Desain primer

Primer mutagen oligonukteotida untuk bisa diguakan dengan metode ini harus di desain secara individu sesuai dengan mutasi yang diinginkan. Berikut caranya :

Kedua primer harus mengandung mutasi dan anneal ke sekuen yang sama pada untai yang komplemen pada plasmid.

Primer secara optimal harus memiliki minimal GC 40% dan harus diakhiri dengan satu atau lebih basa C atau G.

Mutasi yang diinginkan (delesi atau insersi) harus berada di tengah primer dengan 10-15 basa pada kedua sisinya.

Mutasi yang diinginkan (delesi atau insersi) harus berada di tengah primer dengan 10-15 basa pada kedua sisinya.

Panjang primer harus sekitar 25 sampai 45 basa, dengan suhu leleh (Tm) ≥ 780C.

Tm = 81,5 + 0,41(%GC) – 675/N - %mismatch

Pertimbangan tambahan desain primer.

Sangat penting untuk selalu menjaga konsentrasi dalam keadaan berlebih. Stratagene menyarankan membuat variasi jumlah template

sedangkan menjaga konsentrasi primer secara konstan dalam keadaan berlebih.

Ujung 5’ primer tidak perlu difosforilsi tapi harus dipurifikasi dengan salah satu diantara fast polynucletide liquid chromatography (FPLC)

atau polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).

Desain primer untuk mengganti asam amino alanin

Posisi 108 dari 121 asam amino penyusun apotin atau basa urutan ke 322-324 pada susunan basa yaitu ACT.

GCT merupakan susunan basa untuk asam amino Alanin yang akan digunakan sebagai pengganti Threonin dalam proses mutasi ini adalah Alanin.

Urutan basa nitrogen threonin:

Primer mutagenik dimana basa threonin (ACT) digantikan dengan basa alanin (GCG) adalah sebagai berikut:

Primer forward mutageniknya:

Primer reverse mutageniknya:

5’ TCG GGG TCG GCT GGG CGC AGT GGT AAT CAA GCT 3’

5’ AGC TTG ATT ACC ACT GCG CCC AGC CGA CCC CGA 3’

5’ AGC TTG ATT ACC ACT ACT CCC AGC CGA CCC CGA 3’