SEMINAR MAKALAH KHUSUS DEPARTEMEN BIOLOGI FMIPA IPB 2011 Nama NIM Judul Penelitian Pembimbing Hari/Tanggal Waktu/Tempat : Cahyo Nugroho : G34070107 : DNA Barkode Variasi Gen Sitokrom Oksidase Subunit I (COI) pada DNA Mitokondria Apis cerana : 1. Dr. Ir. Rika Raffiudin M.Si. 2. Drs. Mochamad Chandra W M.Sc. : Kamis / 23 Juni 2011 : 09.00 09.45 / Laboratorium Biologi 5

PENDAHULUAN Latar Belakang Geografi yang luas menyebabkan lebah memiliki variasi morfologi yang tinggi (Ruttner 1988). Keragaman morfologi lebah yang tinggi mengakibatkan munculnya berbagai spesies yang berbeda di setiap tempat yang berbeda. Penggolongan lebah (Apis) terdiri atas tiga garis keturunan: lebah yang bersarang di rongga seperti Apis cerana, Apis mellifera, dan Apis koschevnikovi; lebah berukuran kecil seperti Apis florea dan Apis andreniformis; lebah berukuran besar seperti Apis dorsata dan Apis labriosa (Smith 1991). A. cerana adalah salah satu lebah yang berada di kawasan Asia dan merupakan serangga sosial yang hidup dalam penggolongan kasta, yang terdiri atas lebah ratu, pejantan, dan pekerja (Winston 1991). Penggunaan mitokondria pada A. cerana dapat digunakan sebagai penanda genetik. Kelebihan dari mitokondria jika digunakan sebagai penanda genetik, yaitu: (i) mtDNA memiliki jumlah salinan yang tinggi, sehingga memudahkan untuk mengisolasi dan memurnikan DNA tersebut, tanpa harus memperbanyak gen dari individu yang akan diamati terlebih dahulu; (ii) Ukuran dari genom mitokondria lebih kecil dibandingkan dengan ukuran genom inti sel sehingga DNA genom mitokondria dapat dipelajari secara menyeluruh; (iii) secara umum mtDNA bersifat konservatif bagi isi dan urutan gen; (iv) gen pada mtDNA tidak terdapat intron (Smith 1991). Data genetik mengenai keragaman A. cerana di Indonesia masih cukup rendah, padahal kondisi geografi Indonesia sangat bervariasi sehingga memungkinkan terjadinya perubahan haplotipe (hap). Terdapat sembilan hap A. cerana di Asia Tenggara dari database Genebank berdasarkan gen mitokondria COI, yaitu AF153101-AF153103 dan AF153105-AF153109 (www.ncbi.nlm.nih.gov). Sembilan data sampel tersebut belum ada satupun yang berasal dari Indonesia. Hal tersebut menyebabkan perlunya dilakukan penelitian untuk mengkode DNA yang ada pada A. cerana. Metode yang digunakan untuk membedakan keragaman di dalam dan diantara spesies dapat menggunakan DNA barkode. DNA barkode yang digunakan berasal dari DNA mitokondria pada situs Cytochrome Oxydase Subunit I (Hebert et.al 2003a, 2003b). Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah mengkonstruksi DNA barkode sitokrom oksidase subunit I (COI) untuk A. cerana. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2011 sampai bulan Juli 2011 di Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. METODE Koleksi Sampel. Obyek yang digunakan adalah sampel koleksi lebah pekerja A. cerana yang berasal dari koleksi Dr. Ir. Rika Raffiuddin M.Si., di Departemen Biologi FMIPA IPB. Hasil koleksi lebah berasal dari beberapa daerah di Indonesia, yaitu Jawa Barat, Jawa Timur, P. Lombok, P. Flores, dan P. Sumbawa. Sampel lebah telah diawetkan di dalam etanol absolut. Ekstraksi DNA. DNA A. cerana diekstraksi dengan menggunakan metode CTAB berdasarkan Sambrook et.al (1989) dengan modifikasi Raffiudin & Crozier (2007). Bagian yang diambil, yaitu toraks lebah pekerja, kemudian toraks dimasukkan ke dalam nitrogen cair lalu dihancurkan secara mekanik dengan menggunakan grinder dan ditambahkan CTAB buffer sebanyak 48 l serta Proteinase-k sebanyak 10 l. Selanjutnya diinkubasi 55C selama 2 jam, lalu ditambahkan PCI 540 l dan CIAA 240 l. Larutan isopropanol ditambahkan untuk mendapatkan DNA murni kemudian diinkubasi dan tambahkan alkohol 70% untuk mengendapkan DNA. Tahap akhir ditambahkan TE 20 l untuk mencairkan endapan DNA. DNA hasil ekstraksi disimpan di dalam freezer pada suhu 4C sampai DNA digunakan untuk tahap selanjutnya.

Amplifikasi DNA. DNA diamplifikasi dengan menggunakan ESCO thermal cycler machine yang berisi 20 l PCR campuran. PCR campuran terdiri dari 5.9 l air destilata, 0.8 l primer forward, 0.8 l primer reverse, 10 l Kapa Ready Mix 2x, dan penambahan 1 l MgCl2. Primer yang digunakan yaitu primer forward Am_COX1b_F dengan urutan nukleotida 5 AGGAGGTGGAGATCCAATTC 3 dan primer reverse 5 TGGATAGTCTGAATAACGTCGTG 3. Pengaturan perlakuan saat PCR sebagai berikut; menginisiasi denaturasi DNA selama 4 menit pada suhu 95 C, denaturasi DNA sebanyak 30 siklus pada suhu 94 C, penempelan primer 1 menit pada suhu 50 C, elongasi DNA selama 2 menit pada suhu 72 C dan 20 menit untuk ekstensi. Hasil PCR divisualisasi dengan menggunakan Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE) dengan konsentrasi 6% dan dimigrasikan dengan menggunakan alat elektroforesis (200 V; 55 menit), lalu diwarnai dengan menggunakan metode pewarnaan perak nitrat (Tegelstrom 1986). Sekuens DNA. DNA hasil PCR disekuens dengan menggunakan primer yang sama pada saat proses amplifikasi. Proses sekuens dilakukan oleh perusahaan jasa pelayanan sekuens. DNA disekuens dari beberapa lokasi di Indonesia (Tabel 1) Tabel 1. Lokasi koleksi A. cerana untuk analisis sekuens NoProvinsi

Asal DaerahWilayah

KodeSampel

1 23 4 5 6 7 8 9 10

Jawa Barat

Cililin Pandeglang Gunung ArcaPasuruan Tretes Sumur Jorong Desa Jarok Rupit Daya Flores Flores

Ac 21.1 Cln Ac 45.1 Pdg Ac 6.1 ArcAc 2.1 Psr Ac 20.1 Trs Ac 1.1 Lsj Ac 1.1 Sdj Ac 1.1 Srd Ac 1 Flr Ac 2 Flr

Jawa Timur Lombok Sumbawa Kepulauan Flores

Analisa DNA. Hasil sekuens berupa kromatogram, diedit dengan menggunakan software BioEdit Sequence Alignment Editor 6.32 dan Genetyx Vs 4.01. Proses pengeditan diawali dengan menyejajarkan antara basa nitrogen dengan kromatogram, lalu menghapus hasil sekuens dari basa nitrogen yang tidak akurat berdasarkan kromatogram. Kemudian dilakukan penjajaran antara hasil sekuens dengan menggunakan primer forward dan primer reverse. DNA yang telah sejajar akan overlapping, lalu bagian tersebut diambil untuk mendapat ukuran DNA yang lebih panjang dengan menggunakan software Clustal X. DNA hasil pengeditan ditranslasikan menjadi asam amino dengan menggunakan software Genetyx. DNA dari sampel yang didapat kemudian dijajarkan dan dibandingkan dengan database DNA gen COI dari A. cerana yang ada di Genebank, dengan nomor identitas AF153101-AF153103 dan AF153105-AF153109 (www.ncbi.nlm.nih.gov). HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi DNA. Dua puluh DNA A. cerana dari dua puluh lima koloni yang berasal dari tempat berbeda telah diamplifikasi dan hanya sepuluh sampel yang dilanjutkan untuk proses sekuens. Hal ini disebabkan oleh pita hasil amplifikasi pada beberapa DNA tidak muncul atau tipis pada saat visualisasi. Pita yang tipis mengindikasikan bahwa konsentrasi DNA rendah. DNA yang menjadi target berukuran kurang lebih 800 pasang basa (pb) pada gel akrilamid (Gambar 1). Pada sampel suhu optimum penempelan primer pada saat amplifikasi, yaitu 50C. Suhu penempelan primer ini sangat penting dalam proses amplifikasi, karena pada tahapan ini primer akan menempel secara spesifik pada DNA target. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gambar 1. Visualisasi DNA A. cerana gen COI pada 800 pb. M=100 pb Marker. 1= Ac 45.1 Pdg. 2= Ac 20.1 Trs. 3= Ac 2.1 Psr. 4= Ac 6.1 Arc. 5= Ac 21.1 Cln. 6= Ac 1.1 Srd. 7= Ac 1.1 Sdj. 8= Ac 1 Flr. 9= Ac 2 Flr. 10= Ac 1.1 Lsj

1000 pb 800 pb 500 pb

Analisis DNA. Jumlah pasang basa yang telah dilakukan penjajaran dengan DNA COI yang berasal dari A. cerana yang ada di Indonesia serta dari database, yaitu 590 pb. Hasil penjajaran DNA sampel dan database menujukkan bahwa dari 10 sampel yang telah disekuens (Tabel 1), terdapat 6 haplotipe baru (Gambar 2). Haplotipe tersebut, yaitu hap 10 (Ac2.1_Psr, Ac20.1_Trs, Ac6.1_Arc dan Ac45.1_Pdg), hap 11 Ac21.1_Cln, hap 12 Ac1.1_Srd, hap 13 Ac1_Flr, hap 14 Ac2 Flr, dan hap 15 Ac1.1_Lsj (Gambar 2). Hap 1 dan 2 berasal dari Malaysia, hap 3 dari Brunei, hap 5 dari Taiwan, hap 6 dari Thailand, hap 7 dari Rusia, hap 8 dari Korea Selatan, dan hap 9 dari Jepang. Hasil penjajaran DNA yang telah diamplifikasi memiliki jumlah pasang basa yang berbeda, hal ini disebabkan oleh sekuens DNA yang diambil hanya yang akurat setelah dicocokkan dengan kromatogram. Gen A. cerana yang berasal dari lokasi yang berbeda memungkinkan terjadinya proses perubahan nukleotida, sehingga haplotipe yang dihasilkan akan berbeda. Terdapat tiga haplotipe yang berbeda pada urutan basa ke 61-120 pb, dengan perubahan nukleotida pada Hap 15 untuk Ac1.1_Lsj urutan basa ke 69 yaitu T C. Hap 13 dan 14 untuk Ac1_Flr serta Ac2_Flr terjadi perubahan basa A T pada urutan basa ke 89. Hap 12 untuk Ac1.1_Srd terjadi perubahan basa T C pada urutan basa ke 98 (Gambar 3).Panjang nukleotida (pb) Hap 8 Korsel Hap 9 Jepang Hap 7 Rusia Hap 6 Thailand Hap 5 Taiwan Hap 1 Malaysia Hap 3 Brunei Hap 2 Malaysia Hap 10 Hap 11 Hap 12 Hap 13 Hap 14 Hap 15 100 pb 300 pb 600 pb

Gambar 2. Gen COI A. cerana yang telah disejajarkan antara DNA sampel dengan DNA yang berasal dari database. Nomor = urutan basa; = haplotipe berbeda. Haplotipe 1-3 dan 5-9 database genebank; hap 10 = Ac2.1_Psr, Ac20.1_Trs, Ac6.1_Arc dan Ac45.1_Pdg; Hap 11 = Ac 21.1 Cln; Hap 12 = Ac1.1 Srd; Hap 13 = Ac1 Flr; Hap 14 = Ac2 Flr; Hap 15 = Ac1.1 Lsj.Hap8_Korsel Hap9_Jepang Hap7_Rusia Hap6_Thailand Hap5_Taiwan Hap1_Malaysia Hap2_Malaysia Hap3_Brunei Hap 10 Hap 11 Hap 12 Hap 13 Hap 14 Hap 15 TTTATATTTT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........C. AATTCTTCCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... GGATTTGGAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........TC ........TC .......... .......... TAATTTCTCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......C.. .......C.. .......C.. .......... TATTGTTATA .......... .......... .......... ......A... C.....A... C.....A... C.....A... ......A... ......A... C.....G... C.....G... C.....A... ......A... AATGAAAGAG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120]

Gambar 3. Hasil sekuens gen COI, perubahan nukleotida pada sampel yang berbeda. Keterangan hap (Gambar 2) = Variasi Hap 15; = Variasi Hap 12 dan Hap 13; = Variasi Hap 12, Hap 13 dan Hap 14 Berdasarkan hasil penelitian, menunjukkan bahwa persebaran A. cerana yang ada Indonesia, terjadi secara luas. Hasil penjajaran DNA, Haplotipe 10 yang berasal dari Jawa Barat dan Jawa Timur, ternyata memiliki hubungan kekerabatan yang sama. Berbeda dengan Haplotipe 11 yang berasal dari Jawa Barat juga, telah terjadi perubahan basa sehingga termasuk ke dalam haplotipe yang berbeda. Hal ini disebabkan lokasi pengambilan sampel di Cililin yang terisolasi (Gambar 2).

Hap8_Korsel Hap9_Jepang Hap6_Thailand Hap3_Brunei Hap5_Taiwan Hap2_Malaysia Hap1_Malaysia Hap 10 Hap 11 Hap 13 Hap 14 Hap 12 Hap 15 Hap7_Rusia

GFIVWAHHMF .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TVGLDVDTRA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

YFTSATMIIA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

VPTGIKVFSW .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

LATYHGSKLK .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

LNISVLWSLG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....I..... ....I..... ....I.....

[120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120] [120]

Gambar 4. Perubahan asam amino pada gen COI Apis cerana. = perubahan asam amino dari Valin menjadi Isoleusin, terjadi pada urutan asam amino ke 115 pada hap 12, hap 15 dan hap 7. COI adalah gen yang mengkodekan protein sitokrom oksidase. Protein ini berfungsi sebagai protein transport melalui membran, pada mekanisme respirasi seluler (Lunt et.al 1996). Proses perubahan nukleotida pada gen tersebut belum tentu menyebabkan perubahan asam amino yang akan ditranslasikan. Hal ini dapat dibandingkan pada gambar 3 dan 4. Berdasarkan gambar 3, telah terjadi perubahan DNA tetapi tidak berkorelasi terhadap perubahan asam amino pada Gambar 4. Perubahan asam amino dari valin menjadi isoleusin terjadi pada A. cerana yang berasal dari Hap 15 dari Lombok, Hap 12 dari Sumbawa, dan Hap 7 dari Rusia. SIMPULAN Hasil amplifikasi gen COI A. cerana yang berasal dari Jawa Barat, Jawa Timur, Flores, Sumbawa, dan Lombok adalah 590 pb. Penelitian ini menghasilkan data gen enam haplotipe baru A. cerana, yaitu hap 10, 11, 12, 13, 14 dan 15. Hap 10 berasal dari Pasuruan, Tretes, Gunung Arca, dan Pandeglang; Hap 11 berasal dari Cililin; Hap 12 berasal dari Sumbawa; Hap 13 dan 14 berasal dari Flores; serta Hap 15 berasal dari Lombok. Hasil ini menunjukkan bahwa geografi Indonesia yang luas berhubungan dengan variasi haplotipe yang tinggi. DAFTAR PUSTAKA Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR. 2003a. Biological identifications through DNA barcodes. Proc. R. Soc. Lond 270: 313-321. Hebert PD, Ratnasingham S, deWaard JR. 2003b. Cytochrome c oxidase subunit I divergences among closely related species. The Royal Society 270: S96-S99. Lunt DH, Zhanx D, Szymura J, Hewitt G. 1996. The insect cytochrome oxidase subunit I gene: Evolutionary patterns and conserved primers for phylogenetic studies. Insect Mol Biol 5: 153165 Ruttner F. 1988. Biogeography and Taxonomy of Honeybees. Springer Verlag: New York. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratorium Manual Second Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. s Smith D. 1991. Diversity in the Genus Apis. Oxford: Westview Press. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24:1596-1599. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. 1997. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nuc Acid Res 25:4876-4882. Winston ML. 1987. The Biology of The Honey Bee. London: Harvard University Press.