Bab IV Hasil dan Pembahasan - Perpustakaan Digital ITB ... · cairan dalam kapiler dapat menarik...

Bab IV Hasil dan Pembahasan

IV.1 Kultur Tanaman Jarak dan Pengambilan Cairan Floem

Pada tahap uji pendahuluan penelitian, dilakukan kultur tanaman dengan

menggunakan metode aeroponik. Keunggulan kultur ini adalah terkontrolnya

kuantitas unsur hara yang diberikan kepada tanaman dan penyerapan unsur hara

tersebut lebih maksimal karena larutan nutrisi disemprotkan secara kontinyu ke

akar tanaman yang tergantung. Namun karena kebutuhan sampel yang relatif

besar (sekitar 40 - 50 pohon untuk sekali panen) sedangkan alat aeroponik yang

ada hanya cukup untuk 12 pohon, maka kemudian dilakukan kultur pot dengan

tanah. Tanah yang digunakan adalah tanah yang terkontrol kualitasnya sehingga

secara statistik dianggap tidak berbeda secara signifikan kandungan unsur hara

yang terkandung.

Untuk mendapatkan sampel cairan floem yang maksimal, pada tahap uji

pendahuluan, dilakukan berbagai variasi pengambilan sampel. Variasi yang

dilakukan adalah umur tanaman, waktu pengambilan, lama pengambilan, tempat

pengambilan, dan proses pengambilan cairan floem. Optimasi pengambilan

dilakukan hanya pada tanaman dengan kultur pot dengan tanah.

Pada Tabel IV. 1 dapat dilihat pengaruh umur tanaman terhadap volume sampel

yang diperoleh per tanaman. Tanaman dengan umur 5 hingga 6 pekan masih

relatif muda sehingga sulit untuk mendapatkan cairan floem dalam jumlah

banyak. Hal ini kemungkinan disebabkan kanal floem masih relatif muda

sehingga irisan pada kanal yang kurang hati-hati, dapat sampai menembus lapisan

xilem. Pada tanaman dengan umur 7 – 8 pekan mulai dapat teridentifikasi dengan

baik sehingga dapat diperoleh sampel dengan jumlah relatif lebih banyak.

Pada umur 9-10 pekan tidak ada pertambahan jumlah sampel yang signifikan

dibandingkan dengan pada umur 7-8 pekan. Dengan demikian umur panen

tanaman jarak yang optimal adalah 7-8 pekan.

55

Tabel IV. 1 Pengaruh umur tanaman terhadap volume cairan sampel yang dihasilkan.

Umur tanaman (pekan) Jumlah cairan floem/tanaman (µL)

5 42 ± 25

6 44 ± 22

7 64 ± 37

8 57 ± 33

9 53 ± 30

10 57 ± 25

Hal yang perlu dicermati adalah tingginya standar deviasi cairan yang dihasilkan

untuk setiap tanaman. Dalam beberapa kasus terkadang satu tanaman hanya

mengeluarkan sekali cairannya setelah itu laju eksudasi berkurang drastis, atau

dengan kata lain tidak ada lagi cairan yang keluar. Hal ini disebabkan karena

terbentuknya callose atau filamen protein yang menutup pori kanal floem yang

dikenal sebagai hipotesis ´ blocked pore ` (Milburn, 1970). Sehingga ada tanaman

yang hanya menghasilkan sekitar 20 µL cairan floem, namun ada juga yang dapat

sampai 100 µL per tanaman.

Pengambilan cairan floem dilakukan pada saat proses transpirasi berlangsung.

Berdasarkan pengamatan yang dilakukan, waktu optimal pengambilan adalah

pukul 8 – pukul 12 siang hari. Lama pengambilan umumnya 2 jam untuk setiap

tanaman. Untuk menghindari kontaminasi dan perubahan komposisi cairan floem,

tanaman hanya digunakan hanya untuk sekali pengambilan.

Pengambilan cairan floem dilakukan di ruang pengambilan sampel dalam rumah

kaca. Pernah dilakukan pengambilan cairan floem dalam laboratorium higienis

dengan tujuan untuk meminimalisasi kemungkinan kontaminasi, namun cairan

floem yang tereksudasi sangat sedikit. Hal ini kemungkinan disebabkan kondisi

laboratorium higenis menimbulkan stress pada tanaman. Kemungkinan lain

56

adalah rendahnya laju transpirasi dalam laboratorium higenis sehingga aliran air

dalam floem menurun. Pomper dan Grusak (2004) telah melakukan penelitian

tentang total Ca dalam cairan xilem snap bean. Hasil penelitiannya menunjukkan

kandungan Ca dalam tanaman lebih tinggi jika pengambilan xilem dilakukan

dalam rumah kaca dibandingkan dalam ruang pertumbuhan (growth chamber).

Hal ini disebabkan laju transpirasi tanaman dalam ruang pertumbuhan lebih besar

dibandingkan dalam rumah kaca. Laju transpirasi yang tinggi menyebabkan

penyerapan air yang tinggi sehingga menurunkan kadar Ca dalam xilem.

Proses pengambilan cairan floem merupakan salah satu langkah yang penting,

karena diperlukan keahlian tertentu agar diperoleh sampel yang banyak. Selain

itu, diperlukan teknik khusus untuk menjaga sampel dari kontaminan dan

terjadinya perubahan komposisi misalnya akibat pengaruh suhu ruang. Beberapa

peneliti sebelumnya (Milburn, 1970; Wiersum, 1979) mengambil cairan floem

seperti teknik mengambil getah karet. Pipa kapiler dilekatkan pada irisan kanal

floem yang diletakkan secara horisontal. Sehingga adanya tegangan permukaan

cairan dalam kapiler dapat menarik cairan floem dari kanal floem menuju pipa

kapiler. Ujung lain pipa kapiler dimasukkan dalam bejana untuk menampung

cairan floem. Bejana tersebut terbuka dan pengambilan cairan floem berlangsung

pada suhu kamar selama beberapa jam. Teknik ini tidak dilakukan karena waktu

pengambilan selama 2 jam pada suhu 25-30 °C dapat menyebabkan perubahan

komposisi cairan floem dan rentan kontaminasi karena bejana penampungan

dalam posisi terbuka. Oleh karena itu, cairan floem dibiarkan alami tereksudasi

setelah pengirisan kanal floem, lalu diambil dengan menggunakan pipet mikro

Eppendorf 20 µL dan langsung dimasukkan dalam tabung polipropilen 1,5 mL

yang diletakkan pada permukaan atas termos berisi nitrogen cair. Dengan cara ini

cairan floem yang diperoleh langsung terbekukan pada suhu -80 °C. Sehingga

kemungkinan kontaminan dari udara luar dan perubahan komposisi dapat

diminimalkan. Konsekuensinya, waktu pengambilan sampel berlangsung lebih

lama karena setiap tetes cairan floem yang keluar langsung dibekukan.

57

IV.2 Optimasi Alat ICP-QMS

Selama periode Oktober 2002 sampai dengan Juli 2005 telah dilakukan analisis

pendeteksian selektif unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo dan Cd dalam cairan ploem

maupun dalam fraksi SEC dan PNC PAGE dengan menggunakan ICP-QMS

sebanyak 113 kali. Setiap memulai suatu proses pendeteksian ICP-QMS diberi

nomor analisis sehingga total nomor analisis adalah 113. Setiap hari pendeteksian

dilakukan optimasi harian untuk mengecek kondisi alat, seperti yang telah

dipaparkan pada Tabel III.4 tentang kriteria standar kondisi operasional ICP-QMS

yang harus dipenuhi sebelum analisis sampel dilakukan. Jika kriteria tersebut

tidak terpenuhi maka dilakukan pengecekan alat dan optimasi lengkap.

Pengecekan alat meliputi kondisi pompa peristaltik, suhu pendingin, maupun

kebersihan skimmer cone dan cone sampel. Jika sampel banyak mengandung

senyawa organik, kedua cone akan cepat kotor karena endapan karbon pada cone.

Hal ini sangat nampak pada sampel dengan matriks buffer MES. Umumnya

setelah dua-tiga kali running sampel dengan matriks tersebut, kedua cone harus

dibersihkan.

Pada Gambar IV. 1 ditampilkan data hasil optimasi harian alat berdasarkan

sensitivitas Mg, Rh dan Pb dengan konsentrasi 10 µg/L. Secara umum,

sensitivitas alat terhadap Mg, Rh, dan Pb sangat baik terlihat dari jumlah cacah

perdetik (count per second, cps) yang jauh melebihi standar yang diharuskan

(Tabel III.3). Sebagai contoh 24Mg, 94 % sensitivitas berada pada level di atas

90.000 cps dan hanya sekitar 6 % yang berada pada ambang batas syarat 40.000

cps. Demikian juga dengan sensitivitas terhadap Rh dan Pb. Batas minimal cacah

perdetik untuk Rh dan Pb adalah 200.000 cps, sedangkan data yang diperoleh 85

% berada di atas 400.000 cps untuk Rh dan 83 % berada di atas 300.000 cps untuk

Pb. Sensitivitas alat terhadap Rh103 lebih tinggi dibandingkan terhadap 208Pb

karena 103Rh adalah isotop tunggal, sedangkan kelimpahan relatif isotop 208Pb

hanya 52,4 % dari total Pb.

Walaupun secara keseluruhan data optimasi memenuhi standar kondisi

operasional, namun ada kecenderungan setelah beberapa kali analisis sensitivitas

58

alat menurun. Hal ini dapat disebabkan semakin banyaknya endapan pada cone,

cairan pendingin pada sistem pendingin yang tidak berfungsi baik lagi sehingga

harus diganti, atau minyak pelumas pompa yang sudah menghitam karena

teroksidasi. Jika penurunan cukup signifikan atau tidak memenuhi standar maka

dilakukan optimasi lengkap setelah pengecekan alat. Kurva optimasi ini sangat

penting untuk melihat kondisi operasional alat, sehingga interpretasi data hasil

pengukuran dapat dilakukan dengan lebih baik.

Gambar IV. 1 Data hasil optimasi harian analisis ICP-QMS berdasarkan sensitivitas Mg, Rh, dan Pb

Gangguan elektronik yang terjadi selama pengukuran dapat diamati dengan

mengukur cacah gangguan latar (background noise, Bg) pada m/z 5, 220 dan 260

pada saat optimasi harian. Maksimum cacah Bg adalah 30 cps. Pada Gambar IV. 2

dapat dilihat grafik hubungan nomor analisis dan cacah Bg yang menunjukkan

semua pengukuran memenuhi kriteria kecil dari 30.

59

Gambar IV. 2 Data hasil optimasi harian analisis ICP-QMS berdasarkan jumlah cacah gangguan (Background noise, Bg) pada m/z 5, 220, dan 260 (Bg 5, Bg 220, dan Bg 260)

Pada awal percobaan hingga sampai percobaan ke 20, cacah Bg rata-rata di atas

sepuluh dan cenderung meningkat sampai 25. Indikasi ini menunjukkan

penampilan alat ICP-QMS cenderung menurun dengan meningkatnya cacah Bg,

sehingga diperlukan optimasi bulanan dan penggantian detektor maupun cone.

Selain itu, tingginya noise juga disebabkan oleh kondisi laboratorium yang kurang

kondusif. Pada saat awal analisis sampai analisis ke 20 pengukuran dilakukan

dalam laboratorium darurat karena laboratorium sedang direnovasi. Percobaan ke

21 dan selanjutnya dilakukan dalam laboratorium yang baru direnovasi dengan

menggunakan alat yang sama tetapi dengan detektor quadrupole dan cone yang

baru. Pada kondisi tersebut, gangguan elektronik dapat diperkecil yang ditandai

dengan cacah Bg stabil pada kisaran 3-5 cps. Grafik ini sangat membantu dalam

meninjau penampilan alat ICP-QMS berdasarkan gangguan elektronik yang

terjadi.

Analisis ICP-QMS adalah suatu analisis yang berdasarkan pengukuran m/z, yaitu

ion positif bermuatan satu. Dengan demikian, diharapkan semua atom terionisasi

60

membentuk ion M+. Namun kenyataannya, ada sebagian atom analit yang

terionisasi membentuk ion bermuatan positif lebih dari satu atau teroksidasi. Oleh

karena itu perlu diamati laju pembentukan oksida dan pembentukan ion positif

bermuatan dua dalam optimasi harian. Berdasarkan penelitian, unsur yang mudah

teroksidasi dalam analisis ICP-QMS adalah Ce, sehingga angka banding CeO dan

Ce dapat digunakan sebagai indikator laju pembentukan oksida analit. Demikian

juga halnya Barium, adalah unsur yang paling mudah terionisasi membentuk Ba2+,

sehingga digunakan sebagai indikator pembentukan ion positif dua.

Pada Gambar IV. 3 ditampilkan grafik hubungan nomor analisis dengan angka

banding laju pembentukan oksida dan ion positif dua. Secara garis besar optimasi

ini memenuhi kriteria standar analisis yaitu angka banding kecil dari 0,03 (3%).

Beberapa percobaan pada tahap akhir penelitian dilakukan dengan kondisi sedikit

di atas angka banding 0,03 untuk laju pembentukan oksida. Kondisi ini tidak

dimaksudkan untuk mengabaikan kriteria standar, namun dengan pertimbangan

laju pembentukan oksida analit yang diteliti jauh lebih rendah dibandingkan

dengan cerium sehingga angka banding CeO/Ce sedikit di atas 0,03 tidak

berpengaruh secara signifikan terhadap analisis. Pertimbangan lain adalah pada

analisis tahap lanjut, jumlah analit dalam sampel semakin mengecil sehingga

tujuan optimasi harian lebih dititik beratkan pada perolehan cps Rh yang

maksimal yang merupakan indikator kepekaan alat terhadap analit.

Pada Gambar IV. 3 terlihat ada kecenderungan peningkatan laju pembentukan

oksida dan pembentukan ion positif dua setelah beberapa kali percobaan, yang

menunjukkan bahwa penampilan alat ICP-QMS menurun dan merupakan indikasi

untuk melakukan optimasi lengkap. Pada Lampiran F ditampilkan data hasil

optimasi Alat ICP-QMS.

61

Gambar IV. 3 Data hasil optimasi harian analisis ICP-QMS berdasarkan laju pembentukan ion positif 2 (Ba2+/Ba) dan pembentukan oksida (CeO/Ce)

IV.3 Validasi metode destruksi dan analisis total unsur dengan ICP-QMS.

Masalah utama yang harus diselesaikan dalam proses analisis adalah persiapan

sampel yang handal untuk menghindari hilangnya sampel dan kontaminasi. Oleh

karena itu dilakukan perhitungan persen perolehan kembali material rujukan

standar untuk mengetahui apakah metode destruksi dan metode analisis ICP-QMS

yang dikembangkan valid untuk sampel yang dianalisis (Koplik dkk., 1998;

Quevauviller, 2003). Validasi dilakukan dengan menggunakan material rujukan

standar daun tanaman poplar (poplar leaves) serta ranting dan daun tanaman

semak (bush twigs and leaves). Proses destruksi cairan floem dan material rujukan

standar dilakukan pada saat bersamaan dengan penambahan pereaksi yang sama.

Pada Tabel IV. 2 ditampilkan data hasil analisis material rujukan standar daun

tanaman poplar (poplar leaves) serta ranting dan daun tanaman semak (bush twigs

and leaves). Data tersebut kemudian diuji secara statistik menggunakan t-tes satu

sampel untuk mengetahui apakah data hasil analisis bersesuaian dengan nilai

tersertifikasi. Uji statistik ini dilakukan dengan program SPSS versi 11,5. Jenis uji

yang dilakukan adalah dua sisi dengan hipotesis H0 diterima jika rerata sampel

sama dengan µ0 sebaliknya H0 ditolak jika rerata sampel tidak sama dengan µ0.

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

0 20 40 60 80 100 120Nomor Analisis

Ba /Ba2+

CeO/Ce

Nila

i ban

ding

62

Dalam hal ini µ0 adalah nilai tersertifikasi masing-masing logam. Tingkat

signifikansi yang digunakan adalah 95 %.

Tabel IV. 2 Hasil analisis material rujukan (reference) standar*. Ranting tanaman semak

(bush twigs) Daun tanaman semak

(bush leaves) Daun tanaman poplar

(poplar leaves) Unsur

Hasil analisis

Nilai tersertifikasi

Hasil analisis


Hasil analisis


Mg 0,285 ± 0,014

0,287 ± 0,011

0,469 ± 0,060

0,48 ± 0,03 0,722 ± 0,062

0,65 ± 0,03

Ca 2,172 ± 0,136

2,22 ± 0,07

1,672 ± 0,116

1,68 ± 0,06 1,623 ± 0,435

1,81 ± 0,07

Mn 58,188 ± 4,151

58 ± 3 62,458 ± 5,248

61 ± 3 48,433 ± 4,352

45 ± 2

Zn 21,157 ± 1,325

20,6 ± 1,0 56,717 ± 4,634

55 ± 2 40,816 ± 8,520

37 ± 1

Mo 0,264 ± 0,049

0,26 ± 0,03 0,287 ± 0,057

0,28 ± 0,03 0,184 ± 0,035

0,18 ± 0,01

Cd 0,147 ± 0,020

0,14 ± 0,01 0,416 ± 0,010

(0,38) 0,361 ± 0,040

0,32 ± 0,05

*Satuan konsentrasi untuk Mg dan Ca dalam persen sedangkan unsur lain dalam µg/g. (n = 3; berat sampel = ± 100 mg)(Anonim, 1990).

Berdasarkan uji statistik t-tes satu sampel (Lampiran G) yang dilakukan ketahui

bahwa secara keseluruhan tidak ada perbedaan signifikan konsentrasi logam hasil

analisis material rujukan standar dengan nilai tersertifikasi kecuali untuk analisis

Cd dalam daun tanaman semak (bush leaves). Nilai sertifikasi Cd dalam daun

tanaman semak (bush leaves) merupakan nilai semikuantitatif, dimana dalam

sertifikat hanya dituliskan (0,38) tanpa nilai standar deviasi (Tabel IV.2). Nilai

tersebut menunjukkan sulitnya untuk menentukan total Cd dalam daun tanaman

semak (bush leaves) secara eksak walaupun kisaran total Cd dalam daun tanaman

semak (bush leaves) lebih besar dibandingkan dalam daun tanaman poplar (poplar

leaves) dan ranting tanaman semak (bush twigs). Secara keseluruhan dapat

disimpulkan bahwa metoda destruksi dan analisis total unsur dengan metode ICP-

QMS yang dikembangkan dapat digunakan untuk analisis total unsur cairan floem

dalam tanaman jarak serta untuk analisis selektif unsur dalam fraksi SEC dan

QPNC PAGE.

63

Pada Tabel IV.3 tertera data hasil analisis total unsur dalam cairan floem tanaman

jarak. Secara umum dapat dilihat bahwa perbedaan media kultur tidak

berpengaruh secara signifikan terhadap total Mg dan Zn, namun berpengaruh

terhadap Ca, Mn, Mo dan Cd. Kandungan Mn, Mo, dan Cd dalam cairan floem

lebih tinggi dengan media aeroponik sebaliknya kandungan Ca lebih rendah.

Fenomena ini sangat menarik, karena umumnya penyerapan larutan nutrisi dengan

media aeroponik lebih baik dibandingkan dengan media pot dan serapan logam

yang tinggi berbanding lurus dengan kandungan logam dalam floem. Fenomena

ini juga ditemukan oleh Grusak dkk (1996) dalam Pomper dan Grusak (2004)

yang menyatakan bahwa konsentrasi Ca dalam xilem kacang polong pada

tanaman yang dikulturkan dengan media hidroponik lebih rendah dibandingkan

pada tanaman yang ditumbuhkan pada lahan tanah.

Tabel IV. 3 Hasil analisis total unsur dalam cairan floem tanaman jarak*. Logam Aeroponik Pot

Mg 131,129 ± 15,782 114,953 ± 10,639Ca 50,136 ± 7,117 70,454 ± 6,244Mn 576,754 ± 70,781 394,989 ± 59,116Zn 6,396 ± 0,333 5,574 ± 0,458Mo 505,072 ± 21,737 65,719 ± 5,828Cd 3,735 ± 1,015 2,278 ± 0,226

*Satuan konsentrasi dalam mg/L untuk Ca, Mg, dan Zn dan µg/L untuk Mn, Mo, dan Cd. (n = 3; berat sampel = ± 300 - 500 mg)

IV.4 Pemisahan spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo dan Cd dengan SEC

Pemisahan tahap I cairan floem dilakukan dengan menggunakan metode SEC.

Ada dua kolom yang digunakan pada penelitian ini yaitu kolom sephadex G-50

SF dan kolom sephadex G-25 M. Pemisahan utama dilakukan dengan

menggunakan kolom sephadex G-50 SF sedangkan pemisahan preparatif dengan

tujuan pemisahan lebih lanjut digunakan kolom sephadex G-25 M. Kondisi

operasional pemisahan SEC telah ditampilkan pada Tabel III.6.

IV.4.1 Kalibrasi kolom sephadex G-50

Kolom sephadex G-50 SF dikalibrasi dengan menggunakan kit campuran standar

penanda berat molekul yang terdiri dari thyroglobulin (670 kDa), bovin globulin

64

(158 kDa), chicken ovalbumin (44 kDa), equine myoglobin (17,5 kDa), dan

vitamin B12 (1,35 kDa). Pada Gambar IV. 4 dapat dilihat profil serapan UV

campuran standar tersebut.

Pada Gambar IV. 4 terlihat protein A dan B terelusi pada volume mati,

sebagaimana diketahui bahwa range fraksinasi gel ini adalah 1,5 – 30 kDa untuk

protein globular dan 0,5 – 10 kDa untuk dekstran (Tabel III.6), sehingga semua

protein diatas 30 kDa akan terelusi pada volume mati. Keunggulan metode

pemisahan yang dikembangkan adalah kemampuan untuk memisahkan ovalbumin

(puncak C) yang berat molekulnya 44 kDa dari thyroglobulin dan bovin globulin.

Keunggulan tersebut menunjukkan metode pemisahan yang dikembangkan

mempunyai resolusi lebih tinggi dari kisaran teoritis berat molekul relatif pada

volume mati kolom sephadex G-50 SF. Oleh karena itu, puncak yang muncul

pada volume mati akan dinotasikan mempunyai berat molekul besar lebih dari 44

kDa dan bukan 30 kDa.

Gambar IV. 4 Profil elusi kalibrasi kolom sephadex G-50 SF (buffer MES). A (5 mg thyroglobulin, 670 kDa), B (5 mg bovin globulin, 158 kDa), C (5 mg chicken ovalbumin, 44 kDa), D (2,5 mg equine myoglobin, 17,5 kDa), dan E (0,5 mg vitamin B12, 1,35 kDa). Pendeteksian serapan UV pada 254 nm.

Myoglobin dan vitamin B12 mudah dideteksi ketika terelusi karena keduanya

berwarna. Myoglobin berwarna kuning sedangkan vitamin B12 berwarna pink.

65

Intensitas serapan vitamin B12 cukup besar relatif dibandingkan dengan protein

lainnya walaupun jumlahnya hanya 0,5 mg sedangkan protein lain beratnya 5 mg

kecuali myoglobin 2,5 mg.

Berdasarkan profil elusi tersebut, dibuat kurva kalibrasi berat molekul relatif

kolom sephadex G-50 (Lampiran H) dan diperoleh persamaan kalibrasi sebagai

berikut:

Kav = - 0,519 log MW + 2,4588

dimana Kav adalah koefisien partisi dan MW adalah berat molekul relatif dengan

nilai koefisien korelasi (R2) sebesar 0,9998. Dengan menggunakan persamaan ini

berat molekul relatif spesi dapat ditentukan.

IV.4.2 Profil serapan UV cairan floem

Pada Gambar IV. 5 ditampilkan profil serapan UV cairan floem tanaman Jarak

menggunakan fasa gerak larutan MES dan NaCl. Resolusi pemisahan dengan fasa

gerak Tris-HCl kurang jelas sehingga tidak ditampilkan.

Gambar IV. 5 Profil serapan UV cairan floem tanaman Jarak pada kolom Sephadex G-50 SF. Pendeteksian UV pada panjang gelombang 254 nm. (a) sampel cairan floem sebanyak 0,5 mL difraksinasi menggunakan 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0 dan (b) sampel cairan floem sebanyak 1,0 mL difraksinasi menggunakan 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

66

Berdasarkan profil serapan UV yang muncul, dapat disimpulkan paling sedikit

ada 6 kelompok senyawa aktif UV berdasarkan perbedaan berat molekulnya

dalam cairan floem. Intensitas serapan UV kelompok A sangat lemah (0,1) relatif

dibandingkan intensitas serapan kelompok C. Telah dilakukan juga optimasi

metode dengan menurunkan kepekaan detektor dan memperkecil jumlah sampel

untuk menurunkan intensitas serapan kelompok C, namun serapan kelompok C

tetap lebih dari 1,0 sehingga puncaknya tidak muncul dan efeknya puncak serapan

kelompok A, E dan F tidak terdeteksi. Dalam hal ini metode pemisahan yang

optimal yang dipilih adalah jika kelompok A masih dapat terdeteksi dengan baik

(intensitas serapan UV maksimal 0,1).

Kelompok A terelusi pada volume mati baik menggunakan fasa gerak MES

maupun NaCl. Kelompok B dan C tidak dapat dipisahkan dengan menggunakan

buffer MES, sedangkan pemisahan dengan fasa gerak NaCl kelompok B dapat

dipisahkan dengan baik namun kelompok C dan D tidak dapat dipisahkan.

Dengan demikian pemisahan dengan menggunakan kedua fasa gerak tersebut

saling komplementer.

Gambar IV. 6 Profil serapan UV cairan floem tanaman Jarak pada kolom Sephadex G-50 SF menggunakan buffer 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Pendeteksian UV pada panjang gelombang 254 nm. (a) sampel cairan floem sebanyak 0,5 mL dan (b) fraksinasi lanjutan 2 mL fraksi 42 dari hasil pemisahan (a).

-0.1

0.1

0.3

0.5

0.7

0.9

0 100 200 300 400 500 600 700Volume elusi (mL)

Inte

nsita

s ser

apan

UV

(a) Phloem(b) Fr.42

A

E

DC

B

F

67

Kelompok B dan C dapat dipisahkan setelah isolasi lebih lanjut fraksi 42 pada

volume elusi 302,4 mL (Gambar IV. 6) menggunakan kolom dan fasa gerak yang

sama (MES). Adapun Kelompok E dapat terpisah dengan baik dengan

menggunakan fasa gerak NaCl namun tidak terpisah dengan baik dalam MES.

Kesimpulan yang dapat ditarik adalah larutan MES dan NaCl dapat digunakan

sebagai fasa gerak pada proses pemisahan cairan floem tanaman jarak.

IV.4.3 Profil Elusi karbon, sulfur dan fosfor

Gambaran profil elusi senyawa organik dalam cairan floem setelah pemisahan

dengan metode SEC dapat diinterpretasikan dari profil elusi atom karbon, fosfor

dan sulfur. Profil elusi nitrogen tidak dapat digunakan untuk maksud tersebut

karena fasa gerak mengandung NaN3 dan matriks larutan analit ICP-QMS dalam

larutan asam nitrat. Kelimpahan senyawa organik dalam cairan floem sangat besar

sehingga isotop yang digunakan isotop minor untuk menghindari penghitungan

cacah yang terlalu tinggi (over count). Fosfor adalah monoisotop, sehingga tidak

ada pilihan lain kecuali menggunakan isotop 31P. Jika terjadi over count, maka

pembacaan cacah tidak dapat dideteksi. Untuk menghindari hal tersebut maka

dwel ltime fosfor diturunkan (3-5 ms). Jumlah cps fosfor tertinggi yang masih

dapat dideteksi oleh alat adalah 657576 cps. Isotop karbon dan sulfur yang

digunakan adalah karbon 13 (persen kelimpahan 1,10%) dan sulfur 34 (persen

kelimpahan 4,21 %).

Pada Gambar IV. 7 ditampilkan profil elusi karbon dalam cairan floem setelah

pemisahan SEC pada kolom sephadex G-25 M. Untuk menghindari perbedaan

penghitungan cps akibat perbedaan viskositas analit maupun kondisi elektronik

alat pada saat analisis berlangsung, sebagai sumbu Y digunakan angka banding

cps unsur dibagi cps In.

Seperti yang terlihat pada Gambar IV. 7, ada dua spesi karbon dalam cairan

floem, yaitu spesi minor CB1 pada volume elusi 0,7 – 1,0 mL dengan kelimpahan

relatif 0,58 % dan spesi utama CB2 pada volume elusi 1,1 – 2,9 mL. Spesi CB2

merupakan akumulasi dari sebagian besar senyawaan karbon (99,42 %) dalam

68

cairan floem dimana konsentrasi karbon tertinggi terdeteksi pada fraksi 19

(volume elusi 1,9 mL). Jika dibandingkan dengan profil elusi protein (lihat Sub

Bab IV.4.5 dan Gambar IV.22), yaitu pada volume elusi 0,5 – 1,5 mL,

menunjukkan bahwa spesi minor karbon dan sebagian spesi utama karbon

berkorelasi positif dengan profil elusi protein. Persen cps karbon pada daerah elusi

polipeptida/protein sekitar 7,78 % dari seluruh cps karbon dalam cairan floem.

Penghitungan ini sangat berguna untuk melihat komposisi senyawa organik dalam

cairan floem. Berdasarkan profil tersebut juga terlihat bahwa spesi minor karbon

merupakan spesi dengan berat molekul relatif besar dan spesi utama karbon

adalah spesi dengan berat molekul kecil.

Gambar IV. 7 Profil distribusi karbon pada kolom sephadex G-25. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; fasa gerak: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

Krüger dkk. (2002) telah melakukan analisis sukrosa dalam cairan floem dalam

kecambah jarak yang berumur 7 hari. Sukrosa terelusi pada daerah molekul

rendah (kolom NAP-5, buffer MES pH 5,5) dengan profil yang mirip pada

Gambar IV.7. Jika persen kelimpahan spesi CB2 yang sebesar 99,42 % dikurangi

dengan persen kelimpahan karbon pada daerah elusi protein/polipeptida (7, 78 %)

maka secara perhitungan kelimpahan relatif senyawa karbon di luar daerah elusi

0

5

10

15

20

25

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Volume elusi (mL)

Cps

C/ c

ps In

C

CB1

CB2

69

protein/polipeptida adalah sebesar 91,64 %. Hasil ini bersesuaian dengan

kandungan sukrosa dalam cairan floem (lebih besar dari 90 %) yang kemukakan

oleh Pate (1975 dalam Salisbury dan Ross 1995). Hal ini menunjukkan bahwa

sebagian besar spesi CB2 kemungkinan sukrosa dan karbohidrat lainnya yang

terdapat dalam cairan floem tanaman jarak.

Sukrosa merupakan fotosintat terpenting dalam cairan floem. Penelitian tentang

sukrosa dalam cairan floem tanaman jarak telah banyak dilakukan baik

menggunakan kecambah (Kallarackal dkk., 1989; Verscht dkk., 1998; Kalusche

dkk., 1999; Geigenberger dkk., 1993; Krüger dkk., 2002) maupun tanaman jarak

dewasa (Vreugdenhil dan Koot-Gronsveld, 1989; Jongebloed dkk., 2004). Dalam

beberapa penelitian tersebut dibahas tentang proses transport, pemuatan dan

pembongkaran (loading and unloading) sukrosa floem, dan metabolismenya.

Namun sebagian besar menggunakan kecambah tanaman jarak sebagai obyek

penelitian dan penambahan/adisi karbohidrat tertentu untuk memudahkan proses

pengamatan (Geigenberger dkk., 1993) atau penggunaan bahan radioaktif

(Kalusche dkk., 1999). Pemodelan proses transport dengan menggunakan

kecambah memudahkan untuk mempelajari proses transport sukrosa pada

batasan-batasan tertentu. Adapun penelitian yang dilakukan menggunakan cairan

floem yang diperoleh dari tanaman yang ditumbuhkan alami tanpa bahan

radioaktif dan analisis pemisahan dan pendeteksian tanpa penambahan aditif

karbohidrat sehingga orisinalitas cairan floem dari tanaman dewasa dapat

dipertahankan.

Forfor terelusi pada volume elusi 0,8 – 3,0 mL dan dinyatakan sebagai spesi PB1,

PB2, PB3 dan PB4 yang saling tumpang tindih (Gambar IV. 8). Puncak spesi PB1

sulit ditentukan posisinya yang berada pada kaki spesi PB2 sedangkan puncak

spesi PB2, PB3 dan PB4 berturut-turut pada volume elusi 1,7; 2,0; dan 2,2 mL.

Fraksi fosfor (Spesi PB1 dan sebagian spesi PB2) pada daerah elusi

polipeptida/protein sebesar 14,97 % dari total fosfor.

70

Gambar IV. 8 Profil distribusi fosfor pada kolom sephadex G-25. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; fasa gerak: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

Keberhasilan penelitian ini adalah dapat mendiferensiasikan fosfor dalam cairan

floem menjadi empat spesi fosfor yang tidak dapat dapat dipisahkan oleh Van

Goor dan Wiersma (1976). Van Goor dan Wiersma (1976) telah melakukan

fraksinasi spesi fosfor dalam cairan floem jarak menggunakan kolom sephadex G-

10, G-15 dan G-25. Dalam penelitian tersebut digunakan radioisotop 32P dan

pendeteksian selektif fosfor dilakukan dengan pencacah radiasi ß (philips liquid

scintillation counter PW 4510). Hasil penelitian menunjukkan cuma ada satu

spesi fosfor dengan menggunakan ketiga kolom tersebut. Kenyataan ini

menunjukkan bahwa pendeteksian selektif fosfor dengan ICP-QMS yang

dilakukan telah berhasil mendeteksi dengan baik keberadaan keempat spesi fosfor

tersebut.

Profil elusi sulfur (Gambar IV. 9) agak unik dibandingkan profil elusi karbon dan

fosfor yang dapat diinterpretasikan dengan mudah. Dengan mempertimbangkan

terbentuknya bahu pada profil sulfur, terdeteksi minimal 7 puncak sulfur pada

daerah elusi 0,5 – 2,5 mL. Ada 4 spesi pada daerah elusi polipeptida/protein dan 3

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Volume elusi (mL)

Cps

C/ c

ps In

P

PB1

PB4PB3PB2

71

spesi pada daerah berat molekul rendah. Spesi utama terletak pada daerah berat

molekul rendah. Persen sulfur pada daerah elusi polipeptida/protein adalah 23,65

% dari total sulfur.

Gambar IV. 9 Profil distribusi sulfur pada kolom sephadex G-25. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; fasa gerak: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

Fraksi SEC dari kolom Sephadex G-25 M yaitu fraksi 5-15; yang berkorelasi

positif dengan daerah elusi polipeptida/protein, dikumpulkan lalu dipisahkan lebih

lanjut menggunakan kolom sephadex G-50 SF untuk melihat profil fraksi

polipeptida/protein cairan floem pada kolom sephadex G-50 SF dan mendapatkan

hasil pemisahan spesi dengan resolusi yang lebih baik. Pada Gambar IV. 10 dapat

dilihat profil elusi karbon pada kolom sephadex G50 SF. Dari gambar tersebut

terlihat dengan jelas dua spesi karbon yaitu CA1 dan CA2. Spesi CA1 terelusi pada

volume mati (persen kelimpahan spesi CA1 7,78 %) dan spesi CA2 pada daerah

elusi serapan maksimum UV cairan floem. Hal ini tidak berarti tidak ada spesi

karbon pada daerah volume elusi 110 - 260 mL. Namun karena intensitasnya yang

sangat kecil dan berada di bawah batas kuantifikasi sehingga tidak terdeteksi.

0,0

1,5

3,0

4,5

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Volume elusi (mL)

Cps

C/ c

ps In

S

SB4

SB1SB2

SB3

SB5

SB6

SB7

72

Gambar IV. 10 Profil distribusi karbon pada kolom sephadex G-50 setelah bidimensional pemisahan. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 400 µL akumulasi fraksi 5-15 SEC Sephadex G25 M; fasa gerak: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

Spesi fosfor dari sampel fraksi 5-15 kolom sephadex G25 juga dapat dibuktikan

setelah bidimensional pemisahan dengan kolom sephadex G50 SF (Gambar IV.

11). Terdeteksi ada 4 spesi fosfor, yaitu PA1, PA2, PA3, dan PA4. Spesi-spesi

tersebut berturut-turut terdeteksi pada volume mati, volume elusi 216, 280, 302

mL. Profil elusi spesi PA1, PA3, dan PA4 berkorelasi positif dengan profil serapan

aktif UV cairan floem.

Jika pada kolom sephadex G25, terdeteksi 7 spesi sulfur, maka pada kolom

sephadex G50 terdeteksi lebih banyak lagi yaitu 11 spesi sulfur (Gambar IV. 12).

Hal ini menunjukkan metode SEC pada kolom sephadex G50 SF mempunyai

resolusi yang lebih tinggi sehingga mampu memisahkan spesi sulfur dengan lebih

baik. Jika spesi karbon dan fosfor umumnya terdeteksi pada daerah serapan aktif

UV cairan floem saja, maka spesi sulfur tersebar mulai dari volume mati hingga

volume elusi 350 mL. Spesi SA1 pada volume mati kemungkinan bagian dari

protein dengan berat molekul besar dari 44kDa.

0

3

6

9

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Volume elusi (mL)

cps C

/cps

In

C 13

CA1

CA2

73

Gambar IV. 11 Profil distribusi fosfor pada kolom sephadex G-50 setelah bidimensional pemisahan. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 400 µL akumulasi fraksi 5-15 SEC Sephadex G25 M; fasa gerak: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Insert: Profil PA1.

.

Gambar IV. 12 Profil distribusi sulfur pada kolom sephadex G-50 setelah bidimensional pemisahan. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 400 µL akumulasi fraksi 5-15 SEC Sephadex G25 M; fasa gerak: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Volume elusi (mL)

cps P

/cps

In

P 31

PA2

PA4PA3

PA1

-0,001

0,001

0,003

0,005

50 100 150 200

Volume elusi (mL)

cps P

/cps

In

P 31

PA1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Volume elusi (mL)

cps P

/cps

In

P 31

PA2

PA4PA3

PA1

-0,001

0,001

0,003

0,005

50 100 150 200

Volume elusi (mL)

cps P

/cps

In

P 31

PA1

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Volume elusi (mL)

cps S

/cps

In

S 34

SA1 SA5

SA6SA4SA3

SA2

SA8

SA7

SA9

SA10

SA11

74

IV.4.4 Profil Elusi dan distribusi berat molekul spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo,

dan Cd pada kolom sephadex G-50 SF

Cairan floem yang telah melalui kolom sephadex G-50 SF difraksinasi menjadi 95

fraksi kemudian dideteksi selektif unsur menggunakan ICP-QMS. Sebelumnya,

setiap fraksi dibagi dua, satu bagian untuk pendeteksian selektif unsur dan bagian

lainnya untuk pemisahan lebih lanjut. Data mentah hasil pendeteksian selektif

unsur direduksi dengan nilai batas kuantifikasi untuk masing-masing unsur. Hasil

reduksi data mentah yang bernilai negatif dianggap nol. Hasil pengolahan data

tersebut diplotkan dengan nomor fraksi atau volume elusi setiap fraksi sehingga

diperoleh profil elusi spesi setelah pemisahan. Pengolahan data pemisahan SEC

dapat dilihat pada Lampiran J.

Pada Gambar IV. 13 ditampilkan profil elusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo dan Cd

dengan menggunakan larutan MES sebagai fasa gerak yang dibandingkan dengan

profil elusi serapan UV cairan floem. Untuk memudahkan interpretasi awal data

hasil penelitian, sebagai sumbu y digunakan satuan konsentrasi ternormalisasi

dengan fraksi yang mengandung konsentrasi tertinggi. Hal ini dilakukan karena

rentang konsentrasi untuk setiap unsur berbeda mulai dari rentang konsentrasi

pg/mL sampai µg/mL.

Secara umum pada Gambar IV. 13 terlihat bahwa sebagian besar spesi yang

dideteksi berkorelasi positif dengan serapan UV cairan floem. Spesi pertama Mg,

Ca, Zn, Mo, Mn dan Cd terdeteksi pada daerah volume mati dengan kelimpahan

relatif yang sangat kecil dibandingkan spesi lainnya kecuali Cd. Spesi utama

umumnya terdeteksi pada daerah di bawah 1 kDa, yaitu pada daerah serapan UV

maksimum. Hanya spesi MgA2, ZnA2, Cd A2, dan CdA3 yang tidak bersesuain

dengan serapan UV cairan floem.

75

Gambar IV. 13 Profil elusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd serta serapan UV 0,5 mL cairan floem tanaman jarak pada kolom Sephadex G-50 SF menggunakan buffer 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Deteksi UV pada panjang gelombang 254 nm dan deteksi selektif unsur menggunakan ICP-QMS. Daerah yang diarsir adalah daerah serapan UV. (A) spesi Mg, Ca, dan serapan UV, (B) spesi Mn dan Zn, dan (C) spesi Mo dan Cd.

76

Pada Gambar IV. 14 ditampilkan perbandingan profil elusi spesi Mg cairan floem

tanaman jarak yang dikulturkan secara aeroponik dan pot setelah fraksinasi

menggunakan metode SEC. Berdasarkan gambar tersebut, terlihat bahwa tidak

ada perbedaan yang signifikan pada profil elusi spesi Mg dan kisaran

konsentrasinya untuk masing-masing spesi dengan menggunakan kedua kultur.

Kenyataan ini semakin menunjukkan bahwa tidak ada batasan kandungan

Magnesium dalam tumbuhan (Salisbury dan Ross, 1995).

0

500

1000

1500

2000

2500

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)

(a) aeroponik(b) pot

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

50 100 150 200Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi/

frak

si (µ

g/L)


MgA1

MgA2

MgA3

MgA1

0

500

1000

1500

2000

2500

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


Kon

sent

rasi/

frak

si (µ

g/L)


MgA1

MgA2

MgA3

MgA1

Gambar IV. 14 Profil distribusi spesi Mg pada kolom sephadex G-50. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0; kultur tanaman (a) aeroponik dan (b) pot. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Tiga spesi Mg terdeteksi, yaitu spesi MgA1 yang terdeteksi pada volume mati;

spesi MgA2, yang merupakan spesi utama dengan berat molekul relatif 1780 Da;

dan spesi MgA3 di bawah 1350 Da. Penentuan berat molekul spesi MgA1 dan MgA3

yang lebih eksak tidak dapat dilakukan karena berada di luar rentang kurva

kalibrasi kolom sephadex G-50 SF. Pendeteksian selektif unsur dengan

menggunakan ICP-QMS dengan batas kuantifikasi 1,198 µg/L telah berhasil

dengan baik mendeteksi spesi MgA1 (insert pada Gambar IV. 14) dengan

kelimpahan relatif hanya 0,01 – 0,08 %. Spesi MgA1 kemungkinan berasosiasi

77

dengan makromolekul karena mempunyai berat molekul relatif di atas 44 kDa.

Makromolekul tersebut kemungkinan enzim yang diperlukan dalam proses

fotosintesis, respirasi, dan pembentukan DNA maupun RNA (Salisbury dan Ross,

1995).

Tabel IV. 4 Distribusi Spesi Mg dalam cairan floem tanaman Jarak (Ricinus communis L.)*.

Kelimpahan relatif (%) Spesi Berat molekul relatif (Da) Aeroponik Pot

MgA1 > 44.000 0,08 0,01 ± 0,01 MgA2 1780 ± 250 98,21 97,28 ± 2,52 MgA3 < 1350 1,71 2,71 ± 2,53

*Pemisahan dilakukan dengan menggunakan SEC pada kolom Sephadex G-50 SF, buffer 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Pada Tabel IV. 5 dan Gambar IV. 15 dapat dilihat profil distribusi spesi Ca dalam

cairan floem tanaman Jarak menggunakan kolom sephadex G-50 SF, dimana

ditemukan 3 spesi Ca berdasarkan perbedaan berat molekulnya. Seperti halnya

spesi MgA1 dan MgA3, ketiga spesi Ca berada di luar rentang kurva kalibrasi berat

molekul relatif kolom sephadex G-50 SF, sehingga tidak bisa ditentukan dengan

dengan eksak berat molekulnya. Spesi CaA1 ditemukan pada daerah berat molekul

tinggi (> 44.000 Da) sedangkan kedua spesi Ca lainnya pada daerah berat molekul

rendah (< 1350 Da).

Tabel IV. 5 Distribusi Spesi Ca dalam cairan floem tanaman Jarak (Ricinus communis L.)*.

Kelimpahan relatif (%) Spesi Berat molekul relatif

(Da) Aeroponik Pot

CaA1 > 44.000 1,95 2,12 ± 1,72

Ca A2 < 1350 74,75 79,76 ± 2,04

Ca A3 < 1350 23,30 18,12 ± 0,32

*Pemisahan dilakukan dengan menggunakan SEC pada kolom Sephadex G-50 SF, buffer 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

78

Gambar IV. 15 Profil distribusi spesi Ca pada kolom sephadex G-50. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0; kultur tanaman (a) aeroponik dan (b) pot. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Profil elusi Ca cairan floem jarak yang ditumbuhkan dengan media aeroponik dan

pot relatif sama, namun distribusi spesi Ca signifikan berbeda. Spesi CaA1 (lihat

insert pada Gambar IV. 16), seperti halnya spesi Mg A1, terdeteksi pada volume

mati dengan kelimpahan relatif sekitar 1,95 – 3,33%. Kelimpahan relatif spesi

CaA1 dan CaA2 menggunakan media tanam aeroponik lebih rendah dibandingkan

dengan menggunakan media pot.

Pada Gambar IV. 15 terlihat juga perbedaan total kandungan Ca yang signifikan.

Fenomena menarik ini menunjukkan adanya perbedaan penyerapan Ca dan

pendistribusian Ca dalam cairan floem tanaman jarak berdasarkan perbedaan

media kulturnya. Adapun total kandungan Ca spesi CaA3 berkisar antara 6 – 8

mg/L dan tidak berbeda secara signifikan dengan menggunakan kedua media

tersebut.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


0

10

20

30

40

50


Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


CaA1

CaA2

CaA3

CaA1

0

200

400

600

800

1000

1200

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


0

10

20

30

40

50


Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


CaA1

CaA2

CaA3

CaA1

79

Pada tahap awal penelitian, jumlah sampel cairan floem yang difraksinasi adalah

500 µL berdasarkan pertimbangan sulitnya memperoleh cairan floem dalam

jumlah besar dan tujuan utama untuk melihat profil distribusi unsur yang diteliti

secara keseluruhan. Berdasarkan hasil fraksinasi tersebut, sebagian kecil unsur

obyek penelitian ditemukan pada daerah volume mati, yaitu pada daerah fraksi

12-17, kecuali Mn. Pengamatan lebih intens dilakukan pada data mentah hasil

pendeteksian selektif Mn, yang menunjukkan adanya kecenderungan peningkatan

konsentrasi Mn mulai pada fraksi 12 yang puncaknya pada fraksi 14 yang

kemudian menurun sampai fraksi 17. Hal ini menunjukkan kemungkinan adanya

Mn pada daerah tersebut, yang merupakan daerah terdapatnya makromolekul

dengan massa molekul relatif besar dari 44 kDa. Sebagaimana diketahui bahwa

Mn dibutuhkan dalam proses fotosintesis dimana atom Mn berperan pada pusat

katalitik oksidasi air dalam sistem fotosintesis II dan dibutuhkan sebagai kofaktor

untuk beberapa enzim seperti enzim Mn-superoksida dismutase (MnSOD)

(Pittman, 2005). Dengan demikian, tidak ditemukannya Mn pada daerah void

volume kolom, kemungkinan karena sedikitnya jumlah sampel yang diaplikasikan

dan konsentrasi Mn yang sangat rendah (sekitar 0,150 µg/L) yang berada di

bawah batas kuantifikasi Mn sebesar 0,169 µg/L untuk percobaan dengan

menggunakan media tanam aeroponik dan 0,174 µg/L untuk percobaan dengan

menggunakan media tanam pot. Oleh karena itu, dilakukan percobaan dengan

jumlah sampel yang lebih besar yaitu 1,5 mL dengan tujuan untuk membuktikan

keberadaan Mn pada volume mati kolom dan untuk isolasi lebih lanjut beberapa

spesi lainnya.

Percobaan dengan aplikasi sampel 1,5 mL telah berhasil menunjukkan adanya

sebagian kecil Mn (kelimpahan relatif 0,4%) pada daerah volume mati.

Keberhasilan pembuktian ini dicapai pertama karena aplikasi sampel yang lebih

besar akan meningkatkan konsentrasi Mn dalam setiap fraksi. Sebagai contoh,

data mentah konsentrasi Mn dalam fraksi 14 adalah 0,132 – 0,168 µg/L untuk

aplikasi sampel 0,5 mL dan 0,232 µg/L untuk aplikasi sampel 1,5 mL.

Keberhasilan kedua dicapai dengan menurunkan batas kuantifikasi Mn menjadi

0,097 µg/L. Batas kuantifikasi Mn dapat diturunkan setelah melakukan

80

pembersihan kedua cone, torch, dan optimasi lengkap ICP-QMS, dan pengaturan

kondisi operasional ICP-QMS dengan prioritas analisis selektif Mn. Aplikasi

jumlah sampel yang berbeda pada percobaan ini masih dapat ditolerir karena tidak

mempengaruhi profil elusi spesi Mn. Hal ini terbukti dengan terdeteksinya puncak

MnA2 dan MnA3 pada fraksi yang sama untuk kedua percobaaan. Distribusi spesi

Mn dalam cairan floem tanaman jarak setelah fraksinasi menggunakan kolom

Sephadex G-50 SF dapat dilihat pada Tabel IV. 6 dan Gambar IV. 16.

Tabel IV. 6 Distribusi Spesi Mn dalam cairan floem tanaman Jarak (Ricinus communis L.)*.


(Da) Aeroponik Pot

MnA1 > 44.000 - 0,16 ± 0,23

MnA2 < 1350 80,42 73,72 ± 0,04

MnA3 < 1350 19,58 26,12 ± 0,19 *Pemisahan dilakukan dengan menggunakan SEC pada kolom Sephadex G-50 SF, buffer 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Seperti yang tertera dalam Tabel IV. 6 , ada tiga spesi Mn yang terdeteksi dalam

cairan floem tanaman jarak. Spesi MnA1 terdeteksi pada volume mati dengan

kelimpahan relatif 0,02 – 0,16 %, spesi MnA2 yang merupakan spesi utama

dengan kelimpahan relatif 73 – 80 % dan berat molekul relatif kecil dari 1350 Da.

Terakhir spesi MnA3 juga mempunyai berat molekul dibawah 1350 Da dan

kelimpahan relatif 19 – 27%. Hasil penelitian ini bersesuaian dengan penelitian

Van Goor dan Wiersma (1976). Keunggulan penelitian yang dilakukan adalah

kemampuan mendeteksi keberadaan spesi MnA1 yang tidak terdeteksi oleh Van

Goor dan Wiersma.

Berbeda dengan spesi CaA2 yang ditemukan dalam jumlah lebih besar dalam

cairan floem tanaman jarak pada media pot, spesi MnA2 justru terdapat lebih

banyak dalam cairan floem tanaman jarak pada media aeroponik. Hal ini

menunjukkan adanya perbedaan sifat spesi CaA2 dan spesi MnA2 yang

kemungkinan disebabkan oleh perbedaan mekanisme penyerapan unsur tersebut

81

dan perbedaan sifat Ca yang immobil (Hanger, 1979; Reddy, 2001) dan Mn yang

mobil dalam floem. Selain ketiga spesi tersebut, ada sebagian Mn yang

terdistribusi sebagai ekor (tailing) pada volume elusi 350 mL sampai 500 mL,

yang kemungkinan adalah ion Mn2+.

Gambar IV. 16 Profil distribusi spesi Mn pada kolom sephadex G-50. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0; kultur tanaman (a) aeroponik dan (b) pot. Insert: percobaan dengan aplikasi sampel 1,5 mL dengan media tanam pot. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Pengambilan keputusan untuk menginterpretasi data dan pengelompokkan

sekumpulan titik yang membentuk puncak sebagai suatu spesi tersendiri

merupakan suatu hal yang tidak mudah. Spesi ZnA1 dapat dengan mudah

dikelompokkan sebagai suatu spesi Zn, berdasarkan pengamatan spesi unsur lain

yang juga teramati pada volume mati dan keberadaannya yang relatif signifikan

yaitu sekitar 5 – 12% (Gambar IV. 17). Demikian juga dengan spesi ZnA3 sebagai

spesi utama yang terdeteksi pada volume elusi 288 mL dengan kelimpahan relatif

80 – 88% (Tabel IV. 7), sangat mudah untuk dikelompokkan sebagai suatu spesi

0

2

4

6

8

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


MnA1

MnA2

MnA3

0.0

0.1

0.2

50 100 150Volume elusi(mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L) MnA1

0

2

4

6

8

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


MnA1

MnA2

MnA3

0.0

0.1

0.2

50 100 150Volume elusi(mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L) MnA1

82

Zn. Namun tidak demikian untuk spesi ZnA2 yang bentuknya mirip fronting

puncak spesi ZnA3. Setelah pengamatan lebih teliti dari beberapa data hasil

percobaan, teramati adanya penurunan konsentrasi Zn dalam fraksi 37/38 sebelum

kemudian naik kembali membentuk kelompok spesi ZnA3. Berdasarkan hal

tersebut dikelompokkan puncak yang terbentuk pada fraksi 32 sampai 36/37

sebagai spesi ZnA2.

Tabel IV. 7 Distribusi Spesi Zn dalam cairan floem tanaman Jarak (Ricinus communis L.)*.

Kelimpahan relatif (%) Spesi Berat molekul relatif (Da)

Aeroponik Pot

ZnA1 > 44.000 6,82 8,20 ± 5,09

ZnA2 2057 ± 300 12,64 7,98 ± 2,85

ZnA3 1350 ± 200 80,54 83,82 ± 7,94 *Pemisahan dilakukan dengan menggunakan SEC pada kolom Sephadex G-50 SF, buffer 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Gambar IV. 17 Profil distribusi spesi Zn pada kolom sephadex G-50. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0; kultur tanaman (a) aeroponik dan (b) pot. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

0

40

80

120

160

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


ZnA1 ZnA2

ZnA3

83

Tidak ada pengaruh media tanam terhadap laju elusi spesi ZnA1 namun menggeser

puncak spesi ZnA2 dan ZnA3 satu fraksi pada media tanam pot. Puncak spesi ZnA2

teramati pada fraksi 36 pada media tanam aeroponik sedangkan pada media tanam

pot pada fraksi 37 dan puncak spesi ZnA3 terdeteksi pada fraksi 39 untuk media

tanam aeroponik dan pada fraksi 40 untuk media tanam pot. Perbedaan posisi

puncak sebesar satu fraksi masih dapat diterima dan telah diperhitungkan dalam

rentang berat molekul relatif spesi sebagai standar deviasi perhitungan berat

molekul relatif.

ZnA1 ditemukan kurang lebih dua kali lebih banyak dalam cairan floem tanaman

jarak dengan media pot dibandingkan dengan media aeroponik baik jumlah total

Zn maupun persen kelimpahan relatifnya. Sebaliknya jumlah total Zn untuk spesi

ZnA2 pada media pot lebih kecil dibandingkan pada media aeroponik. Adapun

untuk spesi ZnA3 tidak ditemukan pengaruh perbedaan media tanam yang

signifikan terhadap jumlah total Zn dalam spesi tersebut.

Secara keseluruhan dapat disimpulkan metode fraksinasi SEC dan pendeteksian

selektif unsur ICP-QMS yang diterapkan telah berhasil mendeteksi spesi Zn

dalam cairan floem tanaman jarak dengan baik dan persen perolehan kembali

(recovery) yang tinggi dengan menggunakan sampel cairan floem dari tanaman

jarak yang berbeda dan kultur tanam yang berbeda serta waktu analisis yang

berbeda.

Pada Tabel IV. 8 dan Gambar IV. 18 dapat dilihat profil distribusi spesi Mo dalam

cairan floem tanaman Jarak menggunakan kolom sephadex G-50 SF. Ada dua

spesi Mo yang dapat dideteksi dengan mudah, yaitu spesi MoA1 yang terdeteksi

pada volume mati dan puncak spesi MoA2 yang terdeteksi pada volume elusi 316

mL. Seperti halnya spesi pertama unsur lainnya, spesi MoA1 merupakan spesi

minor dan spesi MoA2 adalah spesi utama dengan kelimpahan relatif 93 -98%.

84

Tabel IV. 8 Distribusi Spesi Mo dalam cairan floem tanaman Jarak (Ricinus communis L.)*.


(Da) Aeroponik Pot

MoA1 > 44.000 1,97 5,87 ± 0,84

MoA2 < 1350 98,03 94,13 ± 0,84 *Pemisahan dilakukan dengan menggunakan SEC pada kolom Sephadex G-50 SF, buffer 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Perbedaan media tanam tidak berpengaruh terhadap profil elusi spesi Mo namun

berbeda nyata terhadap jumlah total Mo dalam setiap spesi. Spesi MoA1 terdapat

kurang lebih lima kali lebih besar dan spesi MoA2 sepuluh kali lebih besar dalam

cairan floem tanaman jarak dengan media aeroponik dibandingkan dengan media

pot. Hal ini menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan terhadap penyerapan

Mo dengan media aeroponik dan media pot. Dengan media aeroponik Mo terserap

lebih banyak oleh pembuluh akar tanaman jarak yang konsekuensinya

meningkatkan jumlah kandungan Mo dalam cairan floem.

Kelimpahan relatif spesi MoA1 pada media aeroponik hanya sekitar 2% jika

dibandingkan dengan media pot yang dapat mencapai sampai 7% relatif terhadap

spesi MoA2. Hasil penelitian ini menunjukkan kemungkinan pembentukan spesi

MoA1 yang merupakan makromolekul lebih lambat dibandingkan dengan sintesis

spesi MoA2 yang berat molekul relatifnya di bawah 1 kDa.

Pada Gambar IV. 19 dan Tabel IV. 9 dapat dilihat profil elusi spesi Cd dalam

cairan floem tanaman jarak. Minimal ada 5 spesi Cd dalam sampel tersebut, yaitu

CdA1, CdA2, CdA3, CdA4, dan CdA5 dengan berat molekul masing-masing besar dari

44 kDa, 15560 ± 2000 Da, 2057 ± 300 Da, dan dua spesi terakhir dibawah 1350

Da. Secara keseluruhan terlihat bahwa konsentrasi spesi Cd dalam cairan floem

tanaman jarak yang ditumbuhkan dengan menggunakan media aeroponik lebih

tinggi dibandingkan dengan menggunakan media pot seperti halnya pada spesi

Mo.

85

Gambar IV. 18 Profil distribusi spesi Mo pada kolom sephadex G-50. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0; kultur tanaman (a) aeroponik dan (b) pot. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Gambar IV. 19 Profil distribusi spesi Cd pada kolom sephadex G-50. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0; kultur tanaman (a) aeroponik dan (b) pot. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


CdA1CdA5

CdA4

CdA3

CdA2

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400 500 600 700

Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)


MoA1

MoA2

86

Tabel IV. 9 Distribusi Spesi Cd dalam cairan floem tanaman Jarak (Ricinus communis L.).


(Da) Aeroponik Pot

CdA1 > 44.000 10,37 7,13 ± 3,00 CdA2 15560 ± 2000 25,58 15,42 ± 2,87 CdA3 2377 ± 300 41,67 62,78 ± 1,11 CdA4 < 1350 8,51 13,95 ± 0,22 CdA5 < 1350 13,86 2,55 ± 1,57

*Pemisahan dilakukan dengan menggunakan metode SEC pada kolom Sephadex G-50 SF, buffer 20 mM MES/ 1mM NaN3 pH 8,0. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP-QMS.

Kemungkinan ada korelasi positif yang kuat antara Cd dan sulfur dalam cairan

floem yang terbukti karena kemiripan profil elusinya. Terutama untuk spesi CdA1

yang terdeteksi juga pada volume mati seperti spesi SA1, CdA2 yang berkorelasi

dengan spesi SA4, spesi CdA3 dengan spesi SA8 dan spesi CdA4 dengan spesi SA9.

hanya spesi CdA5 yang tidak berkorelasi positif dengan profil elusi sulfur.

Kemungkinan CdA5 adalah Cd dalam bentuk ionik. Grill dkk. (1985 dalam

Günther dan Kastenholz, 2005) menyatakan ada sebagian kecil spesi Cd yang

berikatan dengan protein dengan berat molekul besar dari 30 kDa. Telah

ditemukan juga protein yang mengikat Cd dengan berat molekul relatif sekitar

3100 Da dan adanya kandungan sistein sebesar 40 % dari akar jagung (Rauser,

1984 dalam Günther dan Kastenholz, 2005). Informasi ini semakin mendukung

hasil penelitian ini dan adanya kemungkinan interaksi Cd dengan sulfur pada

spesi Cd dalam cairan floem tanaman jarak.

IV.4.5 Penentuan protein dalam cairan floem dan fraksi SEC

Tujuan utama penentuan protein dalam cairan floem dan fraksi SEC adalah untuk

melihat profil elusi protein dalam cairan floem setelah melewati kolom SEC.

Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford. Standar protein yang

digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi adalah albumin serum sapi (BSA,

bovine serum albumin). Pengukuran konsentrasi protein dalam fraksi dilakukan

87

sesegera mungkin setelah proses fraksinasi untuk menghindari terjadinya

kerusakan protein dan digunakan larutan standar protein segar setiap saat

pengukuran. Pada Gambar IV. 20 dapat dilihat salah satu kurva kalibrasi larutan

standar yang digunakan untuk penentuan konsentrasi protein dalam cairan floem

dan fraksi SEC.

Gambar IV. 20 Salah satu kurva kalibrasi yang digunakan untuk penentuan konsentrasi protein dalam cairan floem dan fraksi SEC berdasarkan metode Bradford.

Konsentrasi protein dalam cairan floem yang telah terdistribusi dalam fraksi SEC

setelah melewati kolom sephadex G-50 terlalu rendah sehingga tidak dapat

ditampilkan profil elusinya. Hal ini disebabkan karena kandungan protein dalam

cairan floem tanaman jarak hanya sekitar 125 ± 20 µg/mL dan tingginya faktor

pengenceran sampel selama melewati kolom dan pada saat penentuan konsentrasi

protein menyebabkan konsentrasi protein dalam fraksi tidak terdeteksi.

Salah satu aspek penting dalam proses spesiasi adalah mempertahankan spesi

dalam bentuk aslinya dan mencegah terjadinya transformasi spesi maupun

hilangnya spesi selama proses spesiasi. Salah satu proses pengujian yang

dilakukan adalah pengujian kemungkinan teradsorpsi/transformasi spesi yang

berasosiasi dengan protein. Oleh karena itu, larutan standar protein thyroglobulin

y = 0.0269 x + 0.0076R2 = 0.9935

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Konsentrasi protein (µg/mL)

Abs

orba

nsi p

ada

595

nm

88

(670 kDa) dilewatkan melalui kolom dan ditentukan konsentrasinya dalam setiap

fraksi. Pada Gambar IV. 21 ditampilkan profil elusi protein standar setelah

melewati kolom sephadex G-50. Sebagai hasil eksperimen, thyroglobulin terelusi

pada volume mati dengan persen perolehan kembali 95,89 %. Hal ini

menunjukkan kemungkinan adsorpsi protein oleh kolom sangat kecil.

Gambar IV. 21 Profil distribusi protein thyroglobulin pada kolom sephadex G-50. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 1000 µL thyroglobulin 2,18 mg/mL; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0; Pendeteksian protein berdasarkan metode Bradford. Jumlah total protein yang terdeteksi 290,329 µg/mL dengan persen perolehan kembali 95,89%.

IV.4.6 Profil Elusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd setelah melalui kolom

sephadex G-25 M

Untuk melihat kesesuaian profil elusi protein dan spesi logam yang dianalisis,

digunakan kolom yang lebih kecil yaitu sephadex G-25. Keuntungan penggunaan

kolom ini adalah fraksinasi dapat berlangsung lebih cepat (kurang lebih satu jam)

sehingga analisis protein dapat dilakukan pada hari yang sama. Keuntungan lain

0

40

80

120

160

200

0 100 200 300 400 500Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

pro

tein

(µg/

ml)

89

adalah penggunaan kolom yang kecil hanya memerlukan sampel cairan floem

relatif lebih sedikit dan faktor pengenceran sampel yang tidak terlalu besar. Profil

elusi protein dalam cairan floem setelah melewati kolom sephadex G-25

ditampilkan pada Gambar IV. 22.

Gambar IV. 22 Profil distribusi protein cairan floem pada kolom sephadex G-25. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0; Pendeteksian protein berdasarkan metode Bradford. Jumlah total protein yang terdeteksi 144,536 µg/mL. Persen perolehan kembali protein 87,64%.

Pada Gambar IV. 22 terlihat bahwa protein terelusi sebagai satu puncak pada

volume elusi 0,5 – 1,5 mL. Persen perolehan kembali protein tersebut setelah

melalui kolom sephadex G-25 M sebesar 87,64 % dengan jumlah total protein

sebesar 144,536 µg/mL. Untuk melihat korelasi profil elusi protein dan profil

elusi unsur setelah melewati kolom, pada Gambar berikutnya daerah elusi protein

yaitu pada volume elusi 0,5 – 1,5 mL akan diarsir. Profil protein yang sama juga

telah dikemukakan oleh Krüger dkk. (2002). Hal ini menunjukkan bahwa tidak

ada perbedaan profil protein cairan floem kecambah dan tanaman dewasa jarak.

-5

15

35

55

75

95

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

pro

tein

(µg/

mL)

90

Pada Gambar IV. 23 terlihat bahwa secara keseluruhan hanya terdapat dua puncak

yaitu spesi utama MgB2 dan spesi MgB3. Spesi MgB1 tidak dapat dipisahkan dari

spesi MgB2 mengingat kecilnya kelimpahan relatif spesi tersebut. Jika

dibandingkan puncak pertama spesi Mg sebelum dan sesudah destruksi, terlihat

puncak tersebut mulai muncul pada volume elusi 0,9 mL sebelum destruksi dan

1,2 mL setelah destruksi. Pada kolom kecil seperti sephadex G-25 yang

digunakan, perbedaan volume elusi dalam satuan 0,1 mL dapat menunjukkan

rentang berat molekul yang sangat besar, terutama pada volume elusi 0,5 – 1,5

mL.

Gambar IV. 23 Profil distribusi Mg pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. MgB1 kemungkinan spesi Mg yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

Penghitungan total konsentrasi dan kelimpahan relatif spesi Mg pada daerah

serapan 0,9-1,2 mL pada pemisahan sebelum destruksi menunjukkan

kemungkinan terdapatnya spesi MgB1 yang kemudian terdestruksi setelah uji

0

40

80

120

160

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (m

g/L)

(a) Mg sebelum destruksi

(b) Mg setelah destruksi

MgB1

MgB3

MgB2

91

proteinase. Hasil penelitian ini bersesuain dan menguatkan penemuan spesi Mg

dalam cairan floem yang dipisahkan dengan menggunakan kolom sephadex G-50

dimana ditemukan juga 3 spesi Mg dengan profil sebaran kelimpahan yang tidak

berbeda jauh. Sehingga dengan demikian dapat dikatakan bahwa spesi MgB1,

MgB2, dan MgB3 yang terdeteksi dengan menggunakan kolom sephadex G-25

bersesuaian dengan berturut-turut spesi MgA1, MgA2, dan MgA3 yang ditemukan

setelah pemisahan dengan kolom sephadex G-50.

Pada Gambar IV. 24 ditampilkan profil distribusi Ca pada kolom sephadex G-25.

Terdeteksi hanya dua spesi Ca, yang diberi notasi sebagai spesi CaB1 da CaB2.

Spesi CaB1 terdeteksi pada daerah arsiran, yang menunjukkan adanya

kemungkinan spesi CaB1 berasosiasi dengan polipeptida /protein yang mana spesi

ini terdestruksi setelah uji proteinase. Kemungkinan pengikatan kalsium oleh

protein telah banyak dibahas. Kalmodulin merupakan salah satu protein kecil

yang mengikat Ca. Pengikatan tersebut mengubah bentuk kalmodulin sedemikian

rupa sehingga kemudian Kalmodulin dapat mengaktifkan beberapa enzim

(Salisbury dan Ross, 1995; Zhang dan Lu, 2003).

Adapun spesi CaB2 kemungkinan akumulasi dari spesi CaA2 dan CaA3 berdasarkan

perhitungan kelimpahan relatifnya. Interpretasi ini juga didukung berdasarkan

data berat molekul relatif spesi CaA2 dan CaA3 (kurang dari 1350 Da) yang tidak

dapat dipisahkan dengan menggunakan kolom sephadex G-25.

Pada Gambar IV. 25 ditampilkan profil elusi Mn pada kolom sephadex G-25 M.

Terdeteksi secara nyata dua spesi Mn yaitu MnB1 dan MnB2, dimana sebagian

spesi MnB1 terdestruksi setelah uji proteinase K. Profil elusi Mn berupa tailing

setelah destruksi yang pada akhir elusi menunjukkan dengan kuat profil elusi ion

Mn2+ sebagai hasil destruksi sebagian spesi MnB1. Jika diperhatikan tingginya

kelimpahan relatif spesi MnB1 yang dapat mencapai 16%, diperkirakan MnB1

merupakan akumulasi spesi MnA1 dan sebagian spesi MnA2. Seperti halnya Ca,

92

Spesi MnB2 kemungkinan merupakan akumulasi dari sebagian spesi MnA2 dan

MnA3.

Gambar IV. 24 Profil distribusi Ca pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. CaB1 kemungkinan spesi Ca yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

Van Goor dan Wiersma (1976) telah meneliti bentuk kimiawi Mn dan Zn dalam

cairan floem tanaman jarak yang berusia 2 bulan. Penelitian ini menggunakan

isotop 54Mn dan 65Zn yang dicampurkan ke dalam larutan nutrisi. Pemisahan

dilakukan pada kolom sephadex G-10, G15 dan G-25 menggunakan buffer Tris-

HCl pH 8,2. Isotop 54Mn dan 65Zn dalam fraksi dideteksi menggunakan pencacah

gamma. Hasil penelitiannya menunjukkan Mn muncul dalam dua bentuk, yaitu

sebagai kation Mn dan senyawaan organik dengan berat molekul 1-5 kDa.

Informasi ini mendukung hasil penelitian yang diperoleh, dimana terdeteksi dua

spesi Mn dengan profil elusi yang mirip.

0

10

20

30

40

50

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (m

g/L) (a) Ca sebelum destruksi

(b) Ca setelah destruksi

CaB1

CaB2

93

Gambar IV. 25 Profil distribusi Mn pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Sebagian spesi MnB1 kemungkinan spesi Mn yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0;

Krüger dkk.(2002) telah melakukan pemisahan spesi Zn dalam cairan floem

kecambah jarak menggunakan kolom NAP-5 dan fasa gerak MES (volume elusi

0,5 mL). Dalam penelitian tersebut Zn terdeteksi sebagai satu spesi pada fraksi

dengan berat molekul rendah. Profil elusi Zn tersebut bersesuaian dengan profil

elusi sukrosa dalam cairan floem kecambah jarak.

Pada penelitian ini (Gambar IV. 26) terdeteksi 3 spesi Zn yaitu ZnB1, ZnB2 dan

ZnB3 dengan kelimpahan relatif berturut-turut 4-5 %, 9-11%, dan 83-86%.

Pendeteksian ketiga spesi Zn ini menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan

telah berhasil memisahkan dan mendiferensiasikan spesi Zn yang dideteksi oleh

Krüger dkk menjadi 3 spesi yang berbeda berdasarkan berat molekulnya.

0

100

200

300

400

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (m

g/L)

(a) Mn sebelum destruksi

(b) Mn setelah destruksi

MnB2

MnB1

94

Gambar IV. 26 Profil distribusi Zn pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0;

Pada pemisahan sebelumnya dengan menggunakan kolom sephadex G-50 SF juga

ditemukan tiga spesi Zn dengan kelimpahan yang relatif sama. Hal ini

menunjukkan adanya kemungkinan bahwa spesi ZnB1 merupakan ZnA1, ZnB2 serta

ZnB3 identik dengan ZnA2 dan ZnA3. Walaupun spesi ZnB1 dan ZnB2 berada pada

daerah arsiran elusi protein, tidak teramati perbedaan profil elusi sebelum dan

sesudah destruksi. Hal ini menunjukkan bahwa spesi ZnB1 dan ZnB2 tidak

berasosiasi dengan polipeptida atau protein. Hipotesa ini mendukung pernyataan

Krüger dkk (2002), dimana sebagian kecil fraksi Zn kemungkinan berasosiasi

dengan ligan yang lebih besar dibanding sukrosa. Van Goor dan Wiersma (1976)

juga mendeteksi Zn sebagai satu spesi yang kemungkinan berasosiasi dengan

senyawaan organik. Menurut Van Goor dan Wiersma spesi tersebut bermuatan

negatif.

Gambar IV. 27 memperlihatkan profil elusi Mo pada kolom sephadex G-25 M.

Terdeteksi dua spesi Mo yaitu MoB1 dan MoB2. berdasarkan kelimpahan

relatifnya, kemungkinan spesi MoB1 merupakan akumulasi dari spesi MoA1 dan

0

1000

2000

3000

4000

5000

0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)

(a) Zn sebelum destruksi

(b) Zn setelah destruksi

ZnB2

ZnB1

ZnB3

95

sebagian spesi MoA2, sedangkan spesi MoB2 merupakan sebagian lain dari spesi

MoA2.

Gambar IV. 27 Profil distribusi Mo pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. MoB1 kemungkinan spesi Mg yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0;

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa spesi MoA2 kemungkinan terdiri dari

beberapa spesi Mo yang berbeda dengan berat molekul kecil dari 1000 Da. Spesi

ini kemungkinan ada yang berikatan dengan polipeptida/protein seperti yang

ditunjukkan pada Gambar IV. 27, dimana spesi tersebut terdestruksi setelah uji

proteinase dan ada yang tidak berasosiasi dengan polipeptida/protein. Profil

tailing pada akhir elusi setelah destruksi dengan proteinase K, menunjukkan

meningkatnya jumlah Mo dalam bentuk kation, memperkuat dugaan bahwa Mo

dalam spesi MoB1 terdestruksi menjadi Mo ionik.

Profil elusi Cd pada kolom sephadex G-25 M sebelum destruksi dengan

proteinase K hanya menampilkan satu puncak lebar pada volume elusi 0,8 – 2,2

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)

(a) Mo sebelum destruksi

(b) Mo setelah destruksi

MoB2

MoB1

96

mL yang diberi notasi CdB1 dengan konsentrasi maksimum pada volume elusi 1,2

mL (Gambar IV. 28). Jika dibandingkan dengan pemisahan yang dilakukan pada

kolom sephadex G-50, ada kemungkinan bahwa spesi CdB1 merupakan akumulasi

dari semua spesi yang terdeteksi pada kolom G-50 SF. Pertanyaan yang muncul

adalah mengapa hanya muncul satu puncak Cd setelah pemisahan dengan kolom

Sephadex G-25 M sedangkan pemisahan dengan kolom sephadex G-50 SF ada

lima spesi yang terdeteksi. Setelah mengamati dengan seksama profil elusi

kelimpahan relatif yang kemudian divisualisasikan pada Gambar IV. 29 terlihat

dengan jelas bahwa sebaran Cd membentuk suatu puncak yang bersesuaian

dengan puncak CdB1.

Gambar IV. 28 Profil distribusi Cd pada kolom sephadex G-25 sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase. Daerah yang diarsir pada volume elusi 0,5-1,5 mL merupakan daerah elusi protein dalam cairan floem. Sebagian spesi CdB1 kemungkinan spesi Cd yang berasosiasi dengan protein yang terdestruksi setelah uji proteinase. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 100 µL floem aeroponik; fasa gerak: 20 mM NaCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0Volume elusi (mL)

Kon

sent

rasi

/frak

si (µ

g/L)

(a) Cd sebelum destruksi

(b) Cd setelah destruksi

CdB1

97

Gambar IV. 29 Profil distribusi kelimpahan Cd pada kolom sephadex G-50.

Profil elusi spesi CdB1 berkorelasi positif dengan profil elusi protein dalam cairan

floem. Setelah uji proteinase K, terlihat bahwa spesi CdB1 tereduksi yang

menunjukkan bahwa sebagian spesi CdB1 yang berada pada daerah arsiran

kemungkinan berasosiasi dengan protein. Hal ini diperkuat dengan terbentuknya

ekor (tailing) pada akhir elusi yang menunjukkan meningkatnya jumlah kation Cd

setelah destruksi dibandingkan sebelum destruksi.

IV.5 Pemisahan spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo dan Cd dalam cairan floem

dengan QPNC PAGE

Spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo dan Cd dalam cairan floem dipisahkan juga dengan

menggunakan metode QPNC PAGE. Metode ini diadopsi dari Kastenholz (2004;

2006; 2007). Dalam percobaan ini fasa gerak yang digunakan adalah MES

sedangkan Kastenholz menggunakan buffer Tris-HCl. Hasil pemisahan spesi-

spesi tersebut dapat dilihat pada Gambar IV. 30. Gambar tersebut terdiri atas tiga

kurva , pada bagian A ditampilkan profil elusi spesi Mg; pada bagian B dapat

dilihat profil elusi Ca dan Zn serta pada bagian C profil elusi Mn, Mo, dan Cd.

Pembagian ini berdasarkan rentang konsentrasi spesi agar hasil penelitian tersebut

dapat dianalisis dengan optimal.

0

10

20

30

40

50

60

70

CdA1 CdA2 CdA3 CdA4 CdA5spesi Cd

Kel

impa

han

rela

tif (

%)

a) aeroponikb) pot

98

Gambar IV. 30 Profil elusi spesi Mg (A), Ca dan Zn (B) dan Mn, Mo, dan Cd setelah pemisahan PNC PAGE. Kondisi fraksinasi: jumlah sampel: 500 µL floem aeroponik; buffer: 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0.

99

Berdasarkan Gambar IV. 30, spesi yang berhasil dipisahkan dengan sangat baik

adalah spesi Mo dan spesi Mn. Spesi Mo terdeteksi sebagai satu puncak Mo pada

daerah elusi 35 sampai 80 mL sedangkan spesi Mn sebagai satu puncak lebar pada

daerah elusi 90-170 mL. Spesi Mo ini kemudian akan dipisahkan lebih lanjut

dengan menggunakan metode SEC.

Ada kemiripan Profil elusi Mg dan Ca, dimana garis dasar (base line) profil

bergradasi dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah dimulai pada fraksi tiga

sampai pada fraksi 37-38. Secara visual terdeteksi 5 puncak Mg, 3 diantaranya

berupa puncak lebar dan 3 puncak Ca. Dua puncak pertama dan puncak terakhir

spesi Ca dan Mg terelusi pada fraksi yang berdekatan.

Berbeda dengan spesi logam lainnya, Zn terdeteksi pada daerah elusi 65-145 mL

berupa 1 puncak yang lebar dengan fronting dan tailing yang panjang. Sedangkan

pada pemisahan spesi Cd dengan metode QPNC PAGE, tidak ada informasi yang

berarti yang dapat diperoleh. Hal ini disebabkan karena garis dasar elusi

bergradasi seperti pada Mg dan Ca dan konsentrasi fraksi yang sangat rendah.

Muktiono (2006) juga telah memisahkan spesi Cd dari Arabidopsis taliana

dengan menggunakan metode yang sama namun buffer yang berbeda. Spesi Cd

tersebut terdeteksi pada fraksi 22-30 dengan garis dasar pada konsentrasi sekitar

0,20 µg/L. Sedangkan pada penelitian ini konsentrasi Cd dalam fraksi yang

tertinggi hanyalah 0,07 µg/L. Perolehan kembali (persen recovery) Cd setelah

dipisahkan sebesar 277 % menunjukkan sistem QPNC PAGE yang diterapkan

tidak cocok untuk spesi Cd dalam cairan floem karena konsentrasinya yang sangat

rendah, walaupun telah berhasil digunakan oleh Kastenholz (2004; 2006) untuk

penentuan spesi Cd dalam sayuran dan Muktiono (2006) untuk penentuan spesi

Cd dalam Arabidopsis taliana.

Kesulitan penerapan teknik QPNC PAGE dalam mendapatkan resolusi pemisahan

yang baik dan stabil juga telah dilaporkan oleh Chery (2003). Kesulitan menjaga

kestabilan spesi agar tidak mengalami transformasi selama proses pemisahan

merupakan masalah primer dalam mengaplikasikan QPNC PAGE. Hal yang sama

100

juga dialami selama penelitian ini, terutama untuk mendeteksi spesi Mg, Ca, dan

Zn. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa spesi Mg, Ca, dan

Zn tidak stabil di bawah kondisi pemisahan yang diterapkan dan kenyataan ini

juga menunjukkan bahwa spesi Mo dan Mn yang dapat dideteksi dengan metode

ini merupakan spesi dari kelompok yang berbeda dengan spesi Mg, Ca, dan Zn.

Beberapa literatur menyatakan bahwa Mo dalam tanaman ditemukan dalam dua

bentuk dasar yaitu sebagai bagian dari atom pusat berinti banyak dari nitrogenase

dan sebagai atom pusat monointi pada sisi aktif beberapa enzim yang berperan

dalam reaksi oksidasi dan reduksi (Hille, 1996; Mendel, 1997; Mendel dan

Hansch, 2002; Guse dkk., 2003; Sauer dan Frebort, 2003; Kaiser dkk., 2005).

IV.6 Pemisahan bidimensional spesi Mo

Molibden sudah sejak lama dikenal sebagai salah satu unsur hara bagi tanaman

(Hille, 1996; Mendel, 1997; Mendel dan Hansch, 2002; Guse dkk., 2003; Sauer

dan Frebort, 2003; Kaiser dkk., 2005). Molibden turut berperan dalam beberapa

reaksi enzimatik. Beberapa enzim yang mengandung Mo dalam tanaman yang

telah diidentifikasi antara lain nitrat reduktase (NR), xantin dehidrogenase

(XDH), aldehid oksidase (ALO), dan sulfit oksidase (SO). Enzim-enzim ini

mengkatalisis reaksi transformasi karbon, nitrogen dan sulfur (Mendel 1997;

Mendel dan Hansch, 2002; Sauer dan Frebort, 2003). Ion Molibden sendiri secara

katalitik tidak aktif dalam sistem biologis namun Mo yang terkomplekskan oleh

ligan spesifik dapat merupakan kofaktor yang esensial. Kofaktor Mo dikenal

dengan singkatan Moco (Mo co-factor) (Hille, 1996; Mendel, 1997; Rajagopalan,

1988; Mendel dan Hansch, 2002; Guse dkk., 2003; Sauer dan Frebort, 2003;

Kaiser dkk., 2005).

Berdasarkan hasil pemisahan tahap I dengan menggunakan metode SEC dan PNC

PAGE, maka spesi MoA2 dipilih untuk dipisahkan lebih lanjut. Fraksi PNC PAGE

yang mengandung konsentrasi Mo tertinggi diisolasi lebih lanjut dengan

menggunakan metode SEC. Hasil penelitian menunjukkan bahwa spesi tersebut

terelusi pada daerah elusi dimana spesi MoA2 dalam cairan floem terelusi (Gambar

101

IV. 31). Penemuan ini sangat menggembirakan karena hal ini menunjukkan spesi

MoA2 adalah spesi yang stabil dan dapat dipisahkan dengan menggunakan metode

SEC dan PNC PAGE yang telah dikembangkan.

Gambar IV. 31 Profil elusi spesi Mo (a) dalam cairan floem dan (b) fraksi PNC PAGE yang mengandung spesi Mo dengan konsentrasi tertinggi serta profil elusi UV (c).

Pembuktian keberadaan dan kestabilan spesi dilakukan dengan membalik strategi

penelitian, yaitu fraksi SEC yang mengandung spesi Mo dengan konsentrasi

tertinggi diisolasi lebih lanjut dengan menggunakan metode PNC PAGE. Hasil

pendeteksian selektif Mo dari fraksi PNC PAGE tersebut juga membuktikan

bahwa spesi MoA2 juga terdeteksi pada volume elusi spesi Mo dari sampel cairan

floem tanaman jarak (Gambar IV. 32). Dengan demikian, spesi MoA2 adalah spesi

Mo dalam cairan floem tanaman jarak yang stabil dan dapat diisolasi dengan

menggunakan kedua metode SEC dan PNC PAGE yang dikembangkan.

102

Gambar IV. 32 Profil elusi spesi Mo setelah pemisahan dengan PNC PAGE. (a) spesi Mo dalam cairan floem dan (b) dalam fraksi SEC yang mengandung spesi Mo dengan konsentrasi tertinggi.

IV.7 Analisis ESI MS spesi MoA2

Pendeteksian suatu spesi dapat dilakukan dengan menggunakan ICP MS untuk

pendeteksian selektif unsur dan ESI MS untuk pendeteksian selektif molekular.

Kedua metode ini menggunakan sumber ionisasi untuk spektrometri massa.

Metode ESI MS menggunakan sumber ionisasi yang lebih lemah, sehingga

dihasilkan ion molekular. Analisis massa ion molekular memungkinkan untuk

menentukan senyawa spesi. Kelemahan ESI MS dibandingkan ICP MS adalah

rendahnya sensitivitas, sehingga spesi yang dapat terdeteksi dengan ICP MS

belum tentu dapat dideteksi dengan ESI MS. Oleh karena itu spesi yang dapat

dianalisis dengan ESI MS adalah spesi yang mempunyai kelimpahan tinggi

dengan konsentrasi yang besar (Chassaigne, 2003).

Spesi MoA2 dianalisis lebih lanjut menggunakan metode ESI MS untuk

mengungkapkan informasi molekular spesi tersebut. Strategi pelaksanaan

penelitian adalah fraksi SEC yang mengandung konsentrasi maksimum spesi

MoA2 dimurnikan dari matriksnya dengan menggunakan ZIP-18, kemudian hasil

103

pemurnian diencerkan sebelum analisis dengan ESI MS. Gambar IV. 33

menyajikan spektrum ESI MS fraksi SEC tersebut. Keunggulan metode ini

pendeteksian m/z spesi sampai pada orde 0,1 amu.

Gambar IV. 33 Spektrum ESI MS fraksi SEC kolom sephadex G-50 SF yang mengandung konsentrasi tertinggi spesi MoA2 (fraksi 44).

Berdasarkan Gambar IV.33, terlihat bahwa massa ion yang terdeteksi mulai dari

60,4 – 993,8 amu. Perhitungan teoritis berat molekul relatif fraksi 44 adalah

dibawah 1350 Da berdasarkan kurva kalibrasi standar protein pada kolom

sephadex G-50 SF. Hal ini menunjukkan kesuaian hasil penelitian dengan

spektrum ESI MS, yang menunjukkan massa ion tertinggi yang terdeteksi adalah

993,8. Munculnya puncak massa ion kecil seperti 60,4; 123,3; 149,6 menunjukkan

bahwa spesi mengalami fragmentasi selama proses persiapan analit untuk analisis

ESI MS.

Pola suatu spesi dalam spektrum ESI MS dapat dikenali berdasarkan kelimpahan

relatif isotopnya. Vonderheide (2002) dapat mengkarakterisasi spesi Se dalam

kacang-kacangan Brazil dengan menggunakan metode HPLC-ICP MS dan ESI

MS berdasarkan pola kelimpahan relatif isotop Se. Encinar dkk (2003) juga telah

mendeteksi senyawa selen dalam protein ragi dengan menggunakan MALDI MS

104

dan ESI MS dan Montes-Bayon (2005) juga telah mempelajari studi spesiasi Se

dalam Brassica juncea dengan menggunakan ICP MS dan ESI MS. Namun

metode ini sulit dilakukan dalam menginterpretasi spesi Mo berdasarkan spektrum

ESI MS yang ada karena adanya pengaruh matriks yang besar. Sebagaimana

diketahui bahwa spesi MoA2 berada pada daerah serapan UV maksimal cairan

floem dalam tanaman jarak. Analisis C, P dan S dalam fraksi SEC menggunakan

ICP MS menunjukkan lebih dari 90% senyawaan organik dalam cairan floem

berada pada daerah tersebut.

IV.8 Pemisahan spesi CaB2 dengan metode CE

Eksplorasi lebih dalam terhadap spesi Ca merupakan suatu hal utama karena Ca

salah satu unsur hara pokok bagi tanaman. Kandungan Ca dalam tanaman sekitar

0,1 – 2,0 % berat kering tanaman. Peranan Ca dalam tanaman sangat besar,

terutama dalam pembentukan kayu, seperti pada manusia dan hewan pada

pembentukan tulang (McLaughlin dan Wimmer, 1999). Kalsium juga merupakan

bagian yang penting dalam signalling molecule yang terstimulasi oleh sinar

merah, gravitasi, sentuhan, kejutan dingin atau hormon tertentu (White, 2001;

2004; Scrase-Field dan Knight, 2003; White and Broadley, 2003; Reddy, 2001;

Kordyum, 2003; Sathyanarayanan dan Poovaiah, 2004) dan sensor (McCormack

dan Braam 2003; Nayyar, 2003).

Sabnis dan McEuen (1986) telah mempelajari kemungkinan pengikatan Ca oleh

protein floem Cucurbita maxima, Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita

pepo. Dalam penelitian tersebut, protein dari cairan floem diinkubasi dengan 10

µL larutan 45CaCl2 10 mM lalu difraksinasi dalam kolom sephadex G-100.

sebagai hasil penelitian sebagian kecil fraksi spesi Ca terdeteksi pada void volume

(>100 kDa) yang berkorelasi positif dengan protein. Total Ca dalam floem 1 mM

(40 mg/L). Menurut Sabnis dan McEuen, tingginya total Ca kemungkinan

disebabkan oleh pelepasan tekanan turgor selama proses pengirisan.

Konsekuensinya air dan ion-ion dari sekitar apoplastik dan simplastik mengalir ke

tabung tapis. Sekitar dua pertiga total Ca terkomplekskan dengan ligan berberat

105

molekul rendah. Itoh dan Kang (1993) juga telah menyelidiki kemungkinan

keberadaan kristal kalsium oksalat dalam dinding sel floem sekunder taxodiaceae.

Spesi Ca dalam cairan floem dapat dipisahkan dengan baik dengan menggunakan

metode SEC namun kurang berhasil dengan metode QPNC PAGE. Oleh karen itu

dicoba strategi pemisahan bidimensional lain yaitu menggunakan LC-MS/MS

untuk spesi CaA2 sebagai spesi utama Ca dalam cairan floem. Hasil yang

diharapkan adalah informasi tentang struktur molekul spesi Ca tersebut. Penelitian

ini merupakan penelitian bersama dengan kelompok spesiasi Intitut ZCH di Pusat

penelitian Jülich, Jerman. Namun penelitian bersama ini kurang berhasil karena

beberapa hal, yaitu: (i) optimasi metode yang kurang optimal (terbatas oleh

waktu), (ii) batas deteksi yang masih tinggi setelah pemisahan tahap kedua, (iii)

proses prekonsentrasi kemungkinan menyebabkan terjadinya transformasi spesi

sehingga tidak terdeteksi, dan (iv) adanya kontaminasi selama proses pemisahan-

pendeteksian.

Berdasarkan pengalaman tersebut di atas, strategi pemisahan berikutnya adalah

menggunakan elektroforesis kapiler dan spesi Ca yang akan dipisahkan adalah

spesi CaB2 yang mempunyai kelimpahan relatif dan kandungan Ca yang tinggi.

Sehingga tidak diperlukan proses prekonsentrasi. Pemilihan metoda CE untuk

spesi CaB2 antara lain: (i) berat molekul spesi yang rendah ( di bawah 1350 Da)

sangat sesuai untuk analisis CE, (ii) kemungkinan spesi aktif UV sehingga bisa

dideteksi dengan detektor UV tanpa proses derivatisasi, (iii) analisis CE hanya

memerlukan sampel dengan jumlah kecil (nanoliter), (iv) proses analisis cepat

(dalam waktu kurang dari 15 menit), serta (v) optimasi metoda dengan berbagai

variasi buffer, baik konsentrasi, komposisi dan pH, serta tegangan yang

diaplikasikan dapat dilakukan dengan mudah sehingga dapat diperoleh hasil

pemisahan yang sangat baik. Selain itu, Metode CE merupakan salah satu metode

yang sangat berkembang saat ini karena kemampuannya memisahkan mulai dari

biomolekul besar hingga ionik anorganik kecil, baik itu sebagai molekul netral,

bermuatan positif maupun negatif. Jika dibandingkan dengan kromatografi cair,

metode ini adalah metode yang lebih sederhana dan teknik pemisahan yang cepat

106

serta membutuhkan sampel dan pereaksi dalam jumlah yang sangat sedikit

(nanoliter) serta biaya operasional yang relatif murah untuk penggantian kolom

kapiler (Cornelis, dkk., 2003; Michalke, 2003a; Caruso, dkk., 2003).

Optimasi metode CE merupakan langkah awal yang penting dalam analisis

spesiasi menggunakan CE. Optimasi kondisi pemisahan meliputi variasi

penyangga, konsentrasi penyangga, pH penyangga, dan besarnya tegangan yang

diaplikasikan. Hal ini dimaksudkan untuk menjaga agar tidak terjadi transformasi

spesi selama proses pemisahan dan mendapatkan hasil pemisahan yang baik

(Wang dkk., 2003).

Kondisi pemisahan sangat dipengaruhi oleh suhu. Pada tahap awal pemisahan

dilakukan pada suhu ruang. Sebagai hasil penelitian, spesi tidak sabil dan kedapat-

ulangan hasil pemisahan kurang baik. Hal ini menunjukkan adanya transformasi

spesi. Aplikasi tegangan tinggi (15-30 kVolt) juga menyumbangkan panas yang

besar sehingga semakin mempengaruhi kestabilan spesi. Oleh karena itu kolom

kapiler didinginkan dengan menggunakan termostat. Idealnya, pemisahan

dilakukan pada suhu 4 °C seperti pemisahan SEC dan QPNC PAGE. Namun suhu

minimum yang dapat diaplikasi hanyalah 15 °C. Hal ini disebabkan aplikasi

tegangan tinggi menimbulkan panas yang cukup tinggi dan termostat yang

digunakan tidak mampu menurunkan suhu lebih rendah dari 15 °C. Walaupun

demikian, kondisi operasional pada suhu 15 °C telah menghasilkan pemisahan

yang sangat baik dengan kedapat-ulangan yang tinggi.

Salah satu teknik yang dikembangkan pada penelitian ini adalah penyuntikan

sampel. Pada penyusunan program analisis CE, sebagai sampel, pertama

disuntikkan fraksi SEC kemudian langsung diikuti penyuntikan BGE sebelum

aplikasi tegangan (Tabel III.8). Hal ini dilakukan untuk mencegah kembalinya

sampel pada saat pemberian tegangan. Teknik ini terbukti memberikan hasil

analisis yang baik yaitu kedapat-ulangan yang tinggi dan garis dasar yang datar.

107

Tahap selanjutnya dalam optimasi metode CE adalah seleksi penyangga yang

digunakan. Untuk mendapatkan pemisahan dengan resolusi yang baik serta

sensitivitas deteksi yang tinggi, mobilitas BGE yang digunakan haruslah sedekat

mungkin dengan mobilitas spesi yang akan dipisahkan. Pada uji pendahuluan

telah dicoba berbagai penyangga, yaitu: Tris-HCl, asam borat, dan garam fosfat.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebagian besar spesi terdeteksi sebagai

senyawa anionik. Pada aplikasi tegangan positif, detektor terletak pada sisi

katoda, sehingga yang terelusi paling awal adalah senyawa kationik, senyawa

netral dan terakhir senyawa anionik. Pengamatan elektroferogram CE

menunjukkan bahwa spesi yang terelusi pada waktu migrasi yang lama

mempunyai kedapat-ulangan rendah. Oleh karena itu sistem campuran penyangga

yang digunakan mengandung surfaktan kation sebagai pemodifikasi EOF (Chen

dkk., 2001). Fungsi surfaktan dalam hal ini adalah sebagai pembalik arah alir

EOF, sehingga dengan mengaplikasikan tegangan negatif, spesi anionik akan ikut

bermigrasi dengan EOF menuju detektor pada ujung kutub anoda. Dengan

demikian pemisahan dapat berlangsung dengan lebih cepat dan baik. Surfaktan

kationik yang digunakan adalah CTAB. Gambar IV.34 menyajikan

elektroferogram spesi Ca menggunakan 2 penyangga yang berbeda.

Berdasarkan Gambar IV.34 terlihat spesi Ca dapat terpisah dengan baik dengan

menggunakan campuran penyangga Na2HPO4/NaH2PO4/CTAB. Hal ini

ditunjukkan dengan garis dasar yang rata dan puncak-puncak yang muncul dapat

teridentifikasi dengan baik jika dibandingkan dengan pemisahan dalam campuran

penyangga asam borat, walaupun dalam asam borat spesi terelusi lebih cepat dan

pemisahan telah usai dalam lima menit. Oleh karena itu campuran penyangga

Na2HPO4/NaH2PO4/CTAB dipilih sebagai elektrolit latar (BGE) untuk pemisahan

spesi LMM Ca dalam cairan floem.

Konsentrasi BGE dalam pemisahan metode CE mempengaruhi resolusi,

sensitivitas, gangguan garis dasar dan waktu migrasi spesi. Oleh karena itu

optimasi konsentrasi campuran penyangga merupakan tahap selanjutnya dalam

optimasi metode CE. Variasi konsentrasi campuran penyangga telah disajikan

108

dalam Tabel. III.8. Seperti yang ditampilkan dalam Gambar IV.35, terdeteksi

minimal ada 13 puncak dalam sampel.

Gambar IV. 34 Elektroferogram low molecular mass (LMM) spesi Ca dalam cairan floem Ricinus communis,L. pada pH 8.0 menggunakan BGE (a) 10 mM Na2HPO4/ 10 mM NaH2PO4/1.0 mM CTAB dan (b) 20 mM H3BO3/ 1.0 mM CTAB.

Secara umum terlihat bahwa semakin tinggi konsentrasi penyangga laju migrasi

spesi semakin lambat. Hal ini karena peningkatan konsentrasi penyangga

meningkatkan kekuatan ion dalam elektrolit yang menyebabkan penurunan EOF.

Pada konsentrasi fosfat 10 mM, pemisahan hanya berlangsung 8,2 menit

sedangkan pada konsentrasi fosfat 15 mM, 10,2 menit. Contoh lain, waktu migrasi

Puncak 13 adalah 7,6 menit pada C1 yang bergeser menjadi 9,4 menit pada C4.

Peningkatan konsentrasi fosfat hanya berpengaruh nyata pada resolusi puncak 11

dan 12. Pada konsentrasi fosfat 15 mM, resolusi Puncak 11-12 lebih baik sehingga

Puncak 11 dapat dipisahkan dari Puncak 12 (Gambar IV.35. C3 dan C4).

Sayangnya intensitas Puncak 6 melemah pada konsentrasi fosfat 15 mM.

109

Gambar IV. 35 Pengaruh variasi konsentrasi BGE I (Na2HPO4/NaH2PO4/CTAB) pada pH 8,0. C1: 10/10/0.5, C2: 10/10/1.0, C3: 15/15/0.5, dan C4: 15/15/1.0

Konsentrasi surfaktan mempengaruhi profil puncak 7 dan 8 (Gambar IV. 35).

Pada konsentrasi fosfat 10 mM, peningkatan konsentrasi CTAB sebesar 0,5 mM

mempengaruhi profil puncak 7 dan 8, yaitu dari bentuk puncak ber-tailing

menjadi puncak ber-fronting. Sedangkan pada konsentrasi fosfat 15 mM, puncak

7 dan 8 dapat terpisah dengan baik, peningkatan konsentrasi CTAB malah

memperkecil resolusi. Ini menunjukkan kemungkinan terbentuknya misel pada

konsentrasi CTAB 1,0 mM. Dengan demikian konsentrasi optimal CTAB untuk

membalik arah EOF adalah 0,5 mM. Berdasarkan pertimbangan waktu migrasi,

intensitas puncak, sensitivitas dan kedapat-ulangan semua puncak, komposisi C1,

yaitu 10 mM Na2HPO4/ 10 mM NaH2PO4/ 0,5 mM CTAB ditetapkan sebagai

konsentrasi optimal campuran penyangga yang digunakan untuk pemisahan spesi

LMM Ca dalam cairan floem tanaman jarak.

Dalam elektroforesis kapiler, spesi ionik dipisahkan berdasarkan muatan dan

ukurannya. Kekuatan keasaman (pH) elektrolit latar mempengaruhi pemisahan

spesi. Pemisahan sebaiknya dilakukan pada pH fisiologi cairan floem, yaitu pada

110

pH 8,0 untuk mempertahankan kestabilan spesi. Oleh karena itu, rentang pH

larutan elektrolit yang dicoba adalah dari 7,5 – 9,0.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa setiap puncak yang muncul memberikan

respon yang berbeda terhadap variasi pH tersebut (Gambar IV. 36). Sebagai

contoh, pada pH 7,5 dan 8,6, peak 7 dan 8 dapat dipisahkan dengan baik

walaupun waktu migrasi spesi meningkat dan kedapatulangan (reproducibility)

waktu migrasi puncak 11/12 dan 13 tidak optimal. Pemisahan pada pH 8,0 secara

keseluruhan memperlihatkan resolusi yang baik sedangkan pada kondisi basa (pH

9,0), terjadi gangguan pada puncak 11 dan 12, yang menunjukkan spesi tersebut

tidak stabil pada pH 9,0. Berdasarkan pertimbangan waktu migrasi dan

kedapatulangan waktu migrasi puncak, maka pH 8,0 merupakan pH optimal untuk

pemisahan spesi LMM Ca dalam cairan floem. Hal ini menunjukkan bahwa

pemisahan spesi Ca selayaknya dilakukan pada kondisi keasaman fisiologi cairan

floem yaitu pH 8,0.

Gambar IV. 36 Pengaruh pH pada pemisahan LMM Ca. Kondisi pemisahan sesuai tabel 3. Konsentrasi BGE 10 mM Na2HPO4/ 10 mM NaH2PO4/ 0.5 mM CTAB.

Bab IV Hasil dan Pembahasan - Perpustakaan Digital ITB ... · cairan dalam kapiler dapat menarik...

Documents

Transcript of Bab IV Hasil dan Pembahasan - Perpustakaan Digital ITB ... · cairan dalam kapiler dapat menarik...