BAB IV METODOLOGI PENELITIAN - eprints.umm.ac.ideprints.umm.ac.id/56085/9/BAB IV.pdf · Penelitian...
Transcript of BAB IV METODOLOGI PENELITIAN - eprints.umm.ac.ideprints.umm.ac.id/56085/9/BAB IV.pdf · Penelitian...
-
31
BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental dan
metode yang digunakan adalah post test only control group design yaitu
rancangan penelitian yang hasil penelitiannya diamati setelah perlakuan
selesai.
4.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas
Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dengan estimasi waktu
selama 3 minggu di Bulan Desember 2018-Januari 2019.
4.3 Populasi dan Sampel
4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus
norvegicus) strain wistar.
4.3.2 Sampel
Sampel yang digunakan adalah tikus putih jantan diambil dari
populasi yang sesuai kriteria inklusi.
4.3.3 Besar Sampel
Terdapat 5 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol negatif
(-), kelompok kontrol positif (+), dan 3 kelompok perlakuan. Penentuan
besar replikasi sampel dalam penelitian ditentukan menggunakan
-
32
rumus pada Sample Size Calculation in Animal Studies tahun 2017,
yakni sebagai berikut:
Tabel 4.1 Rumus penentuan jumlah sampel Annova Design
Application Minimum n/grup
Maximum n/grup
One-way Annova
Group Comparasion 10/k +1 20/k+1
(Ari, 2017)
Keterangan:
n : Jumlah subjek tiap kelompok
k : Jumlah kelompok
Sesuai dengan rumus tersebut maka untuk mendapat sampel atau
jumlah subjek tiap kelompoknya dapat dikalkulasikan sebagai
berikut :
Jumlah sampel minimum
N = 10/k +1
n = 10/5 +1
n = 2 +1
n = 3
Jumlah sampel maksimum
n = 20/k +1
n = 20/5 +1
n = 4 + 1
n = 5
-
33
Sehingga dalam penelitian ini jumlah sampel tiap kelompoknya
adalah 3. Sehingga, jika dijumlahkan pada peneliatian ini digunakan
kurang lebih 15 sampel.
4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel
Sampel penelitian diambil dengan teknik simple random
sampling dari populasi tikus putih jantan strain wistar.
4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian
a. Kriteria Inklusi :
1. Tikus jantan Strain Wistar
2. Umur 2-3 bulan
3. Berat badan 180-200gram
4. Sehat, ditandai dengan gerakan aktif, bulu berwarna putih,
dan mata jernih
b. Kriteria Ekslusi :
1. Tikus yang pernah menjadi sampel penelitian lain
2. Tikus sakit yang ditandai dengan tidak adanya gerakan atau
gerakan pasif, dan matanya tidak jernih.
c. Kriteria Drop Out :
1. Tikus yang mati ketika perlakuan
4.3.6 Variabel Penelitian
a. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian dosis
ekstrak daun kecapi (Sandoricum koetjape).
-
34
b. Variabel Tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar
malondialdehid pada tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar)
model dislipidemia.
4.3.7 Definisi Operasional
a. Daun kecapi yang digunakan yaitu daun kecapi dengan kondisi
sehat yang ditandai dengan warna hijau tua, bersih, dan tidak
kering. Daun kecapi ini didapatkan dari perkebunan kecapi di
Madura sebanyak 3 kg. Determinasi daun kecapi dilakukan di
Materia Medika. Daun kecapi yang didapatkan kemudian
dikeringkan dan diekstrak dengan metode maserasi dimana
masing-masing dosis ekstrak 1,33mg/200grBB;
2,66mg/200grBB; 5,32mg/200grBB (diperoleh dari hasil
perhitungan konversi tabel 4.1). Variabel ini termasuk dalam
skala kategorik (ordinal).
b. Induksi dislipidemia dengan pemberian diet tinggi lemak yang
mengandung minyak jelantah (Suwandi, 2012). Minyak jelantah
dalam penelitian ini diambil dari pedagang gorengan di Kota
Malang dan diberikan dengan metode sonde per oral sebanyak 2,5
ml minyak jelantah dengan penggorengan lebih dari 20 kali
ditambah dengan pakan standar BR-1 (Ulilalbab, et al., 2012).
Perlakuan tersebut diberikan 1x/hari selama 14 hari. Bahan untuk
induksi dislipidemia ini didapatkan dari pedagang pasar setempat
serta toko pakan ternak di kota Malang.
-
35
c. Kadar malondialdehid (MDA) diukur dalam mg/dL dengan
metode TBARS (2-Thiobarbituric Acid Reactive Substance) dari
darah setiap tikus sebanyak 3 ml yang diambil dari spuit (Septiana
& Ardiaria, 2016). Variabel ini menggunakan skala data numerik
(ratio).
4.4 Alat dan Bahan Penelitian
4.4.1 Alat Pemilaharaan Tikus
a. Kandang tikus dan penutup
b. Tempat makan dan minum
c. Timbangan analitik Ohaus dengan ketelitian 0,0001 %
d. Sekam
4.4.2 Perlakuan dan pembedahan
a. Handscoon
b. Masker
c. Tisu
d. Sonde modifikasi
e. Spuit 5cc
f. Neraca berat badan
g. Label
h. Toples klorofom
i. Spons untuk pengambilan klorofom
j. Minor set dan papan bedah
-
36
4.4.2 Alat pengabilan sampel darah tikus
a. Jarum
b. Pipet mikro 50µi
c. Tabung evendoff 3cc dan 1,5cc
d. Sentrifuge
4.4.3 Alat lain
a. Rak dan tabung reaksi
b. Erlenmeyer
c. Gelas ukur
d. Vaccum fezer dyer
e. Kamera digital
4.4.4 Bahan
a. Daun kecapi sebanyak 3 kg
b. Etanol
c. Minyak jelantah
d. Pakan standar BR-1
e. Klorofom (Dewi, Iskandarsyah & Octarina, 2014)
4.5 Prosedur Penelitian
4.5.1 Proses Adaptasi
Tikus diadaptasikan selama 7 hari dan dilakukan pengelompokan
secara acak menjadi 5 kelompok. Tiap kelompok terdiri atas 3 ekor
tikus yang diletakkan di dalam kandang. Masing-masing kandang berisi
1 sampai 2 tikus. Bahan pakan normal BR-1 diberikan 1x/hari dengan
-
37
pemberian minum aquades secukupnya pada masing-masing
kelompok. Sebelum dan sesudah proses adaptasi, tikus ditimbang berat
badannya. Adaptasi bertujuan agar tikus menyesuaikan dulu dengan
lingkungan baru.
4.5.2 Pengelompokan Tikus
Pengelompokan tikus ini berdasarkan perlakuan yang dilakukan
dalam penelitian. Perlakuan dan pengelompokan tikus dalam penelitian
ini ada 5, yaitu:
a. Kelompok I kontrol negatif : Diberi pakan standar BR-1 sebanyak
40 g/hari/tikus serta minum ad libitum selama 14 hari, tanpa
pemberian minyak jelantah dan ekstrak daun kecapi.
b. Kelompok II kontrol positif : Diberi pakan standar BR-1
sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum ad libitum ditambah diet
tinggi lemak berupa minyak jelantah yang diberikan dengan
metode sonde lambung sebanyak 2,5 ml/hari selama 14 hari,
tanpa pemberian ekstrak daun kecapi.
c. Kelompok III: Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hr/tikus
serta minum ad libitum ditambah diet tinggi lemak berupa
minyak jelantah sebanyak 2,5 ml/hari dan ekstrak daun kecapi
(Sandoricum koetjape) dengan dosis 1,33 mg/200grBB/hari
dengan metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 14
hari.
d. Kelompok IV: Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hr/tikus
serta minum ad libitum ditambah diet tinggi lemak berupa
-
38
minyak jelantah sebanyak 2,5 ml/hari dan ekstrak daun kecapi
(Sandoricum koetjape) dengan dosis 2,66 mg/200grBB/hari
dengan metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 14
hari.
e. Kelompok V: Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hr/tikus
serta minum ad libitum ditambah diet tinggi lemak berupa
minyak jelantah sebanyak 2,5 ml/hari dan ekstrak daun kecapi
(Sandoricum koetjape) dengan dosis 5,32 mg/kgBB/hari dengan
metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 14 hari.
4.5.3 Pembuatan Ekstrak Daun Kecapi
Daun yang sudah diambil sebanyak 3 kg, kemudian dicuci
menggunakan air dan dibilas dengan aquades steril kemudian daun
dikeringkan dalam oven suhu 400○C. Daun yang sudah kering
kemudian di blender hingga halus. Setelah itu serbuk tersebut kemudian
diekstrak menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 80%
sebanyak 1000 ml hingga serbuk benar-benar terendam seluruhnya.
Perendaman dilakukan pada suhu kamar hingga 3 hari dan setiap hari
dilakukan pengadukan selama 5 menit. Setelah 3 hari, hasil maserasi
disaring dengan corong buchner yang dialasi kertas saring. Hasil
ekstraksi selanjutnya dipekatkan dengan menggunakan water bath
sampai dihasilkan ekstrak daun kecapi (Asiani, Sulaiman &
Kurniawan, 2012).
-
39
4.5.4 Dasar Penentuan Dosis Ekstrak Daun Kecapi
Penentuan dosis ekstrak daun kecapi (Sandoricum koetjape)
didasarkan pada penelitian sebelumnya oleh Kartika pada tahun 2016
yang melakukan penelitian tentang ekstrak daun kecapi terhadap kadar
kolesterol, didapatkan dosis yang berpengaruh terhadap penurunan
kadar kolesterol sebesar 19mg/kgBB yang menggunakan hewan coba
mencit (Mus musculus) dengan dosis 0,38mg/20gram mencit. Sehingga
dosis harus di konversi terlebih dahulu karena dalam penelitian ini
peneliti menggunakan hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus strain
wistar). Konversi tersebut berdasarkan tabel dengan perhitungan
sebagai berikut:
n’ = n x 7
keterangan :
n’ = dosis ekstrak daun kecapi (Sandoricum koetjape) tikus putih
n = dosis ekstak daun kecapi (Sandoricum koetjape) mencit jantan
7 = ketetapan konversi untuk mencit ke tikus
Tabel 4.2 Konversi Dosis Antar Spesies
Mencit 20 g
Tikus 200 g
Marmot 400 g
Kelinci 1,5 kg
Anjing 12 kg
Manusia 70 kg
Mencit 20 g
1,0 7,0 12,25 27,8 124,2 387,9
Tikus 200 g
0,14 1,0 1,74 3,9 17,8 56,0
Marmot 400 g
0,08 0,57 1,0 2,25 10,2 31,5
Kelinci 1,5 kg
0,04 0,25 0,44 1,0 4,5 14,2
Anjing 12 kg
0,08 0,06 0,1 0,22 1,0 3,1
-
40
Manusia 70 kg
0,0026 0,018 1,031 0,7 0,32 1,0
(Laurance DR & Bacharah AL, 1964)
Dosis yang diberikan adalah 1/2n’, n’, dan 2n’. Berdasarkan tabel
konversi diatas maka diperoleh perhitungan dosis berikut:
Dosis I = 1/2n’ = ½ (0,38 x 7) = 1,33 mg/200 grBB (dosis rendah)
Dosis II = n’ = 0,38 x 7 = 2,66 mg/200 grBB (dosis sedang)
Dosis III = 2n’ = 2(0,38 x 7) = 5,32 mg/200 grBB (dosis tinggi)
Dosis diubah dalam satuan berat menjadi satuan volume
menggunakan piknometer dengan memperhatikan berat jenis dari suatu
benda. Adapun cara dalam penggunaan piknometer, sebagai berikut.
1. Timbang piknometer kosong yang bersih dan kering dengan
seksama.
2. Isi piknometer dengan ekstrak daun kecapi hingga penuh, tutup
piknometer, lalu masukkan ke dalam lemari pendingin hingga
suhu 20°.
3. Biarkan tabung piknometer terbuka dan suhu air naik sampai
mencapai suhu percobaan, lalu tutup tabung piknometer.
4. Biarkan suhu air dalam piknometer mencapai suhu kamar. Air
yang menempel diusap dengan tisu, timbang dengan seksama.
5. Catat hasilnya.
6. Cara perhitungan :
ρ = mv
-
41
keterangan :
ρ = berat jenis (gr/ml)
m = massa (gr)
v = volume (ml) (Aziz, Yuanita & Susanti, 2010).
4.5.5 Diet Tinggi Lemak
Induksi dislipidemia dilakukan dengan pemberian diet tinggi
lemak yang mengandung minyak jelantah (Suwandi, 2012). Pada
kelompok perlakuan, dilakukan penyondean 2,5 ml minyak jelantah
yang diambil dari pedagang gorengan di Kota Malang dengan
penggorengan lebih dari 20 kali, diberikan dengan metode sonde per
oral ditambah dengan pakan standar BR-1 (Ulilalbab, et al., 2012).
Perlakuan tersebut diberikan 1x/hari selama 14 hari.
4.5.6 Pengambilan Sampel Darah dan Pemusnahan Hewan Coba
Tahap ini dilakukan dengan memasukkan hewan coba ke dalam
toples kaca atau akuarium yang sebelumnya sudah diberi kapas
mengandung kloroform. Pembiusan dilakukan satu persatu secara
inhalasi dengan dosis eter 0,67ml/hewan coba selama 28 detik yang
dihitung menggunakan stopwatch. Tikus yang teranastesi ditandai
dengan tidak adanya respon nyeri. Tikus yang teranastesi diletakkan
pada meja paraffin dan keempat nya difiksasi menggunakan jarum
pentul, kemudian dibedah menggunakan gunting dari abdomen hingga
setinggi leher. Darah diambil pada ventikel kiri sebanyak ±3 cc
-
42
kemudian dipindah ke test tube lalu disentrifuge dengan kecepatan
3000 rpm selama ±15 menit.
Tikus yang telah diambil darah yang akan diteliti dipastikan mati,
bangkai tikus diletakkan dalam wadah baskom. Bangkai tikus
percobaan dikubur di tanah dengan kedalaman minimal 50 cm dan luas
lubang 0,25m². Setiap lubang hanya digunakan untuk mengubur 10
tikus secara bersama, hal ini untuk mencegah bangkai tikus digali oleh
hewan lain seperti kucing. Lubang ditutup kembali dengan tanah lalu
lubang dipadatkan agar tidak tercium bau dari bangkai tikus tersebut.
4.5.7 Pemeriksaan Kadar Malondialdehid
Pemeriksaan kadar malondialdehid dengan metode TBARS (2-
Thiobarbituric Acid Reactive Substance) menggunakan TBARS reagen
kits yang sesuai dengan protap Laboratorium Biomedik Universitas
Muhammadiyah Malang. Analisis dilakukan dengan cara memasukkan
750 µl asam fosfat dimasukkan dengan pipet ke dalam polypropilen
tube 13 mL kemudian ditambahkan sebanyak 250 µl TBA
(Thiobarturic Acid) dan ditambahkan 50 µl standar/sampel dan digojog.
Campur sampai homogen kemudian ditambahkan aquades sebanyak
450 µl ke dalam tabung dan tabung di tutup rapat. Campuran
dipanaskan selama 60 menit, setelah pemanasan tabung ditempatkan
dalam ice bath untuk mendinginkan sampel. Sampel yang sudah dingin
diaplikasikan ke dalam kolom Set-Pak C18. Absorbansi diukur
-
43
menggunakan Spektofotometer dengan panjang gelombang 532 nm
(Septiana & Ardiaria, 2016).
4.6 Analisis Data
Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan
uji one way ANOVA, uji normalitas, uji homogenitas, dan uji regresi dengan
menggunakan program komputasi statistik SPSS 23.
a. Uji one way ANOVA digunakan untuk mengetahui perbedaan kadar
MDA pada setiap perlakuan. Hasil uji ANOVA dikatakan terdapat
pengaruh yang sangat bermakna jika nilai signifikansi (sig) < P=0,05.
Sebelum dilakukannya uji ANOVA perlu dilakukan uji normalitas
menggunakan uji Saphiro Wilk yang bertujuan untuk mengetahui
kenormalan data (data bersifat normal apabila sig > 0,05) dan uji
homogenitas menggunakan uji Levene untuk mengetahui homogenitas
varian dari data-data yang diperoleh (data bersifat homogen jika sig >
0,05). Apabila persebaran data tidak normal (sig
-
44
c. Uji regresi linier sederhana digunakan untuk mengetahui seberapa kuat
pengaruh antara dosis ekstrak daun kecapi dengan penurunan kadar
MDA tikus.
-
45
4.7 Alur Penelitian
Adaptasi Hewan Coba selama 7 hari
Setiap tikus dianastesi dengan 0,67 ml kloroform pekat secara inhalasi
Pengambilan darah dari ventrikel kiri jantung hewan coba sebanyak 3ml
menggunakan spuit 5 ml
Setelah tikus dibedah kemudian tikus dikubur dengan setiap
lubang terdapat 10 tikus
Kelompok I (Kontrol Positif)
Pemberian makan BR-1 dan induksi dislipidemia
selama 14 hari
Kelompok II Pemberian
makan BR-1, induksi
dislipidemia, dan ekstrak daun
kecapi dosis 1,33 mg/200grBB
selama 14 hari
Kelompok III Pemberian
makan BR-1, induksi
dislipidemia, dan ekstrak daun
kecapi dosis 2,66 mg/200grBB
selama 14 hari
Kelompok IV Pemberian
makan BR-1, induksi
dislipidemia, dan ekstrak daun
kecapi dosis 5,32 mg/200grBB
selama 14 hari
Analisa Data Menggunakan uji normalitas, homogenitas, ANOVA, post
hoc test, dan regresi
Pemeriksaan Kadar MDA
Kelompok I (Kontrol Negatif)
Pemberian makan BR-1
selama 14 hari
-
46
4.8 Jadwal Penelitian
Tabel 4.3 Jadwal Penelitian
No. Jenis Kegiatan Minggu 1 2 3 4 1. Adaptasi tikus X 2. Induksi diet tinggi lemak X X 3. Pemberian ekstrak daun kecapi X X 4. Pengecekan parameter X 5 Analisa data X 6. Konsultasi dan revisi X X