BAB IPENDAHULUAN

A. TopikPewarnaan Gram (Negatif Staining)

B. Latar BelakangBakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna.Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.Pewarnaan Gram juga sering digunakan untuk mengidentifikasi penyakit yang di akibatkan karena infeksi. Mengingat pentingnya hal tersebut dalam bidang kesehatan maka diadakan praktikum pewarnaan gram untuk mengetahui perbedaan struktur, morfologi dan karakteristik dari suatu bakteri yang menyebabkan suatu penyakit sehingga penanganan terhadap penyakit tersebut dapat dilakukan secara tepat.

C. TujuanUntuk mengetahui perbedaan kuman Gram positif dan kuman Gram negative

D. Prinsip1. Kuman Gram positifDituangkan gram 1 (gentian violet) berwarna ungu, kemudian digenangi dengan gram 2 (lugol) agar cata semakin kuat, dan bila dilunturkan dengan gram 3 (alcohol 70%) tidak luntur, dan bila digenangi dengan gram 4 (fuchsin) cat tidak terserap sehingga kuman tetap berwarna ungu.2. Kuman Gram negatifDituangkan gram 1 (gentian violet) berwarna ungu, kemudian digenangi fuchsin cat terserap sehingga kuman berwarna merah.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 m. Bentuk bakteri bermacam macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan untuk membedakan kuman yang bersifat gram positif dan kuman gram negative dengan menggunakan lebih dari satu macam cat. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi di kenai larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet, larutan yodium, larutan akohol(bahan peluntur) dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna safranin atau air fucshin. Metode ini di beri nama berdasarkan penemunya,ilmuwan Denmark Hans Christian Gram(1853-1938)yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri garam positif akan memprtahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop.Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarn air fucshin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya(Pelczar,2007).

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu (Hadiotomo, 1990) : Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristalviolet. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu (Hadiotomo, 1990) : Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatifpada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Dengan demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987)Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).

BAB IIIMETODOLOGI

A. Waktu dan TempatPraktikum mikrobiologi mengenai pewarnaan gram ini dilaksanakan pada Selasa, 07 April 2015 pukul 11.00, bertempat di Laboratorium Bakteri Institut Ilmu Kesehatan Bhakti Wiyata Kediri.

B. AlatAlat- alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :1. Lampu spiritus2. Obyek glass3. Mikroskop4. Ose bulat5. Korek api6. Penjepit

C. BahanBahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :1. Suspensi kuman2. Gram 1 (gentian violet)3. Gram 2 (lugol)4. Gram 3 (alcohol 70%)5. Gram 4 (fuchsin)6. Oil immerse7. Pz8. Xylol9. Air

D. Prosedur Kerja1. Siapkan semua alat dan bahan2. Panaskan ose bulat dengan api spiritus sampai memijar, dinginkan3. Sterilisasi obyek glass dengan pemijaran, kemudian tetesi dengan Pz4. Mengambil suspensi kuman dalam tabung yang telah di flaming, kemudian oleskan pada obyek glass searah dengan jarum jam5. Sesudah mengambil sediaan tabung di flaming kembali6. Panaskan kembali ose bulat dengan api spiritus sampai memijar7. Sediaan di fiksasi8. Sediaan dituangi dengan Gram 1 (gentian violet) selama 3-5 menit9. Cat dibuang, kemudian sediaan dialiri dengan air10. Sediaan digenagi dengan Gram 2 (lugol) selama 3-5 menit11. Lugol dibuang12. Sediaan digenagi dengan Gram 3 (alcohol 70%) selama 10 detik13. Alkohol 70% dibuang14. Sediaan dituangi dengan Gram 4 (fuchsin) selama 3-5 menit15. Cat dibuang, kemudian sediaan dialiri dengan air16. Sediaan dikeringkan17. Tetesi sediaan dengan oil immersi, kemudian periksa di bawah mikroskop lensa obyektif 100x

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

A. Data Hasil PengamatanGambar bakteri dari pengamatan mikroskop

Keterangan :1. Bentuk:batang2. Warna:merah3. Susunan:menyebar4. Sifat:Gram negatif

B. PembahasanPengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal.Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens,Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalahEschericia Coli.Pada proses pewarnaan gram, harus menggunakan obyek glass yang bersih. Langkah pertama yang harus dilakukan adalah mensterilisasi dengan pemijaran obyek glass dan ose bulat. Stelirisasi ini digunakan untuk membebaskan alat-alat praktikum dari berbagai mikroorganisme.Setelah di sterilkan kemudian obyek glass di beri satu tetes Pz pada permukaannya.Kultur bakteri murni diambil di dalam tabung yang telah di flaming menggukan ose bulat dan diratakan diatas kaca obyek searah dengan jarum jam. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.Setelah bakteri dioleskan pada obyek glass langkah selanjutnya adalah dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram 1 (gentian violet) sebanyak 1-2 tetes dibiarkan selama 3-5 menit. Komposisi dari gentian violet sendiri adalah yang pertama dapat dari cat induk gentian violet 10 ml dan 1 % phenol dalam air 90 ml. Yang kedua adalah dari gentian violet 1 gram, carbolic acid Kristal 2 gram, alcohol 96 % 10 ml, dan aquadest 100 ml. sediaan kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan gunakan tissue untuk mengeringkan bagian bawah obyek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari gentian violet.Kemudian ditambahkan larutan gram 2 yaitu lugol selama 3-5 menit yang mengandung iodium Kristal 1 gram, KI 2 gram, dan aquadest 300 ml. Gram 2 merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan lugol menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan lugol, zat warnagentian violet akan larut saat penambahan larutanalkohol.Akibat pemberian cat Gram 2, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).Alkohol 70 % ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek gentian violet dan lugol pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsiuntuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatifyang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut gentian violet.Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama hanya sekitar 10 detik.Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan fuchsin (gram 4) sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 3-5 menit.Gram 4 merupakan cat yang terdiri dari campurancat induk fuchsin 10 ml dan akuades 90ml. Fuchsin pada gram 4 tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks gentian violettetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan fuchsin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warnaungu yang dihasilkan olehgentian violettelah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga fuchsin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram 4 atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembanding terhadap zat warna gentian violet. Setelah 5 menit kemudian cuci dengan air mengalir dan preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.Pemberian gentian violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu. Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri.Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol 70% pada praktikum pewarnaan gram ini, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan fuchsin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna fuchsin tidak dapat masuk sehingga sel tetap berwarna ungu.Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).Berdasarkan hasil pengamatan di atas, diidentifikasi bakteri yang telah ditemukan mempunyai bentuk batang dan berwarna merah, bakteri ini digolongkan ke dalam bakteri gram negatif karena ciri-cirinya menunjukkan ciri bakteri gram negatif.hasil pengamatan tersebut dapat dinyatakan berhasil dan benar, karena berdasarkan literatur yang ada bakteri tersebut merupakan golongan bakteri gram negatif.

BAB VPENUTUP

A. KesimpulanBerdasarkan praktikum pewarnaan Gram yang telah dilakukan ditemukan bakteri berbentuk batang, berwarna merah, susunannya menyebar dan bersifat Gram negative.

B. SaranAdapun saran yang dapat saya sampaikan yaitu :1. Pengolesan bakteri harus dilakukan dengan ketelitian yang tinggi dan searah dengan jarum jam agar hasil pengamatan bakteri yang didapatkan bentuknya dapat dilihat dengan jelas2. Lama pengecatan harus diperhatikan agar cat benar-benar terserap dengan baik3. Penggunaaan mikroskop harus benar-benar diperhatikan agar dapat dengan mudah menemukan bakteri yang diamati dengan mikroskop4. Penyerapan warna yang terjadi harus benar-benar diperhatikan karena penentuan warna yang terserap akan sangat berperan dalam penentuan sifat bakteri apakah Gram positif atau negatif