untukkonsumsi anak-anak. Selain parasetamol sebagaizat aktif, biasanya dalam kemasan tersebutditambahkan aditif gula dan etanol dalam jumlahsedikit selain air sebagai pelarut.

OH

HN – C = O

CH3

44

Bila senyawa parasetamol akan dianalisis dengan HPLC, teknik mana yang akan dipilih, a. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak

metanol/airb. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak n-

heksana/airc. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak n-

heksanad. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak

kloroformDetektor apa yang dapat digunakan dalam analisis ini ? Bagaimana gambaran kromatogram yang akan dihasilkan ?

3/17/2011

23

45