BAB I

PENDAHULUAN1.1. Prinsip Percobaan

Isolasi merupakan teknik pemisahan suatu zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif yang terdapat dalam suatu tanaman, meliputi proses ekstraksi dan pemisahan menggunakan kromatografi. Isolasi diosgenin dari rimpang pacing dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi alat refluks untuk mendapatkan ekstraknya. Penarikan komponen kimia dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke dalam labu alas bulat bersama-sama dengan cairan penyari lalu dipanaskan, uap-uap cairan penyari terkondensasi pada kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari yang akan turun kembali menuju labu alas bulat, akan menyari kembali sampel yang ada di labu alas bulat, seterusnya secara berkesinambungan sampai penyarian sempurna. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan (Harborne,1987).

Ekstrak yang diperoleh kemudian diuji dengan melakukan Kromatografi Lapis Tipis. Sebagai fase diam digunakan silika gel dan fase geraknya berupa campuran CHCL3-EtOH (95:5), noda terlihat dengan menyemprotkan pereaksi Vanilin-H2SO4 sebagai penampak bercak.1.2. Tujuan PercobaanUntuk mengetahui cara mengisolasi sapogenin/diosgenin dari Coctus speciosus dan mengetahui kromatogram dari diosgenin. 1.3. Manfaat PercobaanPraktikan diharapkan dapat melakukan teknik isolasi dan pemisahan senyawa kimia diosgenin pada tumbuhan. Praktikan juga diharapkan dapat mengetahui prinsip kerja alat refluks dan dapat menggunakannya pada proses isolasi senyawa kimia tumbuhan.BAB IITINJAUAN PUSTAKA2.1 Uraian Tumbuhan

2.1.1 Sistematika TumbuhanPacing (Costus speciosus)Kingdom : PlantaeSub Kingdom: TracheobiontaSuper Divisi: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: LiliopsidaSub Kelas: CommelinidaeOrdo

: Zingiberales

Famili : Zingiberaceae Genus : Costus Spesies: Costus speciosus (Koenig) Sm. (Soegihardjo,2005).2.1.2 Sinonim

Sinonim dari tumbuhan pacing adalah sebagai berikut: Costus sericeous Bl., Costus laureiri Horan, Amomum arboreum Lour., Amomum hirsutum Lamk., Banksia speciosa Koenig (Soegihardjo, 2005).

Nama daerah dari tumbuhan pacing adalah sebagai berikut: tepung tawar, galoba utan (Melayu); tabar-tabar, totar (Batak); sitawar (Minangkabau); tabar-tabar, tawar-tawar, kalacim, kalacing (Bangka); pacing, pacing tawar (Sunda); pacing, poncangpancing, pacing tawa (Jawa); bunto, binto (Madura); palai batang, lingkuas in talun (Minahasa); galoba utan (Manado); tampung tawara, tapung tawara (Makasar); tepu tawa (Bugis); tehe tepu, tubu-tubu (Ambon); uga-uga (Ternate); muri-muri, tebe pusa (Seram). Nama asing dari tumbuhan pacing adalah spiral ginger atau wenteltrap plant (Inggris) (Soegihardjo, 2005).2.1.3 Morfologi

Pacing tumbuh liar di tempat yang lembab dengan sedikit naungan atau tumbuh liar di bawah tumbuh-tumbuhan yang tinggi seperti di hutan primer, hutan sekunder dan hutan jati pada dataran rendah sampai ketinggian 1050 meter di atas permukaan laut. Banyak ditemukan di pulau Jawa (Soegihardjo, 2005).

Pacing berupa herba tahunan, tegak, tingginya dapat mencapai 0,5-4 meter. Batangnya banyak mengandung air, mudah dipatahkan, dari luar kasar dan dari dalam licin dan mengkilat. Batang tertutup oleh pelepah daun, berwarna hijau keunguan. Daunnya merupakan daun tunggal, berwarna hijau, berbentuk lonjong sampai lanset memanjang, tersusun secara spiral melingkari batang. Ujung daun meruncing, tepi rata, pangkal daun tumpul, panjang 11-28 cm dan lebarnya 8-11 cm. Permukaan daun bagian bawah berbulu lembut, sedangkan permukaan atas beralur. Tangkai daun pendek. Perbungaan berbentuk bulir besar yang terletak pada ujung batang. Bunganya berwarna putih atau kuning. Daun pelindung bulat telur dengan ujung runcing. Mahkota berbentuk tabung, panjang lebih kurang 1 cm dan diameter sekitar 5 mm (Soegihardjo, 2005)2.1.4 Kandungan Kimia dan Khasiat

Rimpang dan biji pacing mengandung diosgenin (sapogenin steroid), tigogenin, diosin, grasillin, sitosterol, metiltriakontan, 8-hidroksitriakontan-25-on, 5-alfa-stigmast-9(11)-en-3-beta-ol-24-hidroksitriakontan-26-on, dan 24-hidroksihentriakontan-27-on. Selain itu rimpang juga mengandung saponin, flavonoida, dan tanin. Daun mengandung saponin, flavanoida, dan tanin. Batang juga mengandung saponin, flavonoida, dan tanin. Bunga mengandung saponin, flavonoida, dan senyawa- senyawa polifenol (Soegihardjo, 2005).

Seluruh bagian tumbuhan digunakan sebagai obat luar untuk luka akibat digigit ular atau digigit serangga. Juga digunakan sebagai obat disentri. Daun digunakan sebagai obat radang selaput lendir mata. Daun yang masih muda juga digunakan untuk menyuburkan rambut. Batang digunakan sebagai obat demam dan disentri. Empulur batang untuk mendinginkan mata pada penderita cacar. Rimpang dan biji digunakan sebagai bahan baku obat kontrasepsi (anti hamil) (Soegihardjo, 2005).

Costus speciosus, tanaman hias India, telah lamadigunakan dalam sistem tradisional obat. Pabrik telah ditemukan untuk memiliki beragambeberapa kegiatan farmakologi.Pasal ini memberikan penjelasan tentang diperbaruiinformasi tentang fitokimia dan sifat farmakologis.Kajian ini menunjukkan bahwa luas jumlah konstituen fitokimia telah diisolasi dari tanaman yang memilikikegiatan seperti menjadi pahit, astringen, afrodisiak, pencahar, obat cacing, depurative, obat penurun panas danekspektoran.Rimpang diberikan dalam pneumonia, rematik, basal, penyakit kencing, penyakit kuningsementara daun diberikan pada gangguan mental.daun memar diterapkan pada demam; rebusan batangdigunakan dalam demam dan disentri.Berbagai kegiatan lain juga dilaporkan seperti anti-inflamasi,antiartritis efek dan aktivitas antijamur.Tanaman ini juga digunakan dalam rematik gout danasma bronkial.Rimpang tanaman kardiotonik pameran, hydrochloretic, diuretik dan SSPdepresan kegiatan.Laporan ini sangat menggembirakan dan menunjukkan bahwa tanaman harusdipelajari lebih ekstensif untuk efek terapeutik (Dubey, 1988).Tanaman obat ini telah sangat penting untuk perawatan kesehatan kebutuhan individu dan merekamasyarakat.Penggunaan obat herbal yang terbuat dari tanaman obat ini tersebar luas dinegara-negara berkembang. Kekuatan penyembuhan obat herbal tradisional telah terwujud sejak barang antik.Sekitar 65% dari populasi dunia memiliki akses ke obat lokal pengetahuan sistem.India adalah duduk di atas tambang emas baik dicatat dan tradisional wellpracticedpengetahuan tentang jamu.India memiliki daftar resmi tercatat 45.000 tanaman spesies dan estimasi menempatkan daftar 7500 spesies tanaman obat tumbuh di 16 nyazona agroklimat di bawah 63.700.000 hektar tutupan hutan. Dengan semakin meningkat kecenderungan global menuju jamu, ada permintaan wajib bagi yang besar bakubahan tanaman obat.Obat herbal bergerak dari pinggiran untuk menggunakan mainstream dengansejumlah besar orang mencari solusi dan pendekatan kesehatan gratis dari efek samping yang disebabkanoleh bahan kimia sintetik (Dubey, 1988). 2.2 Diosgenin

Diosgenin adalah golongan saponin alami yang banyak ditemukan pada kacang-kacangan dan umbi dari jenis Dioscorea sp. Diosgenin merupakan prekursor berbagai steroid sintetis yang banyak digunakan dalam industri farmasi. Selama dua dekade terakhir, serangkaian studi independen pra-klinis dan mekanis telah dilakukan untuk mengetahui peran menguntungkan diosgenin terhadap penyakit metabolik (hiperkolesterolemia, dislipidemia, diabetes dan obesitas), peradangan dan kanker. Menurut tanaman yang memiliki potensi untuk mensintesis steroid sapogenin adalah dari golongan Agavaceae (genus Agave), Dioscoreaceae (genus Dioscorea) dan Liliaceae (genera Allium, Asparagus, Lilium). Steroid sapogenin adalah metabolit skunder yang merupkan prekursor biosintesis sterol, terutama kolesterol. Apabila dikonsumsi akan dimetabolisasi dalam hati dan dieliminasi dalam ginjal. Beberapa penelitian menemukan bahwa diosgenin dapat diserap melalui usus, berperan penting dalam mengatur metabolisme kolesterol, mengurangi resiko sakit jantung terutama kanker paru-paru dan kanker darah , memiliki efek esterogenik dan anti tumor (Prabowo, dkk. 2014) .

Gambar 1. Struktur diosgenin

Secara struktur, diosgenin adalah spirostanol saponin yang tersusun atas gula hidrofilik terikat dengan aglikon steroid hidrofobik. Sejak ditemukan, diosgenin adalah prekursor utama dalam produksi steroid sintetik dalam industri farmasi. Aktivitas biologis diosgenin dan steroid saponin lain dan alkaloid telah diuji secara in vitro. Dengan menggunakan model molekuler, spatial conformation dan kapasitas transfer elektron telah dihitung hubungannya dengan karakter struktural diosgenin untuk mengetahui efeknya terhadap rasio proliferasi, distribusi siklus sel dan apoptosis. Bioaktivitas anti kanker diosgenin berhubungan dengan keberadaan ikatan hetero-gula dan 5,6-ikatan ganda pada strukturnya. Konformasi struktur pada C-5 dan C-25 atom karbon juga berperan penting dalam aktivitas biologis diosgenin (Prabowo, dkk. 2014).

2.3RefluksRefluks adalah teknik yang melibatkan kondensasi uap dan kembali kondensat ini ke sistem dari mana ia berasal. Hal ini digunakan dalam industri dan laboratorium distilasi. Hal ini juga digunakan dalam kimia untuk memasok energi untuk reaksi-reaksi selama jangka waktu yang panjang (Harborne, 1987).

Gambar 4 : Alat Refluks

Campuran reaksi cair ditempatkan dalam sebuah wadah terbuka hanya di bagian atas. Kapal ini terhubung ke kondensor Liebig, seperti bahwa setiap uap yang dilepaskan kembali ke didinginkan cair, dan jatuh kembali ke dalam bejana reaksi. Kapal kemudian dipanaskan keras untuk kursus reaksi (Harborne,1987).Keuntungan dari teknik ini adalah bahwa hal itu dapat dibiarkan untuk jangka waktu yang panjang tanpa perlu menambahkan lebih pelarut atau takut bejana reaksi mendidih kering karena setiap uap immedeatly kental dalam kondensor. Selain itu sebagai pelarut yang diberikan akan selalu mendidih pada suhu tertentu (Harborne,1987).

Penarikan komponen kimia dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke dalam labu alas bulat bersama-sama dengan cairan penyari lalu dipanaskan, uap-uap cairan penyari terkondensasi pada kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari yang akan turun kembali menuju labu alas bulat, akan menyari kembali sampel yang ada di labu alas bulat, seterusnya secara berkesinambungan sampai penyarian sempurna, penggantian pelarut dilakukan sebanyak 3 kali setiap 3-4 jam. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan (Harborne,1987).2.4 KromatografiKromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia, Michael Rswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perlokasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelasyang berisi kalsium karbonat (CaCO3) (Gandjar, 2007).

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan 2 fase yaitu gerak dan diam serta mengkuantifikasi macam-macam komponen dalam suatu campuran yang kompleks, baik komponen organik mauapun anorganik. (Gandjar, 2007).Dalam analisis dalam berbagai kandungan kimia, cara pertama yaitu campuran harus dipisahkan. Banyak cara untuk memisahkan senyawa dalam suatu campuran, salah satu diantaranya yang paling sering dan mudah diguunakan yaitu kromatografi. Proses kromatografi melibatkan 2 fase yaitu fase gerak dan fase diam. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan sedangkan fase diam dapat berupa celah-celah atau bentuk granul padat atau berupa lapisan cairan encer yang diserap oleh sebuah padatan (Ewing, 1985).Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparative. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi preparative hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah: (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecenderumgan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penyerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) (Roy, 1991).Kromatografi dapat diklasifikasikan berdasarkan mekanisme pemisahannya misalnya kromatografi adsorpsi, afinitas, penukar ion, dsb. Kromatografi juga dapat diklasifikasikan berdasarkan alat yang digunakan seperti Kromatografi Kertas (KK), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan Kromatografi Gas (GC) (Roy, 1991).Dalam kromatografi juga dikenal istilah kromatografi jenis planar dan kolom. Kromatografi planar menggunakan fase diam berupa lempeng tipis yang umumnya terbuat dari kaca, lempeng alumunium dan sebagainya. Yang termasuk kromatografi planar yaitu kromatografi kertas (KK) dan kromatografi lapis tipis (KLT) (Gandjar, 2007).Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah: Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (KGC), dan Kromatografi Kinerja Tinggi (KCKT) (Harbone, 1987).

Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisah. KKt dapat digunakan terutama bagi kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air (karbohidrat, asam amino dan senyawa fenolat), KLT merupakan metoda pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut lipid (lipid, steroid, karotenoid, kinon sederhana dan klorofil), KGC penggunaannya terutama untuk senyawa atsiri (asam lemak, mono- dan seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa belerang), cara lain yaitu KCKT, dapat memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan keefisienan kolom dan kecepatan analisis (Harbone, 1987).Prinsip Kromatografi adalah:a. Hidrokarbon jenuh terjerap sedikit atau tidak sama sekali, karena itu ia bergerak paling cepat. Penjerapan hidrokarbon tidak jenuh meningkat dengan meningkatnya jumlah ikatan rangkap terkonyugasi. Oleh karena itu, untuk pemisahan harus digunakan suatu penjerapan yang aktif dan pelarut pengembang yang kurang polar. Kemungkinan lain ialah pembalikan fase, dalam hal ini fase diam dibacem dengan suatu lipida dan sebagai fase gerak digunakan pelarut hidrofilik (Stahl, 1985).

b. Bila gugusan fungsi dimasukkan ke dalam suatu hidrokarbon, afinitas jerap naik Misalnya, dengan menggunakan benzena sebagai pelarut pengembang,eter dan ester terdapat pada bagian atas kromatogram KLT berlapis silika gel atau aluminium oksida, keton, dan aldehida kurang lebih di tengah, alkohol dibawahnya, sedangkan asam tetap di titik awal. Jadi, pemisahan terjadi menurut polaran senyawa. Asam organik dan basa kuat dapat dikromatografi dalam bentuk turunannya yang kurang polar atau dengan pelarut pengembang asam atau basa (Stahl, 1985).Metode pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik atau gabungan teknik tersebut (Harbone, 1987).

1. Kromatografi Kertas (KKt) dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kedua cara ini serupa dalam hal fase diamnya berupa lapisan tipis dan fase geraknya mengalir karena kerja kapiler. Perbedaannya dalam sifat dan fungsi fase diam (Roy, 1991). Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluan, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Hostettmann, 1995).

Kromatotron

Proses isolasi yang terjadi berdasarkan adsorpsi dan partisi. Adsorpsi adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap adsorben terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugasi sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda yang menyebabkan terjadi pemisahan (Hostettmann, 1995).

2. Kromatografi Kolom

Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita, senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom (Roy, 1991).

3. Kromatografi Gas Cair (KGC)

Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan fase diam. Fase diam berupa gas akan mengelusi solute dengan fase diam. Fase diam berupa gas akan mengelusi solute dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detector. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 50-350oC) bertujuan untuk menjamin bahwa solute akan menguap dan karenanya akan cepat terelusi (Gandjar, 2007).2.4.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)Kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat plastik (Gandjar, 2007).Fase diam pada KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam, semakin baik kinerja KLT dalam hal efisien dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silica dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama adalah pada KLT yaitu adsorpsi dan partisi. Untuk tujuan tertentu, pejerap atau fase diam dapat dimodifikasi dengan cara pembaceman (Gandjar, 2007).

Fase gerak dari pustaka dapat ditentukan dengan uji pustaka atau dengan dicoba-coba karena pengerjaan KLT ini cukup cepat dan mudah. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran ini dapat diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi dengan optimal. Dalam pembuatan dan pemilihan fase gerak yang harus diperhatikan yaitu kemurnian dari eluen itu sendiri karena KLT merupak teknik yang sensitif; daya elusi dari pelarut itu juga harus diatur sedemikian rupa agar harga Rf berkisar antara 0,2-0,8 yang menandakan pemisahan yang baik; polaritas dari pelarut juga harus diperhatikan agar pemisahan terjadi dengan sempurna (Gandjar, 2007).

Bila KLT dibandingkan dengan KKt, kelebihan KLT adalah keserbagunaan, kecepatan dan kepekaannya. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa disamping selulosa, sejumlah penyerap yang berbeda-beda dapat disapukan pada plat kaca atau penyangga lain yang digunakan untuk kromatografi. Walaupun silika gel paling banyak digunakan, lapisan dapat pula di buat dari aluminium oksida, celite, kalsium hidroksida, damar penukar ion, magnesium fosfat, poliamida, sephadex, polivinil pirolidin, selulosa, dan campuran dua bahan diatas atau lebih. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat penyerap yang lebih padat bila disapukan pada plat (Harbone, 1987).

Satu kekurangan KLT yang asli ialah kerja penyapuan plat kaca dengan penyerap. Plat kaca harus dibersihkan hati-hati dengan aseton untuk menghilangkan lemak. Kemudian bubur silika gel dalam air harus dikocok kuat-kuat selama jangka waktu tertentu (misalnya 90 detik) sebelum penyaputan. Tergantung pada ukuran partikel penyerap, mungkin harus ditambahkan kalsium sulfat hemihidrat (15%) untuk membantu melekatkan penyerap pada plat kaca. Kemudian plat harus dikeringkan pada suhu kamar dan kemudian diaktifkan dengan pemanasan pada suhu 100-1100C selama 30 menit. Pada beberapa pemisahan biasanya akan menguntungkan bila sifat penyerap diubah dengan menambahkan garam anorganik (Harbone, 1987).

Kromatografi lapis tipis telah dikembangkan menjadi suatu teknik yang sangat canggih untuk identifikasi senyawa dan untuk menentukan adanya pengotor minor. Karena metode ini adalah salah satu teknik kromatografi yang paling awal, tersedia sangat banyak uji berbasis KLT dan monografi farmakope yang mencerminkan sejauh mana teknik ini telah dikembangkan sebagai teknik pengendalian mutu dasar untuk pengotor minor. Alas an keunggulan dalam hal ini dikarenakan fleksibelitasnya untuk dapat mendeteksi hamper semua senyawa, bahkan beberapa senyawa anorganik. Setelah KLT, semua kromatogram dapat dilihat sehingga tidak ada keraguan apakah komponen-komponen ini di dalam suatu sampel dapat terelusi dari sistem kromatografi atau tidak, seperti halnya pada KCKT dan KG, dan bahkan elektroforesis kapiler (EK) (Watson, 2007).

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ialah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal). Setelah pelat atau lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya, senyawa yang tidak bewarna harus ditampakkan (Stahl, 1985).a. Fase Diam (Lapisan Penjerap)

Penjerap yang umum ialah silika gel, aluminium oksida, kieselgur, selulosa dan turunannya, poliamida, dan lain-lain. Dapat dipastikan silika gel paling banyak digunakan. Silika gel ini menghasilkan perbedaan dalam efek pemisahan yang tergantung pada cara pembuatannya sehingga silika gel G Merck menurut spesifikasi Stahl, yang diperkenalkan tahun 1958, telah diterima sebagai bahan standar. Selain itu harus diingat bahwa penjerap seperti aluminium oksida dan silika gel mempunyai kadar air yang berpengaruh nyata terhadap daya pemisahnya (Stahl, 1985).

b. Fase Gerak (Pelarut Pengembang)

Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Yang digunakan hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem pelarut multikomponen ini harus berupa suatu campuran sederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl, 1985).2.4.1.1 Angka Rf pada KLT

Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf :

Rf = jarak titik pusat bercak dari titik awal

jarak garis depan dari titik awal

Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hRf ialah angka Rf dikalikan faktor 100(h), menghasilkan nilai berjangka 0 sampai 100. Jika dipilih 10 cm sebagai jarak pengembangan, maka jarak rambat suatu senyawa (titik awal-pusat bercak dalam cm) x 10 menghasilkan angka Rf. Tetapi, karena angka Rf merupakan fungsi sejumlah faktor angka ini harus dianggap sebagai petunjuk saja. Inilah yang menjadi alasan mengapa angka hRf lah, misalnya hRf 60-70 yang dicantumkan untuk menunjukkan letak suatu senyawa pada kromatogram (Stahl, 1985).

Jika keadaan luar, misalnya kelembaban atmosfer yang tidak cukup atau penjerap yang sifatnya agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang secara umum menunjukkan angka Rf dari berbagai komponen lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih tinggi daripada hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika angka hRf lebih rendah, komponen polar pelarut harus dinaikkan. Ini dapat dilakukan dengan cara sederhana, misalnya, pada pengaturan sistem benzena-kloroform atau kloroform-metanol (Stahl, 1985).2.4.1.2 Penggunaan KLTPenggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektivitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta memantau kromatografi kolom, melakukan screening sampel untuk obat.(Gandjar, 2007).

Analisa kualitatif dengan KLT dapat dilakukan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Analisis kuantitatif dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak langsung pada lengpeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometry dan cara berikutnya dalaha dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak dengan metode analisis yang lain, misalnya dengan metode spektrofotometri. Dan untuk analisis preparatif, sampel yang ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar lalu dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang nondekstruktif. Bercak yang mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerok dan dilakukan analisis lanjutan (Gandjar, 2007).

BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN3.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah batang pengaduk, beaker glass, cawan penguap, corong pisah, cutter, erlenmeyer, gelas ukur, karet, kertas saring, lumpang dan alu, pipet tetes, plastik, seperangkat alat penyemprotan, waterbath.3.2BahanBahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah aquadest, CHCl3 (mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 99,5% CHCl3, sisanya terdiri dari alcohol), Etanol 95%, HCl(p) (mengandung 36% b/b HCl), larutan SbCl3 dalam CHCl33.3 Sampel

Sampel yang digunakan ialah rimpang pacing ( Coctus speciosus ).3.4 Prosedur Percobaan3.4.1 Isolasi Diosgenin dari rimpang pacing

Ditimbang 15g rimpang pacing, digerus di dalam lumpang dengan 20 ml air. Kemudian campuran direfluks dengan penambahan 5ml HCl pekat (sehingga konsentrasi akhir HCl 2-3N) selama 4 jam, kemudian disaring dan dibuang ampasnya. Filtrat dimasukkan ke dalam corong pisah, disari dengan 20 ml CHCl3 sebanyak 3 kali (hati-hati pengocokan yang terlalu kuat dapat membentuk emulsi yang sukar pecah). Kumpulkan sari CHCl3 dan uapkan pelarutnya sehingga diperoleh sari kasar diosgenin.

3.4.2 Identifikasi sari kasar dari diosgenin dengan Kromatografi Lapis Tipis Fase diam/adsorben: plat pra lapis silika GF254

Fase gerak

: campuran CHCl3-etanol 95% (95:5) dalam 5 ml.

Penampak noda: larutan Vanilin-H2SO4Prosedur:

Dijenuhkan chamber dengan pelarut pengembang, caranya 2/3 bagian dari chamber dilapisi kertas saring. Dimasukkan pelarut pengembang kedalamnya, dikatakan chamber jenuh apabila seluruh kertas saring telah basa oleh pelarut pengembang. Ditotolkan larutan ekstrak yang mengandung diosgenin kasar (titik penotolan: 1,5 cm dari batas bawah) pada plat KLT (bentuk noda atau pita) sampai plat KLT jenuh oleh larutan ekstrak, diamkan plat KLT selama 15 menit, kemudian plat KLT dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh. Noda dari titik penotolan akan merambat sampai batas pengembangan (catat/ukur batas pengembang) ( batas pengembang: 0,5 cm dari batas atas), dikeluarkan plat KLT lalu dikeringkan. Disemprot plat KLT dengan larutan penampak bercak, setelah disemprot lalu dipanaskan pada suhu 1000 C selama kira-kira 5 menit atau sampai timbul warna, diamati noda yang terjadi, dihitung harga Rf nya.3.6Flowsheet3.6.1 Isolasi Diosgenin

Dihaluskan 15 gram bahan segar

Ditambah air 20 ml

Direfluks dengan 5 ml HCl pekat selama 4 jam

Disaring

Disari 3 kali dengan 20 ml CHCl3

Diuapkan

3.6.2 Identifikasi diosgenin dari rimpang pacing dengan KLT

3.6.2.1 Penjenuhan Chamber

dimasukkan fase gerak (CHCl3 - etanol 95%)

dimasukkan kertas saring dan ditutup chamber dengan rapat hingga kertas saring telah basah seluruhnya dengan fase gerak

3.6.2.2 Pengolahan Plat KLT

ditotolkan dengan ekstrak diosgenin kasar (titikpenotolan: 1,5cm dari batas bawah)

dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuhditunggu hingga noda dari titik penotolan akan merambat sampai garis batas pengembangan (batas pengembang: 0,5cm dari batas atas)

dikeluarkan plat

dikeringkan

disemprot plat dengan larutan Vanilin-H2SO4

diamati noda yang terjadi

dihitung harga Rf nya

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam percobaan digunakan Fase gerak CHCl3 etanol (95:5), fase diam silica gel GF 254 dan penampak noda Vanilin-H2SO4.Table harga Rf dari kromatogram diosgeninSebelum disemprotSesudah disemprot

-Rf1= 1,1/8,5= 0,13

- Rf2= 1,3/8,5= 0,2

-Rf3= 2,7/8,5= 0,32

- Rf4= 6/8,5= 0,71

- Rf5 = 6,3/8,5 = 0,74

- Rf6= 7,7/8,5 = 0,9

Rf7= 8,5/8,5= 1

Dari percobaan yang telah dilakukan, pemisahan diosgenin dengan kromatografi lapis tipis memakai pengembang campuran CHCl3 : etanol (95 : 5). Sebelum penyemprotan, tidak terdapat noda. Setelah penyemprotan terdapat noda berwarna coklat, kuning, biru, hijau, biru ungu, kuning, ungu dengan masing-masing harga Rf 0,13; 0,2; 0,32; 0,71; 0,74; 0,9; 1.

Sruti shrivastrava et. all (2011) mengemukakan kandungan dari rhizoma Costus speciousus berupa saponin diosgenin, dioscin, gracillin dan juga terdapat minyak essensial seperti pinocarveol, cardinene, cineol dan carvachol. Hal ini sesuai dengan hasil percobaan yang diperoleh, yaitu adanya bercak noda lain dengan warna dan harga Rf yang berbeda-beda.BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN5.1. KesimpulanCara mengisolasi sapogenin/diosgenin dari Coctus speciosus adalah dengan cara merefluksnya dengan air dan HCl pekat, kemudian disari dengan kloroform.

Kromatogram dari diosgenin secara Kromatografi Lapis Tipis adalah berupa bercak yang timbul pada plat sebelum dan sesudah disemprot penampak bercak larutan Vanilin-H2SO4. Sebelum disemprot penampak bercak larutan Vanilin-H2SO4, tidak ada bercak yang timbul. Sesudah disemprot penampak bercak larutan Vanilin-H2SO4 diperoleh bercak dengan harga Rf yaitu Rf1 = 1,1/8,5 = 0,13, Rf2 = 1,3/8,5 = 0,2, Rf3 = 2,7/8,5 = 0,32, Rf4 = 6/8,5 = 0,71 , Rf5 = 6,3/8,5 = 0,74, Rf6 = 7,7/8,5 = 0,9, Rf7= 8,5/8,5= 1.5.2. SaranSebaiknya, dilakukan identifikasi diosgenin secara Kromatografi Lapis Tipis dengan menggunakan fase gerak yang lain dan penampak bercak yang lain, seperti larutan SbCl3 dan asam borat metanol.

DAFTAR PUSTAKADubey, N. K and Prasad, B. U. (1988). Aspergillus terrus A New Pathogen asFish Pathogen. Current Science. Hal 622-623Ewing, G.W.(1985). Instrumental of Chemical Analysis Fifth edition. Singapore: McGraw-Hill. Hal 203Gandjar, I. G., Abdul R.(2008). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Hal 23-25Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Modern Menganalisa Tumbuhan. Edisi Kedua. Penerjemah : Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung: Penerbit ITB. Hal 6-7, 13-5.

Hostettmann, K., M. Hostettmann, A. Marston.(1995). Cara Kromatografi Preparatif. Bandung: Penerbit ITB. Hal 305 Prabowo, dkk. (2014). Gembili Bahan Pangan Mengandung Senyawa Bioaktif. Jurnal Pangan dan Agroindustri. Vol.2. No.3: 129-135Roy, J. G, James, M. B, Arthur E. S. (1991). Pengantar Kromatografi. Bandung: Penerbit ITB. Hal 27Soegihardjo, C. J. (2007). Mencari Kondisi Terbaik untuk Pertumbuhan Kalus pada Kultur Jaringan Costus speciosus Smith., dalam Risalah Seminar Nasional Metabolit Sekunder. Yogyakarta: PAU Bioteknologi UGM. Hal 202-209. Stahl, E.(1985).Analisis Obat Secara Kromatografi dan Makroskopi. Diterjemahkan oleh Kokasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Penerbit ITB : Bandung. Hal 115Watson, D. G. (2007). Analisis Farmasi BA: Untuk Mahasiswa Farmasi dan Praktisi Kimia Farmasi. Jakarta: EGC. Hal 261-262

Rimpang pacing segar

Filtrat

Residu

Lapisan air

Lapisan CHCl3

Sari kasar diosgenin

Chamber

Chamber yang jenuh

Plat silika

Plat silika yang telah ditotol

Diperoleh harga Rf

1