III. METODOLOGI

A. BAHAN DAN ALAT

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah saus sambal

dan minuman dalam kemasan untuk analisis kualitatif, sedangkan untuk

analisis kuantitatif digunakan natrium benzoat dengan kemurnian 99 % dan

saus sambal. Bahan-bahan kimia untuk analisis meliputi NaOH 10 %, HCl

(1+3), eter, NH3, FeCl3 0.5 %, NaCl powder, kloroform, aquades, NaOH 0.05

N, H2SO4, indikator PP, alkohol, dan kertas saring.

Peralatan yang digunakan untuk penelitian ini antara lain blender, labu

pemisah, plateform shaker, hot plate, labu takar, gelas pengaduk, pipet tetes,

pipet volumetrik, desikator, buret, gelas piala, erlenmeyer, neraca analitik,

rotavapor, dan pH-meter.

B. METODE

1. Analisis Kualitatif Natrium Benzoat (AOAC 910.02B 1999)

Persiapan Sampel

a. Padatan atau semi padatan :

Sampel sebanyak 50-100 g ditambah dengan 300-400 ml air.

Kemudian dihancurkan dengan menggunakan waring blender. Selanjutnya

campuran ditambah dengan NaOH 10 % hingga alkalis dan dibiarkan

selama + 2 jam, setelah itu disaring.

b. Cairan

Sampel sebanyak 50-100 ml dibuat menjadi alkalis dengan

penambahan NaOH 10 %. Kemudian disaring dengan kapas. Jika sampel

berkadar gula tinggi, maka harus diencerkan sampai total padatan terlarut

10-15 %.

Pengujian

Sebanyak 100 ml atau lebih filtrat dari persiapan sampel dimasukkan

ke dalam labu pemisah. Kemudian ditambahkan HCl (1+3) sampai asam

21

(gunakan kertas litmus sebagai indikator) dan ditambahkan lagi 5-10 ml HCl

(1+3). Setelah itu, larutan tadi diekstrak dengan 75-100 ml eter. Jika perlu

lapisan air diekstrak kembali dengan eter. Ekstrak eter dicuci sebanyak 3 kali,

masing-masing dengan 5 ml air. Ekstrak eter yang telah dicuci dimasukkan ke

dalam pinggan porselin dan diuapkan ke dalam penangas air. Residu yang

dihasilkan mengandung asam benzoat atau eternya, asam salisilat, sakarin,

dulsin, dan atau bahan terekstrak lainnya.

Residu yang diperoleh dilarutkan dalam air. Jika perlu dipanaskan

sampai 80-85o

C selama 10 menit. Larutan tersebut ditambahkan dengan

beberapa tetes NH3 sampai larutan menjadi basa. Kemudian larutan diuapkan

untuk menghilangkan kelebihan NH3. Residu yang tersisa dilarutkan kembali

dengan air panas. Setelah itu, larutan disaring jika perlu. Ke dalam larutan

ditambahkan beberapa tetes FeCl3 netral 0.5 %. Terbentuknya endapan

Ferribenzoat yang berwarna salmon menunjukkan adanya asam benzoat.

Diagram alir prosedur analisis kualitatif benzoat dapat dilihat pada Lampiran

5.

2. Analisis Kuantitatif Natrium Benzoat

a. Penentuan Penggunaan Pereaksi

Pada tahap ini dilakukan analisis larutan natrium benzoat +1000

ppm dengan tiga perlakuan. Perlakuan 1 digunakan bahan kimia yang

semuanya pro analysis (p.a) yang terdiri dari NaCl, kloroform, dan

alkohol. Perlakuan 2 digunakan kloroform teknis dan alkohol teknis.

Perlakuan 3 digunakan NaCl teknis, kloroform teknis, dan alkohol teknis.

Analisis dilakukan secara duplo. Hasil yang didapat kemudian dilakukan

uji t, uji F, dan ANOVA untuk membandingkan apakah ketiga perlakuan

tersebut berbeda nyata atau tidak. Berdasarkan uji statistik yang dilakukan

dan pertimbangan biaya analisis, akan dipilih satu perlakuan untuk

digunakan pada analisis selanjutnya.

22

Larutan Na-benzoat 1000 ppm

Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3

ppm Na-benzoat ppm Na-benzoat ppm Na-benzoat

Uji t, F, dan ANOVA

b. Analisis Saus Sambal

Saus Sambal

Dianalisis 7 kali Dianalisis 7 kali

(ekstraksi dengan labu pemisah) (ekstraksi dengan shaker)

Presisi Presisi

Uji t, F, dan ANOVA

c. Uji Banding Antar Laboratorium

Saus Sambal

Dianalisis di laboratorium yang telah terakreditasi

Uji t, F ,dan ANOVA dengan hasil yang didapat dari

metode titrimetri

23

d. Prosedur Analisis Kuantitatif Natrium Benzoat Secara Titrimetri (AOAC

963.19 1999)

Persiapan Sampel

a. Prosedur Umum

Sampel dihomogenkan, jika sampel berupa padatan atau semi

padat maka harus dihaluskan. Sebanyak 150 ml atau 150 g sampel

dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml. Kemudian ditambahkan NaCl

powder secukupnya untuk menjenuhkan air dalam sampel. Sampel

dibuat menjadi alkalis (periksa dengan kertas lakmus) dengan

penambahan NaOH 10 % atau dengan suspensi Ca(OH)2 (satu bagian

Ca(OH)2 disuspensikan dalam tiga bagian air). Setelah itu, campuran

tersebut diencerkan sampai tanda batas dengan larutan NaCl jenuh dan

dikocok berulang kali. Larutan dibiarkan selama + 2 jam, dikocok

berulang kali, dan disaring. Jika contoh mengandung banyak lemak,

bagian yang saringannya terkontaminasi oleh lemak ditambahkan

beberapa ml larutan NaOH 10 % ke dalam saringan, kemudian

diekstrak dengan eter sebelum penetapan selanjutnya. Jika sampel

mengandung alkohol, perlakuan seperti cara d. Jika sampel

mengandung sejumlah bahan yang dapat diendapkan oleh larutan

NaCl, perlakuan seperti cara e

b. Sampel Saus Tomat

Ke dalam 100 g sampel ditambahkan 15 g NaCl powder dan

campuran dipindahkan ke dalam labu takar 500 ml kemudian dicuci

wadah semula dengan +150 ml larutan NaCl jenuh. Larutan dibuat

menjadi alkalis dengan NaOH 10 % dan diencerkan dengan larutan

NaCl jenuh sampai tanda tera. Larutan dibiarkan selama sedikitnya 2

jam, dikocok setiap selang waktu tertentu, disentrifuse jika perlu,

kemudian disaring.

24

c. Sampel Jeli, Jam, dan Marmalades

Dihancurkan 150 g sampel di dalam 300 ml larutan NaCl jenuh

kemudian ditambahkan 15 g NaCl dan dibuat menjadi alkali dengan

suspensi Ca(OH)2. Selanjutnya dipindahkan larutan tersebut ke dalam

labu takar 500 ml dan diencerkan dengan larutan NaCl jenuh sampai

tanda tera. Larutan dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok

berulang kali, disentrifuse jika perlu, kemudian disaring.

d. Sampel Cider yang mengandung alkohol dan produk sejenisnya

Ke dalam 250 ml sampel ditambahkan NaOH 10 % sampai

alkalis, kemudian diuapkan pada penangas uap sampai volume larutan

menjadi100 ml. Dipindahkan sampel ke dalam labu takar 250 ml,

ditambahkan 30 g NaCl powder dan dikocok sampai larut. Selanjutnya

diencerkan sampai tanda tera dengan larutan NaCl jenuh. Larutan

dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok berulang kali, kemudian

disaring.

e. Sampel Ikan asin atau Ikan yang Dikeringkan

Dicuci 50 g sampel yang telah dihaluskan dalam labu takar 500

ml dengan H2O. Sampel dibuat menjadi alkalis dengan NaOH 10 %

dan ditepatkan sampai tanda tera dengan H2O. Dibiarkan selama

sedikitnya 2 jam, dikocok secara teratur, dan disaring. Lalu dipipet

sebanyak mungkin filtrat (>300 ml), dimasukkan ke dalam labu takar

500 ml kedua dan ditambahkan 30 gram NaCl untuk setiap 100 ml

larutan. Kemudian larutan dikocok sampai NaCl larut. Larutan tersebut

diencerkan sampai tanda tera dengan larutan NaCl jenuh, dikocok

sampai homogen dan disaring protein/bahan lain yang mengendap.

Penetapan Sampel

Sebanyak 100-200 ml filtrat sampel dipipet dan di masukkan ke

dalam labu pemisah. Filtrat dinetralkan dengan penambahan HCl (1 + 3)

dan ditambahkan lagi 5 ml HCl sesudah netral. Filtrat yang telah

diasamkan, diekstrak dengan menggunakan kloroform (CHCl3) beberapa

25

kali dengan volume kloroform 70, 50, 40, dan 30 ml. Untuk mencegah

pembentukan emulsi, digoyang-goyang secara kontinyu setiap kali

ekstraksi dengan gerakan rotasi. Lapisan kloroform biasanya memisah

dengan mudah sesudah dibiarkan beberapa menit. Jika emulsi terbentuk,

emulsi dihilangkan dengan mengocok lapisan CHCl3 menggunakan gelas

pengaduk, dengan memindahkan dan memisahkan emulsi dengan

menggunakan labu pemisah lain atau dengan sentrifusa beberapa menit.

Setiap kali ekstraksi selesai, diambil bagian jernih lapisan

kloroform sebanyak mungkin, diusahakan jangan tercampur dengan

emulsi. Jika lapisan kloroform yang diperoleh kurang jernih maka perlu

dicuci dengan akuades sampai jernih. Selanjutnya seluruh ekstrak

kloroform dipindahkan ke dalam cawan penguap porselen, dibilas wadah

beberapa kali dengan beberapa ml CHCl3 dan diuapkan sampai kering

pada suhu kamar dalam aliran udara kering.

Hasil ekstraksi dapat juga dipindahkan dari labu pemisah ke

dalam erlenmeyer 300 ml dan bilas labu pemisah dengan 5-10 ml CHCl3

tiga kali. Ekstrak tersebut didistilasi dengan lambat pada suhu rendah

sampai volume ekstrak seperempat dari volume semula, kemudian

diuapkan sampai kering pada suhu kamar di atas penangas air sampai

tinggal beberapa tetes cairan saja yang tinggal. Selanjutnya residu

dikeringkan semalaman (atau sampai tidak tercium bau asam asetat bila

sampelnya adalah saus tomat) dalam desikator yang mengandung H2SO4

pekat. Kemudian residu asam benzoat dilarutkan dalam 30-50 ml alkohol,

ditambahkan 12-15 ml air dan 1 atau 2 tetes. Diagram alir prosedur

analisis kuantitatif benzoat dapat dilihat pada Lampiran 6.

Perhitungan :

Volume larutan

ppm Na Titer x N NaOH x 144 x yang dibuat pada x 106

benzoat = persiapan sampel

anhidrat Volume yang diambil x berat sampel x 1000

untuk penetapan