BAB IV HASIL DAN PEMBAHASANdigilib.unimus.ac.id/files/disk1/154/jtptunimus-gdl-veranurtri... ·...
Transcript of BAB IV HASIL DAN PEMBAHASANdigilib.unimus.ac.id/files/disk1/154/jtptunimus-gdl-veranurtri... ·...
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Identifikasi E. coli
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dari 10 sampel feses yang
diambil dari pasien diare pada anak dikultur pada media EMBA dan MC serta
dilakukan uji biokima terhadap koloni hasil kultur. Berdasarkan hasil identifikasi
bakteri E. coli dari 10 sampel feses didapatkan 15 isolat bakteri E. coli.
Koloni E. coli pada media EMBA menunjukkan pertumbuhan yang baik
dari koloni biru-hitam gelap dengan kemilau hijau metalik ditunjukkan pada
gambar 2a.
A
b
Gambar 2. Koloni E. coli pada media EMBA (a) dan MC (b)
EMBA adalah media selektif dan media diferensial. Media ini
mengandung Eosin dan metilen biru, yang menghambat pertumbuhan bakteri
Gram positif, maka media ini dipilih untuk bakteri Gram negatif. EMBA juga
mengandung karbohidrat laktosa, dengan adanya karbohidrat laktosa bakteri
Gram negatif terdiferensiasi berdasarkan pada kemampuan mereka untuk
memfermentasi laktosa. Warna media sebelum pemupukan bakteri berwarna
merah keunguan. Perubahan warna hijau metalik pada media EMBA karena
Escherichia coli dapat memfermentasi laktosa yang mengakibatkan peningkatan
kadar asam dalam media. Kadar asam yang tinggi dapat mengendapkan methylen
blue dalam media EMBA (Cheeptham, 2012 dan Lindquist, 2004).
Berdasarkan hasil pengamatan, koloni E. coli pada media MC berwarna
merah ditunjukan pada gambar 2b. Hal ini sesuai dengan protocol manual dari BD
edisi ke-2 yang menyatakan bahwa Koloni bakteri koliform yang terisolasi akan
berwarna merah jambu tua karena media MC Agar mengandung kristal violet dan
garam empedu yang menghambat organisme Gram-positif memungkinkan
organisme Gram-negatif untuk tumbuh.
Berdasarkan hasil pengamatan uji biokimia yang telah dilakukan pada 15
isolat E. coli dari 10 sampel yang telah diambil, hasil uji biokimia indol, MR, VP,
Citrat, motilitas, Urease, TSIA dan gula-gula ditunjukkan pada Tabel 1. Berikut
adalah gambar hasil uji biokimia E. coli.
Gambar 3. Hasil uji indol, MR, VP, motilitas, citrat, urea, TSIA dan Hasil uji
gula-gula (glukosa, laktosa, sukrosa, galaktosa, fruktosa, maltosa dan
manitol) pada E. coli
Tabel 1. Hasil uji biokimia E. coli dari sampel pasien diare anak
S I MR VP C M U TSIA G L S Gal F Mal Man
1a + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
1b + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
2a + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
2b + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
3a + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
3b + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
3c + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
4a + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
4b + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
5 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
6 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
7 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
8 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
9 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
10 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -
Keterangan:
1. Indol (+) terdapat cincin merah
2. MR (+) larutan berwarna merah
3. VP (-) larutan tetap bening
4. Motilitas (+) pertumbuhan di area
tusukan
5. Citrat (-) tidak terjadi perubahan warna
6. Urea (-) tidak terjadi perubahan warna
7. TSIA A/A , H2S (-) dan gas (+)
8. Glukosa (+) larutan berwarna kuning
9. Laktosa (+) larutan berwarna kuning
10. Sukrosa (+) larutan berwarna kuning
11. Galaktosa (+) larutan terjadi kekeruhan
12. Fruktosa (+) larutan terjadi kekeruhan
13. Maltosa (+) larutan terjadi kekeruhan
14. Manitol (-) tidak terjadi perubahan
warna
Uji indol bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan
indol dengan menggunakan enzim tryptophanase (Leboffe, 2011). Produksi indol
di dalam media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Bakteri yang memiliki
enzim tryptophanase menghidrolisis tryptophan. menjadi indol, piruvat dan
amonia. Hal ini digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, sebuah tes yang
dirancang untuk membedakan antara anggota keluarga Enterobacteriaceae
(Hemraj, 2013).
Gambar 4. Gambar rantai reaksi uji indol (Hemraj, 2013)
Tryptophan adalah asam amino esensial, yang teroksidasi oleh beberapa
bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam piruvat dan amonia. Uji
indol dilakukan dengan inokulasi organisme uji ke dalam tryptophan broth, yang
mengandung tryptophan. Indol yang dihasilkan dideteksi dengan menambahkan
reagen Kovac’s ini yang menghasilkan cincin berwarna merah. Lapisan alkohol
berkonsentrasi warna merah berbentuk cincin terdapat di bagian atas. Hasil indol
positif dinyatakan dengan adanya cincin merah hal ini disebabkan karena Indol
bereaksi dengan aldehida (Sridhar, 2006). Hasil uji indol pada isolat bakteri
E. coli adalah positif yang ditunjukan adanya cincin merah pada bagian atas.
Escherichia coli dan anggota lain dari organisme tingkat rendah
memfermentasi gula melalui jalur asam yang merubah gas CO2 menjadi H2 dalam
jumlah yang sedikit yang dihasilkan melalui fermentasi (McDevitt, 2010). Uji MR
bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme dalam memproduksi dan
mempertahankan produk akhir asam stabil dari fermentasi glukosa. Beberapa
bakteri menghasilkan sejumlah besar asam dari fermentasi. Methyl Red adalah
indikator pH, yang tetap berwarna merah pada pH 4,4 atau kurang. (Sridhar,
2006) Setelah inkubasi, indikator pH Methyl Red ditambahkan ke dalam kultur
bkteri. Methyl Red berwarna merah pada pH di bawah 4,4 (hal ini menunjukkan
hasil positif) dan kuning pada pH di atas 6,0. Warna oranye menunjukkan pH
menengah dan dianggap hasil negatif (Hemraj, 2013).
Gambar 5. Fermentasi asam oleh E.coli
Hasil pengamatan untuk Uji MR pada isolat bakteri E. coli adalah positif
yang ditunjukkan dengan larutan berwarna merah.
VP adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi acetoin dalam kultur cair
bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan alpha-naftol dan kalium
hidroksida dengan kaldu Voges Proskauer yang telah diinokulasi dengan bakteri.
Warna merah cherry menunjukkan hasil yang positif, sedangkan warna kuning-
coklat menunjukkan hasil negatif. Tes ini tergantung pada pencernaan glukosa
menjadi acetylmethylcarbinol. Jika glukosa pecah, maka akan bereaksi dengan
alpha-naftol (VP reagen 1) dan kalium hidroksida (VP reagen 2) untuk
membentuk warna merah. Alpha-naftol dan kalium hidroksida adalah bahan kimia
yang mendeteksi acetoin (Sridhar, 2006).
Gambar 6. Gambar reaksi kimia uji VP (Sridhar, 2006)
Asetil-metil carbinol (acetoin) adalah perantara dalam produksi butilen
glikol. Dalam tes ini dua reagen, 40% KOH dan alpha-naftol ditambahkan setelah
inkubasi dan terkena oksigen. Jika terdapat acetoin, acetoin akan teroksidasi
dengan adanya udara dan KOH menjadi diacetyl. Diacetyl kemudian bereaksi
dengan komponen guanidin dari pepton, adanya alpha-naftol menghasilkan warna
merah. Peran alpha-naftol adalah untuk katalis dan penguat warna (Hemraj, 2013).
Hasil pengamatan untuk uji VP adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya
perubahan warna terhadap larutan VP.
Media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu
mikroorganisme. Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari
Enterobacteriaceae (Shields dkk, 2013). Hasil pengamatan uji motilitas E. coli
adalah positif, hal ini ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area
penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut karena media semisolid (uji motilitas)
dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4%
pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara
memungkinkan pergerakan bakteri bergerak (Leboffe, 2011)
Tes Citrat bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme untuk
memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bakteri
diinokulasi pada medium yang mengandung natrium sitrat dan indikator pH
bromothymol biru. Media juga mengandung garam amonium anorganik, yang
digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Pemanfaatan sitrat melibatkan
enzim citrat permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat.
Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi Na2CO3
serta NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masing-masing
menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan perubahan warna medium dari hijau
menjadi biru (Hemraj, 2013).
Gambar 7. Reaksi kimia uji citrat (Sridhar, 2006)
Uji citrat dilakukan dengan inokulasi mikroorganisme ke dalam media
sintetis organik, "Simons Citrate broth" apabila natrium sitrat adalah satu-satunya
sumber karbon dan energi. Bromothymol blue digunakan sebagai indikator saat
asam sitrat dimetabolisme, menghasilkan karbondioksida yang menggabungkan
natrium dengan air untuk membentuk natrium karbonat yang merupakan produk
alkaline yang menghasilkan perubahan warna dari hijau menjadi biru dan hal ini
menunjukkan tes tersebut positif. (Sridhar, 2006). Hasil pengamatan untuk uji
Citrat adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya perubahan warna terhadap
media uji citrat.
Hasil pengamatan dari uji urea yang telah dilakukan adalah negatif, hal ini
ditunjukan karena tidak ada perubahan warna pada media uji urea. Uji Urease
berguna untuk mengidentifikasi organisme yang mampu menghidrolisis urea yang
dapat menghasilkan amonia dan karbon dioksida terutama untuk mengetahui
mikrooeganisme tersebut mempunyai enzim urease atau tidak. Urease merupakan
enzim konstitutif yang menghidrolisis urea menjadi karbon dioksida dan ammonia
( NH2 ) 2CO + H2O → CO2 + 2NH3 (Brink, 2013).
Gambar 8. Gambar reaksi kimia uji uerase (Leboffe, 2011)
Urea dihidrolisis menjadi amonia oleh organisme positif urease akan
mengatasi buffer dalam jangka menengah dan mengubahnya dari oranye menjadi
merah muda . hasil pengamatan untuk uji uraease pada E. coli menunjukan hasil
negati, hal ini dikarenakan Organisme negatif urease baik tidak menghasilkan
perubahan warna dalam media atau mengubahnya kuning dari produk asam.
(Leboffe, 2011).
TSIA agar adalah media deferensial yang digunakan dalam menentukan
fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, ujia TSIA ini juga dapat
mendeteksi adanya gas hasil dari metabolisme karbohidrat. TSIA membedakan
bakteri berdasarkan fermentasi mereka laktosa, glukosa dan sukrosa dan produksi
hidrogen sulfida. TSIA yang paling sering digunakan dalam identifikasi
Enterobacteriaceae, meskipun berguna untuk bakteri gram negatif lainnya
(Lehman, 2005). Hasil dari pengamatan untuk uji TSIA pada E. coli menunjukan
hasi A/A dengan gas positif dan H2S negatif. Warna kuning pada keseluruhan
media tersebut dikarenakan E. coli pada media TSIA dapat memfermentasikan
glukosa, laktosa dan sukrosa. Gas positif dikarenakan gas yang dihasilkan oleh
fermentasi karbohidrat akan muncul sebagai celah di media atau akan mengangkat
agar-agar dari bagian bawah tabung (Leboffe, 2011). Media uji motilitas
digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Uji motilitas
sering kali digunakan dalam diferensiasi dari Enterobacteriaceae (Shields dkk,
2013). Hasil pengamatan uji motilitas pada E. coli adalah positif, hal ini
ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area penusukan. Pergerakan dari
bakteri tersebut dikarenakan media semisolid (uji motilitas) dirancang dengan
mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4% pada media yang
hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara memungkinkan
pergerakan bakteri bergerak. (Leboffe, 2011).
Hasil dari pengamatan untuk uji gula-gula adalah positif kecuali manitol.
Fermentasi karbohidrat adalah proses metabolisme oleh molekul organik yang
bertindak memberikan donor elektron serta satu atau lebih produk organik yang
bertindak sebagai penerima elektron. Fermentasi glukosa dimulai dengan
memproduksi piruvat. Produk akhir fermentasi piruvat meliputi berbagai asam,
alkohol, dan H2 atau Gas CO2. Produk akhir yang spesifik tergantung pada
organisme tertentu. Setiap media terdiri dari bahan dasar yang ditambahkan
karbohidrat yang dapat difermentasi. Bahan dasar tersebut termasuk di dalamnya
adalah pepton dan indikator pH. Setiap karbohidrat dapat digunakan, namun
umumnya yang sering digunakan adalah glukosa , laktosa , dan sukrosa. Tabung
Durham diletakkan terbalik dalam masing-masing tabung sebagai indikator
adanya produksi gas. Produksi asam dari fermentasi karbohidrat menurunkan pH
di bawah netral dan ternyata Deaminasi dari asam amino pepton menghasilkan
amonia (NH3), yang meningkatkan pH. Produksi gas ditunjukkan dengan adanya
gelembung pada tabung Durham. Kemampuan media ini untuk mendeteksi
produksi asam tergantung pada waktu inkubasi dan kemampuan fermentor untuk
menghasilkan kelebihan yang relatif asam terhadap amonia yang dihasilkan dari
proses deaminasi. (Leboffe, 2011)
Menurut Ijong dan Dien tahun 2011, hasil uji biokimia untuk E. coli
umumnya isolat uji memfermentasi laktosa dan menghasilkan asam dan gas, indol
dan metil red positif, oksidase negatif, tidak menggunakan sitrat sebagai sumber
energi dan motil, sedangkan uji lainnya memberikan hasil yang bervariasi.
B. Resistensi Antibiotik
E. coli pada media semua isolat bakteri kemudian diuji pola resistensinya
terhadap antibiotik. Antibiotik yang digunakan antara lain siprofloksasin,
gentamisin, tetrasiklin, kloramfenikol dan asam nalidiksat.Hasil dari pengujian
antibiotik ditujukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. uji resistensi E. coli isolat feses diare anak terhadap antibiotik
No Sampel Sip Gen Tetra Klo NA
S R S R S R S R S R
1. 1a S - S - - R - R - R 2. 1b S - - R - R - R - R
3. 2a S - S - S - S - S -
4. 2b S - - R S - S - S -
5. 3a - R S - - R - R - R
6. 3b - R S - - R - R - R
7. 3c - R S - - R - R - R
8. 4a - R S - - R - R - R
9. 4b - R S - - R - R - R
10. 5 S - S - S - S - - R
11. 6 - R S - - R S - - R
12. 7 S - S - S - S - - R
13. 8 - R S - - R - R - R 14. 9 S - S - S - - R - R
15. 10 S - S - - R - R - R
Jumlah 8 7 13 2 5 10 5 10 2 13
Persentase 53% 46,7% 86,7% 13,3% 33,3% 67,7% 33,3% 67,7% 13,3% 86,7%
Keterangan :
Cip : siprofloksasin Tet : tetrasiklin
Gen : gentamisin Clo : kloramfenikol
Nal : asam nalidiksat
Gambar 9. Persentase pemeriksaan uji sensitivitas E. coli isolat feses diare anak
terhadap antibiotik
46,7
13,3
66,7 66,7
86,7
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
cip gen tet clo nal
res
sen
Hasil uji pola resistensi E. coli terhadap beberapa jenis antibiotik
menujukan 53,3% sensitif dan 46,7% resisten terhadap siprofloksasin, 86,7%
sensitif dan 13,3% resisten terhadap Gentamisin, 33,3% sensitif dan 67,7%
resisten terhadap Tetrasiklin, 33,3% sensitif dan 67,7% resisten terhadap
kloramfenikol, 13,3% sensitif dan 86,7% resisten terhadap asam nalidiksat.
Pengujian terhadap resistensi E. coli terhadap antibiotik tertinggi adalah asam
nalidiksat diikuti dengan tetrasiklin, kloramfenikol, siprofloksasin dan terendah
adalah gentamisin.
Asam nalidiksat merupakan golongan dari kuinolon, resistensi terhadap
kuinolon dapat terjadi melalui 3 mekanisme, yaitu melalui mutasi Gen gyr A yang
menyebabkan subunit A dari DNA girase bakteri berubah sehingga tidak dapat
diduduki molekul obat lagi, perubahan pada permukaan sel bakteri sehingga
mempersulit penetrasi obat ke dalam sel dan penigkatan mekanisme pemompa
obat keluar sel (efflux) (Anonim, 2007).
Tetrasiklin dan kloramfenikol termasuk antibiotik yang sering digunakan
oleh masyarakat. Terjadinya resistensi pada kloramfenikol dan tetrasiklin ini
karena terjadinya pemindahan plasmid dari bakteri resisten kepada bakteri
sensitif, dan hal ini dapat juga terjadi bila bakteri yang semula sensitif terkena
paparan obat. Tetrasiklin merupakan antibiotika yang paling banyak tersedia pada
unit-unit pelayanan kesehatan terutama Puskesmas untuk pengobatan pasien
sehingga banyak dipakai. Selain itu antibiotika ini digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli. Hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotika yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotika yang kemudian
menjadi resisten (Refdanita dkk, 2004).
Siproflokasin merupakan generasi pertama golongan fluorokuinolon.
Secara umum mekanisme resistensi terhadap fluorokuinolon merupakan
antimikroba yang unik karena secara langsung menghambat sintesis DNA, hal ini
terjadi oleh interaksi antara obat dengan kompleks yang terdiri dari DNA dan
salah satu dari kedua enzim target, yaitu DNA gyrase dan topoisomerase IV.
Mekanisme resistensi fluorokuinolon mencakup satu atau dua dari tiga kategori
utama, yaitu perubahan dalam target obat dan perubahan dalam penetrasi obat
untuk mencapai target (Hooper, 2005).
Gentamisin merupakan golongan dari amino glikosida. Bakteri dapat
resisten terhadap amino glikosida karena kegagalan penetrasi ke dalam bakteri,
rendahnya afinitas obat pada ribosom atau inaktivasi obat oleh enzim bakteri.
Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal yaitu enzim fosforilase, adenilase,
asetilase, gugus hidroksil spesifik atau gugus amino. Informasi genetik untuk
sintesis enzim terutama didapat melalui konjugasi, transfer DNA sebagai plasmid
dan transfer faktor resisten. Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama di lingkungan rumah sakit dan membawa lebih dari 20 kode enzim ini
bertanggung jawab terhadap penyempitan spektrum kanamisin, gentamisin dan
tobramisin (Refdanita dkk, 2004). Hasil penelitian menunjukan 86,7% E. coli
sensitif terhadap antibiotik gentamisin, hal ini menunjukan bahwa disc antibiotik
gentamisin mampu menghambat sintesis protein dari E. coli melalui kerja di
ribosom.
Berikut ini adalah gambar hasil uji antibiotik pada media MHA
1
Keterangan :
a. E. coli sensitif terhadap siptofloksasin
b. E. coli resisten terhadap gentamisin
2
Keterangan :
a. E. coli sensitif terhadap tetrasiklin
b. E. coli sensitif terhadap kloramfenikol
c.
Gambar 10. Hasil uji resistensi isolat E. coli terhadap antibiotik yang disesuaikan
dengan Standart CLSi