ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN IDENTIFIKASI

MOLEKULER BAKTERI PELARUT FOSFAT (BPF) DARI

BEBERAPA SAMPEL TANAH DI BOGOR, NUSA TENGGARA

BARAT (NTB), DAN NUSA TENGGARA TIMUR (NTT)

RENI KASMITA

A14051794

DEPARTEMEN ILMU TANAH DAN SUMBERDAYA LAHAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2010

2

RINGKASAN

RENI KASMITA. Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Molekuler Bakteri

Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah di Bogor, Nusa Tenggara Barat

(NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT). Di bawah bimbingan FAHRIZAL

HAZRA dan ETTY PRATIWI.

Fosfor (P) merupakan salah satu unsur hara makro yang sangat penting

bagi pertumbuhan tanaman, namun kandungannya di dalam tanaman lebih rendah

dibanding nitrogen (N), kalium (K), dan kalsium (Ca). Pemupukan fosfat sering

tidak efisien karena fosfat terikat dalam bentuk yang tidak tersedia bagi tanaman.

Untuk meningkatkan efisiensi pemupukan fosfat, saat ini mulai dikembangkan

pemanfaatan mikroba pelarut fosfat, salah satunya adalah bakteri pelarut fosfat

(BPF). Pemanfaatan BPF dinilai dapat dijadikan sebagai suatu alternatif yang

sangat potensial untuk dikembangkan dalam mencari pemecahan masalah

efektivitas ketersediaan unsur P di dalam tanah. Oleh karena itu, dilakukan

penelitian ini yang bertujuan untuk melakukan isolasi, karakterisasi, dan

identifikasi BPF dari beberapa lokasi di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan

Nusa Tenggara Timur (NTT) yang memiliki kemampuan melarutkan P tertinggi

serta mengetahui jenis bakteri tersebut melalui identifikasi molekuler berdasarkan

amplifikasi gen 16S rRNA.

Sampel tanah yang digunakan sebagai sumber isolat BPF diperoleh dari

areal Kebun Percobaan IPB Cikabayan (Bogor, Jawa Barat), Citeureup (Bogor,

Jawa Barat), Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT).

Kegiatan penelitian dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu isolasi BPF dalam

medium Pikovskaya, karakterisasi dan pengujian BPF dalam melarutkan P,

pengujian BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase dan zat pemacu tumbuh

indole acetic acid (IAA), serta pewarnaan Gram. Tiga isolat unggul terpilih, yaitu

P 3.5 (NTT), P 6.2 (NTB), dan P 10.1 (Citeureup, Bogor). Selanjutnya terhadap

ketiga isolat terpilih tersebut dilakukan beberapa pengukuran, yaitu pengukuran

pertumbuhan populasi, perubahan pH pada medium Pikovskaya cair, pengujian

BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase, dan identifikasi molekuler.

Berdasarkan hasil isolasi sampel tanah Kebun Percobaan IPB Cikabayan,

Citeureup, NTB, dan NTT diperoleh 29 isolat BPF. Isolat P 10.1 memiliki

kemampuan melarutkan P tertinggi dengan indeks pelarutan (IP) terbesar, yaitu

1.80, enzim fosfatase tertinggi (120.40 ppm), dan penurunan pH tertinggi pada

setiap pengamatan. Isolat P 3.5 dan isolat P 10.1 merupakan bakteri Gram negatif

berbentuk kokus atau bulat, sedangkan isolat P 6.2 merupakan bakteri Gram

negatif berbentuk basilus atau batang. Hasil amplifikasi DNA BPF menggunakan

primer F-63 (5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan primer R-1387 (5’-

GGGCGGCGTGTACAAGGC) menghasilkan satu amplikon atau produk PCR

berukuran sekitar 1300 bp. Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA menunjukkan

bahwa isolat P 3.5 dan isolat P 10.1 memiliki kemiripan sebesar 98% dengan

Gluconacetobacter sp. strain Rh1-MS-CO sedangkan isolat P 6.2 memiliki

kemiripan sebesar 97% dengan Enterobacter sp. strain pp9c.

Kata kunci : isolasi, bakteri pelarut fosfat (BPF), enzim fosfatase, indole acetic

acid (IAA), identifikasi 16S rRNA

3

SUMMARY

RENI KASMITA. Isolation, Characterization, and Molecular Identification of

Phosphate Solubilizing Bacteria (PSB) from Some Soil Samples in Bogor, West

Nusa Tenggara, and East Nusa Tenggara. Supervised by FAHRIZAL HAZRA

and ETTY PRATIWI.

Phosphorus (P) is one of the macro nutrients essential for plant growth, but

its contents in the plants was lower than nitrogen (N), potassium (K), and calcium

(Ca). Phosphate fertilization is often inefficient because the phosphate are fixed

by soil so that is not available for plants. To transform the insoluble forms of

phosphorus into soluble forms, phosphate solubilizing bacteria (PSB) would be

essential. These soil bacteria are capable of solubilizing insoluble compounds and

release phosphorus to soil solution.

The objectives of this research are: (i) to isolate and characterize of PSB

and (ii) to identify of these bacteria based on molecular amplification of 16S

rRNA gene. Soil samples were collected from rhizosphere in Bogor, West Nusa

Tenggara, and East Nusa Tenggara. Several stages in this research are: (i)

isolation PSB in Pikovskaya agar, (ii) morphological and biochemical

characterization of PSB, (iii) measurement of phosphatase enzymes, and (iv)

measurement of secreting indole acetic acid phytohormone.

We have collected 29 isolates of PSB and three isolates of them, namely: P

3.5 (East Nusa Tenggara), P 6.2 (West Nusa Tenggara), and P 10.1 (Citeureup,

West Java) were chosen for further study. There are many characteristics of

isolate P 10.1: (i) it has capable to solubilize P with the value of highest

solubilization index (1.80), (ii) it has the highest phosphatase enzyme (120.40

ppm), and (iii) it has the highest pH decrease at each observation for six days.

Isolates P 3.5 and P 10.1 are the Gram-negative bacteria with coccus shapes and

isolate P 6.2 is a Gram-negative bacteria with bacillus shape. DNA amplification

of these bacteria employing 16S rRNA primers generated the 1300bp-PCR

product. The results of the analysis of 16S rRNA gene sequences showed that

isolates P 3.5 and P 10.1 has 98% similarity with Gluconacetobacter sp. strains

Rg1-MS-CO and isolate P 6.2 has 97% similarity with Enterobacter sp. pp9c

strains.

Keywords : isolation, phosphate solubilizing bacteria (PSB), phosphatase

enzymes, indole acetic acid, identification 16S rRNA

4

ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN IDENTIFIKASI

MOLEKULER BAKTERI PELARUT FOSFAT (BPF) DARI

BEBERAPA SAMPEL TANAH DI BOGOR, NUSA TENGGARA

BARAT (NTB), DAN NUSA TENGGARA TIMUR (NTT)

RENI KASMITA

A14051794

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian

Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN ILMU TANAH DAN SUMBERDAYA LAHAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2010

5

Judul Skripsi : Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Molekuler Bakteri

Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah di

Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara

Timur (NTT)

Nama : Reni Kasmita

NIM : A14051794

Menyetujui

Pembimbing I, Pembimbing II,

(Ir. Fahrizal Hazra, M.Sc) (Dr. Ir. Etty Pratiwi, M.Si)

NIP. 19631120 198903 1 002 NIP. 19630419 199203 2 001

Mengetahui :

Ketua Departemen

(Dr. Ir. Syaiful Anwar, M.Sc)

NIP. 19621113 198703 1 003

Tanggal Lulus :

6

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 21 September 1987. Penulis

merupakan anak keempat dari lima bersaudara pasangan Bapak Zubir Siak dan

Ibu Yusmarni.

Penulis mengawali pendidikan di SD Negeri Cakung Barat 013 Pagi,

Jakarta Timur pada tahun 1993. Pada tahun 2000, penulis melanjutkan

pendidikan di SMP Negeri 144 Jakarta Timur. Pendidikan sekolah menengah atas

ditempuh penulis di SMA Negeri 89 Jakarta Timur pada tahun 2002. Pada tahun

2005, penulis diterima sebagai mahasiswa Institut Pertanian Bogor melalui jalur

Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Pada tahun 2006, melalui program

Mayor-Minor penulis diterima di Mayor Manajemen Sumberdaya Lahan,

Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut

Pertanian Bogor.

Selama menjadi mahasiswa di Institut Pertanian Bogor, penulis aktif

dalam organisasi, yaitu Himpunan Mahasiswa Ilmu Tanah (HMIT) pada tahun

2007 sampai 2008. Penulis juga aktif mengikuti seminar dan menjadi panitia

berbagai kegiatan diantaranya, yaitu Seminar Nasional “Evaluasi Sewindu

Reformasi”, Pelatihan Program Kreativitas Mahasiswa (PPKM), Workshop

Penulisan Karya Tulis Ilmiah, panitia Masa Perkenalan Departemen (MPD) Ilmu

Tanah dan Sumberdaya Lahan pada tahun 2007, panitia Masa Perkenalan Fakultas

(MPF) Pertanian pada tahun 2007, panitia Seminar Nasional ”Soil and Mining”

pada tahun 2008, dan panitia kegiatan bakti lingkungan “Water Concervation

Campaign” dalam rangka memperingati Hari Air Sedunia. Selama menjadi

mahasiswa penulis mendapatkan beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa (BBM).

Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Bioteknologi Tanah pada

tahun 2008.

i

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT atas rahmat dan

hidayahNya sehingga penulisan skripsi dengan judul ”Isolasi, Karakterisasi, dan

Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah

di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT)” ini bisa

diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Pertanian di Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya

Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selesainya penelitian ini

tentunya tidak terlepas dari bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh

karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada :

1. Ir. Fahrizal Hazra, M.Sc dan Dr. Ir. Etty Pratiwi, M.Si selaku dosen

pembimbing skripsi yang telah membimbing dengan penuh kesabaran dan

ketulusan, sehingga penulis berhasil menyelesaikan penelitian dan skripsi

ini dengan baik.

2. Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa, M.Sc selaku dosen penguji yang telah

bersedia meluangkan waktu dan memberi banyak masukkan bagi penulis.

3. Papa dan Mama tercinta, Bang Indra dan Mba Diyah, Bang Andre dan

Mba Fany, Kak Ita, adikku Ibnu, dan keponakanku Queenza serta seluruh

keluarga besar yang telah memberikan kasih sayang, perhatian, dukungan,

semangat, dan telah mengajarkan arti hidup yang sebenarnya sehingga

penulis bisa menjalani hidup dengan lebih baik. A’Eko untuk perhatian,

dukungan, semangat, serta kesabarannya hingga penelitian dan skripsi ini

selesai.

4. Dr. Ir. Komaruddin Idris, MS selaku dosen pembimbing akademik yang

telah memberikan bimbingan kepada penulis selama masa perkuliahan.

5. Seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian

(BB.Biogen) : Ibu Susi, Ibu Selly, Ibu Titi, Ibu Aminah, Pak Jajang, Pak

Eep, Ibu Yuli, dan Mas Alam yang telah memberikan bantuan dalam

pelaksanaan penelitian ini.

6. Seluruh staf Laboratorium Bioteknologi Tanah dan staf Departemen Ilmu

Tanah dan Sumberdaya Lahan : Ibu Asih, Ibu Julaeha, Pak Sarjito, Mba

ii

Hesti, Mba Iko, Ibu Tini atas dukungan dan bantuannya. Semua teman-

teman Laboratorium Bioteknologi Tanah dan teman-teman MSL

khususnya MSL ’42 : Dena, Ali, dan lainnya terima kasih atas dukungan

dan kebersamaannya selama ini.

7. Sahabat-sahabatku : Shanty, Linda, Rizma, dan Nana. Kalian semua telah

menorehkan warna indah dalam hidupku. Teman seperjuangan penelitian

dan satu pembimbing : Xenia, Andri, dan Adi. Semoga kebersamaan ini

tidak hanya sampai disini dan bisa berlanjut sampai kapan pun. Teman-

teman kostan Mega : Mba Ririn, Mba Mona, Mba Tuti, Mba Vivin, Eno,

Mpit, Mila, Esti, dan Della yang telah memberikan bantuan, dukungan,

semangat, dan perhatiannya selama ini. Serta semua pihak yang tidak bisa

disebutkan satu persatu yang telah membantu dalam pelaksanaan

penelitian ini.

Akhir kata, penulis sangat menyadari bahwa tulisan ini sangat jauh dari

sempurna. Namun demikian, penulis berharap tulisan ini akan bermanfaat dan

dapat dijadikan sebagai salah satu kajian awal yang dapat menginspirasi

penelitian-penelitian berikutnya yang lebih baik. Terima kasih.

Bogor, Februari 2010

Penulis

iii

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ...................................................................................... i

DAFTAR TABEL ............................................................................................ v

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ vi

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... vii

I. PENDAHULUAN ......................................................................................... 1

1. 1. Latar Belakang ............................................................................... 1

1. 2. Tujuan ............................................................................................. 2

II. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................. 3

2. 1. Senyawa P di Dalam Tanah ........................................................... 3

2. 1. 1. P-Organik ........................................................................... 4

2. 1. 2. P-Anorganik ....................................................................... 4

2. 2. Peranan P Dalam Tanaman ............................................................ 5

2. 3. Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) .......................................................... 6

2. 4. Deoxyribonucleic Acid (DNA) ....................................................... 8

2. 5. Identifikasi Molekuler melalui Amplifikasi Gen 16S rRNA ......... 8

2. 6. Elektroforesis Gel Agarosa ............................................................ 9

2. 7. Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................ 10

III. BAHAN DAN METODE .......................................................................... 13

3. 1. Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................ 13

3. 2. Bahan dan Alat ............................................................................... 13

3. 3. Metode Penelitian ........................................................................... 14

3. 3. 1. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah di sekitar

Perakaran (Rizosfer) ........................................................... 14

3. 3. 2. Karakterisasi dan Pengujian Kemampuan Bakteri

Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P ..................................... 14

3. 3. 3. Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan

Enzim Fosfatase ................................................................... 15

3. 3. 4 Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan

Zat Pemacu Tumbuh Indole Acetic Acid (IAA). ................. 16

3. 3. 5 Pengujian Pewarnaan Gram Bakteri Pelarut Fosfat ........... 17

3. 3. 6. Pengukuran Pertumbuhan Populasi, pH, dan Kandungan

Enzim Fosfatase Bakteri Pelarut Fosfat .............................. 17

3. 3. 7. Identifikasi Molekuler ........................................................ 18

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................. 21

4. 1. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat ........................................................... 21

4. 2. Karakteristik dan Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat

dalam Melarutkan P ......................................................................... 22

iv

4. 3. Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan

Enzim Fosfatase dan Zat Pengatur Tumbuh Indole Acetic Acid

(IAA) serta Karakterisasi Pewarnaan Gram .................................... 25

4. 4. Pertumbuhan Populasi, pH, dan Kandungan Enzim Fosfatase

Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih ...................................................... 30

4. 5. Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat ................................ 34

4. 5. 1. Isolasi DNA ........................................................................ 34

4. 5. 2. Elektroforesis Gel Agarosa ................................................. 36

4. 5. 3. Amplifikasi Gen 16S rRNA ............................................... 36

4. 5. 4. Sekuensing DNA Bakteri Pelarut Fosfat ............................ 37

V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 41

5. 1. Kesimpulan ..................................................................................... 41

5. 2. Saran ............................................................................................... 41

VI. DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 42

LAMPIRAN ...................................................................................................... 45