DISERTASI MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella...

DISERTASI

MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella asiatica (Pegagan) DALAM MENINGKATKAN APOPTOSIS SEL ALVEOLAR MAKROFAG

DARI JARINGAN PARU TIKUS YANG DIINFEKSI Mycobacterium tuberculosis

Arifa Mustika

PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA 2012

ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga

Disertasi MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella asiatica ... MUSTIKA ARIFA

ii

DISERTASI

MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella asiatica (Pegagan) DALAM MENINGKATKAN APOPTOSIS SEL ALVEOLAR MAKROFAG

DARI JARINGAN PARU TIKUS YANG DIINFEKSI Mycobacterium tuberculosis

Arifa Mustika

PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA 2012



iii

MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella asiatica (Pegagan)

DALAM MENINGKATKAN APOPTOSIS SEL ALVEOLAR MAKROFAG DARI JARINGAN PARU TIKUS YANG DIINFEKSI

Mycobacterium tuberculosis

DISERTASI

Untuk memperoleh Gelar Doktor

Dalam Progran Studi S3 Ilmu Kedokteran

Pada Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

Telah dipertahankan dihadapan

Panitia Ujian Doktor Terbuka

Pada hari : Selasa

Tanggal : 12 Juni 2012

Pukul : 10.00 – 12.00 WIB

Oleh : ARIFA MUSTIKA

090810047D



iv

LEMBAR PENGESAHAN

Disertasi ini telah disetujui pada tanggal 26 September 2012

Oleh :

Promotor,

Prof. Dr. Ni Made Mertaniasih,dr.,MS,Sp.MK NIP. 195703071984032001

Ko Promotor I, Ko Promotor II,

Prof. Sri Agus Sudjarwo, Ph.D.,drh. Prof. Dr. Mangestuti Agil, Apt.,MS NIP. 19560904 1984031 004 NIP. 195004221980022001



v

Disertasi ini telah diuji dan dinilai

oleh panitia penguji pada Tertutup (Tahap I)

Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Pada Tanggal 20 April 2012

Panitia Penguji,

Ketua : Dr. Suwarno,drh.,M.Si.

Anggota :

1. Prof. Dr. Ni Made Mertaniasih,dr.,MS,Sp.MK 2. Prof. Sri Agus Sudjarwo, Ph.D.,drh. 3. Dr. Mangestuti Agil, Apt.,MS 4. Prof. Dr. Aulani’am, drh.,DES 5. Dr. JF Palilingan, dr.,Sp.P. 6. Dr. Hari Basuki N,dr.,M.Kes

Ditetapkan dengan Surat Keputusan Rektor Universitas Airlangga

Nomor : 583/H3/KR/2012 Tanggal : 2 Mei 2012



vi

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillahi Robbil ‘Alamin, segala puji syukur penulis panjatkan ke

hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis

dapat menyelesaikan naskah disertasi ini.

Disertasi ini dapat diselesaikan berkat bimbingan, saran dan koreksi tim

Promotor. Dengan segala kerendahan hati saya menyampaikan terima kasih serta

penghargaan yang setinggi-tingginya kepada yang terhormat :

Prof. Dr. Ni Made Mertaniasih,dr.,MS,Sp.MK selaku Promotor yang

membimbing, memberikan wawasan dan falsafah berfikir yang sangat bermanfaat

selama proses penyusunan proposal, penelitian dan penyusunan naskah disertasi.

Prof. Sri Agus Sudjarwo, Ph.D.,drh selaku Ko-Promotor I yang

membimbing, memberikan wawasan dan mengarahkan logika berfikir selama

proses penyusunan proposal, penelitian dan penyusunan naskah disertasi.

Dr. Mangestuti Agil, Apt.,MS selaku Ko-Promotor II yang telah

meluangkan waktunya untuk membimbing, memberikan saran dan nasehat selama

proses penyusunan proposal, penelitian dan penyusunan naskah disertasi.

Ucapan terima kasih saya sampaikan pada Pemerintah Republik Indonesia

melalui Menteri Pendidikan dan Kebudayaan yang telah memberikan kesempatan

serta bantuan dana beasiswa studi BPPS, Hibah Program Doktor dan Program

Sandwich-Like, sehingga saya dapat mengikuti Program Studi S3 Ilmu

Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga dan menyelesaikan

disertasi.



vii

Ucapan terima kasih juga saya sampaikan kepada:

Rektor Universitas Airlangga Prof.Dr.Fasich,Apt yang telah memberikan

ijin dan berkenan menerima saya sebagai mahasiswa Program Studi S3 Ilmu

Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

Dekan Fakultas Kedokteran Prof.Dr.Agung Pranoto,dr.,M.Kes.,SpPD.

KEMD.,FINASIM dan mantan Dekan Prof.Dr.Muhammad Amin,dr.,Sp.P (K)

yang telah memberikan ijin dan kesempatan pada saya untuk mengikuti

pendidikan Doktor dan membantu pembiayaan selama studi.

Ketua Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga Prof. Dr. Teddy Ontoseno,dr.,Sp.A(K).,Sp.JP.,AKK dan

mantan Ketua Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Prof. Dr. Harjanto, JM., dr. AIF

atas nasehat dan perhatian yang diberikan untuk menyelesaikan pendidikan

Doktor.

Direktur Program Pascasarjana Universitas Airlangga Prof.Dr.Hj.Sri

Hajati,SH.,MS, mantan Wakil Direktur Bidang Akademik Prof.Dr.H.R.Eddy

Raharjo,dr., Ank.Ic dan Wakil Direktur Akademik Bidang Pendidikan Prof. Dr.

Sri Suhariningsih,Ir yang telah memberikan fasilitas untuk mengikuti Program

Doktor di Universitas Airlangga.

Para penguji disertasi mulai dari ujian kualifikasi sampai ujian terbuka

yaitu : Prof. Dr. Sarmanu, drh.,MS, Prof. Soetjipto,dr,MS,Ph.D, Prof. Dr.

Aulani’am, drh.,DES, Prof. Dr. Juliati Hood A.,dr.,MS.,Sp.PA(K) FIAC, Prof.

Win Darmanto, M.Si.,Ph.D, Prof. Dr. Achmad Basori,Drs.,MS.,Apt,

Dr.Suwarno,drh.,M.Si., Dr. JF Palilingan, dr.,Sp.P(K), Dr. Hari Basuki

N,dr.,M.Kes., Dr. Umi Athiyah Dra.,MS.,Apt, Dr. Isnaeni.,MS.,Apt, Dr.



viii

Koesnoto,drh.,M.Si, Dr. Ira Arundina, drg.,M.Si yang telah memberikan saran

dan perbaikan naskah disertasi.

Para guru besar dan dosen di Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas

Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberikan ilmu, bimbingan dan

saran selama menempuh menempuh pendidikan Doktor.

Ketua Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas

Airlangga Roostantia Indrawati,dr.,M.Kes dan mantan ketua Departemen

Farmakologi Ramadhani,dr.,M.Kes yang telah memberikan ijin dan kesempatan

pada saya untuk mengikuti pendidikan Doktor

Teman sejawat di Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga yang telah memberikan bantuan dan perhatian selama saya

menempuh pendidikan Doktor.

Anny Setijo Rahaju, dr.,Sp.PA di Departemen Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Airlangga yang telah membantu dalam menyelesaikan

penelitian disertasi.

Para staf yang membantu dalam menyelesaikan penelitian Pak Sugeng,

Mbak Agnes, Pak Heri, Bu Leni, dan Pak Sudjarwo. Para staf di bagian

pendidikan Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Universitas Airlangga.

Rekan di Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga yang telah bekerjasama dengan baik dan saling memberi

motivasi untuk menyelesaikan pendidikan ini.

Saya sampaikan rasa hormat dan kasih sayang yang tak terhingga kepada:

Orangtua saya Achsan Karim (Alm) dan Rubi’ah. Mertua saya Sodikun (Alm)

dan Sunarsih. Suami saya Ariefudin Achmad,Ir. dan anak saya Hasby Fahrudin,



ix

Zumara Ma’rifah Azzahra dan Aqila Rashida. Abi Ihya Ullumuddin yang telah

memberikan pelajaran berharga bagi saya untuk menyikapi kehidupan ini.

Akhirnya kepada semua pihak yang namanya tidak bisa saya sebutkan satu

persatu, yang telah membantu selama penelitian berlangsung hingga tahap

penulisan, saya sampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya.

Semoga hasil penelitian dalam disertasi ini bermanfaat bagi masyarakat

dan Semoga Allah SWT meridloiNya. Amiin ya Rabbal Alamin.

Penulis



x

RINGKASAN

Mekanisme Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica (pegagan)

Dalam Meningkatan Apoptosis sel Alveolar Makrofag dari Jaringan paru

Tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri intraseluler di dalam makrofag

yang mempunyai kemampuan untuk menghindari antibiotika dan mengubah

respons imunologi dari makrofag. Secara umum, respons imun tubuh akan

berusaha untuk melakukan eliminasi patogen yang masuk ke dalam tubuh,

khususnya melalui apoptosis. Pada infeksi tuberkulosis ditemukan bahwa

Mycobacterium tuberculosis mempunyai kemampuan untuk menghambat

apoptosis sel makrofag sehingga Mycobacterium tuberculosis berkembang biak di

dalam makrofag. Ekstrak etanol Centella asiatica mempunyai kemampuan untuk

membunuh Mycobaterium tuberculosis dan meningkatkan respons imun seluler

dan apoptosis pada sel kanker. Bukti ini menimbulkan harapan bahwa tumbuhan

tersebut dapat berfungsi sebagai imunostimulan terutama untuk meningkatkan

apoptosis makrofag dengan infeksi Mycobacterium tuberculosis. Tujuan

penelitian ini adalah untuk mengetahui efek dan mekanisme ekstrak etanol herba

Centella asiatica terhadap apoptosis sel makrofag jaringan paru tikus yang

diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.

Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah eksperimental

laboratories pada tikus. Tiga puluh lima tikus jantan dinfeksi secara intratrakeal

dengan Mycobacterium tuberculosis dan dibagi secara random menjadi 5



xi

kelompok. Kelompok 1, 2, dan 3 mendapat ekstrak etanol Centella asiatica

dengan dosis 375mg/Kgbb, 750mg/KgBB, 1500mg/KgBB, sekali sehari secara

peroral selama 14 hari. Sedangkan kelompok 4 tidak memperoleh ekstrak etanol

Centella asiatica. Pemberian ekstrak etanol Centella asiatica dimulai pada hari

ke-29 setelah tikus diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Kelompok 5

adalah kelompok tikus yang diterminasi pada hari ke 28 untuk menentukan

adanya infeksi tuberkulosis pada hewan coba. Pemeriksaan ekspresi protein Bcl-2,

protein Bax, Caspase-8 dan antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar

makrofag dilakukan dengan menggunakan metode imunohistokimia. Apoptosis

sel alveolar makrofag diperiksa dengan pengecatan TUNEL assay. Pemeriksaan

jumlah Mycobacterium tuberculosis pada jaringan paru dilakukan dengan kultur

jaringan paru pada media Midllebrook 7H10. Pemeriksaan kerusakan jaringan

paru dilakukan dengan pengecatan Hematoksilin Eosin dan penilaian kerusakan

jaringan berdasarkan skor Dormans.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba Centella

asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag di

jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Ekstrak

etanol herba Centella asiatica tidak secara linier menurunkan ekspresi protein

Bcl-2 pada sel alveolar makrofag jaringan paru tikus seiring dengan peningkatan

dosis yang diberikan. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375

mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500 mg/KgBb memberikan perbedaan yang

signifikan pada penurunan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag bila

dibandingkan dengan kontrol, tetapi diantara ketiga dosis tersebut tidak

memberikan perbedaan yang bermakna.



xii

Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada penelitian ini

meningkatkan ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru

tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis secara bermakna

dibandingkan dengan kontrol. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis

375 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb pada ekspresi protein Bax pada sel alveolar

makrofag tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol,

sedangkan dosis 750 mg/Kgbb ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag

meningkat secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan dosis

ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dari dosis 375 mg/KgBb ke

750 mg/KgBb menyebabkan peningkatan ekspresi protein Bax, tetapi pemberian

ekstrak pada dosis 1500mg/KgBb menyebabkan ekspresi protein Bax pada sel

alveolar makrofag menurun.

Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica secara bermakna

meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 pada sel alveolar makrofag dari jaringan

paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Peningkatan dosis

ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dengan dosis 375

mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier meningkatkan

ekspresi protein caspase 8 pada sel alveolar makrofag, karena hanya dosis 750

mg/KgBb yang dapat meningkatkan ekspresi Caspase-8 secara bermakna.

Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis

sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis secara bermakna bila dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan

dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dengan dosis 375

mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier meningkatkan



xiii

apoptosis sel alveolar makrofag, tetapi dosis 750 mg/KgBb memberikan

peningkatan apoptosis yang tertinggi.

Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba

Centella asiatica menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel

alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium

tuberculosis. Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang

diberikan dengan dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak

secara linier menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel

alveolar makrofag, tetapi dosis 750 mg/KgBb menurunkan ekspresi antigen

Mycobacterium tuberculosis yang paling rendah.

Penelitian ini menunjukkan penurunan jumlah Mycobacterium

tuberculosis yang signifikan akibat pemberian ekstrak etanol herba Centella

asiatica terutama pada dosis 750 mg/kgBB dan 1500mg/KgBB.

Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan

jaringan paru tikus secara signifikan terutama pada perivaskulitis, alveolitis dan

pembentukan granuloma pada dosis optimum 750 mg/KgBB.

Kesimpulan penelitian ini adalah ekstrak etanol herba Centella asiatica

memiliki bahan aktif yang mempunyai kemampuan untuk meningkatkan respons

sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis, melalui peningkatan apoptosis sel makrofag. Mekanisme

peningkatan apoptosis sel alveolar makrofag tersebut melalui peningkatan

eskpresi protein Caspase 8, peningkatan ekspresi protein Bax dan penurunan

ekspresi protein Bcl-2. Hasil dari proses tersebut menyebabkan penurunan jumlah



xiv

Mycobacterium tuberculosis dan penurunan kerusakan jaringan paru tikus yang




xv

SUMMARY

Mechanism of Ethanol Extracts of Centella asiatica herb in enhancing

Apoptosis of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by

Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis is an intracellular bacterium within

macrophages. The bacterium has the ability to evade antibiotics and manipulate

host defense pathways. In general, when a cell is infected by pathogens, the

immune response will effort to eliminate pathogens through various mechanisms,

particularly to inhibit apoptosis of infected host cells. Mycobacterium tuberculosis

can induced the anti-apoptotic protein in macrophages infected by Mycobacterium

tuberculosis, therefore the bacteria can multiply within macrophages. Ethanol

extract of Centella asiatica is medicinal plant which is able to reduce growth of

Mycobaterium tuberculosis and enhance the cellular immune response and

apoptosis in cancer cells. This evidence raises the hope that the plants can be used

as imunostimulant, particularly to enhance the apoptosis of macrophages in

Mycobacterium tuberculosis infection. The aim of this research is to determine the

effect and mechanism of the ethanol extract of Centella asiatica herbs in

enhancing apoptosis of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by

Mycobacterium tuberculosis.

The research method is an experimental laboratory in rats. Thirty-five

male rats were infected by Mycobacterium tuberculosis using intratrachea method



xvi

and they were divided randomly into 5 groups. Groups 1, 2, and 3 were given

ethanol extracts of Centella asiatica herbs at 375mg/KgBW, 750mg/KgBW,

1500mg/KgBW, peroral daily for 14 days. The fourth group were not given

ethanol extract of Centella asiatica herbs. The fifth group were terminate at 28

days after infected by Mycobacterium tuberculosis. The treatment of ethanol

extracts of Centella asiatica herbs were begin on day 29th after rats infected by

Mycobacterium tuberculosis. Apoptosis, expression of Bcl 2, expression of Bax,

expression of Caspase 8 and expression of antigen of Mycobacterium tuberculosis

were performed by using immunohistochemistry. The bacillary load were

evaluated by culture on Middlebrook 7H10. The damaging of rats lung tissue

were analyzed by histopathological and the damaging of tissue was assessed

based on the score of Dormans.

The results have shown that the etanol extract of Centella asiatica herbs

at 375 mg/KgBW, 750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW were able to reduce

significantly Bcl2 expression of alveolar macrophages from rats lung tissue

infected by Mycobacterium tuberculosis.

The effect of etanol extract of Centella asiatica herbs at 750 mg/KgBW

were able to increase significantly Bax expression of alveolar macrophages from

rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis.

Administration of etanol extract of Centella asiatica herbs 375 mg/KgBW,

750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW increased significantly caspase 8 expression

of alveolar macrophages. Interestingly, the increasing of caspase 8 expression

decreased at dose 1500 mg/KgBW.



xvii

The Effect of etanol extract of Centella asiatica herbs at 375 mg/KgBW,

750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW were able to enhance significantly apoptosis

of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium

tuberculosis, but the dose of 750 mg/KgBW gave the highest increase.

Administration of etanol extract of Centella asiatica herbs at 375

mg/KgBW, 750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW decreased significantly

expression of antigen Mycobacterium tuberculosis of alveolar macrophages from

rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis, but the dose of 750

mg/KgBW gave the lowest decrease.

This extract were able to reduce the growth of Mycobacterium

tuberculosis. The optimum dose of this extract were able to reduce the growth of

Mycobacterium tuberculosis was 750 mg/KgBW and 1500 mg/KgBW.

The ethanol extract of Centella asiatica herbs at 375 mg/KgBW, 750

mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW decreased significantly rats lung tissue damage,

especially in perivasculitis, alveolitis, and granuloma formation, but the optimum

dose of this extract to decrease rats lung tissue damage was 750 mg/KgBW.

In conclusion, the ethanol extract of Centella asiatica herbs have active

ingredients to enhance of apoptosis alveolar macrophages from rat lung tissue that

were infected by Mycobacterium tuberculosis through increasing of Caspase 8’s

expression, Bax’expression and decreasing of Bcl-2’s expression. The effect of

ethanol extract of Centella asiatica herb is a chain reaction that occurs in various

stages until decrease the bacillary load of Mycobacterium tuberculosis and reduce

rats lung tissue damage.



xviii

ABSTRACT

Mechanism of Ethanol Extracts of Centella asiatica herbs in enhancing

Apoptosis of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis has capacity to manipulate host defense

pathway, particularly the ability to inhibit apoptosis of infected host cells. Centella asiatica is a medicinal plant which is able to reduce growth of Mycobacterium tuberculosis and enhance the cellular immune response and apoptosis in cancer cells. The aim of this research is to determine the effect and mechanism of the ethanol extract of Centella asiatica herbs in enhancing apoptosis of alveolar macrophages from rat lung tissue that has been infected by Mycobacterium tuberculosis. . The research method is an experimental laboratory in. Thirty five male rats were infected by Mycobacterium tuberculosis using intratrachea method and they were divided randomly into 5 groups. Group 1, 2, and 3 were given ethanol extracts of Centella asiatica herbs at 375mg/KgBW, 750mg/KgBW, 1500mg/KgBW, daily for 14 days. The fourth group were not given ethanol extract of Centella asiatica herbs. The fifth group were terminate at 28 days after infected by Mycobacterium tuberculosis. Apoptosis, expression of Bcl 2, Bax, Caspase 8 and antigen of Mycobacterium tuberculosis were performed by using immunohistochemistry. The bacillary loads were evaluated by culture in Middlebrook 7H10. The damaging of rats lung tissue were analyzed by histopathological. The results have shown that the ethanol extract of Centella asiatica herbs were able to reduce expression of Bcl-2 and antigen of Mycobacterium tuberculosis, increase expression of Bax, increase expression of Caspase 8 and enhance the apoptosis of alveolar macrophages in rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis. Ethanol extract of Centella asiatica herbs have decreased the number of Mycobacterium tuberculosis and reduced lung tissue damage of rats infected by Mycobacterium tuberculosis. . In conclusion, the ethanol extract of Centella asiatica herbs have active ingredients to enhance of apoptosis alveolar macrophages from rat lung tissue that were infected by Mycobacterium tuberculosis through increasing of Caspase 8’s expression, Bax’expression and decreasing of Bcl-2’s expression. The effect of ethanol extract of Centella asiatica herb is a chain reaction that occurs in various stages until decrease the bacillary load of Mycobacterium tuberculosis and reduce rats lung tissue damage. Key words : Extracts ethanol of Centella asiatica, Mycobacterium tuberculosis,

macrophages, apoptosis, rats lung tissue



xix

DAFTAR ISI

Sampul Depan i

Sampul Dalam ii

Lembar Pengesahan iii

Penetapan Panitia Penguji iv

UCAPAN TERIMA KASIH v

RINGKASAN ix

SUMMARY xiv

ABSTRACT xvii

DAFTAR ISI xviii

DAFTAR TABEL xxiii

DAFTAR GAMBAR xxvi

DAFTAR LAMPIRAN xxvii

DAFTAR ARTI / LAMBANG / SINGKATAN / ISTILAH xxviii

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Rumusan Masalah 5

1.3 Tujuan Penelitian 6

1.4 Manfaat Penelitian 7

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Centella asiatica 9

2.1.1 Taksonomi Centella asitica 10

Halaman



xx

2.1.2 Profil farmakokinetik dan toksisitas Centella asiatica 10

2.1.3 Khasiat Centella asiatica 12

2.2 Mycobacterium tuberculosis 14

2.2.1 Patogenesis tuberkulosis 16

2.2.2 Gejala klinis tuberkulosis 19

2.2.3 Pengobatan tuberkulosis 19

2.3 Respons Imun terhadap Mycobacterium tuberculosis 20

2.4 Apoptosis 30

2.4.1 Perbedaan apoptosis dengan nekrosis 31

2.4.2 Protein Caspase 34

2.4.3 Protein Bax dan Bcl-2 35

2.4.4 Apoptosis pada tuberkulosis 36

2.5 Sel Alveolar Makrofag 41

2.6 Kerusakan Jaringan Paru 42

BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Konseptual 47

3.2 Hipotesis 49

BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN

4.1 Jenis dan Rancangan Penelitian 51

4.2 Unit eksperimen dan replikasi 52

4.3 Variabel Penelitian 55

4.4 Bahan dan Alat Penelitian 57

4.5 Lokasi dan Waktu Penelitian 59



xxi

4.6 Prosedur Penelitian 59

4.7 Analisis Data 69

4.8 Kelaikan Etik 69

Bab 5 HASIL DAN ANALISIS HASIL

5.1 Hasil Ekstraksi dan identifikasi herba Centella asiatica 70

5.2 Hasil Model Infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis pada tikus 71

5.3 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica

menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari

jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis 73


meningkatkan ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari


tuberculosis 75


meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag dari


tuberculosis 78


meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru

tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis 81

5.7 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol Centella asiatica

menurunkan jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis



xxii

dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis 84

5.8 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol Centella asiatica

menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis(CFU/ml) dari

jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis 87

5.9. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol Centella asiatica

menurunkan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi

Mycobacterium tuberculosis 89

BAB 6 PEMBAHASAN 98

6.1 Ekstraksi dan identifikasi herba Centella asiatica 99

6.2 Model Infeksi Mycobacterium tuberculosis pada tikus 100

6.3 Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan

ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru

tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis 102

6.4 Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan

ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru



ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru



apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus

yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis 111

6.7 Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan



xxiii

jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar

Makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis. 113

6.8 Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan jumlah

Mycobacterium tuberculosis(CFU/ml) dari jaringan paru tikus

yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis 114

6.9 Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan

kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis. 117

6.10. Temuan baru 121

BAB 7. PENUTUP

7.1. KESIMPULAN 122

7.2. SARAN 123

DAFTAR PUSTAKA 124

LAMPIRAN 134



xxiv

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Skala Dormans 67

Tabel 5.1 Perhitungan statistik ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 75

Tabel 5.2 Perhitungan statistik ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 77 Tabel 5.3 Perhitungan statistik ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 80 Tabel 5.4 Perhitungan statistik apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 83 Tabel 5.5 Perhitungan statistik ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 87 Tabel 5.6 Perhitungan statistik jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml/gram)jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 89 Tabel 5.7 Perhitungan statistik peribronkiolitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 91 Tabel 5.8 Perhitungan statistik perivaskulitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 92 Tabel 5.9 Perhitungan statistik alveolitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x),

Halaman



xxv

simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 93 Tabel 5.10 Perhitungan statistik granuloma jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 95 Tabel 5.11 Perhitungan statistik jumlah total skor Dormans kerusakan jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) 96



xxvi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Centella asiatica 9

Gambar 2.2 Struktur dinding sel Mycobacterium tuberculosis 15

Gambar 2.3. Kemungkinan Luaran bila individu terpapar 21

Gambar 2.4. Maturasi Fagosom dan blokade fagolisosom 24

Gambar 2.5. Mekanisme apoptosis 31

Gambar 2.6. Infeksi bakteri tuberkulosis virulen 37

Gambar 2.7. Histopatologi paru mencit 43

Gambar 3.1. Skema Kerangka Konseptual 47

Gambar.4.1. Bagan rancangan penelitian 51

Gambar 4.2. Skema alur penelitian 69

Gambar 5.1. Hasil KLT ekstrak etanol Centella asiatica 71

Gambar 5.2. Histopatologi kerusakan jaringan paru tikus pada minggu ke-4 setelah infeksi dengan Mycobacterium tuberculosis makrofag pada jaringan paru tikus.

72

Gambar 5.3. Rerata ekspresi protein Bcl 2 positif sel alvelolar makrofag pada jaringan paru tikus

73

Gambar 5.4. Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan paru Tikus

74

Gambar 5.5. Rerata ekspresi protein Bax positif sel alvelolar makrofag pada jaringan paru tikus

76

Gambar 5.6. Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag jaringan paru tikus.

77

Gambar 5.7. Rerata ekspresi enzim Caspase-8 positif sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus

79

Gambar 5.8. Ekspresi protein caspase-8 sel alveolar makrofag

Halaman



xxvii

jaringan paru tikus

80

Gambar 5.9. Hasil rerata apoptosis alveolar makrofag pada jaringan paru 82

Gambar 5.10. Apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus 83

Gambar 5.11. Rerata ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis positif dari sel alveolar makrofag

85

Gambar 5.12. Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis dari 86 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus

Gambar 5.13. Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis pada MidlleBrook 7H10

88

Gambar 5.14. Hasil rerata jumlah Mycobacterium tuberculosis CFU/ml/gram dari jaringan paru tikus

88

Gambar 5.15. Peribronkiolitis 90

Gambar 5.16. Perivaskulitis 92

Gambar 5.17. Alveolitis 94

Gambar 5.18. Granuloma 95

Gambar 5.19. Skema Analisis Jalur 97



xxviii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Determinasi Centella 135

Lampiran 2. Ethical Clearance 136

Lampiran 3. Data Penelitian pretest 137

Lampiran 4. Data Penelitian 138

Lampiran 5. Hasil uji statistik 139

Lampiran 6. Prosedur pemeriksaan Tunnel assay 160

Halaman



xxix

DAFTAR ARTI LAMBANG / SINGKATAN / ISTILAH

ANAVA = Analysis of Variance

BCG = Bacillus Calmette Guerin

BCL = Burkitt Cell Lymphoma

BTA = Basil Tahan Asam

BSL = Bio Safety Level

C = Complement

CCR = Chemokine Receptor

CD = Cluster Differentiation

CFU = Colony Forming Unit

CMC Na = Carboxyl Methyl Cellulose Natrium

CMI = Celluler Mediated Immunity

DAB = Diamino benzidine

DC SIGN = Dendritic Cell Specific Interceluller adhesion molecule Grabing

Non integrin

DISC = Death Inducing Signaling Complex

DNA = Deoxyribonucleat

DTH = Delayed Type Hypersensitif

EMCA = Ekstrak Metanol Centella Asiatica

ESAT-6 = Early Secretory Antigenic Target-6

HIV = Human Immunodefesiensi Virus

HPLC = High Performance Liquid Chromatography

HNP = Human Neutrofil Defensin



xxx

IFN-γ = Interferon Gamma

INH = Isoniazid

IL = Interleukin

kD = kilo Dalton

KLT = Kromatografi Lapis Tipis

LAM = Lipoarabinomannan

LJ = Lowenstein Jensen

MDR = Multiple Drug Resitance

MMP = Matrix Metalloproteinase

MHC = Major Histocompatibility Complex

MTSA = Mycobacterium Tuberculosis Secreted Antigen

OAT = Obat Anti Tuberculosis

NFκB = Nuclear Factor Kappa Beta

NK = Natural Killer

ROI = Reactive Oxygen Intermediate

TACO = Tryptophan Aspartate Coat Protein

TDT = Terminal Deoxynucleotidyl Transferase

TB = Tuberkulosis

TGF-β = Tumor Growth Factor Beta

Th = T Helper

TIMPs = Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase

TLR = Toll Like Receptor

TNF-α = Tumor Necrosis Factor Alfa

TRADD = TNF receptor associated death domain



xxxi

VATP-ase = Vesicular Proton-Pump Adenosin Triphosphatase

WHO = World Health Organization



1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit yang disebabkan oleh Mycobacterium

tuberculosis. Penyakit tersebut sudah ada sejak sebelum pencatatan sejarah

dimulai. Penyakit ini meninggalkan tanda dalam berbagai kehidupan manusia

termasuk musik, seni dan budaya, serta mempengaruhi kemajuan ilmu biomedis

dan perawatan kesehatan dan telah membunuh lebih banyak manusia

dibandingkan dengan mikroba patogen yang lain (Daniel, 2006). Bakteri

tuberkulosis ditemukan pada tahun 1882, dan dunia optimis mampu memberantas

penyakit tersebut dengan obat antibiotika. Berbagai macam antibiotika untuk

membunuh bakteri tuberkulosis telah ditemukan pada tahun 1944 dan tahun

1950, terapi tuberkulosis dengan menggunakan kombinasi berbagai antibiotika.

Berbagai bukti menunjukkan bahwa sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi

Mycobacterium tuberculosis. Pada tahun 2009, jumlah penderita tuberkulosis di

dunia 9,4 juta atau 137 kasus per 100.000 penduduk, sebanyak 35% adalah

wanita. Jumlah penderita baru dan kambuh 292.753 per tahun Penderita yang

paling banyak terdapat di Asia 55%, Afrika 30%, timur Tengah 7%, Eropa 4%

dan Amerika 3%. Angka kematian 1,7 juta pertahun. Jadi hampir di seluruh

dunia tidak terbebas dengan infeksi tuberkulosis. Indonesia menduduki peringkat

kelima setelah India, Cina, Afrika Selatan dan Nigeria (WHO, 2010).

Berbagai strategi pengobatan telah digunakan untuk menurunkan insiden

dan angka kematian karena tuberkulosis, tetapi kasus dan angka kematiannya

tetap tinggi bahkan cenderung meningkat terlebih lagi dengan adanya infeksi



2

human immunodeficiency virus (HIV). Jumlah penderita tuberkulosis yang juga

menderita HIV sebesar 27% di dunia, sedangkan di Indonesia sebesar 2,8%.

Jumlah penderita HIV dengan tuberkulosis meningkat setiap tahunnya dari tahun

2005 sebesar 8,5% menjadi 27% pada tahun 2009. Pada penderita acquired

immunodeficiency syndrome (AIDS) tuberkulosis merupakan penyebab kematian

nomor satu. Data ini menunjukkan bahwa respons imun tubuh memegang

peranan penting pada infeksi tuberkulosis (WHO, 2010).

Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri intraseluler di dalam

makrofag. Bakteri tersebut selain mempunyai kemampuan menghindar dari

antibiotika juga mampu mengubah respons makrofag. Kemampuan bakteri untuk

mengubah respons makrofag juga ditentukan oleh respons imun penderita.

Apabila terjadi gangguan respons imun pada inang maka bakteri akan terhindar

dari mekanisme eliminasi sistem imun. Oleh karena itu, respons imun

memegang peranan yang fundamental bagi luaran infeksi bakteri tuberkulosis.

Diduga bahwa salah satu penyebab kegagalan penanganan tuberkulosis, karena

kegagalan respons imun dari penderita itu sendiri (Kritski et al., 2007). Secara

umum, bila suatu sel terinfeksi oleh suatu patogen, maka respons imun tubuh

akan berusaha mengeliminasi patogen melalui berbagai macam mekanisme.

Salah satunya melalui mekanisme apoptosis. Pada infeksi tuberkulosis

ditemukan suatu fenomena bahwa pada makrofag justru terjadi anti apoptosis

yang ditandai dengan peningkatan berbagai protein anti apoptosis seperti Bcl-2

dan penurunan protein proapoptosis seperti Bax (Mustafa et al., 2001; Mogga et

al., 2002; Velmurugan et al., 2007; Rodrigues et al., 2009). Berbagai proses ini

menyebabkan bakteri Mycobacterium tuberculosis mampu berkembang biak di

dalam makrofag. Jadi hambatan proses apoptosis pada makrofag oleh



3

Mycobacterium tuberculosis merupakan faktor virulensi bagi bakteri (Zhang et

al., 2005; Patel et al., 2009; Behar et al., 2010; Danelishvili et al., 2010; Maziar

et al., 2010; Miller et al., 2010; Rudel et al., 2010).

Berdasarkan berbagai penelitian yang berhubungan dengan mekanisme

imunopatogenesis tuberkulosis di atas, maka perlu dilakukan suatu penelitian

tentang metode penanganan tuberkulosis yang lebih tepat. Karena respons imun

mempunyai peranan penting dalam perkembangan infeksi tuberkulosis, maka

penanganan tuberkulosis tidak hanya dengan menggunakan antibiotika tetapi

perlu ditambahkan imunostimulan terhadap respons imun. Pemberian

imunostimulan tersebut terutama untuk meningkatkan apoptosis pada makrofag

yang terinfeksi bakteri, sehingga respons imun dapat berfungsi sebagai suatu

sistem yang mampu mengeliminasi bakteri. Keuntungan dari apoptosis ini adalah

meningkatkan eliminasi bakteri tanpa ada bahan intraseluler yang keluar ke

ekstraseluler sehingga bakteri tidak bisa tersebar keluar dari sel. Selain itu,

proses apoptosis ini akan meminimalkan reaksi inflamasi yang akan merusak

jaringan sekitarnya (Elmore, 2007; Samali et al., 2010; Peter et al., 2010).

Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mengetahui tanaman yang

diduga mempunyai khasiat sebagai imunodulator. Penelitian ekstrak tanaman

sebagai imunostimulan pada infeksi tuberkulosis masih perlu dilakukan.

Pemerintah Indonesia mendukung pengembangan obat dari tanaman untuk

capaian tujuan temuan obat baru, termasuk untuk mengatasi masalah infeksi. Hal

ini juga sejalan dengan strategi WHO (Gitawati et al., 2005).

Salah satu bahan imunomodulator yang saat ini sedang dikembangkan

adalah tanaman obat. Centella asiatica adalah tumbuhan yang banyak terdapat di

Indonesia. Tumbuhan ini sudah sejak lama digunakan sebagai bahan obat



4

terutama untuk penyembuhan luka. Beberapa peneliti membuktikan bahwa

Centella asiatica yang mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid,

polifenol dan polisakarida juga memiliki khasiat antimikroba (Suratman et al.,

1996; Mamtha et al., 2004; Wang et al., 2004; Gitawati et al., 2005). Kandungan

senyawa yang terbesar dalam tumbuhan tersebut adalah senyawa golongan

madecasic acid, asiatic acid, madecasoside dan asiaticoside. Kandungan lainnya

adalah asiatiquercetin-3-glycoside, kämpferol-3-glycoside (Bunyapraphatsara et

al., 1999).

Ekstrak etanol Centella asiatica menghambat pertumbuhan

Mycobaterium tuberculosis invitro dan meningkatkan produksi imunoglobulin G

pada mencit (Gitawati et al., 2005; Mustika dkk, 2009). Peneliti lain juga

menunjukkan peningkatan titer antibodi pada mencit yang memperoleh ekstrak

Centella asiatica (Fatmasari et al., 2007). Ekstrak air dan etanol Centella asiatica

mampu meningkatkan kadar tumor necrosis factor-α (TNF-α) pada kultur sel

makrofag sehat (Punturee et al., 2004). Ekstrak tersebut meningkatkan ekspresi

sel cluster differentiation (CD)4, CD8, makrofag dan meningkatkan produksi

sitokin TNF-α, interferon-γ (IFN-γ) dan menghambat transforming growth

factor-β (TGF-β) pada sel makrofag (Taib, 2000; Punturee et al., 2005; Lyu et

al., 2005). Ekstrak etanol Centella asiatica telah dibuktikan meningkatkan kadar

IFN-γ secara bermakna pada makrofag terinfeksi Mycobacterium tuberculosis

bila dibandingkan dengan kontrol (Mustika dkk, 2009). Asiatic acid salah satu

kandungan senyawa kimia yang dimiliki oleh Centella asiatica menginduksi

apoptosis makrofag melalui peningkatan sitokrom-c dan protein caspase-3 (Cho

et al., 2003). Berbagai penelitian membuktikan bahwa baik ekstrak Centella

asiatica maupun derivatnya asiatic acid menginduksi apoptosis pada berbagai



5

sel kanker (Lee et al., 2002; Cho et al., 2003; Parka et al., 2005; Babykutty et

al., 2009; Tang et al., 2009). Bukti ini menimbulkan harapan bahwa tumbuhan

tersebut dapat berfungsi sebagai imunostimulan terutama untuk meningkatkan

apoptosis makrofag pada infeksi Mycobacterium tuberculosis.

Berdasarkan latar belakang di atas, peneliti tertarik pada efek dan

mekanisme Centella asiatica terhadap aktivitas respons imun terutama

kemampuannya untuk menginduksi apoptosis makrofag yang terinfeksi

tuberkulosis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek ekstrak etanol herba

Centella asiatica terhadap mekanisme apoptosis sel makrofag jaringan paru tikus

yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Mekanisme ini penting

untuk diketahui karena apoptosis pada makrofag akan meningkatkan eliminasi

bakteri dan mencegah bakteri tersebar ke ekstraseluler, sehingga bakteri tersebut

tidak dapat menginfeksi sel di sekitarnya. Dengan demikian proses penyakit

infeksi tuberkulosis serta penyebaran infeksi ke populasi sekitarnya dapat

dihentikan atau disembuhkan.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang dari penelitian ini, maka dapat dirumuskan

permasalahan sebagai berikut :

1. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi

protein Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang

diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ?

2. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi

protein Bax sel alveolar pada jaringan paru tikus yang diinfeksi

Mycobacterium tuberculosis ?



6

3. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi

protein Caspase-8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang


4. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis

sel alveolar makrofag (fragmentasi DNA) pada jaringan paru tikus yang


5. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan jumlah

ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada

jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ?

6. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan jumlah

Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) pada jaringan paru tikus yang


7. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan

jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ?

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1. Tujuan umum

Membuktikan efek dan mekanisme ekstrak etanol herba Centella

asiatica terhadap peningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru

tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.

1.3.2. Tujuan khusus

1. Membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan

ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus

yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.



7

2. Membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica

meningkatkan ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag pada jaringan

paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.


meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag pada

jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.


meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag (fragmentasi DNA) pada

jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.


jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag

pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.


jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) pada jaringan paru tikus

yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.


kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1. Manfaat teoritik

Temuan pada penelitian ini memberikan informasi ilmiah berupa konsep

baru : Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada infeksi tuberkulosis dan

mekanisme kerja Centella asiatica dalam membantu penyembuhan penyakit

tuberkulosis yaitu melalui peningkatan apoptosis sel makrofag jaringan paru

tikus yang dapat menurunkan kerusakan jaringan.



8

1.4.2. Manfaat praktis

Hasil temuan pada penelitian ini dapat dilanjutkan sampai tingkat uji

klinis lengkap dan diharapkan berguna menunjang pengembangan obat dari

ekstrak etanol herba Centella asiatica untuk terapi kombinasi pada pengobatan

penyakit tuberkulosis yang diperlukan masyarakat.

Sedangkan bagi industri farmasi, hasil penelitian ini berguna pada skala

produksi setelah melalui berbagai uji klinis.



9

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Centella asiatica

Centella asiatica adalah tanaman liar yang banyak tumbuh di

perkebunan, tepi jalan, serta pematang sawah. Tanaman ini berasal dari daerah

Asia tropik, tersebar di Asia Tenggara, termasuk Indonesia, India, Republik

Rakyat Cina, Jepang dan Australia kemudian menyebar ke berbagai negara-

negara lain. Nama yang biasa dikenal untuk tanaman ini selain pegagan

adalah daun kaki kuda dan antanan (Bunyapraphatsara et al., 1999).

Gambar 2.1 Centella asiatica (Mustika, 2011).

Sejak zaman dahulu, pegagan telah digunakan untuk obat kulit, gangguan

saraf dan memperbaiki peredaran darah. Masyarakat Jawa barat mengenal

tanaman ini sebagai salah satu tanaman untuk lalapan. Pegagan merupakan

tanaman herba tahunan yang tumbuh menjalar dan berbunga sepanjang tahun.

Tanaman akan tumbuh subur bila tanah dan lingkungannya sesuai hingga

dijadikan penutup tanah. Jenis pegagan yang banyak dijumpai adalah pegagan

hijau. Pegagan hijau sering banyak dijumpai di daerah pesawahan dan disela-

sela rumput. Tempat yang disukai oleh pegagan hijau yaitu tempat agak



10

lembab dan terbuka atau agak ternaungi. Selain itu, tanaman yang mirip

pegagan atau antanan ada empat jenis yaitu antanan kembang, antanan beurit,

antanan gunung dan antanan air (Bunyapraphatsara et al.,1999).

2.1.1 Taksonomi Centella asiatica

Taksonomi tumbuhan Centella asiatica adalah (Bailey, 1953;

Bunyapraphatsara et al.,1999):

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Bangsa : Umbilliferae

Suku : Umbilliferae

Marga : Centella

Jenis : Centella asiatica(L)Urb.

Kandungan kimia utama pegagan adalah asiaticoside, madecasoside,

asiatic acid dan madecasic acid. Kandungan kimia lainnya adalah

asiaticoside, asiatoside, asiatic acid oxyasiaticoside, thankuniside,

isothankuniside, inositol, centellose, carotenoids, berbagai garam mineral

seperti garam kalium, natrium, magnesium, kalsium, besi, vellarine, zat samak

(Bunyapraphatsara et al.,1999).

2.1.2 Profil farmakokinetik dan toksisitas Centella asiatica

Pada penelitian toksisitas akut diketahui bahwa ekstrak etanol Centella

asiatica pada mencit secara peroral sampai pada dosis 10.000mg/KgBB tidak

terjadi kematian. Pengamatan ini dilakukan sampai hari ke-7 ( Djatmiko dkk,

2009). Penelitian lain menunjukkan bahwa asiaticoside, salah satu kandungan

dari Centella asiatica, diberikan pada mencit secara peroral sampai pada dosis



11

1g/kg BB mencit tidak menunjukkan tanda toksik. Pemberian ekstrak Centella

asiatica pada mencit dan kelinci menimbulkan efek toksik pada pemberian

secara intramuskular pada dosis 40-50 mg/KgBB. Penelitian teratogenik pada

kelinci juga menujukkan bahwa ekstrak Centella asiatica tidak menujukkan

efek teratogenik (Pizzorno et al., 1996).

Penelitian tentang profil farmakokinetika terpenoid dari ekstrak

Centella asiatica telah dilakukan pada manusia sehat. Kadar terpenoid dari

ekstrak Centella asiatica yang diukur di dalam plasma adalah kadar asiatic

acid. Kadar asiatic acid di dalam plasma diukur dengan menggunakan metode

high performance liquid chromatography (HPLC). Hasil penelitian tersebut

menunjukkan bahwa setelah pemberian terpenoid dari ekstrak Centella

asiatica pada dosis tunggal 30 mg secara peroral, kadar maksimum asiatic

acid di dalam plasma adalah 0,70 ± 0,11 µg/ml dan waktu paruhnya adalah

2,20 ± 0,30 jam. Kadar maksimum asiatic acid di dalam plasma setelah

pemberian terpenoid dari ekstrak Centella asiatica pada dosis tunggal 60 mg

secara peroral adalah 1.36 ± 0,13 µg/ml dan waktu paruhnya adalah 3,4 ±

0,68 jam. Pada pemberian terpenoid dari ekstrak Centella asiatica dengan

dosis dua kali sehari 30 mg secara peroral selama 7 hari menunjukkan kadar

maksimum asiatic acid di dalam plasma adalah 1,03 ± 0,05 µg/ml dan waktu

paruhnya adalah 6,33 ± 1.82 jam. Kadar maksimum asiatic acid di dalam

plasma setelah pemberian terpenoid dari ekstrak Centella asiatica pada dosis

dua kali sehari 60 mg secara peroral selama 7 hari adalah 1,69 ± 0,07 µg/ml

dan waktu paruhnya adalah 10,28 ± 1,80 jam (Grimaldi et al., 1990).



12

2.1.3 Khasiat Centella asiatica

Centella asiatica adalah tumbuhan yang digunakan sebagai bahan obat

terutama untuk mempercepat penyembuhan luka. Beberapa peneliti

membuktikan bahwa Centella asiatica menstimulasi sintesis kolagen pada

penyembuhan luka pada tikus (Djatmiko dkk., 2008). Terpenoid dari ekstrak

Centella asiatica meningkatkan sintesis glikosaminoglikan dan menstimulasi

sintesis kolagen sehingga mempercepat penyembuhan luka pada tikus

(Shomashekar et al., 2006).

Peneliti lainnya juga mampu membuktikan bahwa ekstrak Centella

asiatica yang mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid, polifenol

dan polisakarida juga memiliki khasiat antimikroba. Pada dosis yang

bervariasi antara 100 mg/ml sampai 400mg/ml ekstrak etanol pegagan mampu

menghambat mikroorganisme antara lain : E.coli, S. aureus, V.

parahaemolyticus, P. aeruginossa, V. cholerae, S. typhimurium (Suratman et

al., 1996; Mamtha et al., 2004; Wang et al., 2004). Ekstrak etanol Centella

asiatica (pegagan) juga dibuktikan mampu menghambat pertumbuhan

Mycobacterium tuberculosis invitro pada media Lowenstein Jensen (LJ) dan

7H10. Dosis minimal yang mampu menghambat pertumbuhan Mycobacterium

tuberculosis adalah 15 mg/ml (Gitawati et al., 2005). Mustika, 2009

melaporkan bahwa ekstrak etanol Centella asiatica mampu menghambat

pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis strain H 37 Rv yang dikultur pada

media LJ.

Ekstrak metanol Centella asiatica telah dibuktikan sebagai

imunomodulator pada tikus dengan cara meningkatkan eksprei dari CD4,

CD8, makrofag, imunoglobulin G, M dan A. Hal ini membuktikan bahwa



13

ekstrak tersebut dapat mempengaruhi respons imunologi baik humoral

maupun seluler. Pada penelitian ini mengungkapkan bahwa terdapat

perbedaan modulasi respons imun antara ekstrak metanol Centella asiatica

(EMCA) dengan tablet yang hanya mengandung asiaticoside, asiatic acid dan

madecaside (FTECA). EMCA memodulasi respons imun melalui presentasi

oleh molekul MHC klas II sedangkan FTECA memodulasi respons imun

melalui MHC klas I (Taib, 2000).

Ekstrak etanol Centella asiatica (pegagan) juga dibuktikan

meningkatkan produksi imunoglobulin G mencit (Gitawati et al., 2005).

Peneliti lain juga membuktikan bahwa ekstrak tumbuhan tersebut

meningkatkan kadar IFN-γ secara bermakna pada makrofag terinfeksi

Mycobacterium tuberculosis dan meningkatkan produksi TNF-α tetapi tidak

bermakna secara statistik (Mustika dkk, 2009). Peneliti lain juga menunjukkan

peningkatan titer antibodi pada pemberian ekstrak tumbuhan tersebut pada

mencit (Fatmasari et al., 2007). Ekstrak air dan etanol Centella asiatica

mampu meningkatkan kadar TNF-α pada sel kultur makrofag sehat (Punturee

et al., 2004). Centella asiatica juga terbukti tidak bersifat toksik dan

memiliki khasiat hepatoprotektif pada hewan coba tikus yang diinduksi

dengan carbon tetrachloride (Anthony et al., 2006).

Ekstrak Centella asiatica meningkatkan apoptosis pada sel kanker

payudara secara invitro. Peningkatan apoptosis diduga karena perubahan

permeabilitas membran mitokondria, yang akhirnya menyebabkan kondensasi

nukleus dan fragmentasi deoxyribonuclease (DNA) (Babykutty et al., 2009).

Bunpo et al., juga menemukan bahwa ekstrak Centella asiatica menghambat

proses karsinogenesis pada usus tikus. Pada tahun 2005, Bunpo et al.,



14

membuktikan bahwa salah satu kandungan ekstrak Centella asiatica yaitu

asiatic acid meningkatkan apoptosis pada kultur sel kanker usus besar HT-29

melalui perubahan ratio protein Bcl-2 dan Bak-xl. Asiatic acid yang diisolasi

dari ekstrak Centella asiatica menginduksi apoptosis sel kanker melanoma

melalui peningkatan reactive oxygen species, perubahan ratio Bax/Bcl-2 dan

aktivasi protein caspase 3 (Park et al., 2005). Selain itu, asiatic acid

mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker melalui

peningkatan apoptosis pada jalur intrinsik (Tang et al., 2009).

Derivat dari asiatic acid salah satu kandungan senyawa kimia yang

dimiliki oleh pegagan mampu menginduksi apoptosis makrofag. Pada

penelitian yang menggunakan makrofag sel line Raw 264,7 juga membuktikan

adanya peningkatan sitokrom-c, aktivasi caspase 3 dan pemecahan poly(ADP-

ribose) pada proses apoptosis yang diinduksi oleh pegagan (Cho et al., 2003).

2.2. Mycobacterium tuberkulosis

Bakteri ini di isolasi pertama kali oleh Robert Koch pada tahun 1882,

dan pada tahun yang sama Ehrlich membuktikan bahwa bakteri tuberkulosis

bersifat tahan asam. Morfologi bakteri ini berbentuk batang langsing lurus

atau sedikit membengkok (membentuk kurva), terkadang berbentuk filamen

atau bercabang membentuk huruf X,Y,V dengan ukuran 1- 4 mikron x 0,2-0,5

mikron, tersusun secara terpisah dan soliter atau membentuk gerombolan yang

menyerupai tali (serpentine cord). Bakteri ini tidak membentuk spora, tidak

membentuk kapsul dan tidak bergerak. Bersifat tahan asam, dinding selnya

seperti dinding sel bakteri gram negatif tetapi lebih banyak mengandung lipid

(sampai 60% dari berat bakteri kering) yang sebagian besar terikat dengan



15

polisakarida dan protein. Dengan pemberian lisosim akan terbentuk

spheroplast. Sitoplasmanya mengandung granula metakromatik (Jawetz,

2007).

Gambar 2.2 Struktur dinding sel Mycobacterium tuberculosis (Park et al., 2000).

Sifat utama dari bakteri tuberkulosis adalah ketahanannya terhadap zat

peluntur yang bersifat asam. Ketahanan bakteri terhadap asam disebabkan oleh

lapisan lilin pada dinding sel. Hal itu juga menyebabkan bakteri tuberkulosis

mempunyai daya tahan di alam lebih kuat dari pada bakteri tidak berspora

lainnya, dengan sinar matahari atau panas, bakteri akan mati dalam beberapa

menit. Mikobakterium membentuk sedikit asam dari glukosa, maltosa,

trihalosa dan gliserol. Mycobacterium tuberkulosis adalah katalase positif dan

beberapa spesies membentuk sedikit H 2 S. Medium yang di gunakan untuk

isolasi primer bakteri ini harus mengandung sumber karbon (C) sumber

nitrogen (N) yang ditambah dengan serum atau telur, kentang, dan asam

amino (asparagine). Salah satu contoh medium tersebut adalah medium

Lowenstein Jensen. Medium lainnya adalah Petragnani / kentang gliserin

dalam suasana aerob (Barrera, 2007).



16

Bakteri ini dapat tumbuh pada pH 6-7,6 (optimumnya 6,8) dan suhu

30˚C-41˚C (optimumnya 37˚C). Bersifat obligat aerob dan waktu generasinya

20-24 jam, karena waktu generasinya panjang maka waktu inkubasinya yang

diperlukan adalah 6-8 minggu. Koloni pada medium Lowenstein Jensen kecil,

kering, kasar berwarna putih kuning. Pada medium kultur bakteri tahan selama

2-8 bulan, bila terkena sinar matahari secara langsung tahan selama 2 jam,

bakteri ini sangat tahan terhadap asam bila di bandingkan dengan bakteri-

bakteri yang lain (Jawetz, 2007).

Salah satu kunci patogenisitas dari Mycobacterium tuberkulosis adalah

kemampuan bakteri tersebut untuk mengubah metabolismenya pada stadium

yang berbeda. Setelah menginfeksi sel alveolar makrofag, Mycobacterium

tuberkulosis melakukan perubahan pada sistem metabolismenya dengan

menghentikan akumulasi masa biologi dan meningkatkan akumulasi asam

mikolat dan asam lemak pada dinding selnya. Perubahan ini bertujuan untuk

meningkatkan daya tahan bakteri terhadap lingkungan fagosom yang miskin

nutrisi, hipoksia, nitrosatif dan oksidatif. Asam mikolat dan asam lemak

merupakan faktor yang esensial pada resistensi Mycobacterium tuberkulosis

terhadap antibiotika (Bordbar et al., 2010).

2.2.1 Patogenesis tuberkulosis

Tuberkulosis adalah penyakit menular langsung yang disebabkan oleh

bakteri Mycobacterium tuberkulosis. Sebagian besar bakteri tersebut

menyerang paru, tetapi dapat juga mengenai organ tubuh lainnya (Kritski,

2007).

Sumber penularan adalah penderita tuberkulosis dengan pemeriksaan

basil tahan asam (BTA) positif. Pada waktu batuk atau bersin, penderita



17

menyebarkan bakteri ke udara dalam bentuk droplet (percikan dahak). Droplet

yang mengandung bakteri dapat bertahan diudara pada suhu kamar selama

beberapa jam. Orang dapat terinfeksi kalau droplet tersebut terhirup kedalam

saluran pernapasan. Selama Mycobacterium tuberculosis masuk kedalam

tubuh manusia melalui saluran pernapasan, bakteri tersebut dapat menyebar

dari paru ke bagian tubuh lainnya, melalui sistem peredaran darah, sistem

saluran limfe, saluran napas, atau penyebaran langsung kebagian tubuh

lainnya. Daya penularan dari seorang penderita ditentukan oleh banyaknya

bakteri yang dikeluarkan dari parunya. Makin tinggi derajat positif hasil

pemeriksaan dahak, makin menular penderita tersebut. Jika hasil pemeriksaan

dahak negatif (tidak terlihat bakteri), maka penderita tersebut dianggap tidak

menular. Kemungkinan seseorang terinfeksi Mycobacterium tuberculosis

ditentukan oleh konsentrasi droplet dalam udara dan lamanya menghirup

udara tersebut (Kritski, 2007). .

Riwayat terjadinya tuberkulosis, di dahului dengan infeksi primer,

dimana seseorang terpapar pertama kali dengan bakteri tuberkulosis. Droplet

yang terhirup sangat kecil ukurannya, sehingga dapat melewati sistem

pertahanan mukosillier bronkus, dan terus berjalan sehinga sampai di alveolus

dan menetap disana. Infeksi dimulai ketika bakteri berhasil berkembang biak

dengan cara pembelahan diri, yang mengakibatkan peradangan di dalam paru.

Saluran limfe akan membawa Mycobacterium tuberculosis ke kelenjar limfe

disekitar hilus paru, dan ini disebut sebagai kompleks primer. Waktu antara

terjadinya infeksi sampai pembentukan kompleks primer adalah 4 - 6 minggu.

Adanya infeksi dapat dibuktikan dengan terjadinya perubahan reaksi

tuberkulin dari negatif menjadi positif. Kelanjutan setelah infeksi primer



18

tergantung bakteri yang masuk dan besarnya respons daya tahan tubuh

(imunitas seluler). Pada umumnya reaksi daya tahan tubuh tersebut dapat

menghentikan perkembangan bakteri. Meskipun demikian, ada beberapa

bakteri akan menetap sebagai bakteri persisten atau dorman (tidur). Hal ini

karena daya tahan tubuh tidak mampu menghentikan perkembangan bakteri,

akibatnya dalam beberapa bulan, yang bersangkutan akan menjadi penderita

tuberkulosis. Masa inkubasi, yaitu waktu yang diperlukan mulai terinfeksi

sampai menjadi sakit, diperkirakan sekitar 6 bulan (Kritski, 2007).

Setelah beberapa bulan atau beberapa tahun setelah infeksi primer

dapat terjadi tuberkulosis pasca primer. Hal tersebut terjadi karena daya tahan

tubuh menurun akibat terinfeksi human immunodefisiensi virus (HIV) atau

status gizi yang buruk. Ciri khas dari tuberkulosis pasca primer adalah

kerusakan paru yang luas dengan terjadinya kavitas atau efusi pleura (Kritski,

2007).

Komplikasi pada penderita tuberkulosis, terutama terjadi pada stadium

lanjut, antara lain, adalah : hemoptisis yang berat, bronkiektasis, fibrosis paru,

pneumotoraks spontan, dan penyebaran infeksi ke organ lain. Lebih dari 50 %

penderita tuberkulosis akan meninggal dalam jangka waktu 5 tahun tanpa

pengobatan, 25 % akan sembuh sendiri dengan daya tahan tubuh tinggi, dan

25 % sebagai kasus kronik yang tetap menular (WHO, 1996).

Pada infeki oleh HIV menyebabkan kerusakan luas sistem daya tahan

tubuh seluler, sehingga jika terjadi infeksi oportunistik, seperti tuberkulosis.

Jika hal tersebut terjadi, maka yang bersangkutan akan menjadi sakit parah

bahkan mengakibatkan kematian. Bila jumlah orang terinfeksi HIV

meningkat, maka jumlah penderita tuberkulosis akan meningkat, dengan



19

demikian penularan tuberkulosis di masyarakat akan meningkat pula

(Aditama, 2007).

2.2.2 Gejala Klinis infeksi tuberkulosis paru

Gejala umum tuberkulosis, batuk terus menerus dan berdahak selama

3 minggu atau lebih, gejala lain yang sering dijumpai ialah dahak purulen

bercampur darah, batuk darah, sesak napas dan rasa nyeri dada, badan lemah,

nafsu makan menurun, berat badan turun, rasa kurang enak badan (malaise),

berkeringat malam walaupun tanpa kegiatan, demam lebih dari sebulan. Pada

pemeriksaan fisik inspeksi ditemukan adanya penarikan organ lain ke daerah

yang sakit, misalnya trakea. Fosa supra dan infraklavikuler menjadi cekung,

ruang antar iga menyempit dan gerakan pernafasan menurun. Pada palpasi

ditemukan adanya gerakan pernafasan yang menurun, fremitus raba yang

meningkat. Perkusi, suara ketok menurun. Pada auskultasi, terdengar suara

nafas dengan intensitas yang menurun dan suara nafas bronkial atau bronko

vesikuler (Rai dkk, 2005).

2.2.3 Pengobatan tuberkulosis

Pengobatan anti tuberkulosis terbagi atas 2 fase yaitu fase intensif

selama 2-3 bulan dan fase lanjutan selama 4-7 bulan. Paduan obat yang

digunakan terdiri dari paduan obat utama dan tambahan (Rai dkk, 2005).

Obat anti tuberkulosis (OAT) yang utama atau lini pertama yang

digunakan adalah: isoniazid (INH), rifampisin, pirazinamid, streptomisin,

etambutol. Jenis obat tambahan lainnya (lini kedua) adalah: golongan

aminoglikosida (kanamisin dan amikasin), golongan kuinolon (ciprofloxacin

dan levofloxacin), golongan makrolid dan kombinasi antara amoksilin dengan

asam klavulanat. Beberapa obat yang belum tersedia di Indonesia yaitu



20

kapreomisin, sikloserin, PAS, thioamides (ethionamide dan prothionamide)

derivat rifampisin dan INH (Rai dkk, 2005).

Pengembangan pengobatan tuberkulosis paru sangat penting untuk

menyembuhkan pasien dan menghindari multidrug resistant tuberculosis

(MDR TB). WHO menyarankan untuk mengganti obat tunggal dengan

kombinasi dosis tetap dalam pengobatan tuberkulosis primer. Keuntungan

kombinasi dosis tetap adalah: penatalaksanaan sederhana dengan kesalahan

pembuatan resep minimal, peningkatan kepatuhan dan penerimaan pasien

dengan penurunan kesalahan pengobatan yang tidak disengaja, peningkatan

kepatuhan tenaga kesehatan terhadap penatalaksanaan yang benar dan standar,

perbaikan manajemen obat karena jenis obat lebih sedikit, menurunkan risiko

penyalahgunaan obat tunggal dan MDR akibat penurunan penggunaan

monoterapi (WHO, 2010).

2.3. Respons Imun terhadap Mycobacterium tuberculosis

Tuberkulosis berawal dari inhalasi bakteri Mycobacterium tuberculosis

ke dalam alveoli paru. Bakteri berikatan dengan reseptor fagosit yang terdapat

diberbagai sel seperti alveolar makrofag, sel dendritik dan monosit yang

masuk dari pembuluh darah. Makrofag dan sel dendritik mengkespresikan

reseptor fagosit dan toll like receptors (TLR). Ikatan spesifik antara TLR

dengan patogen akan menciptakan sebuah signal transduksi pada host. Sinyal

ini akan mengaktifkan NF-kβ, selanjutnya akan menginduksi sitokin dan

kemokin. Jadi aktivasi TLR merupakan penghubung yang penting antara

respons imun alami dengan respons imun selular. Oleh karena itu, respons

imun terhadap Mycobacterium tuberculosis memegang peranan penting dalam



21

hasil keluaran infeksi Mycobacterium tuberculosis (Bhat et al., 2007). Bila

seseorang terpapar bakteri tersebut maka keluaran penyakit tergantung respons

imun individu tersebut, seperti yang digambarkan pada gambar 2.3.

Gambar 2.3 Kemungkinan luaran bila individu terpapar Mycobacterium tuberculosis (Bhatt et al.,2007). Meskipun makrofag merupakan target utama untuk infeksi M.

tuberkulosis tetapi berbagai sel juga berperan pada perkembangan penyakit.

Neutrofil adalah sel pertama yang dimobilisasi ke tempat dimana agen

patogen masuk ke dalam tubuh atau ketika dipicu oleh sinyal inflamasi. Sel

tersebut mempunyai mekanisme mikrobisidal yang tergantung oksigen dan

mampu membentuk “neutrofil ekstraseluler trap” (Urban, 2006).

Pada penelitian infeksi tuberkulosis pada hewan, neutrofil dapat

dideteksi pada awal infeksi dan memegang peranan mengontrol pertumbuhan

mikobakterium tetapi sampai saat ini kemampuan neutrofil dalam membunuh

bakteri tersebut masih diragukan (Pedrosa, 2000; Fulton, 2002).

Kemungkinan peranan neutrofil dalam infeksi tuberkulosis adalah melalui

produksi kemokin yang menginduksi terbentuknya granuloma dan bertindak

sebagai sel penyaji Mycobacterium tuberculosis kepada makrofag. Jadi,

Imunitas didapat cacat

Infeksi <10% Imunitas alami rendah

Imunitas alami rendah Infeksi laten Imunitas didapat

Containment> 90% Penyakit atau rekativasi <10%, bila terjadi imunosupresi

Imunitas alami tinggi M.tuberculosis mati Tidak infeksi



22

keterlibatan neutrofil ada pada proses patogenesis bukan pada proteksi host

(Keller, 2006).

Sel mast adalah sel efektor yang memegang peranan pada reaksi alergi

dan perkembangan sel Th2. Mereka dapat ditemukan pada mukosa respirasi,

gastrointestinal, traktus urinarius, pembuluh darah dan pembuluh limfe. Sel

mast mengekspresikan reseptor terhadap IgE dan interaksi antara IgE dan

reseptor pada permukaan sel mast menyebabkan sel tersebut mensekresi

berbagai molekul seperti berbagai mediator dan mediator untuk sintesa “de

Novo”. Berbagai mediator tersebut antara lain: histamin, triptose, kimase,

karboksipeptidase dan heparin. Mediator pada sintesis de Novo adalah

leukotrien C4, prostaglandin D2, faktor agregasi platelet, TNF-α, TGF-β,

FGF-2, IL-4, IL-5, IL-8 (Turner,1999; William, 2000; Sayama, 2002). Selain

interaksi antara IgE dengan antigen, agen lain dapat menginduksi aktivasi sel

mast dan pelepasan sitokin. Produk mikroba juga menstimulasi sel mast

melalui TLR-2 dan TLR-4 (Pando et al., 2007).

Sel mast di paru memegang peran dasar untuk pertahanan terhadap

mikobakteria. Sebuah studi menunjukkan bahwa terjadi peningkatan jumlah

sel mast dan granulasinya pada binatang percobaan yang diinfeksi dengan

Mycobacterium tuberculosis. Kehadiran sel mast juga dibuktikan di

duodenum dan ileum sapi yang diinfeksi dengan para tuberkulosis. Penelitian

lain menunjukkan bahwa interaksi antara sel mast dengan Mycobacterium

tuberculosis melalui CD48. Interaksi ini memicu pelepasan mediator seperti

histamin dan β-heksoamidase dan liberasi dari sitokin sintesis de Novo seperti

IL-6 dan TNF-α yang terlibat aktif dalam aktivasi neutrofil dan pemeliharaan

integritas dari granuloma (Pando et al., 2007).



23

Protein dari Mycobacterium tuberculosis yaitu Mycobacterium

tuberculosis secreted antigen (MTSA-10) dan protein 6kDa early secretory

antigenic target (ESAT-6) mempunyai kontribusi untuk mengaktifkan

makrofag, sel dendritik dan juga sel mast untuk melepaskan mediator pro

inflamasi (Pando et al., 2007).

Makrofag dianggap sebagai sel utama pada terjadinya infeksi

tuberkulosis. Makrofag alveolar mempunyai peranan esensial untuk

mengeliminasi organisme yang masuk ke dalam saluran napas. Makrofag

merupakan sel yang pertama yang berinteraksi dengan Mycobacterium

tuberculosis. Interaksi awal antara bakteri dengan makrofag adalah melalui

reseptor yang disebut Fc, komplemen, manose, protein surfaktan, dan CD43.

Meskipun belum diketahui secara pasti jika bakteri berinteraksi dengan salah

satu atau lebih reseptor tersebut tetapi secara invitro diketahui bahwa respons

makrofag tergantung pada interaksi antara makrofag dengan salah satu

reseptor. Interaksinya dengan Fc reseptor meningkatkan produksi reactive

oxygen species (ROS) dan menyebabkan fusi antara fagosom yang

mengandung bakteri dan lisosom. Di sisi lain interaksi antara bakteri dengan

reseptor C3 mencegah respiratory brust dan memblokir maturasi antara

fagosom yang mengandung bakteri dengan mencegah fusi antara fagosom

dengan lisosom. Interaksi Mycobacterium tuberculosis dengan TLR-2 dan

TLR-4 akan mengaktifkan berbagai komponen Mycobacterium tuberculosis

seperti 19-kDa lipoprotein dan lipoarabinomannan (LAM) yang akan

mengaktifkan makrofag melalui TLR-2 dan menginduksi IL-12 dan sintesis

iNOS (Pando et al., 2007).



24

Tanpa memperhatikan reseptor yang berinteraksi dengan bakteri telah

diteliti bahwa keberadaan kolesterol di membran sel merupakan molekul

esensial untuk proses internalisasi bakteri. Dipercaya bahwa kolesterol seluler

bekerja sebagai titik berlabuh dari bakteri dan sebagai stabilisator untuk

berikatan dengan membran makrofag kemudian bakteri akan mudah ditelan.

Ketika bakteri masuk ke dalam makrofag secara umum masuk ke dalam

fagosom. Struktur ini diperoleh dari membran plasma dan kehadiran berbagai

reseptor permukaan. Mycobacterium tuberculosis mampu menghalangi

proses ini. Hambatan ini tergantung pada sebuah proses aktif yang diinduksi

oleh Mycobacterium tuberculosis yang hidup karena bakteri mati dapat

mudah ditemukan di lisosom. Vakuol di mana didalamnya terdapat bakteri,

memiliki morfologi yang berbeda yang disebut early endosomal

compartemen marker diganti menjadi karakter late endosom. Fagosom

Mycobacterium tuberculosis mempunyai petanda awal seperti Rab5 dan

Rab14 GTPase dan tidak ada molekul Rab7. Sebuah penemuan yang

konsisten dengan blokade proses maturasi dari early menjadi late endosom

(Pando et al., 2007).

Gambar 2.4 Proses fagositosis pada infeksi Mycobacterium tuberculosis (a) Proses maturasi fagosom, (b) Blokade fagolisosom oleh Mycobacaterium tuberkulosis (Kaufmann, 2001).

a b



25

Karakteristik lain dari fagosom Mycobacterium tuberculosis adalah

terbatasnya asidifikasi. Secara normal transport berbagai bahan menuju

endosom membutuhkan medium asam untuk mengaktifkan kerja dari

vesicular proton-pump adenosine triphosphatase (V-ATPase) pada late

endosom. Jadi penurunan asidifikasi akan menghasilkan konsentrasi V-

ATPase rendah atau nol di dalam fagosom yang mengandung mikobakterium.

Lebih jauh lagi bahwa fagosom tersebut tidak dapat berhubungan dengan

iNOS. Ketidakmampuan fagosom menjadi matur karena adanya protein

tryptophan aspartate coat protein (TACO) pada fagosom. Pada sebuah

penelitian telah dibuktikan bahwa sel dengan defisiensi TACO yang diinfeksi

dengan Mycobacterium tuberculosis mampu membentuk fagosom yang matur

dan dapat melakukan fusi dengan lisosom membentuk fagolisosom, sehingga

sel mampu mengeliminasi bakteri. Hal ini membuktikan bahwa molekul

tersebut sangat penting pada mekanisme pertahanan hidup dari

mikobakterium. Hambatan maturasi fagososom oleh Mycobacterium

tuberculosis mungkin juga dikendalikan oleh sitokin seperti IFN-γ dan TNF-

α, karena kedua sitokin tersebut merangsang mekanisme mikrobisidal

termasuk produksi oksigen reaktif dan nitrogen intermediate. Peran proteksi

dari nitrogen intermediate telah didemonstrasikan pada berbagai model tikus

yang berbeda. Tetapi peranan oksigen reaktif dan hidrogen peroksida masih

belum sepenuhnya diketahui (Chan, 1992).

Sel lain yang penting pada respons imun alami tubuh terhadap

Mycobacterium tuberculosis adalah sel dendritik. Sel dendritik jelas terlibat

dalam pertahanan respons imun terhadap infeksi Mycobacterium tuberculosis.

Ketika bakteri tersebut masuk secara inhalasi dan difagositosis oleh alveolar



26

makrofag, mereka tinggal dan replikasi di fagosom. Sel dendritik baik di darah

maupun di jaringan paru ditemukan dalam jumlah besar (Sturgill-Koszyki,

1994; Pedroza et al., 2004)

Sel dendritik mengenali, menangkap, memproses antigen dan

dipresentasikan oleh molekul MHC melalui CD1. Sel dendritik mengikat

antigen melalui reseptor C-type Lectin dan reseptor Fcγ/Fcε dan ditelan

melalui endositosis. Endositosis Mycobacterium tuberculosis dibawa keluar

melalui reseptor C-type Lectin yang disebut dendritic cell specific interceluller

adhesion molecule grabing non integrin (DC-SIGN) (Geijtenbeek, 2003;

Tailleux, 2003). Molekul ini akan berinteraksi dengan mannose capped LAM,

sebuah komponen dinding sel bakteri. Sel dendritik yang ditemukan dari

pembuluh darah perifer dan sel dendritik imatur dari monosit

mengekspresikan TLR-2 dan TLR-4, 2 macam toll receptor yang nampaknya

berinteraksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Diasumsikan bahwa respons

imun pertahanan mungkin diinduksi melalui sinyal ini. Interaksi antara

mannose-LAM dengan DC-SIGN menginduksi IL-10. 19-kDa Mycobacterium

tuberculosis lipoprotein dan TLR-2 menginduksi IL-12, TNF-α, IL-6. Ketika

suatu antigen ditangkap dan ditelan, sel dendritik menjadi matur (ditandai

dengan perubahan fungsi dan fenotip) dan secara efisien migrasi ke pembuluh

limfe perifer atau kelenjar getah bening. Ada bukti secara in vitro

Mycobacterium tuberculosis dan BCG dari jaringan paru ke kelenjar getah

bening melalui sel dendritik yang terinfeksi. Migrasi sel dendritik yang

terinfeksi Mycobacterium tuberculosis membutuhkan ekspresi dari kemokin

reseptor 7 (CCR7) pada permukaannya. Ekspresi reseptor membuat mereka

sensitif terhadap kemokin (CC) CCL-19 dan CCL-21. Hal ini penting untuk



27

menyebutkan bahwa maturasi sel dendritik tidak hanya dengan peningkatan

sintesis MHC I dan II, tetapi juga melalui ekspresi dari molekul ko stimulasi

seperti CD80 dan CD86 dan produksi IL-12 (Pando et al., 2007).

Dilaporkan bahwa ketika sel dendritik yang berasal dari monosit

diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis, kemampuan mereka

menghadirkan antigen lipid gagal dan ekspresi CD 1 turun. Komponen

dinding sel Mycobacterium tuberculosis yang menghambat maturasi sel

dendritik adalah lipopolisakarida. Peningkatan virulensi bakteri berhubungan

dengan ketidakmampuan maturasi dari sel dendritik. Pada respons pertahanan

imun, sel dendritik menginduksi maturasi sel Th1 yang mensekresi sitokin IL-

12, IL-8, IL-23 dan mungkin IFN α dan β bukan IFNγ. Sel Th1 memperluas

responsnya terhadap antigen BCG yang dipresentasikan oleh sel dendritik di

kelenjar getah bening dan migrasi menuju tempat infeksi dimana mereka

melepaskan IFNγ yang akan mengaktifkan makrofag lokal yang mengontrol

replikasi bakteri (Kadowaki, 2001; Wozniak, 2006).

Sel natural killer (NK) bermain dalam peran penting dalam

perkembangan respons imun alami. Fungsi utamanya berhubungan dengan

sitotoksisitas pada sel target dan merupakan sel pertama yang memproduksi

IFNγ selama respons imun. Sel NK terlibat dalam infeksi virus, bakteri

maupun kanker. Jumlah sel NK bertambah pada paru tikus C57BL/6 yang

diinfeksi secara aerosol dengan Mycobacterium tuberculosis setelah 21 hari.

Penyebaran sel ini dihubungkan dengan meningkatnya ekspresi petanda

aktivasi dan maturasi dan produksi IFN-γ. Bagaimanapun juga kehilangan sel

NK tidak mempengaruhi jumlah bakteri paru, mengindikasikan bahwa

meskipun sel ini diaktifkan selama respons awal pada tuberkulosis paru,



28

mereka tidak punya peran esensial untuk pertahanan tubuh inang (Junqueira-

Kipnis, 2003). Sel NK pada manusia telah ditunjukkan mempunyai

kemampuan meningkatkan sitotoksisitas makrofag yang diinfeksi dengan

Mycobacterium tuberculosis. Mereka juga mengoptimalkan kemampuan sel

CD8+ untuk memproduksi IFN-γ dan melisis sel yang terinfeksi

Mycobacterium tuberculosis kemudian menggabungkan respons imun alami

menuju adaptif (Vankalayapati et al., 2002; Vankalayapati et al., 2004).

Defensin adalah peptida antimikroba endogen. Terdiri dari 30-50 asam

amino pada mieloid dan sel epitel semua spesies hewan. Mereka menunjukkan

fungsi antibakteri, antifungi dan antiviral. Molekul diklasifikasikan pada α, β,

θ defensin berdasarkan posisi residu sistein dan jumlah ikatan disulfur. Pada

sel fagosit, defensin menunjukkan destruksi komponen mikroorganisme

tergantung metabolisme O 2 . Diduga peptida ini memecah membran berbagai

mikroorganisme dan beberapa mampu menembus membran sitoplasma dan

masuk ke dalam sel yang terinfeksi. Pada makrofag manusia sampai sekarang

belum diketahui apakah memiliki defensin tetapi pada neutrofil terdapat

human neutrofil defensin peptides (HNP 1 , HNP 2 , HNP 3 ) ditemukan aktif

melawan M.avium intraseluler dan Mycobacterium tuberculosis. Secara

invitro, α-defensin dari neutrofil manusia secara langsung menarik sel T

CD4+/CD45RA+, CD8+ dan sel dendritik. Ekspresi β-defensin 2 dan 3

diinduksi oleh IL-1, TNF-α, TLR mengenali bakteri dan fungi. β-defensin

manusia merupakan kemoaktran untuk CD β-defensin4+/CD45RA+ melalui

CCR6 (Pando et al., 2007).

Tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis mengekspresikan β-

defensin yaitu mBD3 dan mBD4. Pada tahap awal infeksi, sel epitel dari



29

traktus respiratorius mengekspresikan kedua defensin tersebut yang

berhubungan dengan mengontrol proliferasi bakteri. Bagaimanapun juga

ekspresi menurun ketika penyakit berlanjut. Pada model infeksi laten, mBD3

dan mBD4 tetap terekspresi tetapi ekspresi menurun ketika terjadi reaktivasi.

Ekspresi genetik HBD-2 didentifikasi di sel epitel di kulit, paru, trakea dan

sistem urogenital. Defensin juga terdeteksi pada sel bronkial hasil lavase dari

penderita terinfeksi M. avium. Monosit dari pembuluh darah perifer yang

diberi HBD2 lebih baik mengontrol pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis

daripada monosit tanpa HBD2. Sel alveolar epitel manusia yang diinfeksi

Mycobacterium tuberculosis juga mengekspresikan HBD2. Tikus yang

diinfeksi Mycobacterium tuberculosis yang diterapi dengan HNP-7

menurunkan jumlah bakteri di paru, liver dan limpa. Hal ini menunjukkan

bahwa defensin dapat digunakan sebagai terapi baru (Pando et al., 2007).

Berbeda dengan respons imun alami, respons imun adaptif

membutuhkan pengenalan spesifik dari antigen asing. Sistem imun alami

sangat besar pengaruhnya pada tipe mekanisme imun didapat yang

dikembangkan dan respons imun spesifik menjalankan berbagai fungsi efektor

melalui aktivasi dari berbagai komponen dari imunitas alami. Respons imun

spesifik dapat dibagi menjadi respons imun seluler dan respons imun humoral.

Kedua mekanisme tersebut tidak eksklusif. Sel Th dibutuhkan untuk maturasi

antibodi, perubahan isotipe dan memori, sedangkan sel B juga berfungsi

sebagai sel penyaji dengan mengaktifasi sel T secara spesifik (Pando et al.,

2007).

Mycobacterium tuberculosis merupakan contoh paling menonjol dari

bakteri intraseluler yang tetap di dalam host untuk waktu yang lama



30

menyebabkan infeksi laten. Suatu infeksi kronik asimtomatik tanpa

menyebabkan kerusakan jaringan. Pada infeksi intraseluler respons imun

protektif lebih pada respons imun seluler daripada antibodi. Mycobacterium

tuberculosis tinggal di dalam makrofag dan relatif resisten terhadap

mekanisme mikrobisidal yang secara efisien mengeliminasi bakteri lain yang

difagositosis. Hal ini merupakan bagian dari kemampuan bakteri tersebut

untuk menghindari aktivasi makrofag oleh IFN-γ dan IL-12. Berbagai studi

menunjukkan bahwa sitokin tersebut memegang peranan kritis pada infeksi

Mycobacterium tuberculosis baik pada manusia maupun pada hewan.

Defisiensi dari IFN-γ dan IL-12 atau reseptornya menyebabkan individu lebih

rentan terhadap infeksi tersebut. Lebih dari 20 tahun diasumsikan bahwa

induksi sel Th1 menghasilkan respons imun yang protektif terhadap infeksi

tuberkulosis. Walaupun kenyataannya masih ada kehilangan informasi penting

seperti peranan sel penyaji secara invivo selama tuberkulosis paru. Informasi

ini penting untuk mengetahui induksi respons imun terhadap bakteri

tuberkulosis dan dapat digunakan untuk mengontrol penyakit menjadi lebih

efektif (Pando et al., 2007).

2.4. Apoptosis

Apoptosis disebut juga dengan kematian sel terprogram, yaitu suatu

proses penyelesaian secara bertingkat untuk menghilangkan sel yang tidak

diperlukan tanpa menggunakan respons inflamasi. Bila melibatkan respons

inflamasi yang terjadi adalah nekrosis sel. Apoptosis adalah suatu proses

fisiologis yang dikendalikan dengan kontrol genetik yang ketat, berlangsung

melalui proteolisis, kondensasi dan fragmentasi DNA disusul dengan



31

pengerutan sel. Secara biokimiawi terjadi aktivasi berbagai endonuklease dan

protease, DNA dipecah menjadi fragmen-fragmen dengan panjang berbeda

dan terbentuk badan apoptotik. Badan apoptotik ini akan difagositosis oleh

makrofag (Geweis, 2003).

Apoptosis merupakan proses abnormal yang menjaga perkembangan

jaringan normal maupun homeostasis tubuh dan merupakan bagian integral dari

fungsi sistem imun. Proses apoptosis akan menyingkirkan sel T autoreaktif

untuk mencegah terjadinya penyakit imun demikian pada sel-sel yang terinfeksi

mikroorganisme misalnya sel CD4 dengan HIV sehingga infeksi tidak

berkembang (Elmore, 2007)

Gambar 2.5 Mekanisme apoptosis melalui jalur instrinsik dan ekstrinsik (Faherty et al., 2008).

2.4.1 Perbedaan apoptosis dan nekrosis

Seperti diferensiasi dan proliferasi, apoptosis merupakan metode

kontrol seluler yang tidak kalah penting dalam pengendalian sel. Gangguan

pada sistem ini dapat menyebabkan gangguan dalam pengendalian sel menjadi

abnormal. Proses kematian sel terjadi melalui apoptosis atau nekrosis. Kedua



32

proses kematian sel tersebut memberikan gambaran yang berbeda. Nekrosis

selalu patologis, tetapi apoptosis dapat patologis maupun fisiologis. Apoptosis

fisiologis merupakan proses kematian sel yang terjadi secara alami. Apoptosis

dipicu oleh sekelompok enzim yang disebut caspase. Dalam kondisi normal

enzim tersebut dalam keadaan inaktif yaitu sebagai pro-enzim. Aktivasi caspase

segera disusul gambaran morfologis spesifik apoptosis, yaitu badan apoptotik.

Apoptosis dipicu oleh berbagai molekul sinyal dari dalam sel, misalnya protein

p53 (p53 dependent mediated pathway) dan dari luar sel, misalnya TNF-α (p53

independent mediated pathway). Apoptosis di modulasi oleh molekul yang

proapoptotik dan molekul yang anti apoptotik. Keseimbangan antara kedua

kondisi tersebut menentukan sensitifitas atau resistensi terhadap apoptosis

(Buchman, 2000).

Terdapat perbedaan gambaran morfologis dari nekrosis dan apoptosis.

Sel yang nekrotik menunjukkan pembengkakan, lisis, diisi oleh komponen-

komponen ekstraseluler, disertai proses inflamasi, menarik serta berkumpulnya

sel-sel fagosit, terjadi perubahan berupa sel-sel nekrotik. Sel yang mengalami

apoptosis tidak disertai pembengkakan sel, terjadi perubahan struktur seperti

penyusutan volume, pengkerutan membran, sitoplasma mengalami konsentrasi,

kondensasi kromatin, tidak ada proses lisis tetapi terjadi degradasi DNA

menjadi oligonukleosomal fragmen. Terbentuk fragmen kecil disebut badan

apoptotic dari 600-750 kb menjadi sekitar 50-300 kb serta kehilangan

kemampuan berkomunikasi dengan sekitarnya (Winter, 1988; Rasola,1999;

Buchman, 2000). Badan apoptotik yang terbentuk tidak bertahan lama oleh

karena segera difagositer makrofag tanpa disertai proses inflamasi (Buchman,

2000). Berbagai faktor dapat mendorong terjadi apoptosis, menginduksi



33

munculnya perubahan mitokondria sebagai proses awal kematian sel. Awalnya

terbentuk megaspore pada permukaan mitokondria, pembengkakan matrik,

hilangnya mekanisme elektrokimia pada permukaan membran dalam,

menyebabkan terlepasnya sitokrom-C di dalam sitosol akan memprovokasi

komplek multiprotein yang kemudian mengaktifkan caspase-9 dan berikutnya

caspase-3. Caspase merupakan protease suatu enzim proteolitik yang mengubah

zimogen inaktif menjadi enzim heterodimerik aktif disebut juga interleukin-1β

converting enzyme (Rasola, 1999).

Apoptosis fisiologis terjadi pada masa embrional atau terjadi pada usia

dewasa, misalnya penggantian sel kulit dan mukosa saluran cerna (Buchman,

2000). Apoptosis patologis terjadi bila terdapat fragmentasi DNA yang

diinduksi oleh peningkatan aktivitas protein p53, maupun reseptor TNF-α.

Keadaan normal sinyal kematian melalui apoptosis berada dalam keadaan

inaktif menjadi aktif bila terdapat sinyal kematian sel dan program kematian

yang dipandu gen nef, dengan demikian disebut kematian sel terprogram.

Apoptosis merupakan proses kematian sel terprogram berakibat matinya sel

yang tidak dikehendaki. Apoptosis jelas berbeda dengan nekrosis, karena

apoptosis merupakan suatu kematian sel yang terprogram dan bukan secara

kebetulan seperti kerusakan sel yang mengalami nekrosis. Selain itu, sel

apoptotik dikenali dan dimusnahkan oleh fagosit sebelum mengalami

disintegrasi sehingga sel yang mengalami apoptosis tidak didapatkan kerusakan

jaringan sekitarnya, tidak terjadi induksi respons peradangan seperti pada

nekrosis (Geweis, 2003; Elmore, 2007).

Apoptosis merupakan bentuk kematian sel secara fisiologis, terjadi pada

semua sel dan jaringan. Merupakan bagian penting dari keseimbangan sel dan



34

jaringan normal. Pada akhir masa hidupnya, sel normal terjadi kondensasi inti

heterokromatik, pengerutan sel dan teracaknya letak berbagai organela di dalam

sitoplasma. Gambaran karakteristik seperti pola anak tangga di dapatkan pada

elektroforesis DNA sel apoptotik yang dihasilkan oleh fragmen

oligonukleosom karena adanya kromatin internukleosom oleh endonuklease

endogen (Elmore, 2007).

2.4.2 Protein Caspase

Mekanisme apoptosis dipicu oleh beberapa produk gen. terdapat 3

gen utama yang berperan dalam proses apoptosis yaitu : CED-3, CED-4 dan

CED-9. CED-3 dan CED-4 mendorong terjadi apoptosis, sedangkan CED -9

berfungi menghambat apoptosis. CED-3 adalah caspase yaitu suatu protease

sistein yang dapat memecah protein pada posisi spesifik setelah residu asam

aspartat pada rangkaian asam amino yang menyusun protein. Proses apoptosis

dimulai dari CED-4 yang mengikat CED-3. Ikatan CED-4 pada CED-3 akan

menyebabkan CED-3 teraktivasi sehingga proses apoptosis dimulai. CED-9

dapat mencegah apoptosis karena CED-9 dapat membentuk komplek dengan

CED-4 dan CED-3, sehingga CED-4 tidak dapat mengaktivasi CED-3.

Akibatnya apoptosis dapat dihambat (Geweis, 2003).

Pada manusia dan mencit terdapat 14 caspase yang telah berhasil

diidentifikasi yang dikelompokkan menurut sekuen asam amino yang sama

atau spesifikasi proteasenya. Berdasarkan fungsinya caspase dibagi dua, yaitu

caspase inisiator (upstream atau inisiator caspase) dan caspase efektor

(downstream atau effector caspase) (Elmore, 2007).

Peran caspase pada apoptosis belum sepenuhnya diketahui karena

banyak sekali ditemukan substrat caspase dan beberapa substrat tersebut



35

diantaranya mengalami pemrosesan selama apoptosis. Substrat dari caspase

efektor merupakan protein kinase. Sebagian besar caspase diperkirakan terlibat

dalam apoptosis. Caspase yang terlibat dalam apoptosis antara lain casapase 2,

8, 9, 10 yang tergolong caspase inisiator. Caspase 3,6,7 yang tergolong caspase

eksekutor. Sedangam caspase 1, 4, 5 merupakan caspase yang terlibat dalam

proses inflamasi (Cullen et al., 2009). Caspase 3 merupakan efektor utama

dengan berat molekul 32 kD yang teraktivasi hampir pada seluruh proses

apoptosis. Aktivasi caspase 3 secara langsung maupun tidak langsung

bertanggung jawab pada pemecahan substrat protein target, menuju pemecahan

DNA yang spesifik dan perubahan morfologi yang spesifik pula dari sel

apoptotik. Pada saat caspase 3 di dalamsel sudah aktif, sel tersebut benar

commited to death dan apoptosis sudah dapat dikatakan menuju kondisi yang

tidak dapat kembali lagi (Cullen et al., 2009).

2.4.3 Protein Bax dan Bcl-2

Protein Burkitt’s Cell Lymphoma (Bcl)-2 adalah anggota dari keluarga

protein Bcl. Keluarga protein bcl dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan

domain Bcl homolog (BH) yang dimilikinya. Kelompok pertama adalah

kelompok yang mempunyai domain BH1, BH2, BH3 dan BH4. Protein tersebut

yaitu Bcl-2, Bcl-XL dan Mcl-1. Kelompok protein tersebut berfungsi untuk

menghambat apoptosis dan disebut sebagai antiapoptosis. Kelompok kedua

adalah kelompok yang mempunyai domain BH1, BH2 dan BH3, yaitu Bax dan

Bak. Protein tersebut mempunyai fungsi untuk menginduksi apoptosis sehingga

disebut proapoptosis. Kelompok ketiga adalah kelompok yang hanya

mempunyai domain BH3, yaitu protein tBid, Bim dan Puma. Protein tersebut



36

berfungsi menginduksi apoptosis dan disebut sebagai proapoptosis (Shore et

al., 2008; Yao et al., 2009).

Salah satu mekanisme respons suatu sel terhadap sinyal apoptosis adalah

melalui keseimbangan antara protein antiapoptosis dan protein proapoptosis

dari keluarga Bcl tersebut. Pada suatu kondisi dimana protein proapaoptosis

pada sel berlebihan, maka sel tersebut menjadi lebih sensitif terhadap proses

apoptosis. Demikian juga sebaliknya, apabila suatu sel memilki protein

antiapoptosis yang berlimpah maka sel tersebut menjadi lebih resisten terhadap

proses apoptosis. Peningkatan ekspresi protein pro apoptosis pada permukaan

mitokondria merupakan kondisi y ang penting pada pembentukan permeability

transition pore (Adams et al., 2007; Dash, 2009; Brenner et al., 2009).

Interaksi antara protein proapoptotik dan protein antiapoptotik

mengakibatkan gangguan pada fungsi protein antiapoptotik Bcl-2 sehingga

mengakibatkan terbentuknya pori pada mitokondria. Pori pada mitokindria

yang terbuka menyebabkan lepasnya sitokrom-c dan protein proapoptosis yang

lainnya. Sitokrom-c yang keluar dari mitokondria berinteraksi dengan molekul

Apaf-1. Interaksi kedua protein tersebut akan menarik protein caspase 9 untuk

membentuk komplek yang disebut dengan apotosome. Formasi apoptosome

tersebut menyebabkan aktivasi protein caspase 9 dan akhirnya protein tersebut

menginduksi proses apoptosis (Dash, 2009; Brenner et al., 2009).

2.4.4 Apoptosis pada tuberkulosis

Makrofag merupakan pertahanan lini pertama untuk melawan infeksi

Mycobacterium tuberculosis dan memicu terjadinya respons imun seluler dari

penderita. Meskipun makrofag mampu memfagositosis bakteri dan

membunuhnya di dalam sel, tetapi Mycobacterium tuberculosis mempunyai



37

mekanisme tersendiri sehingga terhindar dari proses terebut. Hasilnya adalah

interaksi yang tetap antara makrofag dan Mycobacterium tuberculosis.

Makrofag mungkin membangun sarana untuk melindungi host dari bakteri

tuberkulosis namun bakteri tersebut mungkin menganggu fungsi makrofag

sehingga membuat bakteri mampu proliferasi dan melepaskan diri dari sel.

Berbagai bukti menunjukkan bahwa proses apoptosis makrofag pada infeksi

tuberkulosis memegang peranan penting pada interaksi antara host dan

patogen. Diduga apoptosis pada makrofag yang terinfeksi bakteri tuberkulosis

menguntungkan host dan merupakan mekanisme pertahanan yang sangat

berguna (Kornfeld et al.,1999).

Beberapa peneliti membuktikan bahwa interaksi antara bakteri

tuberkulosis dengan host juga tergantung dari virulensi bakteri. Bila infeksi

oleh bakteri yang virulen maka akan menginduksi terjadinya nekrosis

sedangkan infeksi oleh bakteri yang tidak virulen menginduksi terjadinya

apoptosis (Behar et al., 2010; Kumawat et al., 2010; Maziar et al., 2010;

Miller et al,. 2010; Rudel et al.,2010; Shin et al., 2010).

Gambar 2.6 Infeksi bakteri Mycobacterium tuberculosis virulen pada sel makrofag (Behar et al., 2010).



38

Pada penelitian oleh Zhang et al menunjukkan bahwa terdapat

perbedaan ekspresi caspase-3 antara bakteri H37Ra yang tidak virulen

dibandingkan dengan H37Rv yang virulent. Makrofag yang diinfeksi oleh

H37Rv terjadi penurunan apoptosis. Pada bakteri tuberkulosis virulen yang

menginfeksi makrofag menyebabkan makrofag terhindar dari apoptosis.

Fenomena ini menyebabkan bakteri berkembang biak di dalam makrofag dan

akhirnya terjadi nekrosis. Mekanisme nekrosis ini diduga merupakan upaya

bakteri untuk melepaskan diri dari sel dan masuk ke dalam medium

ekstraseluler (Zhang et al., 2005; Chen et al., 2006). Hubungan antara

virulensi M. tuberkulosis dan hambatan terhadap apoptosis juga telah

dibuktikan pada penelitian dengan menggunakan tikus. Suatu gen tertentu

pada M. tuberkulosis mampu menghambat apoptosis pada makrofag

(Velmurugan et al., 2007).

Fas (APO-1/CD95) anggota dari reseptor TNF yaitu tipe-I protein

membran dan FasL sebuah anggota dari keluarga TNF yaitu tipe-II protein

membran. Ikatan antara Fas dan FasL menghasilkan sinyal transduksi yang

menyebabkan sel mengalami apoptosis. Pada penelitian tersebut menunjukkan

bahwa M. tuberculosis mengatur sinyal Fas/FasL, diduga penurunan regulasi

Fas bisa mencegah makrofag terinfeksi bakteri mengalami apoptosis dan

terjadi prolong intraseluler survival. Penelitian lain menunjukkan bahwa

terjadi peningkatan ekspresi FasL pada pada makrofag yang terdapat di

granuloma tuberkulosis (Mustafa et al., 2001; Zhang et al., 2005).

Bcl-2 adalah molekul pengatur antiapoptosis utama yang

menyelamatkan sel dari apoptosis. Pada penelitian diatas menunjukkan bahwa

terjadi peningkatan ekspresi mRNA Bcl-2 pada makrofag terinfeksi H37Rv.



39

Peningkatan regulasi ekspresi Bcl-2 pada makrofag terinfeksi tuberkulosis

mengijinkan M. tuberkulosis untuk terus berkembang intraseluler pad awal

fase dan pada fase lanjut akan menyebabkan nekrosis makrofag sehingga

bakteri akan menginfeksi jaringan sekitarnya (Zhang et al., 2005; Rodrigues et

al., 2009). Penelitian ini menguatkan penelitian sebelumnya bahwa terjadi

peningkatan regulasi Bcl-2 pada tikus yang diinfeksi dengan M. tuberkulosis.

Interaksi antara makrofag dan bakteri menyebabkan peningkatan ekspresi

proapoptosis dan antiapoptosis terhadap makrofag tergantung juga pada

virulensi bakteri. Pada bakteri yang virulen terjadi peningkatan ekspresi Bcl-2.

Penelitian ini juga membuktikan bahwa terjadi penurunan ekspresi Bax, yaitu

protein proapoptosis dengan mekanisme kerja menghambat kerja Bcl-2

(Mogga et al., 2002).

Hambatan apoptosis makrofag oleh Mycobacterium tuberculosis

merupakan strategi dari bakteri tersebut untuk mempertahankan diri dan

merupakan faktor virulensi. Proses ini juga akan menghindari bakteri tersebut

dari mekanisme respons imun alami dan menghambat respons imun adaptif.

Melalui mekanisme anti apoptosis ini, Mycobacterium tuberculosis akan

berkembang biak dan menyebar ke berbagai sel sekitarnya melalui proses

nekrosis. Beberapa penelitian membuktikan bahwa bakteri yang virulen akan

berkembang biak di dalam makrofag dan menginduksi nekrosis sel tersebut.

Dampak negatif dari proses nekrosis adalah bakteri tetap hidup dan

menginfeksi sel sekitarnya. Proses nekrosis ini juga akan menyebabkan reaksi

inflamasi yang berlebihan sehingga menimbulkan kerusakan sel sekitarnya

(Behar et al.,2010; Samali et al., 2010; Peter et al., 2010).



40

Mycobacterium tuberculosis yang virulen juga mempunyai mekanisme

lain untuk menghindari apoptosis yaitu melalui hambatan terhadap perbaikan

membrane plasma yang diperlukan oleh sel untuk mencegah terjadinya

nekrosis dan menginduksi apoptosis dan meningkatkan sekresi dari TNFR2

yang akan menetralisasi fungsi dari sitokin TNF-α (Balcewihcz-Sablinska,

1998; Divanghi et al., 2009; Fairbain, 2009).

Keuntungan dari mekanisme apoptosis adalah Mycobacterium

tuberculosis akan mati pada proses apoptosis. Mekanisme kematian

Mycobacterium tuberculosis pada proses apoptosis kemungkinan disebabkan

karena dua proses yaitu: melalui peningkatan Nitrik Oksida atau melalui

proses fusi fagosom menjadi fagolisosom (Molloy et al.,1994;Herbs et

al.,2011).

Nitrik oksida (NO) diketahui mempunyai kemampuan untuk

menginduksi apoptosis pada makrofag dan produksi NO diinduksi oleh IFN-γ

melalui peningkatan ekspresi Nitric oxide synthetase (NOS2) (Brune et al.,

1997). NO dapat membunuh Mycobacterium tuberculosis intrase melalui

berbagai mekanisme yaitu : secara langsung pada DNA bakteri,

mempengaruhi metabolisme tembaga, target virulensi dari mikobakterial atau

berfungsi sebagai pembawa pesan kedua (Shiloh et al., 2000; Nathan, 2003;

Axelrod et al., 2008; Yang et al., 2009). Pada penelitian yang dilakukan oleh

Herbs, 2011, menunjukkan bahwa NO yang diinduksi oleh IFN-γ

meningkatkan apoptosis makrofag yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis dan membunuh bakteri tersebut.

Apoptosis diduga mempunyai hubungan dengan perubahan aristektur

dari sistem vesikular host sehingga menyebabkan fusi dari fagosom dan



41

lisosom yang sebelumnya dihambat oleh Mycobacterium tuberculosis (Molloy

et al., 1994; Grassme et al., 2001; Labbe et al., 2008).

2.5. Sel Alveolar Makrofag

Alveolar makrofag adalah salah satu populasi makrofag pada jaringan

yang dengan mudah sapat dipelajari baik pada manusia maupun pada hewan

coba. Pada tahun 1961, sel tersebut dapat dipanen dengan menggunakan

metode bronchoalveolar lavage dan sejak saat itu sel alveolar makrofag mulai

diteliti. Sel alveolar makrofag merupakan tipe sel yang predominan di dalam

alveolus (Fels et al., 1986; Lohmann-Matthes et al., 1994).

Alveolar makrofag adalah sel yang berfungsi sebagai sel pertahanan

seluler lini pertama untuk melawan pathogen yang masuk melalui saluran

respirasi. Alveolar makrofag merupakan sel fagosit utama dari sistem imun alami

pada paru. Sel tersebut bertugas untuk membersihkan ruang udara dari agen

infeksi, toksik atau partikel alergen yang dapat lolos dari mekanisme pertahanan

mekanik saluran respirasi seperti : mukosa nasal, glottis dan sistem transport

mukosilia (Rubins, 2003; Peter-Golden, 2004). Alveolar makrofag mempunyai

kemampuan untuk mengeliminasi patogen yang kita hisap setiap harinya pada

manusia sehat melalui mekanisme fagositosis dan intracellular killing, sekresi

dari metabolit oksigen, sekresi peptide dan protease anti mikroba. Ketika

alveolar makrofag bertemu dengan patogen dalam jumlah besar atau patogen

yang virulen, sel tersebut akan mensintesis dan mensekresi berbagai macam

sitokin seperti interleukin-1, interleukin-6 dan tumor necrosis factor-α,

interleukin-8, TGF-β, kemokin dan metabolit arakidonat. Kemokin yang disekresi

antara lain : macrophage inflammatory proteins 1 & 2, leukotrien B 4. Beberapa



42

sitokin yang diproduksi oleh alveolar makrofag juga menginduksi proliferasi

fibroblas. Alveolar makroafag juga menginduksi berbagai sel seperti neutrofil,

granulosit untuk menjadi aktif. Alveolar makrofag juga memegang peranan

penting sebagai sel pengatur dari pertahanan alveolar. (Rubins, 2004; Kirby et al.,

2009).

2.6. Kerusakan Jaringan Paru

Pada level yang fundamental, sebagian besar respons inflamasi terhadap

infeksi Mycobacterium tuberculosis pada binatang dan manusia memiliki

kemiripan. Perbedaan yang penting diantara manusia dan binatang adalah

progresifitas perjalanan penyakit dan susunan tipe lesi. Pada binatang perjalanan

penyakit lebih cepat sehingga binatang sangat menguntungkan untuk dijadikan

hewan coba pada infeksi tuberculosis (Basaraba, 2008).

Lesi tuberkulosis pada jaringan paru pada semua spesies adalah spesifik

campuran antara makrofag, limfosit, sel plasma dan granulosit yang melampaui

batas pada jaringan paru. Tanda khas infeksi Mycobacterium tuberculosis

terdapat dominasi dari makrofag baik dalam bentuk mononuclear maupun

multinucleated giant cells (Basaraba, 2008).

Gambaran patologi kerusakan jaringan paru pada hewan coba dipengaruhi

oleh cara infeksi bakteri, jenis dan strain hewan coba, dosis dan strain

Mycobacterium tuberculosis. Perbedaan lesi morfologi pada hewan coba pada

umumnya disebabkan karena resistensi genetik, stadium penyakit dan respons

imun adaptif (Basaraba, 2008).

Derajad kerusakan jaringan paru dapat digunakan untuk menilai efektivitas

obat yang diuji pada hewan coba, selain itu juga dapat digunakan untuk menilai



43

virulensi kuman (Dormans et al., 2004; Reviono, 2011). Ker usakan jaringan

paru pada infeksi Mycobacterium tuberculosis mulai berupa lesi morfologi yang

terdiri dari infiltrasi sel radang sampai granuloma. Granuloma merupakan tanda

stadium kronik infeksi Mycobacterium tuberculosis sebagai usaha dari sistem

imun pejamu untuk melokalisir multiplikasi dan penyebaran lebih lanjut ke organ

lain (Ordway et al., 2005).

Respons pertama yang tampak setelah dilakukan pemberian infesi kuman

adalah terkumpulnya sel mononuklear baik makrofag, limfosit maupun sel

plasma dan neutrofil, baik berupa kelainan alveolitis, perivaskulitis maupun

peribronkiolitis (Dormans et al., 2004). Pembentukan granuloma terjadi beberapa

waktu kemudian, paling sering tampak pada hari ke-20 (Flynn et al., 2005;

Cardona et al., 2000).

Gambar 2.7. Histopatologi jaringan paru mencit yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis setelah 23 hari. Pribronkiolitis (B), Perivaskulitis (C) dan granuloma (G) (Dormans et al., 2004).

Perjalanan awal infeksi Mycobacterium tuberculosis sangat bervariasi,

tergantung pada faktor imunitas, sensitivitas dari penjamu serta virulensi ataupun

agresivitas dari kuman tersebut (Dormans et al., 2004). Lesi tuberkulosis pada

awal perjalanan penyakit adalah proliferasi dan eksudatif. Pada individu yang

resisten atau mempunyai daya tahan, reaksi fagositosis akan memulai dengan

B C

G



44

pembentukan batas dinding fibroplastik dan skar. Pada individu yang rentan, lesi

eksudatif akan lebih luas dengan melibatkan banyak sel inflamasi dan ditandai

kemampuan melokalisir yang buruk (Basaraba et al., 2008). Respons terhadap

kuman selanjutnya berkembang sampai timbul kekebalan imun yang didapat

dengan pembentukan granuloma. Kekebalan imun yang didapat pada

tuberkulosis ada 2 yaitu cell mediated immunity (CMI) dan delayed type

hypersentitivity (DTH). CMI menunjukkan proses yang menyebabkan akumulasi

sejumlah makrofag teraktivasi yang bersifat mikrobisid, sedangkan DTH

menunjukkan proses imun sitotoksik yang membunuh makrofag imatur dan tidak

teraktivasi sehingga menyebabkan multiplikasi bakteri tuberkulosis (Saunders et

al., 2007).

Pembentukan granuloma diawali dari pengenalan CD4+sel Th1 yang

mengenali antigen fragmen peptida terbentuk melalui reseptor major

histocompatibility (MHC) kelas II. Antigen fragmen peptida terbentuk oleh

enzim digesti proteolitik yang dibangkitkan oleh antigen presenting cell misalnya

makrofag dan sel dendritik. Beberapa sitokin diproduksi oleh CD4+ sel Th1

yaitu IFN-γ, GMCSF ke makrofag terinfeksi Mycobacterium tuberculosis untuk

meningkatkan fungsi efektor pada makrofag tersebut. Sitokin lain yaitu IL-2 juga

diproduksi oleh CD4+sel Th1 untuk merangsang CD8+ sel T sitotoksik,

selanjutnya berperan menghancurkan makrofag imatur terinfeksi secara

apoptosis. Makrofag yang teraktivasi mengelilingi lesi yang terinfeksi

Mycobacterium tuberculosis dengan mengeluarkan sitokin kemotaktik antara lain

IFN-γ, monosit chemoactractant protein 1(MCP 1) dan Interleukin-8 (IL-8).

Setelah terjadi agregasi pada lesi tersebut, monosit berpindah dari sirkulasi

menuju lesi tersebut. Sejumlah monosit tersebut menjadi alveolar makrofag,



45

selanjutnya berubah menjadi histiosit palisade atau epitel. Beberapa sel tersebut

berfusi untuk membentuk giant cells Laghans yang merupakan khas granuloma

(Saunders et al., 2007). Granuloma pada tikus berbeda dengan granuloma pada

manusia. Granuloma pada tikus tersusun oleh neutrofil, makrofag dan limfosit

dengan struktur makrofag teraktivasi dan limfosit yang mengelilingi kumpulan

makrofag terinfeksi. Pada granuloma ini tidak terdapat nekrosis. Meskipun

strukturnya berbeda tetapi fungsinya sama yaitu mengendalikan infeksi dan

mencegah penyebaran infeksi (Flyn et al., 2005).

Kerusakan jaringan paru pada infeksi tuberkulosis juga disebabkan karena

Mycobacterium tuberculosis menginduksi ekspresi enzim matrix

metalloproteinase-1 (MMP-1). MMP-1 merupakan anggota keluarga matrix

metalloproteinase (MMPs) yang mempunyai fungsi untuk memecah matrik dan

mengubah bentuk jaringan. MMPs merupakan anggota dari keluarga protease

yang tergantung Zinc yang secara kolektif mampu mendegradasi semua

komponen matriks ekstraseluler. Aktivitas MMPs secara ketat diatur pada tingkat

transkripsi dan aktivasinya dilakukan oleh pemecahan proteolitik. MMPs secara

spesifik dihambat oleh enzim tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMPs).

Peningkatan yang berlebihan dari aktivitas enzin MMPs menyebabkan gambaran

patologi yang luas pada jaringan paru yang ditandai dengan kerusakan matriks

ekstraseluler (Elkington et al., 2011). Berbagai enzim dari keluarga tersebut juga

mempunyai peranan penting pada proses angiogenesis, motilitas sel, apoptosis,

regulasi imunitas, inflamasi dan pertahanan tubuh (Salgame, 2011).

MMP-1 secara spesifik telah ditunjukkan mempunyai kemampuan

melakukan degradasi terhadap kolagen tipe I yang menyebabkan kerusakan

jaringan paru. Penelitian yang dilakukan pada pasien tuberkulosis menunjukkan



46

adanya peningkatan enzim MMP-1 dan penurunan enzim tissue inhibitor of

metalloproteinase (TIMPs). Penelitian ini juga diperkuat pada penelitian mencit

yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis, menunjukkan adanya

peningkatan enzin MMP-1 yang mempunyai korelasi yang kuat dengan

peningkatan kerusakan jaringan alveoli dan secara signifikan terjadi peningkatan

pemecahan kolagen. Pada penelitian tersebut juga menunjukkan bahwa

mekanisme patogenesis terjadinya kerusakan jaringan paru akibat aktivitas

MMP-1 berbeda dengan kerusakan jaringan paru karena proses nekrosis dan

granuloma (Elkington et al., 2011).



47

BAB 3

KERANGKA KONSEPTUAL

3.1. Kerangka konseptual

Ekstrak etanol herba Centella asiatica

Gambar 3.1 Skema kerangka konseptual. Meningkatkan Menghambat Variabel yang diteliti

Bcl-2 Bax

TNFα

TNFR1

Caspase-8

Caspase-3

Apoptosis

Apoptosome

C-9

M.tuberculosis

Badan apoptotik

Mitokondria

Kerusakan jaringan

IFNγ

IL 10

BH3 ONLY

M.tuberculosis

Makrofag



48

Keterangan

Mycobacterium tuberculosis yang masuk kedalam tubuh melalui saluran napas

akan difagositosis oleh sel alveolar makrofag pada jaringan paru. Mycobacterium

tuberculosis merupakan bakteri intraseluler di dalam makrofag dan mempunyai

kemampuan untuk mempengaruhi respons makrofag. Bakteri tersebut menginduksi

peningkatan ekspresi protein anti apoptosis yaitu Bcl-2 dan menghambat ekspresi

protein pro apoptosis yaitu Bax. Mycobacterium tuberculosis juga menghambat

ekspresi reseptor membran seperti TNFR1 dan meningkatkan sekresi TNFR2.

Mekanisme tersebut bertujuan untuk menghambat apoptosis sel makrofag. Hambatan

mekanisme apoptosis sel makrofag, menyebabkan Mycobacterium tuberculosis tetap

hidup dan berkembang biak di dalam sel makrofag.

Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica akan meningkatkan respons

sel makrofag yang terinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis sehingga sel makrofag

dapat meningkatkan kemampuannya untuk melakukan eliminasi bakteri melalui

proses apoptosis. Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi

protein pro apoptosis yaitu Bax dan menghambat ekspresi protein Bcl2. Kedua protein

tersebut adalah protein yang menginduksi proses apoptosis melalui jalur instrinsik.

Ekstrak etanol herba Centella asiatica juga meningkatkan apoptosis melalui jalur

ekstrinsik dengan cara meningkatkan sekresi TNF-α dan menghambat sekresi TNFR2.

Interaksi antara TNF-α/TNFR1 akan membentuk suatu komplek yang memicu

aktivitas protein caspase 8. Selain menginduksi jalur ekstrinsik, Aktivasi protein

Caspase 8 juga mempengaruhi jalur instrinsik dengan memperkuat aktivitas protein

Bax. Induksi apoptosis sel makrofag baik melalui jalur ekstrinsik maupun intrinsik

akan memicu aktivitas protein eksekutor yaitu caspase 3 sehingga terjadi apoptosis sel

makrofag.



49

Sel makrofag yang mengalami apoptosis akan membentuk badan apoptotik.

Selanjutnya, badan apoptotik akan difagositois oleh sel makrofag melalui proses yang

disebut efferositosis. Hasil akhir dari mekanisme apoptosis sel makrofag adalah

menurunnya jumlah bakteri Mycobacterium tuberculosis dan menurunkan kerusakan

jaringan paru.

3.2.Hipotesis

Berdasarkan kerangka konseptual diatas maka disusunlah hipotesis sebagai

berikut :

1. Ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2

sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan


2. Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein Bax



3. Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein

Caspase-8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi

dengan Mycobacterium tuberculosis.

4. Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel alveolar

makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis.

5. Ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi antigen

Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru

tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.



50

6. Ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan jumlah Mycobacterium

tuberculosis (CFU/ml) pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan


7. Ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan

paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.



51

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1. Jenis dan Rancangan penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris pada

hewan coba. Rancangan penelitian adalah rancangan acak lengkap. Penelitian

ini membuktikan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan

apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus dengan infeksi


Tikus diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis secara intratrakea

dan dibagi secara acak menjadi 5 kelompok. Pada hari ke-29 setelah infeksi

tikus pada kelompok 5 dieuthanasia untuk mengetahui adanya infeksi

tuberkulosis pada jaringan paru tikus. Kelompok 1, 2, dan 3 adalah kelompok

perlakuan, yaitu kelompok tikus yang mendapat ekstrak etanol herba Centella

asiatica dengan dosis 375mg/KgBB, 750mg/KgBB, 1500mg/KgBB, sekali

sehari secara peroral selama 14 hari. Kelompok 4 adalah kelompok kontrol, yaitu

kelompok tikus yang tidak memperoleh ekstrak etanol Centella asiatica.

Gambar 4.1 Bagan rancangan penelitian.

Randomisasi

P1

Unit Eksperimen

P4 P3 P2 P5

O5 O4 O3 O2 O1



52

Keterangan:

Kelompok P1=adalah kelompok tikus yang diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis dan mendapat ekstrak etanol herba Centella

asiatica sebesar 375mg/kgBB/ peroral sehari sekali







Kelompok P4= adalah kelompok tikus kontrol, yang diinfeksi dengan

Mycobacterium tuberculosis dan tidak mendapat ekstrak

etanol herba Centella asiatica

Kelompok P5= adalah kelompok tikus praperlakuan yaitu kelompok tikus

yang dieuthanasia pada hari ke-29 setelah infeksi untuk

menentukan keberhasilan infeksi

4.2. Unit Eksperimen dan Replikasi

4.2.1 Unit Eksperimen

Unit eksperimen pada penelitian ini adalah tikus jantan berumur 2 -3

bulan dengan berat badan sekitar 150 gram. Tikus dipilih sebagai unit

eksperimen dalam penelitian ini karena memiliki banyak kesamaan proses

patogenesis penyakit tuberkulosis dengan manusia, kemiripan respons

imunologis dengan manusia, kemudahan pemeliharaan dan ketersediaan reagen

(Orme, 2003; Gupta et al., 2005).



53

4.2.2 Replikasi

Jumlah replikasi yang dipergunakan pada penelitian ini ditentukan

dengan memakai rumus, sebagai berikut :

2σ 2 ( Z1-α + Z1-β ) 2 r≥ d 2 Keterangan r = besarnya masing-masing kelompok eksperimen Z1-α = nilai standar normal yang besarnya tergantung α α = 0,05 jadi Z = 1,645 Z1-β = power test (90%) = nilai yang diperoleh dari tabel yang telah ditentukan = 1,28 σ = standard deviasi = 6,3 d = selisih rerata antara kelompok kontrol dan perlakuan yang diharapkan= 11 f = faktor koreksi (10%) Diperoleh nilai r adalah 5, 6 dibulatkan menjadi 6. Jadi replikasi minimal pada

penelitian ini adalah 6. Setelah dilakukan koreksi 1/1- f, maka jumlah

replikasi adalah 7.

4.3. Variabel penelitian

4.3.1 Variabel bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah dosis ekstrak etanol herba

Centella asiatica.

4.3.2 Variabel tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kerusakan jaringan paru

tikus.

4.3.3 Variabel Antara

1. Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag

2. Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag



54

3. Ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag

4. Apoptosis sel alveolar makrofag

5. Jumlah Mycobacterium tuberculosis pada jaringan paru tikus

6. Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag

4.3.4 Variabel terkendali

1. Strain , jenis kelamin, umur dan berat badan tikus

2. Asal herba Centella asiatica

3. Kandang hewan coba, makanan dan minuman

4. Strain bakteri H37Rv

5. Cara menginfeksi tikus

4.3.4 Definisi operasional variabel

4.3.4.1 Dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica

Dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica adalah jumlah ekstrak etanol

herba Centella asiatica yang diberikan pada tikus sesuai dengan berat badan

secara peroral satu kali sehari selama 14 hari. Dosis ekstrak etanol herba

Centella asiatica adalah 375mg/KgBB, 750mg/KgBB dan 1500mg/kgBB.

Penetapan dosis ekstrak berdasarkan penelitian pendahuluan. Sedangkan,

Dosis ekstrak pada penelitian pendahuluan tersebut ditentukan berdasarkan

penelitian sebelumnya pada hewan coba mencit dan dilakukan konversi dosis

dari mencit ke tikus (Fatmawati et al., 2007). Ekstrak diberikan secara

peroral dalam bentuk suspensi satu kali sehari selama 14 hari sesuai dengan

berat badan tikus (Granapragrasam, 2004; Gitawati, 2005; Shamaseker,

2006; George et al., 2009; Wahjo, 2009).



55

4.3.4.2 Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag

Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag adalah jumlah ekspresi protein

Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus, diperiksa dengan

menggunakan pemeriksaan imunohistokimia. Dihitung sebanyak 5 lapang

pandang dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x

(Mustafa et al., 2001; Mustafa et al., 2007).

4.3.4.3 Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag

Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag adalah jumlah ekspresi protein

Bax sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus, diperiksa dengan

menggunakan pemeriksaan imunohistokimia. Dihitung sebanyak 5 lapang



4.3.4.4 Ekspresi protein Caspase 8 sel alveolar makrofag

Ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag adalah jumlah ekspresi

protein Caspase 8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus, diperiksa

dengan menggunakan pemeriksaan imunohistokimia. Dihitung sebanyak 5

lapang pandang dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x


4.3.4.5 Apoptosis sel alveolar makrofag

Apoptosis sel alveolar makrofag adalah sejumlah sel alveolar makrofag di

jaringan paru tikus yang mengalami apoptosis diperiksa dengan pewarnaan

TUNNEL assay (Apoptag Detection Kit), dihitung sebanyak 5 lapang





56

4.3.4.6 Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag

Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag adalah

jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel makrofag pada

jaringan paru tikus, diperiksa dengan menggunakan pemeriksaan

imunohistokimia. Dihitung sebanyak 5 lapang pandang dengan

menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x (Mustafa et al., 2001;

Mustafa et al., 2007).

4.3.4.7 Jumlah Mycobacterium tuberculosis dari jaringan paru tikus

Jumlah Mycobacterium tuberculosis adalah jumlah koloni bakteri

Mycobacterium tuberculosis pada jaringan paru tikus dengan menghitung

colony forming unit (CFU)/ml/gram jaringan yang dikultur pada media

Midllebrook 7H10 (Forbes et al., 2007).

4.3.4.8 Kerusakan Jaringan Paru Tikus

Kerusakan jaringan paru tikus adalah kerusakan jaringan paru tikus yang

dinilai dengan menggunakan skor dari Dormans. Penilaian kerusakan

berdasarkan parameter histopatologi : peribronkiolitis, perivaskulitis,

alveolitis dan pembentukan granuloma. Secara semikuantitatif tiap parameter

dinilai dengan tidak ada (0), minimal, apabila hanya terdapat infilttrasi sel

inflamasi dominan polimorfonuklear (1), ringan, apabila terdapat sel

inflamasi dominan mononuklear dengan ketebalan < 5um (2), sedang, apabila

terdapat sel inflamasi dominan mononuklear dengan ketebalan 5-10 um (3),

jelas apabila terdapat sel inflamasi dominan mononuklear dengan ketebalan

>10 um (4), dan berat, apabila terdapat kerusakan endotel dan sel inflamasi

(5) (Dormans, 2004).



57

4.4. Bahan dan Alat Penelitian

4.4.1 Bahan

4.4.1.1 Bahan tumbuhan

Tumbuhan yang digunakan adalah Centella asiatica (pegagan) yang

diambil dari Balai Materia Medika, Batu, Malang dan telah dilakukan

determinasi di Kebun Raya Purwodadi Pasuruan. Bagian tumbuhan yang

diambil adalah keseluruhan tanaman diatas tanah dan disebut dengan herba

Centella asiatica Tumbuhan tersebut ditanam pada daerah dataran tinggi

dengan ketinggian 800 meter diatas permukaan laut dan dipanen pada usia

antara 2-3 bulan.

4.4.1.2 Hewan coba

Hewan coba yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus strain

Wistar) jantan yang diperoleh dari unit hewan coba Universitas Gadjah

Mada. Tikus yang dipilih berumur 2-3 bulan dengan berat badan antara 125 –

200 gram. Pakan tikus adalah pellet par G diproduksi oleh PT. Comfeed

Indonesia. Air minum adalah air PDAM yang dimasak terlebih dahulu.

4.4.1.3 Bakteri

Mycobacterium tuberculosis yang digunakan adalah strain H 37 RV

(ATCC27294) yang diperoleh dari laboratorium tuberkulosis Lembaga

Penyakit Tropik Universitas Airlangga. Bakteri yang diambil dari stock

bakteri Mycobacterium tuberculosis ditanam pada Media LJ selama 2-3

minggu. Suspensi kuman dibuat dengan mengambil koloni bakteri masukkan

didalam tabung kaca yang berisi 0,05% tween 80 2 tetes, glas bit yang telah

diterra terlebih dahulu. Tambahkan aquadest ± 6 ml kemudian divortex dan

suspensi dibandingkan dengan standard Mc Farland, 1 Mc Farland sebanding



58

dengan 10 8 /ml Mycobacterium tuberculosis (Saunders et al.,1996; Sato K et

al.,1998).

4.4.1.4 Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah ketamin

HCl injeksi (Hameln Pharmaceutical), ether (EMS No katalog 1180), alkohol

absolut, alkohol 96%, alkohol 80%, alkohol 70% (Brataco), aquadestilata

(Brataco), carboxy methyl cellulosa natrium (Brataco), kiesel gel 60F 254

(Merk, no katalog 0345629), xylol, n-hexana, etilasetat, anisaldehide asam

sulfat, pewarna Hematoxylin Eosin (EMS No katalog 14653), phosphate

buffer saline (PBS) (Brataco), formaldehyde (Brataco), pewarna Ziehl-

Neelsen (EMS No katalog 484k), media Middlebrook 7H9 dan 7H10 (BD

Biosciens No katalog 295964 ), fungizone (Sigma, katalog no A2942),

Apoptag detection Kit (Milipore corporation, katalog no S1701), antibodi

primer untuk Bcl-2 yaitu anti mouse monoclonal antibody Bcl-2 (Bioworld

Technology Inc, No catalog BS1511), antibodi primer untuk antigen

Mycobacterium tuberculosis (antibodies-online GmbH, katalog no.

ABIN112959), antibodi primer untuk Bax yaitu rabbit Ig G Bax antibody

(species reactivity to rat and mouse) (Novus Biologicals, katalog no.

NB120-7977), antibodi primer untuk Caspase-8 yaitu rabbit IgG caspase 8

antibody (Novus Biologicals, katalog no. NB120-15552),

Immunohistochemistry Kit (antibodi sekunder, streptavidim-HRP, DAB dari

Daco LSAB no catalog K0673).

4.4.2 Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: tabung erlenmeyer

2L, corong Buchner, vakum ekstraktor dan rotavapour , chamber, timbangan,



59

sendok pengaduk, mortar, stamper, sonde pediatrik no 8, spuit 1 cc dan 5 cc,

alat bedah minor, sarung tangan, masker, laminar flow, tabung sentrifus,

incubator CO2, plate, glass bit, ose, vortek, bunsen, pipet mikro dan pinset.

4.5. Lokasi dan Waktu Penelitian

4.5.1 Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia

Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Laboratorium Biokimia Fakultas

Kedokteran Universitas Airlangga, Laboratorium Farmasi Kedokteran

Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Airlangga, Laboratorium Tuberkulosis Lembaga Penyakit Tropik

Universitas Airlangga, dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Airlangga.

4.5.2 Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan selama 9 bulan pada bulan Maret 2011 sampai

dengan Nopember 2011.

4.6. Prosedur Penelitian

4.6.1 Ekstraksi dan Identifikasi herba Centella asiatica

Ekstraksi herba Centella asiatica dilakukan dengan cara maserasi.

Herba Centella asiatica adalah keseluruhan tanaman diatas tanah yang diambil

dari Balai Materia Medica, Batu, Malang. Sebanyak 20 kg tanaman basah

dikeringkan pada suhu kamar dan tidak terkena sinar matahari langsung. Bahan

yang sudah kering dihaluskan dengan mesin penggiling dan diayak dengan

pengayak. Serbuk yang dihasilkan ditampung dan dilakukan ekstraksi.

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu dengan merendam

serbuk herba Centella asiatica dalam pelarut etanol 70%. Serbuk direndam di



60

dalam benjana tertutup selama 24 jam pada suhu kamar sambil sering diaduk.

Rendaman disaring dengan menggunakan penyaring buchner dan vakum

ekstraktor. Filtrat dikumpulkan dan residu direndam kembali dengan pelarut

etanol 70% yang baru. Proses ekstraksi dilakukan sampai senyawa terpenoid

yang terkandung didalam ekstrak herba Centella asiatica tidak terdeteksi lagi

dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Filtrat hasil

maserasi kemudian diuapkan dengan menggunakan rotavapour sampai

didapatkan ekstrak kental. Sisa pelarut dalam ekstrak kental diuapkan dalam

lemari asam. Hasilnya disebut dengan ekstrak etanol herba Centella asiatica.

Identifikasi kandungan terpenoid dari ekstrak etanol herba Centella

asiatica dilakukan dengan metode KLT. Ekstrak herba etanol Centella asiatica

diambil secukupnya dan ditetesi dengan etanol, diaduk sampai larut. Larutan

tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipet kapiler pada fase diam yaitu

kiesel gel GF 254. Fase diam dikeringkan dan setelah kering, direndam pada

fase gerak (eluen) yaitu kombinasi antara n-hexana - etil asetat (4:1).

Keberadaan senyawa terpenoid ditunjukkan adanya noda warna merah

keunguan dengan penampak noda anisaldehida asam sulfat. Senyawa terpenoid

juga dideteksi dengan menggunakan sinar uv vis (λ=365 nm).

4.6.2 Model infeksi Mycobacterium tuberculosis pada tikus

Tikus dipelihara dalam kabinet BSL di FKH Unair dan diberi makanan

dan minuman ad libitum. Tikus diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

melalui trakea. Tikus dibius terlebih dahulu sebelum diinfeksi dengan

Mycobacterium tuberculosis. Obat anestesi yang digunakan adalah ketamin

HCl dan obat anestesi yang digunakan untuk pemeliharaan selama tindakan

pembedahan adalah ether. Ketamin HCl diberikan kepada tikus secara injeksi



61

intramuskular. Dosis ketamin adalah 50 mg/KgBb dan pada dosis tersebut

tidak menimbulkan efek toksik (Kusumawati, 2004). Tikus difiksasi terlentang

dan dibuat insisi pada leher sepanjang 0,5-1 cm, setelah terlihat trakea,

suspensi bakteri diinjeksikan ke dalam trakea. Dosis Mycobacterium

tuberculosis adalah 10 8 /ml, diinjeksikan ke trakea sebanyak 50μl. Luka insisi

dijahit dan diberi betadin (Panduro et al., 1998; Adolfo et al., 2006; Rodrigues

et al., 2009). Tikus dibiarkan pada posisi kepala lebih tinggi dan diamati

sampai sadar kembali.

Pada hari ke-29 setelah infeksi dengan Mycobacterium tuberculosis,

tikus pada kelompok 5 dibunuh untuk membuktikan adanya infeksi

tuberkulosis pada jaringan paru tikus. Jaringan paru kiri diambil secara aseptik

dan dikultur pada media Middlebrook 7H10, sedangkan paru bagian kanan

dimasukkan ke dalam formalin buffer 10% untuk dilakukan pemeriksaan

histopatologi dengan menggunakan pewarnaan HE (Dormans et al., 2004).

4.6.3 Perlakuan

Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica pada kelompok

perlakuan dimulai pada hari ke-29 setelah infeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis. Tikus pada kelompok 1 memperoleh ekstrak etanol herba

Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB, kelompok 2 memperoleh ekstrak etanol

herba Centella asiatica dosis 750 mg/KgBB, kelompok 3 memperoleh ekstrak

etanol herba Centella asiatica dosis 1500 mg/KgBB. Ekstrak diberikan secara

peroral dengan menggunakan sonde, satu kali sehari, selama 14 hari. Tikus

pada kelompok 4 yaitu kelompok kontrol memperoleh suspensi CMC Na 1%



62

dalam aquadestilata yang diberikan secara peroral dengan menggunakan sonde,

satu kali sehari, selama 14 hari.

Pada hari ke-15 setelah perlakuan, baik tikus pada kelompok perlakuan

maupun kelompok kontrol dibunuh dan diambil organ paru untuk dilakukan

pemeriksaan. Jaringan paru kiri diambil secara aseptik dan dikultur pada media

Middlebrook 7H10, sedangkan paru bagian kanan dimasukkan ke dalam

formalin buffer 10% untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi dan

imunohistokimia.

4.6.4 Pemeriksaan

4.6.4.1 Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap

ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus

yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan metode

imunohistokimia. Sediaan ditempatkan pada rak pengecatan, dilakukan

deparafinisasi dengan xylol sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit.

Hidrasi preparat dengan alkohol absolut selama 5 menit, alkohol 96%

selama 5 menit dan alkohol 80% selama 5 menit. Sediaan dicuci dengan

PBS 3 kali selama 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi primer

yaitu anti mouse monoclonal antibody Bcl-2 selama 1-2 jam dalam suhu

kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan

antibodi sekunder selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3

kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan strepatavidin selama 1 jam dalam

suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Ditetesi dengan kromogen

diamino benzidine tetrahydrochlorida (DAB) selama 15 menit. Dicuci



63

dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan counterstain dengan Meyer’s

Hematoxylin selama 5 menit. Dicuci dengan air mengalir atau aquadest

selama 10 menit. Preparat dikeringkan, mounting dengan entelan dan kaca

penutup.


ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus





Dilakukan hidrasi dengan alkohol absolut selama 5 menit, alkohol 96%



rabbit Ig G Bax antibody (species reactivity to rat and mouse) selama 1-2

jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan

inkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci

dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan strepatavidin

selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit.

Ditetesi dengan kromogen Diamino Benzidine Tetrahydrochlorida (DAB)

selama 15 menit. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan

counterstain dengan Meyer’s Hematoxylin selama 5 menit. Dicuci dengan

air mengalir atau aquadest selama 10 menit. Preparat dikeringkan,

mounting dengan entelan dan kaca penutup.



64


ekspresi protein Caspase 8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru

tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis







rabbit IgG caspase 8 antibody selama 1-2 jam dalam suhu kamar. Dicuci

dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi sekunder

selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit.

Dilakukan inkubasi dengan strepatavidin selama 1 jam dalam suhu kamar.

Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Ditetesi dengan kromogen Diamino

Benzidine Tetrahydrochlorida (DAB) selama 15 menit. Dicuci dengan PBS

3 kali 2-3 menit. Dilakukan counterstain dengan Meyer’s Hematoxylin

selama 5 menit. Dicuci dengan air mengalir atau aquadest selama 10 menit.

Preparat dikeringkan, mounting dengan entelan dan kaca penutup.


apoptosis sel alveolar makrofag di jaringan paru tikus yang diinfeksi

dengan Mycobacterium tuberculosis

Preparat yang akan diperiksa dilakukan deparafinisasi dengan

menggunakan xylol 1, xylol 2, xylol 3 masing selama 5 menit. Proses

dilanjutkan dengan pencucian dengan menggunakan alkohol absolute



65

sebanyak 2 kali selama 5 menit, alkohol 96% selama 3 menit, alcohol 70%

selama 3 menit. Selanjutnya cuci dengan aquadest dan phosphate buffer

saline (PBS). Setelah proses deparafinisasi selesai, dilanjutkan dengan

praperlakuan dengan tujuan untuk menghilangkan protein. Preparat

ditambah dengan enzim trypsin 0,025% selama 5 menit, kemudian dicuci

dengan PBS, tambahkan H2O2 3% selama 10 menit dan dicuci lagi dengan

PBS. Inkubasi dengan antibodi spesifik (antibodi primer) dan dicuci dalam

PBS. Lakukan prosedur sesuai dengan sistem deteksi yang digunakan.

Dilakukan pewarnaan dan analisis secara mikroskopis.


ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis pada sel alveolar

makrofag di jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis







polyclonal antibody to Mycobacterium tuberculosis selama 1-2 jam dalam

suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi

dengan antibodi sekunder selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan

PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan strepatavidin selama 1 jam

dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Ditetesi dengan



66

kromogen Diamino Benzidine Tetrahydrochlorida (DAB) selama 15 menit.

Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan counterstain dengan

Meyer’s Hematoxylin selama 5 menit. Dicuci dengan air mengalir atau

aquadest selama 10 menit. Preparat dikeringkan, mounting dengan entelan

dan kaca penutup.

4.6.4.6 Pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap jumlah

Mycobacterium tuberculosis H37Rv dari jaringan paru tikus yang

diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

Tikus yang sudah dieuthanasia, diambil jaringan paru secara aseptik

dan ditimbang. Bagian paru kiri dihaluskan dan dilakukan pengenceran

dengan penambahan larutan normal salin steril. Seratus mikroliter dari

larutan tersebut diambil dan ditanam di media Midllebrook 7H10 selama 3

minggu. Setelah 3 minngu, dihitung jumlah bakteri CFU/ml/gram jaringan

(Forbes et al., 2007).

4.6.4.7 Pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada kerusakan

jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

Paru bagian kanan akan dibuat histopatologi dengan pengecatan HE

untuk mengetahui kerusakan jaringan (Sheshagiri et al., 2010). Paru kanan

difiksasi dalam larutan formaldehyde 10% dalam PBS selama 2 hari

kemudian direndam dalam paraffin dan pemotongan dilakukan sepanjang

daerah terluas dari tiap lobus, hal ini dilakukan terhadap semua jaringan paru

yang diperiksa sehingga semua jaringan paru mencit diperiksa pada daerah

yang sama. Potongan setebal 5µm terpisah setiap 100 µm. Untuk

pemeriksaan skor jaringan sediaan diwarnai dengan pengecatan HE.



67

Skor yang digunakan untuk menilai kerusakan jaringan paru tikus

pada penelitian ini berdasarkan skor dari Dormans. Penilaian kerusakan

berdasarkan parameter histopatologi : peribronkiolitis, perivaskulitis,

alveolitis dan pembentukan granuloma. Peribronkiolitis adalah keradangan

pada bronkioli. Perivaskulitis adalah keradangan pada pembuluh darah.

Alveolitis adalah keradangan pada jaringan alveoli. Granuloma adalah

agregat seluler yang merupakan tanda khas dari infeksi tuberkulosis. Secara

semikuantitatif tiap parameter dinilai dengan tidak ada (0), minimal, apabila

infiltrasi sel radang berupa sel polimorfonuklear(1), ringan, apabila infiltrasi

sel radang didominasi oleh sel mononuklear dengan ketebalan < 5 µm (2),

sedang, apabila infiltrasi sel radang didominasi oleh sel mononuclear

dengan ketebalan 5-10 µm (3), kuat, apabila apabila infiltrasi sel radang

didominasi oleh sel mononuclear dengan >10 µm (4) dan berat, apabila

infiltrasi sel radang didominasi oleh sel mononuklear dan terdapat kerusakan

struktur (5) (Dormans, 2004).

Tabel 4.1 Skala Dormans (Dormans et al., 2004) Peribronkiolitis

Skor Identifikasi

0 Tidak terdapat sel inflamasi pada dinding bronkiolus

1 Terdapat sel inflamasi dominan polimorfonuklear pada dinding bronkiolus

2 Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding bronkiolus, ketebalan < 5 µm

3 Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding bronkiolus, ketebalan 5 - 10 µm

4 Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding bronkiolus, ketebalan >10 µm

5 Terdapat sel inflamasi dan kerusakan epitel bronkiolus



68

Perivaskulitis Skor Identifikasi

0 Tidak terdapat sel inflamasi pada dinding kapiler

1 Terdapat sel inflamasi dominan polimorfonuklear pada dinding kapiler

2 Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding kapiler, ketebalan < 5 µm

3 Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding kapiler, ketebalan 5 - 10 µm

4 Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding kapiler, ketebalan >10 µm

5 Terdapat sel inflamasi dan kerusakan endotel kapiler

Alveolitis

Skor Identifikasi

0 Tidak terdapat sel inflamasi pada dinding alveoli

1 Terdapat sel inflamasi dominan polimorfonuklear pada dinding alveoli

2 Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding alveoli, luas,10%

3 Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding alveoli, luas >10%

4 Terdapat sel inflamasi peradangan intraalveoli <10%

5 Terdapat sel inflamasi peradangan intraalveoli >10%

Granuloma

Skor Identifikasi 0 Tidak terdapat Granuloma

1 terdapat Granuloma diameter < 100 µm

2 terdapat Granuloma diameter 100 – 200 µm, jumlah < 2 buah

3 terdapat Granuloma diameter 100 – 200 µm, jumlah ≥ 2 buah

4 terdapat Granuloma diameter > 200 µm, jumlah < 2 buah

5 terdapat Granuloma diameter > 200 µm, jumlah ≥ 2 buah



69

4.6.5 Alur Penelitian

Gambar 4.2. Skema alur penelitian. Keterangan : EECA = ekstrak etanol herba Centella asiatica CMC Na = carboxy methyl cellulosa natrium

4.7. Analisis Data

Data yang dihasilkan dilakukan uji normalitas dan homogenitas varians.

Untuk komparasi dilakukan uji ANAVA. Data kerusakan jaringan dilakukan uji

Kruskal Wallis dan dilanjutkan dengan Mann-Whitney U. Untuk tujuan korelasi

dilakukan analisis jalur dan korelasi dari Spearman.

4.8. Kelaikan Etik

Penelitian ini telah dinyatakan laik etik oleh Komisi Etik penelitian

Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.

Tikus diinfeksi dg

M.tuberculosis H37Rv

Tikus dikelompokkan secara acak ke dalam 5 kelompok

35 ekor tikus diaklimatisasi selama 1 mgg

Suspensi CMC Na 1%

Setelah 4 minggu

EECA 375mg/KgBB

EECA 1500mg/Kg BB

EECA 750mg/KgBB

Perlakuan Ekstrak diberikan satu kali sehari selama 14 hari

Tikus dieuthanasia diambil paru kiri untuk dilakukan pemeriksaan jumlah M.tbc CFU/ml dan jaringan paru kanan dilakukan preparai PA untuk dilakukan pengecatan HE untuk pemeriksaan kerusakan jaringan dan

pemeriksaan imunohistokimia yaitu: apoptosis, caspase-8,protein Bax dan BCl-2

Tikus dibunuh untuk pemeriksaan model infeksi tuberkulosis

Tikus diinfeksi dg


Tikus diinfeksi dg


Tikus diinfeksi dg


Tikus diinfeksi dg




70

BAB 5

HASIL DAN ANALISIS

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental pada hewan coba tikus tentang

efek dan mekanisme ekstrak etanol herba Centella asiatica pada apoptosis sel

makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

terhadap ekspresi protein Bcl-2, protein Bax, Caspase-8, antigen Mycobacterium

tuberculosis, jumlah Mycobacterium tuberculosis dan kerusakan jaringan paru tikus.

Data yang diperoleh dari penelitian dilakukan analisis dan ditampilkan dalam bentuk

tabel, grafik dan gambar.

5.1. Hasil Ekstraksi dan identifikasi herba Centella asiatica

Telah dilakukan ekstraksi secara maserasi terhadap 2 kg serbuk kering

Centella asiatica yang menghasilkan 551 gram ekstrak kental.

Berdasarkan identifikasi menggunakan KLT menunjukkan bahwa pada

ekstrak alkohol herba Centella asiatica nampak noda berwarna merah keunguan

dengan penampak noda anisaldehide-asam sulfat. Eluen yang digunakan pada

KLT adalah kombinasi antara n- hexana dan etil asetat dengan perbandingan n-

hexane 4 : etil asetat 1. Noda yang tampak pada kiesel gel apabila dilihat dengan

sinar uv vis dengan panjang gelombang 365 nm menunjukkan warna biru terang

dan oranye terang dan oranye gelap (gambar 5.1). Warna noda tersebut

menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica mengandung

senyawa terpenoid.



71

(a) (b)

5.2. Hasil Model Infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis pada tikus.

Hasil model infeksi Mycobacterium tuberculosis pada tikus setelah minggu

ke-4 menunjukkan adanya kerusakan jaringan paru tikus. Hasil pemeriksaan

histopatologi kerusakan jaringan paru tikus dinilai berdasarkan skor Dorman yaitu

peribronkiolitis, perivaskulitis, alveolitis dan granuloma menunjukkan tingkat

kerusakan ringan sampai sedang. Peribronkiolitis yaitu infiltrasi sel radang

campuran antara polimorfonuklear (PMN) dan makrofag pada dinding bronkiolus

dengan ketebalan > 10 um yang didominasi sel makrofag, tanpa disertai

kerusakan epitel bronkiolus menunjukkan skor 4 (gambar 5.2 a). Pada

perivaskulitis menunjukkan adanya infiltrasi sel radang pada pembuluh darah

merupakan campuran antara PMN dan makrofag dimana PMN lebih dominan.

Gambaran tersebut menunjukkan perivaskulitis dengan skor 1 (gambar 5.2 a).

Gambar 5.1 Hasil KLT ekstrak etanol Centella asiatica. (a) Noda bewarna merah keunguan dengan penampak noda anisaldehide-asam sulfat menunjukkan senyawa terpenoid (b) Noda berwarna biru terang, oranye terang dan oranye gelap dengan sinar uv vis dengan panjang gelombang 365 nm menunjukkan senyawa terpenoid.

Senyawa terpenoid

Senyawa terpenoid



72

Alveolitis adalah keradangan pada jaringan alveoli yang ditandai dengan adanya

infiltrasi sel radang tanpa kerusakan dinding alveoli atau struktur alveoli.

Gambaran tersebut menunjukkan alveolitis dengan skor 3 (gambar 5.2 c).

Granuloma yang ditunjukkan pada gambar 5.2.(d) merupakan ciri khas infeksi

tuberkulosis dan penilaian berdasarkan skor Dorman adalah 1.

Gambar 5.2 Histopatologi kerusakan jaringan paru tikus pada minggu ke-4 setelah infeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Gambar diatas menunjukkan kerusakan jaringan paru dengan parameter: peribronkiolitis dengan skor 4 (a), perivaskulitis dengan skor 1 (b), alveolitis dengan skor 3 (c), dan granuloma dengan skor 1. Pengecatan Hematoxylin Eosin. Pembesaran 200x untuk (a), 400x untuk (b,c,d).

d c

b

a



73

5.3. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap

ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang


Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap

ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang

diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis menunjukkan perbedaan antara

kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi ekspresi protein

Bcl-2 pada sel alveolar makrofag ada pada kelompok kontrol yaitu 79,06

(gambar 5.3).

ha

Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus

antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol diperiksa dengan

menggunakan imunohistokimia. Ekspresi protein Bcl2 dikatakan positif jika

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Kontrol

27.83 30.47 33.83

79.06

Rer

ata

eksp

resi

pro

tein

Bcl

2

Gambar 5.3 Rerata ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.



74

sitoplasma sel alveolar makrofag yang berwarna coklat, sedangkan ekspresi

protein Bcl-2 negatif apabila sitoplasma sel alveolar tidak berwarna (gambar

5.4). Pada gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan

dengan kelompok kontrol. Pada kelompok kontrol, menunjukkan jumlah sel

alveolar makrofag dengan ekspresi protein Bcl-2 positif yang tinggi.

Gambar 5.4. Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), dan kelompok kontrol (d) terhadap ekspresi Bcl-2. Diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Sitoplasma sel yang berwarna coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl2 positip (panah kuning) sedangkan yang tidak berwarna menunjukkan hasil negatip (panah merah). Jumlah ekspresi protein Bcl-2 tertinggi ada pada kelompok kontrol. Pembesaran 400x.

a b

c d



75

Tabel 5.1 Perhitungan statistik ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan

paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 29,7 a 9,7 12,2 38,8 750mg/Kgbb 30 a 11,9 20,4 55,2 1500mg/Kgbb 33,8 a 25,7 10 81,4 Kontrol 79,2 b 47,2 27,6 168,2

Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas one sample

Kolmogorov Smirnov dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal dan

homogen. Setelah dilakukan analisis varian dan dilanjutkan dengan multiple

comparasion (α=0,05) didapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan yang

bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kelompok kontrol

(p=0,016), antara kelompok dosis 750 mg mg/KgBB dengan kontrol (p=0,008)

dan dosis 1500 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,037).


ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang



ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi

dengan Mycobacterium tuberculosis menunjukkan perbedaan antara kelompok

perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi ekspresi protein Bax pada

sel alveolar makrofag pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba

Centella asiatica dosis 750mg/Kgbb yaitu 98,3 (gambar 5.5).



76

Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus


menggunakan imunohistokimia. Ekspresi protein Bax dikatakan positif jika

sitoplasma sel alveolar makrofag berwarna coklat, sedangkan ekspresi protein

Bax negatif apabila sitoplasma sel alveolar tidak berwarna (gambar 5.6). Pada

gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan

kelompok kontrol. Pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba

Centella asiatica 750mg/KgBB menunjukkan jumlah sel alveolar makrofag

dengan ekspresi protein Bax positif yang tinggi.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


51.51

98.03

52.97 53.03 R

erat

a ek

spre

si p

rote

in B

ax

Gambar 5.5 Rerata ekspresi protein Bax sel alvelolar makrofag pada jaringan paru tikus. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.



77

Tabel 5.2 Perhitungan statistik ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag jaringan

paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 51,3 a 19,6 26 77 750mg/Kgbb 98,1 b 7,8 86,8 109,2 1500mg/Kgbb 53 a 34,1 30,6 120,8

Gambar 5.6 Ekspresi protein Bax dari sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), dan kelompok kontrol (d) terhadap ekspresi Bax. Diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Sitoplasma sel yang berwarna coklat menunjukkan ekspresi protein Bax positip (panah kuning) sedangkan yang tidak bewarna menunjukkan hasil negatip (panah merah). Jumlah ekspresi protein Bax tertinggi ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/KgBB. Pembesaran 400x.



78

Kontrol 53 a 23,6 30,4 90,6 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas One Sample-




bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kelompok dosis 750

mg/KgBB (p=0,004), antara kelompok dosis 750 mg/KgBB dengan dosis 1500

mg/KgBB (p=0,008) dan antara dosis 750 mg/KgBb dengan kelompok kontrol

(p=0,008).


ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus



ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang

diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis menunjukkan perbedaan antara

kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi ekspresi protein

caspase 8 pada sel alveolar makrofag ada pada kelompok yang memperoleh

ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 750mg/Kgbb yaitu 109,43

(gambar 5.7).

Ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus


menggunakan imunohistokimia. Ekspresi protein caspase 8 dikatakan positif jika

sitoplasma sel alveolar makrofag berwarna coklat, sedangkan ekspresi protein



79

caspase 8 negatif apabila sitoplasma sel alveolar tidak berwarna (gambar 5.8).

Pada gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan


Centella asiatica 750mg/KgBB menunjukkan jumlah sel alveolar makrofag

dengan ekspresi protein caspase 8 positif yang tinggi.

0

20

40

60

80

100

120


57.06

109.43

100.3

37.1

Rer

ata

eksp

resi

pro

tein

cas

pas

e8

Gambar 5.7 Rerata ekspresi enzim Caspase-8 positif dari sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.



80

Tabel 5.3 Perhitungan statistik ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

Kelompok x SD Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 57 a 18,3 38,6 87,6 750mg/Kgbb 107,2 b 16,3 87,4 121,8 1500mg/Kgbb 100,3 b 38,4 42,4 153,4 Kontrol 36,1 a 15,3 20 64,6


Gambar 5.8 Ekspresi protein caspase-8 dari sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), kelompok kontrol (d) terhadap ekspresi caspase 8. Diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Sitoplasma sel yang berwarna coklat menunjukkan ekspresi protein Caspase positip (panah kuning) sedangkan yang tidak bewarna menunjukkan hasil negatip (panah merah).Ekspresi caspase 8 tertinggi ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/Kgbb. Pembesaran 400x.



81

Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas Kolmogorov Smirnov

dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal dan homogen. Setelah dilakukan

analisis varian dan dilanjutkan dengan multiple comparasion (α=0,05)

didapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok

dosis 375 mg/KgBB dengan kelompok dosis 750 mg/KgBB (p=0,003), antara

dosis 750 mg/kgBB dengan kelompok kontrol (p=0,000) dan antara dosis 1500

mg/KgBB dengan kontrol (p=0,001).


apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi


Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica apoptosis


Mycobacterium tuberculosis menunjukkan perbedaan antara kelompok

perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi apoptosis sel alveolar

makrofag ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella

asiatica dosis 750mg/Kgbb, yaitu 105,94 ( gambar 5.9).

Apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus diperiksa

dengan menggunakan pengecatan Tunnel assay. Pada pengecatan tersebut suatu

sel dikatakan mengalami apoptosis apabila sel tersebut mengalami fragmentasi

DNA. Sel alveolar makrofag yang menunjukkan apoptosis positif adalah sel

alveolar makrofag yang inti selnya berwarna kecoklatan (gambar 5.10). Pada

gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan




82

Centella asiatica 750mg/KgBB menunjukkan jumlah apoptosis sel alveolar

makrofag yang tinggi.

0

20

40

60

80

100

120


57.8

105.94

74.1

19.1

Rer

ata

apo

pto

sis

sel a

lveo

alr

mak

rofa

g

Gambar 5.9 Rerata apoptosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.



83

Tabel 5.4 Perhitungan statistik ekspresi protein apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 57,8 b 15,4 37,6 77,2 750mg/Kgbb 105,9 c 21,2 68,8 134 1500mg/Kgbb 74,1 b 17,1 52,8 97,4 Kontrol 19,1 a 18,6 4 44,6


Gambar 5.10 Apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), kelompok kontrol (d) terhadap apoptosis sel alveolar makrofag. Diperiksa dengan menggunakan Tunnel assay (Apoptag detection kit). Inti sel yang berwarna coklat menunjukkan hasil positip (panah kuning) sedangkan yang tidak bewarna menunjukkan hasil negatip (panah merah). Jumlah apoptosis tertinggi ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/KgBB Pembesaran 400x.



84





bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan dosis 750

mg/KgBB (p=0,000), kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kontrol

(p=0,005), dosis 750 mg/KgBB dengan dosis 1500 mg/KgBB (p=0,023),

dosis 750 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,000), dosis 1500 mg/KgBB dengan

kontrol (p=0,000).


jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar

makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis

Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica

terhadap ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar

makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis menunjukkan perbedaan antara kelompok perlakuan dengan

kelompok kontrol. Rerata tertinggi ekspresi antigen Mycobacterium

tuberculosis sel alveolar makrofag ada pada kelompok kontrol, yaitu 109

(gambar 5.11).

Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag

dari jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol

diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Ekspresi antigen



85

Mycobacterium tuberculosis dikatakan positif jika sitoplasma sel alveolar

makrofag berwarna coklat, sedangkan ekspresi antigen Mycobacterium

tuberculosis negatif apabila sitoplasma sel alveolar tidak berwarna (gambar

5.12). Pada gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan

dengan kelompok kontrol. Pada kelompok kontrol menunjukkan ekspresi

antigen Mycobacterium tuberculosis yang tinggi.

0

20

40

60

80

100

120


91.57

54.27

92.7

109

Jum

lah

eks

pre

si a

nti

gen

M

.tu

ber

culo

sis

Gambar 5.11. Rerata ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikusyang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.



86

Gambar 5.12 Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis dari sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), dan kelompok kontrol (d) terhadap ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis. Diperiksa dengan imunohistokimia. Sitoplasma sel yang berwarna coklat menunjukkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis positip (panah kuning) sedangkan yang tidak bewarna menunjukkan hasil negatip (panah merah). Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis tinggi pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/Kgbb. Pembesaran 400x.



87

Tabel 5.5 Perhitungan statistik ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 91,5 a b 25,1 67,4 139,8 750mg/Kgbb 52,5 b 42,9 14,6 144,8 1500mg/Kgbb 92,7 a b 33,5 62,4 141,4 Kontrol 109 a 20,6 74,8 133,8


Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas One Sample




bermakna antara kelompok dosis 750 mg/KgBB dengan kelompok kontrol

(p=0,021).


jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/g) dari jaringan paru tikus yang

diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.


jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/g) jaringan paru tikus yang diinfeksi

dengan Mycobacterium tuberculosis pada media 7H10 terdapat perbedaan

antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Rerata jumlah Mycobacterium

tuberculosis (CFU/g) terendah pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol

herba Centella asiatica pada dosis 750 mg/KgBB dan 1500 mg/KgBB, yaitu

tidak terdapat pertumbuhan koloni (ganbar 5.13).



88

Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis dari jaringan paru

pada media Midllebrook 7H10 nampak bentukan bulat, kecil dan berwarna putih

kekuningan. Koloni tersebut dilakukan pewarnaan dengan pewarna Ziehl

Neelsen nampak bentukan batang soliter, berkelompok, dan bentuk huruf Y yang

bewarna merah. Bentukan tersebut merupakan bakteri tahan asam

Mycobacterium tuberculosis (gambar 5.14).

0

50

100

150

200

250

300

350


110.4

0 0

326.4

Rer

ata

jum

lah

M.t

ub

ercu

losi

s C

FU/m

l

Gambar 5.13. Rerata jumlah Mycobacterium tuberculosis CFU/ml/gram dari jaringan paru tikus. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.

Gambar 5.14 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis pada media MidlleBrook 7H10 (panah hitam)(a), Mycobacterium tuberculosis dari hasil kultur dilakukan pengecatan dengan Ziehl Neelsen. Mycobacterium tuberculosis ditunjukkan dengan panah hitam (b).

a b



89

Tabel 5.6 Perhitungan statistik jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml/gram) jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

Kelompok x SD Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 110,4 a 35,7 76,2 181,8 750mg/Kgbb 0 b 0 0 0 1500mg/Kgbb 0 b c 0 0 0 Kontrol 326 d 111,2 161,9 473,7



Kolmogorov Smirnov dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal tetapi

tidak homogen. Setelah dilakukan uji independent t-test, didapatkan hasil

bahwa terdapat perbedann yang bermakna antara kelompok dosis 375

mg/KgBB dengan kontrol (p=0,000), dosis 750 mg/KgBB dengan kontrol

(p=0,000), dosis 1500 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,000), dosis 375

mg/KgBB dengan dosis 750 mg/KgBB (p=0,000), dosis 375 mg/KgBB dengan

dosis 1500 mg/KgBB (p=0,000).


kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.


kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

berdasarkan 4 paramater histopatologi dari Dormans. Peribronkiolitis terjadi

pada semua kelompok baik pada kelompok perlakuan maupun kelompok

kontrol. Gambaran peribronkiolitis ringan (skor 1) yaitu terdapat infiltrasi sel



90

makrofag pada bronkiolus dengan ketebalan < 5 µm, terjadi pada kelompok

perlakuan yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 750

mg/KgBB (gambar 5.15 b). Sedangkan, peribronkiolitis yang paling berat

dengan skor 5 terjadi pada kelompok kontrol (gambar 5.15 d). Pada kelompok

yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB dan

1500 mg/KgBB, gambaran peribronkiolitis adalah sedang dengan skor 3

(gambar 5.15 a & c).

Gambar 5.15. Peribronkiolitis. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap terjadinya peribronkiolitis (panah hitam) pada dosis 375 mg/Kgbb dengan skor 3(a), 750mg/Kgbb dengan skor 1 (b), 1500mg/Kgbb dengan skor 3(c), dan kelompok kontrol dengan skor 5(d). Pengecatan Hematoxylin Eosin. Pembesaran 400x (a,b,c), 200x (d).

a

c d

b



91

Tabel 5.7 Perhitungan statistik peribronkiolitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

Dosis Median Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 2 a 2 5 750mg/Kgbb 2 a 1 5 1500mg/Kgbb 3 a 2 5 Kontrol 3 a 2 5


Setelah dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis dan dilanjutkan

dengan Mann-WhitneyU ternyata tidak terdapat perbedaan yang bermakna

antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol.

Perivaskulitis yang terjadi pada kelompok yang mendapat ekstrak

etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB dan 1500 mg/KgBB adalah

ringan (skor 2) yaitu terdapat infiltrasi sel makrofag di sekitar pembuluh darah.

Pada kelompok dengan dosis ekstrak 750 mg/KgBB perivaskulitis yang terjadi

adalah minimal (skor 1) yaitu hanya terdapat infiltrasi sel radang

polimorfonuklear. Pada kelompok kontrol perivaskulitis yang terjadi adalah

jelas yaitu infiltrasi sel makrofag pada pembuluh darah ketebalannya lebih dari

10 µm dan terjadi kerusakan dinding pembuluh darah (skor 5) (gambar 5.16).



92

Tabel 5.8 Perhitungan statistik perivaskulitis jaringan paru tikus antara

kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Dosis Median Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 2 a b 1 2 750mg/Kgbb 1 a 1 2 1500mg/Kgbb 2 b c 2 3 Kontrol 3,5 c 3 5


Gambar 5.16 Perivaskulitis. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap perivaskulitis (panah hitam) pada dosis 375 mg/Kgbb dengan skor 2(a), 750mg/Kgbb dengan skor 1 (b), 1500mg/Kgbb dengan skor 2(c). Kelompok yang tidak memperoleh terapi adalah kelompok kontrol dengan skor 5(d). Pengecatan Hematoxylin eosin. Pembesaran 400x (a,b,c), 200x (d).

a

c d

b



93


dengan Mann-Whitney U ternyata terdapat perbedaan yang bermakna antara

kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,027) dan 750 mg/KgBB

dengan kontrol (p=0,012) Dosis 750 mg/KgBB juga berbeda bermakna dengan

dosis 1500 mg/KgBB (p=0,025).

Alveolitis yang terjadi pada jaringan paru tikus kelompok 1 pada dosis

ekstrak 375 mg/KgBB, 750 mg/KgBB dan 1500 mg/KgBB adalah ringan

(skor2) yaitu terdapat infiltrasi sel mononuklear pada dinding alveoli. Pada

kelompok kontrol alveolitis yang terjadi adalah jelas yaitu infiltrasi sel

makrofag pada alveoli, ketebalannya lebih dari 10 um (skor 4) (gambar 5.17).

Tabel 5.9 Perhitungan statistik alveolitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

Dosis Median Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 2 a 2 4 750mg/Kgbb 3 a 2 5 1500mg/Kgbb 3 a b 2 5 Kontrol 4 b 3 5

Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna



kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kelompok kontrol (p=0,01), dosis 750

mg/KgBB dengan kontrol (p=0,033).



94

Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap pembentukan

granuloma pada jaringan paru tikus menunjukkan perbedaan kelompok

perlakuan dan kelompok kontrol. Pada pemberian ekstrak dengan dosis 375

mg/KgBB, 750 mg/KgBB, dan 1500 mg/KgBB menunjukkan skor 1,

sedangkan pada kelompok kontrol skor 3 (gambar 5.20).

Gambar 5.17 Alveolitis. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap alveolitis (panah hitam) pada dosis 375 mg/Kgbb dengan skor 2(a), 750mg/Kgbb dengan skor 2 (b), 1500mg/Kgbb dengan skor 2(c). Kelompok yang tidak memperoleh terapi adalah kelompok kontrol dengan skor 4 (d). Pengecatan Hematoxylin eosin. Pembesaran 400x (a,c,d), 200x (b).

a

c

b

d



95

Tabel 5.10 Perhitungan statistik pembentukan granuloma jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok Median Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 0 a 0 1 750mg/Kgbb 0 a 0 1 1500mg/Kgbb 0 a 0 1 Kontrol 2 a 0 3


Gambar 5.18 Granuloma. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap granuloma (panah hitam) pada dosis 375 mg/Kgbb dengan skor 1(a), 750mg/Kgbb dengan skor 1 (b), 1500mg/Kgbb dengan skor 1(c). Kelompok yang tidak memperoleh terapi adalah kelompok kontrol dengan skor 3(d). Pengecatan Hematoxylin eosin. Pembesaran 400x (c), 200x (a,b,d).

a b

c d



96

Setelah dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis dan dilanjutkan dengan

Mann-Whitney U ternyata tidak terdapat perbedaan yang bermakna.

Jumlah total skor Dormans antara kelompok perlakuan dan kelompok

kontrol ditampilkan dalam bentuk tabel 5.11.

Tabel 5.11 Perhitungan statistik jumlah total skor Dormans kerusakan jaringan paru tikus

Kelompok Median Minimum Maksimum 375mg/Kgbb 8 a 5 11 750mg/Kgbb 7 a 6 9 1500mg/Kgbb 8,5 a 7 12 Kontrol 12,5 b 9 17

Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna



kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,006), dosis 750 mg/KgBB

dengan kontrol (p=0,004), dosis 1500 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,043).

Untuk mengetahui adanya korelasi antara pemberian ekstrak etanol

herba Centella asiatica dengan ekspresi protein Bcl 2, Bax, caspase 8,

apoptosis dan jumlah Mycobacterium tuberculosis maka dilakukan analisis

statistik yaitu analisis jalur. Analisis tersebut juga bertujuan untuk mengetahui

hubungan antar variabel.

Berdasarkan analisis jalur, ekstrak etanol herba Centella asiatica

secara signifikan menurunkan ekspresi protein Bcl2 sel alveolar makrofag

(p=0,044), meningkatkan ekspresi protein Bax secara bermakna (p=0,001),

dan meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 (p=0,000). Peningkatan ekspresi

protein Caspase 8 secara signifikan mempengaruhi peningkatan ekspresi

protein Bax (p=0,000) dan peningkatan apoptosis sel alveolar makrofag



97

(p=0,000). Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel

alveolar makrofag (p=0,000) sehingga menyebabkan penurunan jumlah

Mycobacterium tuberculosis (p=0,000).

Gambar 5.19. Skema analisis jalur

Hasil uji korelasi Spearmans antara jumlah Mycobacterium tuberculosis

(CFU/g) dengan kerusakan jaringan adalah bermakna (p=0,038). Hal ini

menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang kuat antara penurunan jumlah

Mycobacterium tuberculosis dengan penurunan kerusakan jaringan paru tikus.

DOSIS

CAS8

BAX

BCL2

APOP CFU

-.39

-.59

.66 .60

-.03 -.70

e1

e2

e3 e6

e4

e5 -.22

1.00



98

BAB 6

PEMBAHASAN

Karakteristik bakteri patogen di dalam tubuh manusia dan hewan adalah untuk

menemukan tempat replikasi yang cocok di dalam tubuh inang, dimana bakteri

tersebut dapat berkembang biak. Setiap bakteri mempunyai sifat yang spesifik yang

berbeda antara satu bakteri dengan bakteri lainnya, sebagai usaha untuk

mempertahankan hidup dan menimbulkan infeksi pada inang. Berbagai usaha tersebut

adalah memanipulasi respons imun, menghindari sistem pengenalan dan menghambat

proses apoptosis. Kemampuan bakteri patogen untuk menghambat apoptosis

makrofag pada sel inang selama infeksi merupakan masalah utama pada studi

patogenesis bakteri (Faherty et al., 2008).

Apoptosis adalah suatu proses kematian sel terpogram yang terjadi secara

teratur untuk menghilangkan berbagai sel yang tidak diperlukan tanpa respons

inflamasi (Geweis, 2003). Apoptosis terjadi secara normal selama masa

perkembangan dan penuaan. Mekanisme tersebut merupakan mekanisme homeostasis

untuk menjaga dan memelihara populasi sel di dalam jaringan. Apoptosis juga

berfungsi sebagai mekanisme pertahanan seperti pada reaksi imun atau ketika sel

rusak karena suatu penyakit atau agen toksik. Karakteristik apoptosis adalah

terjadinya fragmentasi DNA, kondensasi kromatin, pengerutan sitoplasma dan sel

akan mati tanpa lisis sehingga tidak merusak sel atau jaringan sekitarnya (Geweis,

2003; Elmore, 2007).

Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri penyebab tuberkulosis. Bakteri

tersebut merupakan parasit fakultatif intraseluler di dalam makrofag yang mempunyai

kemampuan untuk memanipulasi respons imun inang pada makrofag, sehingga



99

makrofag merupakan tempat yang sesuai untuk berkembang biak (Kornfeld et al.,

1999).

Studi terbaru menunjukkan bahwa kemampuan Mycobacterium tuberculosis

menghambat apoptosis makrofag merupakan faktor yang mempengaruhi virulensi,

karena hambatan pada proses apoptosis menyebabkan Mycobacterium tuberculosis

dapat hidup dan berreplikasi di dalam makrofag (Faherty et al., 2009; Rudel et al.,

2010; Behar et al., 2010). Hal ini merupakan dasar untuk menemukan bahan obat

yang dapat digunakan sebagai imunoterapi untuk memperbaiki terapi tuberkulosis

yang sudah ada. Imunoterapi tersebut diharapkan mampu menimbulkan

imunostimulasi yang sesuai sehingga menginduki apoptosis sel makrofag dan

membunuh Mycobacterium tuberculosis di dalam sel makrofag serta mencegah

kerusakan jaringan yang lebih luas.

6.1. Ekstraksi dan Identifikasi herba Centella asiatica

Hasil identifikasi ekstrak etanol herba Centella asiatica yang

menggunakan metode kromatografi lapis tipis dengan penampak noda

anisaldehide-asam sulfat dan eluen kombinasi dari n-hexana dengan etil asetat

menunjukkan bahwa terdapat 3 noda berwarna merah ungu. Warna noda tersebut

menunjukkan bahwa ekstrak etanol Centella asiatica mempunyai kandungan

senyawa terpenoid. Apabila noda tersebut dilihat dibawah sinar uv dengan

panjang gelombang 365 nm, ketiga noda warna ungu tersebut mempunyai tiga

warna yang berbeda yaitu biru terang, oranye gelap dan oranye terang. Hasil ini

mempunyai kesamaan dengan penelitian tentang profiling analisis dari ekstrak

etanol Centella asiatica yang memperlihatkan adanya senyawa aktif golongan

terpenoid yang ditunjukkan dengan adanya warna biru terang adalah senyawa



100

asiatic acid, oranye gelap adalah madecassoside dan oranye terang adalah

asiaticoside (Zainol et al., 2008: James et al., 2011).

6.2. Model Infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis pada Tikus

Pada penelitian ini tikus digunakan sebagai model untuk infeksi oleh

Mycobacterium tuberculosis. Tikus secara umum sering digunakan sebagai

model untuk penelitian penyakit tuberkulosis, terutama untuk menemukan obat

baru. Pemilihan ini disebabkan karena infeksi tuberkulosis pada tikus

menghasilkan respons imun yang cepat dan spesifik yang mempunyai korelasi

dengan respons imun pada manusia (Gupta et al., 2005; Singhal et al., 2011).

Hewan coba tikus telah dibuktikan memiliki progresifitas perjalanan penyakit

tuberkulosis yang menyerupai manusia dan mampu memberikan gambaran

histopatologik akibat infeksi tuberkulosis yang mewakili infeksi pada manusia.

Selain itu tikus memiliki kemiripin pada dasar fisiologis, metabolik, anatomi,

respons imun dengan manusia (Gupta et al., 2005; Gaonkar et al., 2010).

Terdapat berbagai macam cara untuk melakukan infeksi Mycobacterium

tuberculosis pada hewan coba yaitu aerosol, intranasal, intraperitoneal dan

intratrakeal. Aerosol adalah cara infeksi Mycobacterium tuberculosis pada hewan

coba yang paling mendekati cara alami bakteri tersebut menginfeksi manusia

(Gaonkar et al., 2010). Kelemahan pada cara tersebut terletak pada alat khusus

yang digunakan serta standart laboratorium Biosafety level 3 (BSL3). Infeksi

Mycobacterium tuberculosis pada hewan coba bisa dilakukan melalui intranasal,

yaitu dengan cara larutan kuman diinokulasikan lewat nares eksternal dengan

mikropipet. Hasil dari cara infeksi ini juga mampu menilai pertumbuhan bakteri

dan sel inflamasi pada mencit (Saunders et al., 1996). Kelemahan cara intranasal



101

ini kurang efektif dibandingkan dengan cara intratrakea karena harus melalui

saluran napas atas sehingga dimungkinkan bakteri akan bertempat di faring

maupun laring. Selain itu penempatan bakteri pada mukosa nasal akan

merangsang mukosa dan menimbulkan refleks bersin karena bakteri merupakan

benda asing. Akibat refleks tersebut sebagian bakteri akan terbuang ke luar dan

yang masuk ke dalam jaringan paru berkurang.

Pada penelitian ini, menggunakan cara infeksi Mycobacteriun tuberculosis

dengan menggunakan cara intratrakea karena cara tersebut paling aman

digunakan baik bagi peneliti maupun bagi lingkungan. Cara intratrakeal ini juga

sudah dibuktikan mampu menimbulkan infeksi dan kelainan histopatologik pada

jaringan paru tikus dan dapat menilai pertumbuhan koloni kuman (Sugawara et

al., 2004; Dormans et al., 2004; Rodrigues et al., 2009; Gil et al., 2010; Singhal

et al., 2011).

Hasil infeksi Mycobacteriun tuberculosis pada tikus menunjukkan adanya

kerusakn jaringan paru berupa peribronkiolitis, perivaskulitis, alveolitis dan

pembentukan granuloma. Peribronkiolitis yang terjadi menunjukkan adanya

infiltrasi sel radang yang didominasi oleh makrofag pada dinding bronkioli

dengan ketebalan 5-10um. Perivaskulitis yang terjadi menunjukkan adanya

infiltrasi sel radang terutama polimorfonuklear pada dinding vaskuler. Alveolitis

pada penelitian ini menggambarkan infiltrasi sel radang polimorfonuklear dan

makrofag pada dinding alveoli, sedangkan granula yang terbentuk masih sedikit.

Pada fase ini banyak ditemukan sel radang polimorfonuklear yang menunjukkan

bahwa tingkat kerusakan jaringan adalah minimal dan juga bisa menunjukkan

bahwa ini merupakan fase awal infeksi tuberkulosis. Hasil penelitian ini sesuai

dengan penelitian tentang infeksi tuberkulosis bahwa pada awal infeksi



102

morfologi lesi di jaringan paru tikus yang disebabkan oleh Mycobacterium

tuberculosis menunjukkan gambaran infiltrasi sel radang yang didominasi sel

polimorfonulear (Sugawara et al., 2004; Dormans et al., 2004; Basaraba, 2008).

Hasil kultur jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium

tuberculosis pada kelompok ini menunjukkan adanya pertumbuhan koloni

Mycobacterium tuberculosis pada jaringan paru tikus. Berdasarkan hasil tersebut

menunjukkan bahwa pada minggu ke-4 setelah infeksi oleh Mycobacterium

tuberculosis, tikus sudah mengalami infeksi tuberkulosis.

6.3. Efek Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica terhadap Ekspresi Protein

Bcl-2 Sel Alveolar Makrofag dari Jaringan Taru tikus yang diinfeksi


Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba Centella

asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag di jaringan

paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Ekstrak etanol

herba Centella asiatica tidak secara linier menurunkan ekspresi protein Bcl-2

sel alveolar makrofag jaringan paru tikus seiring dengan peningkatan dosis yang

diberikan. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375

mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500 mg/KgBb memberikan perbedaan yang

signifikan pada penurunan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag

bila dibandingkan dengan kontrol, tetapi diantara ketiga dosis tersebut tidak

memberikan perbedaan yang bermakna.

Pada kelompok kontrol dari penelitian ini, yaitu tikus yang diinfeksi

dengan Mycobacterium tuberculosis tanpa diberi ekstrak etanol herba Centella

asiatica, menunjukkan bahwa ekspresi protein Bcl-2 2,5 kali lebih tinggi bila



103

dibandingkan dengan kelompok yang memperoleh ekstrak. Hasil ekspresi bcl2

sel alveolar makrofag pada penelitian ini memang tidak dibandingkan dengan

tikus normal. Pada penelitian ini menunjukkan adanya peningkatan ekspresi

Bcl2 sel alveolar makrofag sebesar 65 % apabila dibandingkan antara rerata

ekspresi Bcl2 sel alveolar makrofag pada infeksi tuberkulosis hari ke-28 dengan

hari ke-42. Hasil ini sejalan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Adolfo,

2006 tentang patogenesis infeksi tuberkulosis pada tikus, bahwa Mycobacterium

tuberculosis mempunyai kemampuan untuk meningkatkan ekspresi protein Bcl-

2 pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus. Pada penelitian tersebut

menunjukkan bahwa ekspresi protein Bcl2 pada sel alveolar makrofag

meningkat dari 12,5% pada hari pertama setelah infeksi dengan H37Rv menjadi

32 % pada hari ke-28 setelah infeksi.

Efek terapi dari suatu obat merupakan hasil interaksi antara obat tersebut

dengan molekul di dalam tubuh. Sebagian besar obat akan bekerja melalui

hubungan dengan makromolekul yang spesifik dan mempengaruhi aktivitas

biokimia atau biofisik dari makromolekul tersebut. Makromolekul tersebut

dikenal dengan istilah zat penerima atau reseptor. Definisi dari reseptor yaitu

suatu komponen di dalam sel atau organisme yang berinteraksi dengan obat dan

memulai reaksi biokimia yang berantai yang menghasilkan efek terapi (Bourne,

1998). Interaksi tersebut mengubah reseptor sehingga reseptor berfungsi untuk

meneruskan sinyal ke dalam sel melalui perubahan permeabilitas membran,

pembentukan second messenger atau mempengaruhi transkripsi gen (Ross et al.,

1985). Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica ini kemungkinan disebabkan

karena adanya interaksi antara bahan aktif yang ada di dalam ekstrak etanol



104

herba Centella asiatica dengan reseptornya tetapi hal ini masih memerlukan

penelitian lebih lanjut.

Salah satu kandungan bahan aktif ekstrak etanol Centella asiatica adalah

asiatic acid. Bahan tersebut diduga mempunyai peranan yang penting untuk

menurunkan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag di jaringan paru

tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Pada penelitian yang

telah dilakukan oleh Hsu et al., 2005, melaporkan bahwa asiatic acid yang

diisolasi dari Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 yang

diidentifikasi dengan menggunakan Westren blotting pada apoptosis sel kanker.

Pada penelitian ini menggunakan ekstrak etanol herba Centella asiatica yang

didalamnya terdapat berbagai macam bahan aktif seperti asiaticoside, asiatic

acid dan madecaside acid yang memungkinkan bahan aktif selain asiatic acid

dapat menyebabkan penurunan ekspresi protein Bcl-2.

Bcl-2 adalah sebuah onkogen anggota dari keluarga protein Bcl yang

mempunyai fungsi untuk menghambat proses apoptosis dan peningkatan protein

Bcl-2 mempunyai peranan yang sangat penting pada hambatan apoptosis sel

makrofag oleh Mycobacterium tuberculosis (Mogga et al., 2002). Salah satu

kemungkinan mekanisme Mycobacterium tuberculosis untuk meningkatkan

ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag adalah melalui peningkatan

sekresi sitokin interleukin-10 (Mustafa et al., 2000; Mogga et al., 2002). Pada

infeksi Mycobacterium tuberculosis, bakteri tersebut mempunyai kemampuan

untuk menghambat respons imun seluler dari makrofag dengan meningkatkan

sekresi IL-10 yang dapat dihambat oleh sitokin IFN-γ (Kornfeld et al., 1999).

Mustika dkk, 2009, melaporkan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica

meningkatkan sekresi sitokin IFN-γ pada sel kultur makrofag yang diinfeksi



105

dengan Mycobacterium tuberculosis. Hasil menunjukkan bahwa mekanisme

kerja ekstrak etanol herba Centella asiatica dalam menurunkan ekspresi protein

Bcl-2 pada sel alveolar makrofag adalah dengan meningkatkan sekresi sitokin

IFN-γ sehingga dapat menghambat sekresi IL-10.

Protein Bcl-2 bekerja untuk menghambat proses apoptosis melalui

hambatan kompetitif terhadap aktivasi protein Bax. Jumlah protein Bcl-2 yang

berlebihan akan berikatan dengan protein dari keluarga Bcl yang hanya

mempunyai domain BH3. Ikatan tersebut menyebabkan protein Bax tidak dapat

berikatan dengan protein BH3, sehingga protein Bax tidak teraktivasi. Hal ini

menyebabkan hambatan pada proses apoptosis sedangkan apabila jumlah

protein Bcl-2 sedikit, maka protein pro apoptosis Bax mempunyai kesempatan

lebih besar untuk berikatan dengan protein BH3 dan ikatan ini merupakan

inisiasi awal dari proses apoptosis (Shore et al., 2008)

Protein BH3-only adalah protein yang mempunyai fungsi untuk menerima

rangsangan yang berasal dari luar sel seperti obat atau radiasi. Rangsangan

tersebut menyebabkan protein BH3-only aktif dan bekerja secara langsung untuk

membebaskan ikatan antara protein Bax dengan Bcl-2 dan menurunkan ekspresi

Bcl-2 (Marzo et al., 2008). Kemampuan protein BH3-only ini mulai

dimanfaatkan sebagai target kerja obat untuk meningkatkan apoptosis (Adams et

al., 2007). Berdasarkan fakta tersebut, maka kemungkinan ekstrak etanol

Centella asiatica mempunyai kemampuan untuk merangsang protein BH3-only

sehingga menurunkan ekspresi protein Bcl-2.



106


Bax Sel Alveolar Makrofag dari Jaringan Paru Tikus yang diinfeksi


Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada penelitian ini

meningkatkan ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag dari jaringan

paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis secara bermakna

dibandingkan dengan kontrol. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis

375 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb pada ekspresi protein Bax pada sel alveolar

makrofag tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol,

sedangkan dosis 750 mg/Kgbb ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag

meningkat secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan

dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dari dosis 375

mg/KgBb ke 750 mg/KgBb menyebabkan peningkatan ekspresi protein Bax,

tetapi pemberian ekstrak pada dosis 1500mg/KgBb menyebabkan ekspresi

protein Bax pada sel alveolar makrofag menurun. Hal ini dapat dijelaskan

bahwa pada pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375

mg/KgBB, efek yang ditimbulkannya belum mencapai dosis terapeutik yang

dibutuhkan untuk meningkatkan ekspresi protein Bax sedangkan pada dosis

1500mg/KgBB kemungkinan telah terjadi down regulation atau desensitisasi

reseptor. Jadi dosis efektif ekstrak etanol herba Centella asiatica untuk

meningkatkan ekspresi protein Bax adalah 750 mg/KgBb.

Efek terapeutik suatu bahan obat selain ditentukan oleh afinitas, yaitu

kemampuan obat untuk berikatan dengan reseptor juga ditentukan oleh efikasi,

yaitu kemampuan obat yang terikat untuk mengubah konformasi reseptor

sehingga reseptor menjadi aktif dan meneruskan sinyal transduksi ke dalam sel.



107

Pada dosis obat yang cukup tinggi, kemungkinan terjadi desensitisasi reseptor

sehingga efikasi obat tersebut menurun (Ross et al., 1985). Sedangkan down

regulation adalah suatu keadaan dimana jumlah total reseptor di permukaan sel

menurun (Bourne, 1998).

Salah satu kandungan ekstrak etanol herba Centella asiatica yaitu asiatic

acid mempunyai peranan penting pada peningkatan ekspresi protein Bax pada

sel alveolar makrofag. Hal ini berdasarkan pada penelitan tentang asiatic acid

dapat meningkatkan apoptosis sel kanker payudara melalui peningkatan

ekspresi protein Bax (Hsu et al., 2005). Demikian juga dengan penelitian yang

dilakukan oleh Park et al., 2005, asiatic acid meningkatkan apoptosis sel

melanoma melalui peningkatan ekspresi protein Bax. Hasil ini konsisten dengan

efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada peningkatan ekspresi protein

Bcl-2. Kedua protein tersebut adalah anggota dari keluarga protein Bcl yang

mempunyai peranan penting pada proses apoptosis melalui jalur mitokondria.

Hasil analisis jalur menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol herba

Centella asiatica mempunyai korelasi yang kuat dengan penurunan ekspresi

protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag dan peningkatan ekspresi protein Bax

pada sel alveolar makrofag. Analisis jalur pada Protein Bax dan Bcl-2

menunjukkan bahwa korelasi antara kedua protein tersebut dengan apoptosis

lemah artinya kedua protein tersebut tidak secara langsung meningkatkan

apoptosis sel alveolar makrofag tetapi melalui jalur yang lain yang tidak diteliti

pada penelitian ini. Hasil ini dapat dijelaskan, bahwa interaksi yang terjadi

diantara keluarga protein Bcl, yaitu antara protein proapoptotik (Bax) dan

protein antiapoptotik (Bcl-2) memberikan kontribusi yang cukup besar pada

induksi apoptosis, bukan sekedar jumlahnya yang meningkat atau menurun.



108

Hasil dari interaksi berbagai protein tersebut adalah untuk mengatur

permeabilitas membran mitokondria yang hasil akhirnya adalah keputusan

suatu sel untuk tetap hidup atau mengalami apoptosis (Yao et al., 2009).

Pada keadaan normal, tanpa ada rangsangan, protein Bax berada di

sitosol sel dalam keadaan inert. Stimulus yang sesuai menyebabkan perubahan

struktur protein sehingga protein Bax tersebut melakukan insersi pada target

membran, yaitu membran luar mitokondria dan retikulum endoplasmik. Pada

membran mitokondria, protein Bax mengalami perubahan konformasi dan

berinteraksi dengan protein proapoptosis lainnya yaitu protein tBid, Bim dan

Puma. Interaksi antara protein Bax dengan salah satu dari protein tBid, Bim dan

Puma terjadi pada domain BH3 dan memicu perubahan bertingkat dari protein

Bax dan fase ini merupakan tahap awal dari proses apoptosis melalui jalur

instrinsik (Shore et al., 2008; Marzo et al., 2008).

Protein BH3-only adalah protein yang mempunyai fungsi untuk menerima

rangsangan yang berasal dari luar sel seperti obat atau radiasi. Rangsangan

tersebut menyebabkan protein BH3-only aktif dan bekerja secara langsung untuk

membebaskan ikatan antara protein Bax dengan Bcl-2 dan menurunkan ekspresi

Bcl-2 (Marzo et al., 2008). Stimulus dari luar yaitu bahan obat, iradiasi maupun

stres mempunyai kemampuan untuk mempengaruhi interaksi antara protein

proapoptosis dengan protein antiapoptosis (Geweis, 2003). Pada penelitian ini,

peneliti memberikan stimulus dari luar, berupa ekstrak etanol herba Centella

asiatica dan ekstrak tersebut mempunyai kemampuan untuk meningkatkan

ekspresi protein Bax melalui aktivasi terhadap protein BH3 only.



109


Caspase-8 Sel Alveolar Makrofag dari Jaringan Paru Tikus yang diinfeksi


Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica secara bermakna

meningkatkan ekspresi protein caspase-8 pada sel alveolar makrofag dari

jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.

Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dengan

dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier

meningkatkan ekspresi protein caspase 8 pada sel alveolar makrofag, karena

hanya dosis 750 mg/KgBb yang dapat meningkatkan ekspresi caspase-8 secara

bermakna. Hal ini dapat dijelaskan bahwa pada pemberian ekstrak etanol herba

Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB, efek yang ditimbulkannya belum

mencapai dosis terapi yang dibutuhkan untuk meningkatkan ekspresi protein

caspase-8, sedangkan pada dosis 1500mg/KgBB kemungkinan sudah terjadi

down regulation atau desensitisasi reseptor (Ross et al., 1985: Bourne, 1998).

Caspase-8 adalah enzim yang berada di dalam sel yang bentuknya tidak

aktif yaitu procaspase-8. Aktivasi procaspase-8 menjadi caspase-8 terjadi melalui

jalur ekstrinsik yang melibatkan sinyal transduksi death receptor. Death receptor

tersebut akan berikatan dengan ligan yang sesuai untuk membentuk sebuah death

domain, yang mempunyai peranan utama dalam meneruskan sinyal kematian dari

permukaan sel ke intraseluler. Death domain yang berhasil diidentifikasi antara

lain FasL/FasR, TNF-α/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 dan Apo2L/DR5

(Elmore, 2007; Karger, 2010).

Aktivasi procaspase-8 menjadi caspase-8 pada penelitian ini, karena

ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan interaksi antara ligan TNF-



110

α dengan reseptor transmembran TNFR1. Fakta ini juga didukung oleh sebuah

penelitian tentang efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada kultur

makrofag. Pada penelitian tersebut membuktikan bahwa pemberian ekstrak

etanol herba Centella asiatica meningkatkan kadar TNF-α (Punturee et al., 2004;

Mustika dkk, 2009). Peningkatan kadar TNF-α menyebabkan ikatan antara ligan

TNF-α dengan reseptornya yaitu TNFR1 untuk membentuk death domain di

dalam sitoplasma sel. Death domain bersama dengan death effector domains

membentuk sebuah protein adaptor yaitu TNF receptor-associated death domain

(TRADD). Bagian dari komplek tersebut, yaitu death effector domains akan

berikatan dengan procaspase-8 membentuk suatu komplek yang disebut dengan

death-inducing signaling complex (DISC). Komplek DISC menyebabkan aktivasi

procaspase-8 secara autolitik menjadi caspase-8. Ketika caspase-8 diaktifkan,

maka akan memicu terjadinya apoptosis sel alveolar makrofag (Geweis, 2003;

Elmore, 2007).

Mycobacterium tuberculosis mempunyai kemampuan untuk

meningkatkan sekresi protein TNFR2 yang dapat menyebabkan ikatan yang

inaktif antara TNF-α dengan TNFR2, sehingga TNF-α tidak bisa berikatan

dengan TNFR1 dan membentuk death domain (Balcewicz-Sablinka, 1998;

Fratazzi et al., 1999; Fairbain, 2004). Peningkatan sekresi TNFR2 terjadi karena

induksi dari sitokin IL-10, sehingga hambatan pada IL-10 akan menurunkan

sekresi TNFR2 (Fratazzi et al., 1999; Mustafa et al., 2007).

Centella asiatica meningkatkan sekresi sitokin IFN-γ pada sel kultur

makrofag yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis, yang menghambat sekresi

IL-10 dan menurunkan sekresi TNFR2 sehingga meningkatkan aktivitas caspase



111

8 yang dapat menginduksi apoptosis melalui jalur ekstrinsik (Mustika dkk,

2009).

Hasil analisis jalur menunjukkan bahwa mekanisme kerja caspase 8 selain

meningkatkan apoptosis juga meningkatkan ekspresi protein Bax pada jalur

instrinsik. Hal ini menunjukkan adanya komunikasi antara jalur ekstrinsik dan

jalur instrinsik pada apoptosis.

6.6. Efek Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica terhadap Apoptosis sel

Alveolar Makrofag dari Jaringan Paru Tikus yang diinfeksi dengan


Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan

apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi

Mycobacterium tuberculosis secara bermakna bila dibandingkan dengan

kontrol. Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang


secara linier meningkatan apoptosis sel alveolar makrofag, tetapi dosis 750

mg/KgBb memberikan peningkatan apoptosis yang tertinggi. Hal ini dapat

dijelaskan bahwa pada pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis

375 mg/KgBB, efek yang ditimbulkannya belum mencapai dosis terapeutik

yang dibutuhkan untuk meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag

sedangkan pada dosis 1500mg/KgBB kemungkinan sudah terjadi desensitisasi

reseptor atau down regulation. Metode yang digunakan untuk pemeriksaan

apoptosis makrofag pada penelitian ini adalah pengecatan imunohistokimia

dengan menggunakan pewarnaan terminal dUTP nick end labeling (TUNEL)

Assay. Metode ini dipilih karena mampu mendeteksi fragmentasi DNA sebagai



112

salah satu ciri apoptosis (Elmore, 2007). Prinsip kerja TUNEL assay adalah

menyambung ujung 3-OH dari fragmen DNA dengan oligomer yang

merupakan rangkaian nukleotida trifosfat yang diberi label secara acak dengan

digoxigenin. Pemberian label secara acak tersebut bertujuan untuk memicu

ikatan antara digoxygenin dan antidigoxygenin secara optimal. Reaksi ini

memerlukan enzim katalisator yaitu enzim terminal deoxynucleotidyl

transferase (TDT). Digoxygenin mengikat antidigoxygenin peroxydase

conjugate yang mengikat diamino benzidine (DAB) substrat sehingga bewarna

coklat. Metode ini menyebabkan sel yang mengalami apoptosis dapat

ditemukan walau belum terjadi perubahan morfologis dan mudah dibedakan

dengan sel yang tidak mengalami apoptosis (D’herde et al., 2003; Elmore,

2007).

Setiap sel akan merespons semua stres atau stimulus yang diterimanya

melalui berbagai macam cara baik melalui aktivasi sinyal kehidupan sampai

inisiasi kematian sel. Tujuan dari proses tersebut adalah untuk menjaga

homeostasis, sehingga sel yang tidak diperlukan akan dieliminasi. Mekanisme

tersebut tergantung pada berbagai macam faktor eksogen dan kemampuan sel

untuk mengatasi stres atau stimulus (Samali et al., 2010). Pada penelitian ini,

stimulus yang diberikan berupa bahan alam yaitu ekstrak etanol herba Centella

asiatica, bahan tersebut menunjukkan peningkatan apoptosis sel alveolar

marofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis. Penelitian oleh Bunpo et al., 2004 dan Babbykutty, 2009

membuktikan bahwa ekstrak tumbuhan tersebut meningkatkan apoptosis sel

kanker usus dan sel kanker payudara. Senyawa aktif dari ekstrak etanol herba

Centella asiatica yang diduga meningkatkan apoptosis adalah asiatic acid



113

karena asiatic acid yang diisolasi dari herba Centella asiatica juga terbukti

meningkatkan apoptosis sel kanker payudara (Hsu et al, 2004).

Hasil analisis menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang kuat antara

pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dengan peningkatan ekspresi

protein caspase 8 dan terdapat korelasi yang kuat pula antara peningatan

ekspresi caspase 8 dengan apoptosis sel alveolar makrofag. Hal ini

membuktikan bahwa mekanisme peningkatan apoptosis oleh ekstrak etanol

herba Centella asiatica melalui jalur ekstrinsik.

6.7. Efek Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica terhadap Ekspresi Antigen

Mycobacterium tuberculosis Sel Alveolar Makrofag dari Jaringan Paru

Tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba

Centella asiatica menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel

alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium

tuberculosis. Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang


secara linier menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel

alveolar makrofag, tetapi dosis 750 mg/KgBb menurunkan ekspresi antigen

Mycobacterium tuberculosis yang paling rendah. Hal ini dapat dijelaskan bahwa

pada pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB, efek

yang ditimbulkannya belum mencapai dosis terapeutik yang dibutuhkan untuk

menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag

sedangkan pada dosis 1500mg/KgBB kemungkinan sudah terjadi down

regulation.



114

Antibodi primer yang digunakan pada penelitian ini adalah antibodi

terhadap antigen spesifik Mycobacterium tuberculosis, sehingga yang terdeteksi

pada pengecatan imunohistokimia ini adalah antigen dari bakteri tersebut, baik

bakteri tersebut hidup ataupun sudah mati.

Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi antigen

Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang

diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis, diduga melalui proses apoptosis

makrofag dan efek antibakteri terhadap Mycobacterium tuberculosis. Kedua

mekanisme tersebut menyebabkan jumlah Mycobacterium tuberculosis di dalam

jaringan paru menurun sehingga antigen yang dapat dideteksi juga menurun.

6.8. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan jumlah

Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) dari jaringan paru tikus yang

diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

Penelitian ini menunjukkan penurunan jumlah Mycobacterium

tuberculosis yang signifikan akibat pemberian ekstrak etanol herba Centella

asiatica terutama pada dosis 750 mg/kgBB dan 1500mg/KgBB.

Mekanisme ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap penurunan

jumlah Mycobacterium tuberculosis yang hidup di jaringan paru tikus,

kemungkinan disebabkan karena proses apoptosis makrofag dan efek antibakteri

terhadap Mycobacterium tuberculosis. Pada proses apoptosis Mycobacterium

tuberculosis yang mati akan didegradasi menjadi beberapa fragmen di dalam

abadan apoptotik, selanjutnya akan melalui proses eferositosis. Eferositosis

adalah suatu mekanisme dimana badan apoptotik akan difagositosis oleh sel

fagosit terdekat (Behar et al, 2010). Proses eferositosis merupakan proses yang



115

melibatkan berbagai sinyal transduksi yang dikenal dengan eat me atau find me

(Lee et al., 2009; Rudel et al., 2010).

Mekanisme kematian Mycobacterium tuberculosis pada proses apoptosis

dapat disebabkan karena dua proses yaitu: melalui peningkatan Nitrik Oksida

atau melalui proses fusi fagosom menjadi fagolisosom (Molloy et al., 1994;

Herbs et al., 2011).

NO dapat membunuh Mycobacterium tuberculosis intrasel melalui

berbagai mekanisme yaitu: secara langsung pada DNA bakteri, mempengaruhi

metabolisme tembaga, target virulensi dari mikobakterial atau berfungsi sebagai

pembawa pesan kedua (Shiloh et al., 2000; Nathan, 2003; Axelrod et al., 2008;

Yang et al., 2009). Selain itu, Nitrik oksida (NO) diketahui mempunyai

kemampuan untuk menginduksi apoptosis pada makrofag dan produksi NO

diinduksi oleh IFN-γ melalui peningkatan ekspresi Nitric oxide synthetase 2

(NOS2) (Brune et al., 1997). Pada penelitian yang dilakukan oleh Herbs, 2011,

menunjukkan bahwa NO yang diinduksi oleh IFN-γ meningkatkan apoptosis

makrofag yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis dan membunuh

bakteri tersebut. Pada penelitian terdahulu ditunjukkan bahwa ekstrak etanol

herba Centella asiatica meningkatkan produksi IFN-γ sehingga diduga

mekanisme kematian Mycobacterium tuberculosis intrasel disebabkan ekstrak

etanol herba Centella asiatica yang juga meningkatkan produksi NO (Mustika et

al., 2009; Punturee et al., 2004). Pada proses apoptosis diduga mempunyai

hubungan dengan perubahan aristektur dari sistem vesikular inang sehingga

menyebabkan fusi antara fagosom dan lisosom yang sebelumnya dihambat oleh

Mycobacterium tuberculosis (Molloy et al., 1994; Grassme et al., 2001; Labbe

et al., 2008).



116

Ekstrak etanol herba Centella asiatica mempunyai efek antibakteri

menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis H37Rv secara in vitro

(Mustika, 2009). Penelitian oleh Gitawati dkk, juga membuktikan bahwa ekstrak

etanol herba Centella asiatica menghambat pertumbuhan Mycobacterium

tuberculosis H 37 Rv multiresisten. Beberapa studi mengungkapkan, aktivitas

antibakteri dari tanaman tersebut terutama disebabkan oleh kandungan glikosida

triterpenoid yaitu asiaticoside (Dutta et al., 1967; Ramaswamy et al., 1970;

Bisignano et al., 1999). Hal ini disebabkan karena senyawa tersebut

berpengaruh pada permeabilitas membran sel. Peningkatan permeabilitas

membran sel menyebabkan cairan elektrolit dari ekstraseluler masuk ke

intraseluler, akibatnya sel akan terdegradasi menjadi beberapa fragmen (Zhang

et al., 2005).

Berdasarkan analisis jalur, terdapat korelasi yang kuat antara pemberian

ekstrak herba Centella asiatica dengan apoptosis sel alveolar makrofag dan

jumlah Mycobacterium tuberculosis di dalam jaringan paru tikus yang diinfeksi

Mycobacterium tuberculosis. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak herba

Centella asiatica menurunkan jumlah bakteri di dalam jaringan paru melalui

mekanisme apoptosis sel alveolar makrofag. Jadi mekanisme kerja ekstrak

etanol herba Centella asiatica dalam menurunkan jumlah Mycobacterium

tuberculosis di jaringan paru tikus melalui peningkatan apoptosis sel alveolar

makrofag dan anti bakteri.



117

6.9. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap kerusakan jaringan

paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan

jaringan paru tikus secara signifikan terutama pada perivaskulitis, alveolitis dan

pembentukan granuloma. Pada kelompok kontrol dimana tikus tidak mendapat

ekstrak, kerusakan jaringan berdasarkan skor dormans yaitu peribronkiolitis,

perivaskulitis, alveolitis dan granuloma adalah sedang sampai berat.Parameter

peribronkiolitis tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna antara kelompok

yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dengan kelompok yang

tidak memperoleh ekstrak. Hal ini disebabkan karena cara infeksi tikus oleh

Mycobacterium tuberculosis adalah melalui intratrakea. Hal ini berarti bakteri

akan melalui bronkus terlebih dahulu sebelum melakukan invasi ke jaringan

paru. Keberadaan Mycobacterium tuberculosis pada bronkus menyebabkan

respons imun tubuh melakukan perlawanan dengan memobilisasi sel radang

(reaksi inflamasi). Mobilisasi sel radang tersebut bertujuan untuk mencegah

Mycobacterium tuberculosis invasi ke dalam jaringan paru. Proses inflamasi ini

menyebabkan kerusakan pada bronkioli.

Granuloma merupakan respons utama dari stadium kronik infeksi

Mycobacterium tuberculosis yang memperlihatkan respons dari sistem imun

untuk melokalisir multiplikasi dan penyebaran lanjut dari bakteri tersebut ke sel

dan organ lain (Ordway et al., 2005). Pada kelompok yang tidak mendapat

ekstrak, infiltrasi sel radang sudah didominasi oleh sel alveolar makrofag dan

mulai merusak jaringan parenkim paru. Pada kelompok ini semua hewan coba

menunjukkan bentukan granuloma dengan gambaran khas sel datia Laghans.



118

Gambaran ini menunjukkan adanya infeksi kronis tuberkulosis pada tikus

(Pando et al., 1998).

Gambaran histopatologis jaringan paru ini berbeda dengan kelompok

praperlakuan, menujukkan lesi yang memiliki karakteristik infiltrasi sel radang

mononuklear yang didominasi makrofag. Infiltrasi ini mulai dari daerah

peribronkial, perivaskular, daerah interstitial alveoli. Pada kelompok ini sudah

mulai ada gambaran sel alveolar makrofag yang berkelompok dan hal ini

merupakan fase awal terbentuknya granuloma. Pada fase ini nampak banyak sel

polimorfonuklear pada infiltrasi sel radang. Hal ini menunjukkan bahwa pada

fase awal sel polimorfonuklear mempunyai peranan penting dalam mencegah

perkembangan tuberkulosis (Sugawara et al., 2004). Penilaian hasil infeksi

Mycobacterium tuberculosis pada tikus setelah 4 minggu, berdasarkan skor

Dormans adalah kerusakan jaringan paru pada tikus termasuk sedang, dimana

infiltrasi sel radang belum sepenuhnya didominasi oleh sel mononuklear dan

belum ditemukan kerusakan pada epitel bronkus maupun endotel pembuluh

darah. Struktur alveoli juga masih bagus, tidak ditemukan kerusakan pada septum

alveoli. Perbedaan kerusakan jaringan paru tikus pada kelompok infeksi

Mycobacterium tuberculosis setelah minggu ke-4 dan minggu ke-6 menunjukkan

adanya progresifitas perjalanan penyakit tuberkulosis pada tikus yang tidak diberi

terapi ekstrak etanol herba Centella asiatica.

Mekanisme kerja ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan

kerusakan jaringan disebabkan karena ekstrak tersebut meningkatkan apoptosis

sel alveolar makrofag dan mencegah terjadinya nekrosis. Proses apoptosis

menyebabkan bahan intraseluler tidak keluar ke jaringan ekstraseluler sehingga

enzim yang bersifat litik tidak dapat merusak jaringan sekitarnya. Disamping itu



119

apoptosis adalah suatu proses untuk melakukan eliminasi Mycobacterium

tuberculosis dengan reaksi inflamasi yang minimal (Rudel et al., 2010).

Kerusakan jaringan paru pada infeksi tuberkulosis juga disebabkan karena

Mycobacterium tuberculosis menginduksi ekspresi enzim matrix

metalloproteinase-1 (MMP-1) (Salgame, 2011). MMP-1 secara spesifik telah

ditunjukkan mempunyai kemampuan melakukan degradasi terhadap kolagen tipe

I yang menyebabkan kerusakan jaringan paru. Penelitian yang dilakukan pada

pasien tuberkulosis menunjukkan adanya peningkatan enzim MMP-1 dan

penurunan enzim tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMPs). Penelitian ini

juga diperkuat pada penelitian mencit yang diinfeksi oleh Mycobacterium

tuberculosis, menunjukkan adanya peningkatan enzin MMP-1 yang mempunyai

korelasi yang kuat dengan peningkatan kerusakan jaringan alveoli dan secara

signifikan terjadi peningkatan pemecahan kolagen (Elkington et al., 2011).

Berdasarkan hasil penelitian ini bahwa ekstrak etanol herba Centella

asiatica menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis di jaringan paru, maka

kemungkinan mekanisme penurunan kerusakan jaringan paru disebabkan karena

menurunnya sekresi MMP-1 sehingga tidak terjadi pemecahan kolagen. Resolusi

jaringan paru bisa disebabkan karena ekstrak etanol herba Centella asiatica yang

mengandung bahan aktif asiaticoside diduga mempunyai kemampuan untuk

meningkatkan sintesis kolagen (Maquart et al., 1999; Coldren et al., 2003;Lee et

al., 2006;Dyatmiko dkk, 2009; Hashim et al., 2011).

Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan

dari dosis terkecil 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara

linier menurunkan kerusakan jaringan paru.



120

Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat diperkirakan bahwa dosis optimum

efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada mekanisme apoptosis sel

alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis adalah dosis 750 mg/KgBB. Efek terapeutik suatu obat tergantung

pada interaksi antara bahan aktif suatu obat dengan reseptor yang spesifik. Ikatan

tersebut menyebabkan perubahan konformasi reseptor sehingga memicu respons

sel. Respons sel ditentukan oleh afinitas dan efikasi antara bahan aktif dengan

reseptornya. Afinitas adalah ukuran kemampuan obat untuk berikatan dengan

reseptor, sedangkan afinitas adalah kemampuan obat terikat untuk mengubah

reseptor sehingga memberikan efek. Suatu bahan aktif bisa mempunyai afinitas

tetapi tidak menunjukkan efikasi. Bahan aktif yang dimiliki oleh ekstrak etanol

herba Centella asiatica pada dosis 375 mg/kgBB kemungkinan mempunyai

afinitas yang rendah sehingga belum bisa memberikan efek farmakologis yang

maksimum. Pada dosis 1500 mg/Kg, bahan aktif dari ekstrak etanol herba

Centella asiatica mengalami desensitisasi reseptor, yaitu mempunyai efikasi

yang rendah sehingga efek terapeutik yang diberikannya juga belum optimum.

Kemungkinan lain adalah terjadi down regulation yaitu jumlah reseptor pada

permukaan sel menurun.

6.10. Temuan baru

Pada penelitian ini membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella

asiatica memiliki bahan aktif yang meningkatkan kemampuan sel makrofag

sebagai bagian dari sistem imunitas, melalui peningkatan apoptosis sel alveolar

makrofag pada tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.



121

Mekanisme kerja ekstrak etanol herba Centella asiatica dalam

meningkatkan apoptosis adalah melalui jalur ekstrinsik dan instrinsik, dimana

kedua jalur tersebut saling berkomunikasi melalui protein caspase 8 dengan

protein Bax.

Fungsi imunostimulan dari ekstrak etanol herba Centella asiatica

merupakan reaksi berantai dalam berbagai tahap sampai terjadi kematian dari

Mycobacterium tuberculosis dan perbaikan jaringan paru.

Hasil penelitian ini juga membuktikan bahwa induksi pada mekanisme

apoptosis merupakan faktor esensial untuk mengatasi masalah penyakit infeksi

terutama infeksi oleh bakteri intraseluler.



122

BAB 7

PENUTUP

7.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian, maka dapat disimpulkan sebagai berikut

bahwa Ekstrak etanol Centella asiatica :

1. Menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru

tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum

adalah 750 mg/KgBb.

2. Meningkatkan ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag pada jaringan paru

tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum

adalah 750 mg/KgBb.

3. Meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag pada jaringan

paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum

adalah 750 mg/KgBb.

4. Meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang

diinfeksi Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum adalah 750 mg/KgBb.

5. Menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis pada sel alveolar

makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis,

dosis optimum adalah 750 mg/KgBb.

6. Menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis(CFU/ml) pada jaringan

paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum adalah

750 mg/KgBb dan 1500 mg/KgBb.

7. Menurunkan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis, pada dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb, dan 1500 mg/KgBb.



123

7.2. Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk

1. Uji ekstrak etanol herba Centella asiatica pada Mycobacterium tuberculosis

yang resisten, wild type atau isolat klinik.

2. Uji klinik ekstrak etanol herba Centella asiatica sebagai terapi pendamping

pada penderita infeksi tuberculosis.

3. Pengaruh ekstrak etanol herba Centella asiatica pada enzim matrix

metalloproteinase-1, tissue inhibitor of metalloproteinase dan kolagen.

4. Senyawa aktif dalam Centella asiatica yang dapat digunakan sebagai senyawa

marker antituberkulosis untuk menyaring bahan alam lain yang memiliki

peluang sebagai anti tuberkulosis.

5. Pengaruh ekstrak etanol herba Centella asiatica pada apoptosis sel neutrofil,

sel stroma dan limfosit.



124

DAFTAR PUSTAKA

Abebe M, Kim L, Rook G, Aseffa A, Wassie L, Zewdie M, Zumla A, Engers H, Andersen P, Doherty T M, 2011. Modulation of cell death by M. tuberculosis as a strategy for pathogen survival. Clin Develop Immunol: 1-11.

Adams JM, Cory S, 2007. A Bcl-2 regulated apoptosis: mechanism and therapeutic

potential. Curr Opin Immunol 19: 488-496. Adolfo Ro-BVc, Victoria C-Pa, Diana A-Ln, Ricardo LL, Antonio M-RoM, Jos M,

Victor F-G, Rogelio Hn-P, 2006. Macrophage and T lymphocyte apoptosis during experimental pulmonary tuberculosis: their relationship to mycobacterial virulence. Eur J Immunol 36: 345-353.

Aditama TY, 2006. Extreme drug resistane tuberuculosis (XDR-TB). J Tuberkulosis

Indonesia 3 (2): 20-23. Anthony A, Santhakumari G, Merina B, Sheeba V, Mukkadan J, 2006.

Hepatoprotektif effect of Centella asiatica (L) in carbon tetrahchloride-induced liver injury in rats. Ind J Pharm Sci 68 (6): 772-776.

Axelrod S, Oschkinat H, Enders J, Schlegel B, Brinkmann V, 2008. Delay of

phagosome maturation by a mycobacterial lipid is reversed by nitric oxide. Cell Microbiol 10: 1530–1545.

Babykutty S, Padikkala J, Sathiadevan PP, Vijayakurup V, Thasni Azis, KA Srinivas,

P, Gopala S, 2009. Apoptosis induction of Centella asiatica on human breast. Afr J TCAM 6 (1): 9-16.

Bailey LH, 1953. The standard cyclopedia of horticultura. Jilid 1.3. Balcewicz-Sablinska MK, Keane J, Kornfeld H, Remold HG, 1998. Phatogenic

Mycobacterium tuberculosis evades apoptosis of host macrophages by release of TNF-R2, resulting in inactivation of TNF-α. J Immunol 161: 2636-2641.

Barera L, 2007. The basics of clinical bacteriology. In Tuberculosis 2007. Editor

Palomino. ebook. Barnes PF, 2003. Immunotherapy for tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med

168:142-143. Basaraba R J, 2008. Experimental tuberculosis: the role of comparative pathology in

the discovery of improvement tuberculosis treatment strategies. Tuberculosis 88 (1): S35-47.

Behar SM, Divangahi M, Remold HG, 2010. Evasion of innate immunity by

Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy?. Nature 8: 668-74.



125

Bhatt K, Salgane P, 2007. Host innate immune response to Mycobacterium tuberculosis. J Clin Immunol 27 (4): 347-362.

Bordbar A, Lewis N E, Schellenberger J, Ø Palsson B, Jamshidi N, 2011. Insight into

human alveolar macrophage and M. tuberculosis interactions via metabolic reconstructions. Mol Sys Biol 6: 422.

Bourne HR, 1998. Drug receptor and pharmacodynamics. In Basic and clinical

pharmacology. Edisi 7th . editor Betram G Katzung. A Simon & Schuster company. 9-34.

Brenner D, Mak TW, 2009. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol

21: 871-877. Brune B, Gotz C, Messmer UK, Sandau K, Hirvonen MR, 1997. Superoxide

formation and macrophage resistance to nitric oxide-mediated apoptosis. J Biol Chem 272: 7253–7258.

Bunpo K, Kataoka K, Arimochi H, Nakayama H, Uwahara T, Bando T, Vinetetkumnuen U, Ohnishi Y, 2004. Inhibitory effects of Centella asiatica on azoxymethane-induced aberrant crypt focus formation and carcinogenesis in the intestines of F344 rats. Food Chem Toxicol 42: 1987-97.

Bunpo K, Kataoka K, Arimochi H, Nakayama H, Uwahara T, Bando T, Vinetetkumnuen U, Ohnishi Y, 2005. Inhibitory effects of Asiatic acid on CPT-cells on growth cells HT-29. J Med Invest 52: 65-73.

Bunyaphrapatsara N, Padua LS, Lemmens RHMJ, 1999. Plant resources of south-east

asia no 12(1). Bogor Indonesia: 190-194. Cardona PJ, Llatjós R, Gordillo S, Díaz J, Ojanguren I, Ariza A, 2000. Evolution of

granulomas in lungs of mice infected aerogenically with Mycobacterium tuberculosis. Scand J Immunol 52: 156-163.

Chan X, Xing Y, Magliozzo RS, Bloom BR, 1992. Killing of virulent Mycobacterium

tuberculosis by reactive nitrogen intermediates produced by activated macrophages. J Exp Med 175: 1111-12.

Chen Li, Shi W, Li H, Sun X, Fan X, LeSage G, Li H, Li Y, Zhang Y, Zhang X,

Zhang Y, Yin D, 2010. Critical role of Toll-Like Receptor 9 in Morphine and Mycobacterium tuberculosis-Induced Apoptosis in Mice. Plos One 5(2): e9205.

Chen M, Gan H, Remold H G, 2006. A mechanism of virulence: virulent

Mycobacterium tuberculosis Strain H37Rv, but not attenuated H37Ra, causes mitochondrial Inner membrane disruption in macrophages leading to necrosis. J Immunol 176:3707-3716.

Cho MK, Sung MA, Kim SD, Park HG, Jew SS, Kim SG, 2003. 2-Oxo-3,23-

isopropylidene-asiatate (AS2006A), a wound-healing asiatic derivative, exerts



126

anti-inflammatory effect by apoptosis of macrophages. Int Immunopharmacol 3(11):1429-1437.

Coldren CD, Hashim P, Ali JM, Oh S, Sinskey AJ, Rha C, 2003. Gene expression

Changes in the Human Fibroblast Induced by Centella asiatica Triterpenoids. Planta Med 69: 725-732.

Cullen S, Martin SJ, 2009. Caspase activation pathways: some recent progress. Cell

Death Differ 16: 935-38. Danelishvili L, Yamazaki Y, Selker J, Bermudez LE, 2010. Secreted Mycobacterium

tuberculosis Rv3654c and Rv3655c Proteins Participate in the Suppression of Macrophage Apoptosis. PLoS ONE 5(5): e10474.

Daniel TM, 2004. The history of tuberculosis. Respir Med 100: 1862-70. Dash P, 2009. Apoptosis. Basic Medical sciences, St.george’s, University of London. D’Herde K, Mussche S, Roberg K, 2003. Morphological changes in dying cell in cell

proliferation & apoptosis. Hughes D and Mehmet H (Eds). Ed 1st.Trowbridge.The Cromwell pres.p: 202-231.

Djatmiko W, 2009. Pengembangan dan Pemanfaatan tanaman Obat Indonesia

menjadi produk fitofarmaka dengan tekhnologi fitosom untuk Terapi Tuberkulosis. Laporan akhir Program Hibah Kompetitif Penelitian Unggulan Strategis Nasional tahun anggran 2009.

Dormans J, Burger M, Aguilar D, Hernandez-Pando R, Kremer K, Roholl P, S. M.

Arend S M, Van Soolingen D, 2004. Correlation of virulence, lung pathology, bacterial load and delayed type hypersensitivity responses after infection with different Mycobacterium tuberculosis genotypes in a BALB/c mouse model. Clin Exp Immunol 137: 460–468.

Edward, 2010. IL-32 Is a host protective cytokine against Mycobacterium

tuberculosis in differentiated THP-1 human macrophages. J Immunol 184: 3810-40.

Elkington P, Shiomi T, Breen R, Nuttal RK, Upgarte-Gill CA, Walke NF, Saraiva L,

Pederson B, Mauri F, Lipman M, Edwards DR, Robertson BD, D”Armiento J, Friedland JS, 2011. MMP-1 drives immunopathology in human tuberculosis and transgenic mice. J Clin Immunol 121 (5): 1827-1833.

Elmore S, 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 35:

495-516. Faherty CS, Maurelli AT, 2008. Staying alive: bacterial inhibition of apoptosis during

infection. Trend in Microbiol 16(4): 173-179. Fairbain IP, 2004. Macrophage apoptosis in host immunity to mycobacterial

infections. Biochem societ trans 32(4): 496-498.



127

Fatmasari AR, Immaculata I, 2007. Efek Imunostimulasi Ekstrak Air Herba Pegagan

(Centella asiatica Urb) dan Daun Beluntas (Pluchea indica Less.) pada Mencit Swiss Webster Betina. Skripsi Sekolah farmasi ITB. http://bahan-alam.fa.itb.ac.id. Diunduh pada tanggal 17 April 2008.

Fels AO, Cohn ZA, 1986. The Alveolar macrophages. J App Phys 60(2). 353-369.

Forbes B, Sahn D, Weissfield AS, 2007. Diagnostic Microbiology. St Louis, Missouri. Mosby Elsevier: 843-859.

Fratazzi C, Arbeit R D, Carini C, Balcewicz-Sablinska M K, Keane J, Kornfeld H,

Remold H G, 1999. Macrophage apoptosis in mycobacterial infection. J Leu Biol 66: 763-64.

Fulton SA, Cross JV, Toossi ZT, Boom VH, 1998. Regulation of IL-12 by IL-10,

TGF-β, TNF-α, and INF-γ in human monocytes infected with Mycobacterium tuberculosis H37Ra. J Infect Dis 178(4):1105-14.

Ganthina, Elin Y, Tintin G, 2004. Uji Aktivitas Ekstrak Beberapa Tumbuhan

terhadap Mycobacterium tuberculosis yang Sensitif dan Resisten terhadap Obat Antituberkulosis. Thesis Sekolah farmasi ITB. http://bahan-alam.fa.itb.ac.id. Diunduh tanggal 17 April 2008.

Gan H, Lee J, Ren F, Chen, Kornfeld H, Remold H, 2008. Mycobacterioum

tuberculosis blocks crosslinking of annexin-1 and apoptotic envelope f ormation on infected macrohages to maintain virulence. Nat Immunol 9(10): 1189-1197.

Gaonkar S, Balasubramanian V, Sowmya B, Radha KS, Naveen K 2010. Aerosol

infection model of tuberculosis in Wistar Rats. Int J Microbiol: 1-6. Geijtenbeek TB, Van VSJ, Koppel EA, 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to

suppress dendrintic cell function. J Exp Med 197: 7-17. Geweis Andreas, 2003. Introduction to apoptosis. Aporeview: 1-26. Gil O, Diaz I, Vilaplana C, Tapia G, Diaz J, Fort M, Caceres N, Pinto S, Cayla J,

Corner L, Domingo M, Cardona P, 2010. Granuloma encapsulation is a key factor containing tuberculosis infection in minipigs. Plos one 5(4): e10030.

Gitawati R, Astuti Y, Winarno W, 2005. Herba pegagan (Centella asiatica L): Studi

pendahuluan efek anti mikobakterium secara invitro. Jurnal bahan Alam Indonesia 4(2): 286-291.

Grassme H, jendrossek V, Gulbins E, 2001. Molecular mechanism of bacteria-

induced apoptosis. Apoptosis 6: 441-445. Grimaldi R, De Ponti F, D’angelo L, Caravaggi M, Guidi G, Lechhini S, Frigo GM,

Crema A, 1990. Pharmacokinetics of the total triterpenic fraction of Centella



http://bahan-alam.fa.itb.ac.id/




128

asiatica after single and multiple administration to healthy volunteers. A New Assay for Asiatic acid. J Ethnopharmacol 28: 235-41.

Gupta UD, Katoch VM, 2005. Animal models of tuberculosis. Tuberculosis 85: 277-

93. Hashim P, Sidek H, Helan MHM, Sabery A, Palanisamy UD, Ilham M, 2011.

Triterpene composition and bioactivities of Centella asiatica. Mol 16: 1310-1322.

Herbst S, Schaible UE, Schneider BE, 2011. Interferon Gamma activated

macrophages kill mycobacterium by Nitric Oxide induced apoptosis. Plos One 6(5): e19105.

Hirsch CS, Johnson JL, Okwera A, Kanost RA, Mianda WU, Peters P, Muhumuza ,

Kizza HM, Mugerwa RD, Mugyenyi P, Ellner J,Tossi Z, 2005. Mechanisms of apoptosis of Tcells in human tuberculosis. J Clin Immunol 25(4): 353-364.

Hsu Ya-Ling,Kuo PL, Lin LT, Lin CC, 2005. Asiatic acid a triterpene induces

apoptosis and cell cycle arrest through activation of extracellular signal-regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase pathways in human breast cancer cells. J Pharmacol Exp Ther 313 (1): 333-344.

James J, Ian D, 2011. Identification and qualification of triterpenoid centelloids in

Centella asiatica (L.) urban by densitometric TLC. J Planar Chrom 24 (1): 82-7.

Junqueira-Kipnis AP, Kipnis A, Jamison A, 2003. NK cells respond to pulmonary

infection with Mycobacterium tuberculosis, but play a minimal role in protection. J Immunol 171: 6039-45.

Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, 2001. Subsets of human dendritic cell precursor

express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. J Exp Med 194; 863-9.

Kaufmann SHE, 2001. How can immunology contribute to the control of

tuberculosis? Nat Rev Immunol 1: 20-30. Kaufmann SHE, 2003. Immune response to tuberculosis: experimental animal

models. Tuberculosis 83: 107-11. Karger AG, B. 2010. Apoptosis, cell death and inflammation. J Innate Immun 2: 201-

203. Keane J, Sablinska MK, Remold HG, Chupp GL, Meek BB, Fenton MJ, Kornfeld H,

1997. Infection by Mycobacterium tuberculosis promotes human alveolar macrophage apoptosis. Infect Immun 65(1): 298-304.

Kornfeld H, Mancino G, Colizzi V, 1999. The role of macrophage cell death in

tuberculosis. Cell Death Diff 6: 71-78.



129

Kritszki A, 2007. Tuberculosis in adult. In Tuberculosis 2007. e-book: 487-500. Kumawat K, Pathak SK, Spetz A-L, Kundu M, Basu J, 2010. Exogenous Nef Is an

Inhibitor of Mycobacterium tuberculosis-induced Tumor Necrosis Factor- Production and Macrophage Apoptosis. J Biol Chem 285 (17): 12629–37.

Kusumawati D, 2004. Tehnik eksperimentasi. In Bersahabat dengan hewan coba. Ed

1.Yogyakarta. Gadjah Mada University Press: 102-110. Labbe K, Saleh M, 2008. Cell death in the host response to infection. Cell Death

Differ 15: 1339-1349. Lee YS, Jin D-Q, Kwon EJ, Park SH, Lee E-S, Jeong TC, Doo Hyun Nam, Huh K,

Kim J-A, 2002. Asiatic acid, a triterpene, induces apoptosis through intracellular Ca21 release and enhanced expression of p53 in HepG2 human hepatoma cells. Canc Lett 186: 83–91.

Lee J, Hartman M, Kornfeld H, 2009. Macrophage apoptosis in tuberculosis. Yonsei

Med J 50(1):1-11. Lohmann-Matthes ML, Steinmuller G, Franke-Ullmann, 1994. Pulmonary

Macrophages. Eur Respir J 7. 1678-1689. Lyu Su-Yun, Park WB, 2005. Production of cytokine and NO by Raw 264,7

macrophages and PBMC in vitro incubation with flavonoids. Arch Pharm Res 28 (5): 573-581.

Mamtha B, Kavitha K, Srinivasan K K, Shivananda PG, 2004. An in vitro study of the

effect of Centella asiatica on enteric phatogen. Ind J Pharmacol 36: 41-44.

Maquart FX, Chastang F, Simeon A, Birembaut P, Gillery P, Wegrowski Y, 1999. Triterpenes from Centella asiatica stimulate extracellular matrix accumulation in rat experimental wounds. Eur J Dermatol 9 (4): 289- 96

Marriot HM, Bingle CD, Read RC, Braley KE, Kroemer G, Hellewell PG, Craig RW, Whyte MKB, Dockrell DH, 2005. Dynamic changes in Mcl-1 expression regulate macrophage viability or commitment to apoptosis during bacterial clearance. J Clin Invest 115(2): 359-368.

Marzo I , Naval J, 2008. Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy.

Biochem pharm 76: 939-4 6. Maziar Divangahi, Danielle Desjardins, Cláudio Nunes-Alves HGR, Behar SM, 2010.

Eicosanoid pathways regulate adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis. Nat Immunol 11(8): 751-760.

Miller JL, Velmurugan K, Cowan MJ, Briken V, 2010. The Type I NADH

dehydrogenase of Mycobacterium tuberculosis counters phagosomal NOX2



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maquart%20FX%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chastang%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Simeon%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Birembaut%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gillery%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wegrowski%20Y%22%5BAuthor%5D

130

activity to inhibit TNF-α mediated host cell apoptosis. PLoS Pathog 6 (4): e100864.

Ming LJ , Yin ZD, 2006. Therapeutic DNA vaccines against tuberculosis: a promising

but arduous task. Chin Med J 119 (13): 1103-1107. Mustafa T, Phyu S, Bjune G, Jonsson R, Nilsen R, 2000. In situ expression of

cytokines and cellular phenotypes in the lungs of mice slowly progressive primary murine Mycobacterium tuberculosis infection. Scand J Immunol 51: 548-56.

Mustafa T, Bjune G, Jonsson R, Pando HR, Nilsen R, 2001. Increased expression of

fas ligand in human tuberculosis and leprosy lesions: A potential novel mechanism of immune evasion in Mycobacterial infection. Scand J Immunol 54,630-639.

Mustafa T, Wiker H G, Morkve O, Sviland L, 2007. Reduced apoptosis and increased

inflammatory cytokines in granulomas caused by tuberculosis compared to non-tuberculous mycobacteria: Role of MPT64 antigen in apoptosis and immune response. Clin Exp Immunol 150: 105-113.

Mustika A, Roostantia I, 2009. Efek ekstrak ethanol Centella asiatica L pada

produksi Interferon γ, tumor necrosis factor α, transforming growth factor β dan macrophages intracelluler killing Mycobacterium tuberculosis. Laporan Penelitian RisbinIptekdok.

Mogga SJ, Mustafa T, Sviland L, Nilsen R, 2002. Increased Bcl-2 and reduced Bax

expression in infected macrophages in slowly progressive primary murine Mycobacterium tuberculosis infection. Scand J Immunol 54: 383-391.

Molloy A, Laochumroonvorapong P, Kaplan G (1994). Apoptosis, but not necrosis, of infected monocytes is coupled with killing of intracellular bacillus Calmette-Guerin. J Exp Med 180: 1499–1509.

Nathan C, 2003. Specificity of a third kind: reactive oxygen and nitrogen intermediates in cell signaling. J Clin Invest 111: 769–778.

Ordway D, Henao-Tamayo M, Orme IM, Gonzalez-Juarrero M, 2005. Foamy

macrophages within lung granulomas of mice infected with Mycobacterium tuberculosis express molecules characteristic of dendritic cells and antiapoptotic markers of the TNF Receptor-Associated Factor Family. J Immunol 175: 3873-81.

Orme IM, 2003. The mouse as a useful model of tuberculosis. Tuberculosis 83: 112-

115. O’Sullivan MP, O’Leary S, Kelly DM, Keane J, 2007. A caspase-independent

pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun 75(4):1984-1993.



131

Othieno C, Hirsch CS, Hamilton BD, Wilkinson K, Ellner JJ, Toossi ZT, 1999. Interaction of Mycobacterium tuberculosis-induced TGF-beta 1 and IL-10. Infect Immun 67(11): 5730-5.

Pando Rogelio H,Salinos RC, Lopez JS, Estrada E, 2007. Immunology, phatogenesis,

virulence. In Tuberculosis 2007. Editors Juan Palomo:157-193. Pando RH, Panduro CA, Madrid-Marina V, Larriva-Sahd J, Orozco EH, Arriaga AK

1998. The response of hepatic acute phase proteins during experimental pulmonary tuberculosis. Exp Mol Pathol 65 (1): 25-36.

Park BC, Bosire K O, Lee E, Lee Y S, Kim J, 2005. Asiatic acid induces apoptosis in

SK-MEL-2 human melanoma cells. Canc Lett 218: 81-90. Park JS, Tamayo MH, Gonzalez-Juarrero M, Orme IM, Ordway DJ, 2006. Virulent

clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis grow rapidly and induce cellular necrosis but minimal apoptosis in murine macrophages. J Leu Biol 79: 80–86.

Park SH, Bendelac A, 2000. Progress CD1-restrictid T-cell responses and microbial

infection. Nature 409: 788-792. Pedroza-Gonzalez A, Garcia-Romo GS, Aguilar-Leon D, 2004. In situ analysis of

lung antigen-presenting cells during murine pulmonary infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. Int J Exp Pathol 85: 135-45.

Peters-Golden M, 2004. The Alveolar Macrophage : The forgotten cell in asthma. Am

J Respir Cell Mol Biol 31. 3-7. Peter CSW, Herrmann M, Lauber K, 2010. Dangerous attraction: phagocyte

recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis 15: 1007-28.

Punturee K, Wild CP, Vinitketkumneun, 2004. Thai medicinal plants modulate nitrit

oxide and tumor necrosis factor α in J 774, 2 mouse macrophages. J Ethnopharmacol 95.183-189.

Reviono, 2011. Pengaruh penambahan Clofazimine terhadap aktivasi INH pada

mencit yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis resisten INH Mutan KatG. Disertasi. Universitas Airlangga.

Rodrigues MF, Barsante MM, Alves CCS, Souza MA, Ferreira AP, Amarante-

Mendes GP, Teixeira HC, 2009. Apoptosis of macrophages during pulmonary Mycobacterium bovis infection: correlation with intracellular bacillary load and cytokine levels. Immunol 128: e691-e69

Rojas RE, Balaji KN, Subramanian A, Boom WH, 1999. Regulation of human cd4+

alphabeta Tcell receptor + and gammadelta TCR+ responsses to Mycobacterium tuberculosis by IL-10 and TGF beta. Infect Immun 67(12): 6461-72.



132

Ross E M, Gilaman A G, 1985. Pharmacodynamic. In The pharmacological Basis of

Therapeutics. Ed 7Th. Editor Goodman and Gilman. London. MacMilland Publishing company: 35-48.

Rudel T, Kepp O, Kozjak-Pavlovic V, 2010. Interactions between bacterial pathogens

and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev 8:693-705. Rubins JB, 2003. Alveolar Macrophages : Welding the double-edged sword of

inflammation. Am J Respir Crit Care Med 167. 103-104. Salgame Padmini, 2011. MMPs in tuberculosis: granuloma creators and tissue

destroyers. J Clin Invest 121(5): 1686-1688. Samali A, Fulda S, Adrienne MG, Osamu H, Srinivasula SM, 2010. Cell stress and

cell death. Int J Cell Biol:11-2 Sato K, Akaki T, Tomioka, 1998. Differential potentiation of anti-mycobacterial

activity and reactive nitrogen intermediate-producing ability of murine peritoneal macrophages activated by interferon-gamma (IFN-γ) and tumour necrosis factor-alpha (TNF-α). Clin Exp Immunol 112(1): 63–68.

Saunders BM, Cheers C, 1996. Intranasal infection of beige mice with

Mycobacterium avium complex: Role of neutrophils and natural killer cells. Infect Immun 64; 4236-4241.

Saunders BM, Britton WJ, 2007. Life and death in the granuloma: immunopathology

of tuberculosis. Immun Cell Biol 85: 103-111. Schaible UE, Winau F, Sieling PA, Fischer K, Collins HL, 2003. Apoptosis facilitates

antigen presentation to T lymphocytes through MHC-I and CD1 in tuberculosis. Nat Med 9: 1039–1046.

Shiloh MU, Nathan CF, 2000. Reactive nitrogen intermediates and the pathogenesis

of salmonella and mycobacteria. Curr Opin Microbiol 3: 35–42. Shin DM, Jo EK, Park JK, Hur GM, Choi HH, Kang G, Lee HM, Park JB, Song CH,

Lim YJ, Kim KH, 2010. Endoplasmic reticulum stress response is involved in Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6-mediated apoptosis. FEBS LETTERS 584(11): 2445-54.

Shore GC , Nguyen M , 2008. Bcl-2 Proteins and Apoptosis: Choose Your Partner.

Cell 135: 1004-7 Singhal A, Aliouat EM, Herve M, Mathys V, Kiass M, Creusy C, Delaire B, Tsenova

L, Fleurisse L, Bertout J, Camacho L, Foo D, Tay HC, Siew JY, Boukhouci W, Romano M, Mathema B, Dartois V, Kaplan G, Bifani P, 2011. Experimental tuberculosis in the Wistar Rat : A model for protective immunity and control of infection. Plos One 6(4):e18632.



133

Sly LM, Hingley-Wilson SM, Reiner NE, McMaster WR, 2003. Survival of Mycobacterium tuberculosis in host macrophages involves resistance to apoptosis dependent upon induction of antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1. J Immunol 170: 430–437.

Somashekar Shetty, S. L. Udupa, A. L. Udupa, S. N. Somayaji, 2006. Effect of

Centella asiatica L (Umbelliferae) on normal and dexamethasone-suppressed wound healing in Wistar Albino Rats. Int J low Extrem Wounds 5:137.

Sturgill-Koszycki S, Schlesinger PH, Chakraborty P, 1994. Lack of acidification in

Mycobacterium tuberculosis phagosome produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Sci 263: 678-81.

Sugawara I, Udagawa T, Yamada H, 2004. Rat neutrophils prevent the development

of tuberculosis. Infect Immun 72 (3): 1804-6. Suratman, Sumiwi SA, Gozali D,1996. Pengaruh ekstrak antanan dalam bentuk salep,

krim, jelly terhadap penyembuhan luka bakar.Cermin dunia kedokteran 108.31-36.

Tailleux L, Schwartz O, Hermann JL, 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium

tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197: 121-7. Tang X-L, Yang X-Y, Jung H-J, Kim S-Y, Jung S-Y, Choi D-Y, Park W-C, Park H

2009. Asiatic Acid induces colon cancer cell growth inhibition and apoptosis through mitochondrial ceath Cascade. Biol Pharm Bull 32 (8): 1399-405.

Taib Saleh WBM, 2000. Efek ekstrak methanol Centella asiatica sebagai

imunomodulator ajuvan pada perubahan beberapa variabel respons imun tikus putih. Disertasi. Universitas Airlangga Surabaya.

Toossi Z, Mincek M, Seeholtzer, Fulton SA, Hamilton BD, Hirsch Cs, 1997.

Modulation of IL-12 by transforming growth factor beta in Mycobacterium tuberculosis-infected mononuclear phagocytes and in patient with active tuberculosis. J Clin Lab Immunol 49(2):59-75.

Vankalayapati R, Wizel B, Weis SE, 2002. The NKp46 receptor contributes to NK

cell lysis of mononuclear phagocytes infected with an intracellular bacterium. J Immunol 168: 3451-7.

Vankalayapati R, Klucar P, Wizel B, 2004. NK cells regulate CD8+ T cell effector

function in response to an intracellular pathogen. J Immunol 172: 130-7. Velmurugan K, Chen B, Miller JL, Azogue S ,Gurses S, Hsu Tsungda, Glickman m,

Jacobs jr, Porcell SA, Briken V, 2007. Mycobacterium tuberculosis nuoG is a virulence gene that inhibits apoptosis of infected host cells. Plos Pathogens 3(7): 972-980.

Wang XS, Duan JY, Fang JN, 2004. Structural features of polysaccharide from

Centella asiatica. Chin chem let 15(2):187-190.



134

Worlh Health Organization, 2010. Who report 2010: global tuberculosis control. Wozniak TM, Ryan AA, Triccas JA, Britton WJ, 2006. Plasmid interleukin-23(IL-

23), but not plasmid IL-27, enhances the protective efficacy of a DNA vaccine against Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun 74: 557-65.

Yao Y , Marassi FM, 2009. BAX and BAK Caught in the Act. Mol Cell 36: 353-54. Yang CS, Yuk JM, Jo EK (2009) The role of nitric oxide in mycobacterial infections.

Immune Netw 9: 46–52. Zainol NA, Voo SC, R SM, Aziz RA, 2008. Profiling of Centella asiatica (L) urban

extract. Mal J Analyt Sci 12 (2): 322-7. Zhang J, Jiang R,Takayama H, Tanaka Y, 2005. Survival of virulent mycobacterium

tuberculosis involves preventing apoptosis induced by Bcl-2 upregulation and resulting from necrosis in J774 macrophages. Microbiol Immunol 49(9): 845-852.

Zhang S, Won YK, Ong C N, Shen H M, 2005. Anti cancer potential of sesquiterpene

lactones bioactivity and molecular mechanisms. Curr Med Chem Canc Agent 5(3):239-24.



135

Lampiran 1 Determinasi Centella



136

Lampiran 2 Ethical Clearance



137



138



139



139

Lampiran 5 Hasil uji statistik Uji Normalitas Uji normalitas untuk ekspresi protein Bcl2

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

BclD1 BclD2 BclD3 BclK

N 7 7 6 6

Normal Parametersa,,b Mean 29.7143 30.5286 33.8333 79.0667

Std. Deviation 9.71381 11.91396 25.70243 47.27158

Most Extreme Differences Absolute .278 .236 .300 .319

Positive .175 .236 .300 .319

Negative -.278 -.198 -.177 -.178

Kolmogorov-Smirnov Z .736 .625 .734 .781

Asymp. Sig. (2-tailed) .650 .830 .654 .576

a. Test distribution is Normal.

b. Calculated from data.

Uji normalitas untuk ekspresi protein Bax


Bax1 Bax2 Bax3 BaxK

N 7 7 6 6


Std. Deviation 19.59553 7.78521 34.11989 23.65432


Positive .188 .160 .333 .235

Negative -.183 -.135 -.256 -.169


Asymp. Sig. (2-tailed) .965 .994 .519 .896





140

Uji Normalitas untuk ekspresi caspase 8


CasD1 CasD2 CasD3 CasDK

N 7 7 6 6


Std. Deviation 18.31637 16.26366 38.37159 15.29950


Positive .250 .224 .147 .258

Negative -.159 -.251 -.162 -.178


Asymp. Sig. (2-tailed) .773 .769 .998 .819



Uji normalitas untuk apoptosis


ApopD1 ApopD2 ApopD3 ApopDk

N 7 7 6 6


Std. Deviation 15.35901 21.23165 17.06818 18.59061


Positive .122 .167 .149 .284

Negative -.159 -.225 -.161 -.211


Asymp. Sig. (2-tailed) .994 .869 .998 .720





141

Uji normalitas untuk ekspresi antigen M.tuberculosis


antigen1 antigen2 antigen3 antigenk

N 7 7 6 6


Std. Deviation 25.09335 42.90854 33.55894 20.63024


Positive .247 .331 .301 .118

Negative -.169 -.188 -.183 -.182


Asymp. Sig. (2-tailed) .785 .429 .648 .989



Uji normalitas untuk jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml/gram)


CFUD1 CFUD2 CFUD3 CFUDK

N 7 7 6 6

Normal Parametersa,,b Mean 110.3571 .0000 .0000 326.3667

Std. Deviation 35.71320 .00000c .00000c 111.21472

Most Extreme Differences Absolute .228 .113

Positive .228 .112

Negative -.169 -.113

Kolmogorov-Smirnov Z .604 .277

Asymp. Sig. (2-tailed) .859 1.000



c. The distribution has no variance for this variable. One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test cannot be

performed.



142

Analisis untuk Ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag

Test of Homogeneity of Variances CASPASE8

Levene Statistic df1 df2 Sig.

2.989 3 22 .053

ANOVA CASPASE8 Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 22392.896 3 7464.299 13.535 .000 Within Groups 12132.244 22 551.466

Total 34525.140 25

Multiple Comparisons CASPASE8 Tukey HSD

(I) DOSIS

(J) DOSIS

Mean Difference (I-

J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

.00 375.00 -20.92381 13.06490 .398 -57.2029 15.3553

750.00 -71.06667* 13.06490 .000 -107.3458 -34.7876

1500.00 -64.13333* 13.55809 .001 -101.7819 -26.4847

375.00 .00 20.92381 13.06490 .398 -15.3553 57.2029

750.00 -50.14286* 12.55235 .003 -84.9987 -15.2870

1500.00 -43.20952* 13.06490 .016 -79.4886 -6.9304

750.00 .00 71.06667* 13.06490 .000 34.7876 107.3458

375.00 50.14286* 12.55235 .003 15.2870 84.9987

1500.00 6.93333 13.06490 .951 -29.3458 43.2124

1500.00 .00 64.13333* 13.55809 .001 26.4847 101.7819

375.00 43.20952* 13.06490 .016 6.9304 79.4886

750.00 -6.93333 13.06490 .951 -43.2124 29.3458 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.



143

Analisis untuk ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag

Test of Homogeneity of Variances BAX


1.777 3 22 .181

ANOVA BAX Sum of

Squares Df Mean Square F Sig.


Total 22011.940 25

Multiple Comparisons BAX Tukey HSD

(I) DOSIS

(J) DOSIS

Mean Difference (I-

J) Std. Error Sig.



.00 375.00 1.71905 12.60104 .999 -33.2720 36.7101

750.00 -45.10952* 12.60104 .008 -80.1005 -10.1185

1500.00 .06667 13.07672 1.000 -36.2452 36.3786

375.00 .00 -1.71905 12.60104 .999 -36.7101 33.2720

750.00 -46.82857* 12.10669 .004 -80.4469 -13.2103

1500.00 -1.65238 12.60104 .999 -36.6434 33.3386

750.00 .00 45.10952* 12.60104 .008 10.1185 80.1005

375.00 46.82857* 12.10669 .004 13.2103 80.4469

1500.00 45.17619* 12.60104 .008 10.1852 80.1672

1500.00 .00 -.06667 13.07672 1.000 -36.3786 36.2452

375.00 1.65238 12.60104 .999 -33.3386 36.6434

750.00 -45.17619* 12.60104 .008 -80.1672 -10.1852 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.



144

Analisis untuk ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar

Test of Homogeneity of Variances BCL2


1.958 3 22 .150

ANOVA BCL2 Sum of



Total 26513.471 25

Multiple Comparisons BCL2 Tukey HSD

(I) DOSIS

(J) DOSIS

Mean Difference (I-

J) Std. Error Sig.



.00 375.00 49.35238* 14.95377 .016 7.8282 90.8766

750.00 48.53810* 14.95377 .018 7.0139 90.0623

1500.00 45.23333* 15.51826 .037 2.1417 88.3250

375.00 .00 -49.35238* 14.95377 .016 -90.8766 -7.8282

750.00 -.81429 14.36712 1.000 -40.7094 39.0808

1500.00 -4.11905 14.95377 .992 -45.6432 37.4051

750.00 .00 -48.53810* 14.95377 .018 -90.0623 -7.0139

375.00 .81429 14.36712 1.000 -39.0808 40.7094

1500.00 -3.30476 14.95377 .996 -44.8289 38.2194

1500.00 .00 -45.23333* 15.51826 .037 -88.3250 -2.1417

375.00 4.11905 14.95377 .992 -37.4051 45.6432

750.00 3.30476 14.95377 .996 -38.2194 44.8289 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.



145

Analisis untuk apoptosis sel alveolar makrofag

Test of Homogeneity of Variances APOPTOSIS


.263 3 22 .851

ANOVA APOPTOSIS Sum of



Total 32512.154 25

Multiple Comparisons APOPTOSIS Tukey HSD

(I) DOSIS

(J) DOSIS

Mean Difference (I-

J) Std. Error Sig.



.00 375.00 -38.69524* 10.13768 .005 -66.8459 -10.5446

750.00 -86.80952* 10.13768 .000 -114.9602 -58.6588

1500.00 -55.00000* 10.52037 .000 -84.2133 -25.7867

375.00 .00 38.69524* 10.13768 .005 10.5446 66.8459

750.00 -48.11429* 9.73997 .000 -75.1606 -21.0680

1500.00 -16.30476 10.13768 .395 -44.4554 11.8459

750.00 .00 86.80952* 10.13768 .000 58.6588 114.9602

375.00 48.11429* 9.73997 .000 21.0680 75.1606

1500.00 31.80952* 10.13768 .023 3.6588 59.9602

1500.00 .00 55.00000* 10.52037 .000 25.7867 84.2133

375.00 16.30476 10.13768 .395 -11.8459 44.4554

750.00 -31.80952* 10.13768 .023 -59.9602 -3.6588 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.



146

Analisis untuk jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml)

Group Statistics

DOSIS N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

CFU .00 6 326.3667 111.21472 45.40322

375.00 7 110.3571 35.71320 13.49832

Independent Samples Test

Levene's

Test for

Equality of

Variances t-test for Equality of Means

95% Confidence

Interval of the

Difference

F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error

Difference Lower Upper

CFU Equal

variances

assumed

7.055 .022 4.885 11 .000 216.00952 44.22126 118.67918 313.33986

Equal

variances

not

assumed

4.560 5.885 .004 216.00952 47.36726 99.55290 332.46615



147

Group Statistics


CFU .00 6 326.3667 111.21472 45.40322

750.00 7 .0000 .00000 .00000


Levene's

Test for

Equality of


95% Confidence

Interval of the

Difference

F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error


CFU Equal

variances

assumed

16.660 .002 7.824 11 .000 326.36667 41.71555 234.55136 418.18197

Equal

variances

not

assumed

7.188 5.000 .001 326.36667 45.40322 209.65397 443.07936



148

Group Statistics


CFU .00 6 326.3667 111.21472 45.40322

1500.00 6 .0000 .00000 .00000


Levene's Test for

Equality of


95% Confidence

Interval of the

Difference

F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error


CFU Equal

variances

assumed

14.063 .004 7.188 10 .000 326.36667 45.40322 225.20199 427.53135

Equal

variances

not assumed

7.188 5.000 .001 326.36667 45.40322 209.65397 443.07936



149

Group statistic DOSIS N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

CFU 375.00 7 110.3571 35.71320 13.49832

750.00 7 .0000 .00000 .00000


Levene's

Test for

Equality of


95% Confidence

Interval of the

Difference

F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error


CFU Equal

variances

assumed

7.960 .015 8.176 12 .000 110.35714 13.49832 80.94683 139.76746

Equal

variances

not

assumed

8.176 6.000 .000 110.35714 13.49832 77.32794 143.38635



150

Group Statistics


CFU 375.00 7 110.3571 35.71320 13.49832

1500.00 6 .0000 .00000 .00000


Levene's

Test for

Equality of


95% Confidence

Interval of the

Difference

F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error


CFU Equal

variances

assumed

6.736 .025 7.520 11 .000 110.35714 14.67422 78.05940 142.65489

Equal

variances

not

assumed

8.176 6.000 .000 110.35714 13.49832 77.32794 143.38635



151

Analisis untuk ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis

Test of Homogeneity of Variances

Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis


.626 3 22 .606

ANOVA Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis Sum of



Total 34071.675 25

Multiple Comparisons Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis

(I) DOSIS

(J) DOSIS

Mean Difference (I-

J) Std. Error Sig.



.00 375.00 17.57619 17.82525 .759 -31.9216 67.0740

750.00 56.49048* 17.82525 .021 6.9927 105.9883

1500.00 16.30000 18.49814 .815 -35.0663 67.6663

375.00 .00 -17.57619 17.82525 .759 -67.0740 31.9216

750.00 38.91429 17.12595 .135 -8.6417 86.4702

1500.00 -1.27619 17.82525 1.000 -50.7740 48.2216

750.00 .00 -56.49048* 17.82525 .021 -105.9883 -6.9927

375.00 -38.91429 17.12595 .135 -86.4702 8.6417

1500.00 -40.19048 17.82525 .140 -89.6883 9.3073

1500.00 .00 -16.30000 18.49814 .815 -67.6663 35.0663

375.00 1.27619 17.82525 1.000 -48.2216 50.7740

750.00 40.19048 17.82525 .140 -9.3073 89.6883 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.



152

Analisis untuk kerusakan jaringan

Test Statisticsa,b Peribronkioliti

s1 Perivaskulitis

1 Alveolitis1 Granuloma1 Jumlah

Chi-Square 1.731 11.252 8.342 6.749 12.644 df 3 3 3 3 3 Asymp. Sig. .630 .010 .039 .080 .005 a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: DOSIS

Analisis Mann-Whitney untuk dosis 375mg/KgBB dengan kontrol

Ranks DOSIS N Mean Rank Sum of Ranks

Peribronkiolitis1

.00 6 7.83 47.00

375.00 7 6.29 44.00

Total 13

Perivaskulitis1 .00 6 9.25 55.50

375.00 7 5.07 35.50

Total 13

Alveolitis1 .00 6 9.92 59.50

375.00 7 4.50 31.50

Total 13

Granuloma1 .00 6 8.83 53.00

375.00 7 5.43 38.00

Total 13

jumlah .00 6 10.17 61.00

375.00 7 4.29 30.00

Total 13



153

Test Statisticsb Peribronkioliti

s1 Perivaskulitis

1 Alveolitis1 Granuloma1 jumlah

Mann-Whitney U 16.000 7.500 3.500 10.000 2.000 Wilcoxon W 44.000 35.500 31.500 38.000 30.000 Z -.761 -2.207 -2.591 -1.722 -2.737 Asymp. Sig. (2-tailed) .447 .027 .010 .085 .006 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]

.534a .051a .008a .138a .005a

a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: DOSIS

Analisis Mann-Whitney U antara dosis 750 mg/KgBB dengan kontrol


Peribronkiolitis1

.00 6 7.67 46.00

750.00 7 6.43 45.00

Total 13


750.00 7 4.64 32.50

Total 13

Alveolitis1 .00 6 9.42 56.50

750.00 7 4.93 34.50

Total 13

Granuloma1 .00 6 9.08 54.50

750.00 7 5.21 36.50

Total 13

jumlah .00 6 10.33 62.00

750.00 7 4.14 29.00

Total 13



154


s1 Perivaskulitis



.628a .014a .035a .073a .002a


Analisis Mann-Whitney U antara dosis 1500 mg/KgBB dengan control


Peribronkiolitis1

.00 6 6.17 37.00

1500.00 6 6.83 41.00

Total 12


1500.00 6 5.25 31.50

Total 12

Alveolitis1 .00 6 7.58 45.50

1500.00 6 5.42 32.50

Total 12

Granuloma1 .00 6 8.25 49.50

1500.00 6 4.75 28.50

Total 12

jumlah .00 6 8.58 51.50

1500.00 6 4.42 26.50

Total 12



155


s1 Perivaskulitis



.818a .240a .310a .093a .041a


Analisis Mann- WhitneyU antara dosis 375 mg/KgBB dengan 750

mg/KgBB


Peribronkiolitis1

375.00 7 7.36 51.50

750.00 7 7.64 53.50

Total 14

Perivaskulitis1 375.00 7 8.50 59.50

750.00 7 6.50 45.50

Total 14

Alveolitis1 375.00 7 7.00 49.00

750.00 7 8.00 56.00

Total 14

Granuloma1 375.00 7 8.00 56.00

750.00 7 7.00 49.00

Total 14

jumlah 375.00 7 7.21 50.50

750.00 7 7.79 54.50

Total 14



156


s1 Perivaskulitis


Mann-Whitney U 23.500 17.500 21.000 21.000 22.500 Wilcoxon W 51.500 45.500 49.000 49.000 50.500 Z -.142 -1.041 -.490 -.628 -.262 Asymp. Sig. (2-tailed) .887 .298 .624 .530 .793 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]

.902a .383a .710a .710a .805a


Analisis Mann-Whitney U antara dosis 375 mg/KgBB dengan 1500

mg/KgBB


Peribronkiolitis1

375.00 7 5.93 41.50

1500.00 6 8.25 49.50

Total 13


1500.00 6 8.42 50.50

Total 13

Alveolitis1 375.00 7 5.57 39.00

1500.00 6 8.67 52.00

Total 13

Granuloma1 375.00 7 7.36 51.50

1500.00 6 6.58 39.50

Total 13

jumlah 375.00 7 5.43 38.00

1500.00 6 8.83 53.00

Total 13



157


s1 Perivaskulitis


Mann-Whitney U 13.500 12.500 11.000 18.500 10.000 Wilcoxon W 41.500 40.500 39.000 39.500 38.000 Z -1.125 -1.646 -1.517 -.488 -1.621 Asymp. Sig. (2-tailed) .260 .100 .129 .626 .105 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]

.295a .234a .181a .731a .138a


Analisis Mann-Whitney U antara dosis 750 mg/KgBB dengan 1500

mg/KgBb


Peribronkiolitis1

750.00 7 6.07 42.50

1500.00 6 8.08 48.50

Total 13


1500.00 6 9.25 55.50

Total 13

Alveolitis1 750.00 7 6.00 42.00

1500.00 6 8.17 49.00

Total 13

Granuloma1 750.00 7 6.93 48.50

1500.00 6 7.08 42.50

Total 13

Jumlah 750.00 7 5.43 38.00

1500.00 6 8.83 53.00

Total 13



158


s1 Perivaskulitis


Mann-Whitney U 14.500 7.500 14.000 20.500 10.000 Wilcoxon W 42.500 35.500 42.000 48.500 38.000 Z -.984 -2.239 -1.075 -.114 -1.603 Asymp. Sig. (2-tailed) .325 .025 .282 .909 .109 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]

.366a .051a .366a .945a .138a


Analisis jalur

Assessment of normality (Group number 1)

Variable min max skew c.r. kurtosis c.r. DOSIS 1.000 1500.000 .436 .872 -1.154 -1.154 CAS8 20.000 153.400 .252 .503 -1.139 -1.139 BCL2 10.000 168.200 2.260 4.520 5.825 5.825 BAX 26.000 120.800 .342 .684 -1.262 -1.262 APOP 4.000 134.000 .028 .056 -.737 -.737 CFU 1.000 473.700 1.187 2.375 .212 .212 Multivariate 2.880 .720

Regression Weights: (Group number 1 - Default model)

Estimate S.E. C.R. P Label CAS8 <--- DOSIS .045 .011 4.222 *** par_3 BCL2 <--- DOSIS -.023 .011 -2.013 .044 par_1 BAX <--- DOSIS -.031 .010 -3.235 .001 par_2 BAX <--- CAS8 .784 .143 5.495 *** par_8 APOP <--- CAS8 .581 .196 2.963 .003 par_4 APOP <--- BAX -.037 .242 -.154 .878 par_5 APOP <--- BCL2 -.239 .176 -1.359 .174 par_7 CFU <--- APOP -2.786 .589 -4.732 *** par_6



159

Analisis korelasi antara jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) dengan kerusakan jaringan.

Correlations

CFU Jumlah

Spearman's rho CFU Correlation Coefficient 1.000 .354*

Sig. (1-tailed) . .038

N 26 26

jumlah Correlation Coefficient .354* 1.000

Sig. (1-tailed) .038 .

N 26 26

*. Correlation is significant at the 0.05 level (1-tailed).



160

Lampiran 6

Prosedur pemeriksan Apoptosis dengan Apoptag Detection Kit

1. Deparafisasi jaringan

1. Cuci spesimen tiga kali dengan xylene masing-masing selama lima menit.

2. Cuci spesomen dua kali dengan etanol absolut masing-masing selama lima menit

3. Cuci spesimen satu kali dengan etanol 95% dan satu kali dengan etanol 70% masing-masing selama tiga menit

4. Cuci spesimen dengan satu kali PBS selama lima menit

2. Persiapan pewarnaan:

1. Teteskan proteinase K (20ug/ml) langsung pada spesimen (60u/5 ) selama lima belas menit

2. Cuci spesimen dua kali dengan d O copling jar masing- masing selama dua

menit

3. Menghilangkan endogenous peroxidase

1. Teteskan 3% dalam PBS selama lima menit pada suhu kamar.

2. Cuci spesimen dua kali dengan PBS masing-masing selama dua menit dalam copling jar.

4. Gunakan equilibration buffer

1. Singkirkan cairan di sekitar potongan jaringan dengan kertas pengering.

2. Teteskan 75ul equilibration buffer langsung pada spesimen.

3. Inkubasi paling sedikit sepuluh menit pada suhu kamar

5. Gunakan working strength TdT enzyme

1. Singkirkan cairan di sekitar potongan jaringan dengan kertas pengering.

2. Segera teteskan working strength TdT enzyme pada potongan jaringan sebanyak 55ul/5

3. Inkubasi selama satu jam pada suhu 37°C dalam wadah yang lembab



161

6. Gunakan stop/wash buffer

1. Letakkan spesimen dalam copling jar yang berisi working strength stop/wash buffer, goncangkan selama limabelas detik kemudian diinkubasi selama sepuluh menit pada suhu kamar

2. Keluarkan anti-Digoxigenin Peroxidase-Conjugate dari tempat penyimapana dan hangatkan pada suhu kamar

7. Gunakan anti-Digoxigenin Peroxidase-Conjugate

1. Cuci spesimen tiga kali dengan PBS masing-masing selama satu menit.

2. Keringkan cairan diantara potongan jaringan dengan kertas pengering.

3. Teteskan anti-Digoxigenin Peroxidase-Conjugate pada sediaan gunakan kira-kira 65ul/5 dari permukaan spesimen

4. Inkubasi dalam tempat yang lembab selama tigapuluh menit pada suhu kamar

8. Cuci dalam larutan PBS

1. Cuci spesimen sebanyak empat kali dengan PBS dalam copling jar masing-masing selama dua menit pada suhu kamar

2. Sementara mencuci sediaan, disiapkan working strength peroxidase substrate

9. Pemberian warna pada sediaan dengan peroxidase substrate

1. Hilangkan cairan diantara potongan jaringan secara hati-hati dengan kertas pengering

2. Teteskan peroxidase substrate secukupnya sampai menutupi seluruh permukaan jaringan (75ul/5

3. Biarkan sepuluh menit pada suhu kamar

4. Untuk memonitor timbulnya warna dapat dilihat dengan mikroskop cahaya

10.Cuci spesimen

1. Cuci spesimen tiga kali dengan dH2O dalam copling jar masing-masing selama satu menit

2. Slide diinkubasi dengan dH2O dalam copling jar selama lima menit pada suhu kamar

11.Pemberian counter stain specimen

1. Teteskan 0,5% ffast green pada slide selama sepuluh menit pada suhu kamar



162

2. Cuci spesimen 3 kali dengan dH2O masing-masing selama 5 menit

12.Mount specimen

1. Keringkan spesimen dengan cylene

2. Hilangkan cairan diantara sediaan dengan kertas pengering

3. Teteskan mounting medium seperti Permount kemudian tutup dengan cover glas

13.Amati dibawah mikroskop



DISERTASI MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella...

Documents

Transcript of DISERTASI MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella...