18

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. BAHAN DAN ALAT

1. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur Bacillus

thuringiensis subsp. aizawai yang diperoleh dari IPB Culture Collection

(IPBCC) pada medium agar miring. Substrat yang digunakan adalah ampas

tahu dan limbah cair tahu yang diperoleh dari Industri Tahu Cibanteng. Kubis

yang digunakan diperoleh dari pasar-pasar tradisional dan super market. Serta

larva ulat Croccidolomia binotalis (ulat kubis) yang diperoleh dari Laboratorium

Fisiologi dan Toksin Departemen Hama dan Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian,

IPB. Mineral yang digunakan adalah MgSO4.7H2O, MnSO4. H2O,

ZnSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, CaCO3, dan urea. Bahan-bahan yang digunakan

untuk analisa adalah nutrien agar (NA), nutrien broth (NB), HCl, NaOH,

CH3COOH, H2SO4 pekat, fenil, garam fisiologis, etanol 95 %, aqua destilata,

Pro-Stiker, dan spiritus.

2. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi autoklaf, pH-meter,

oven, lemari es, inkubator, neraca analitik, desikator, spektrofotometer, freezer,

loop inokulasi, dan alat-alat gelas lainnya seperti labu erlenmeyer, tabung

reaksi, pipet, bunsen, cawan petri, dan gelas piala.

B. METODE PENELITIAN

1. Penelitian Pendahuluan

a. Analisa Bahan Baku

Analisa ini bertujuan untuk mengetahui komposisi kimia ampas tahu

dan limbah cair tahu yang digunakan, yaitu analisis kadar air, kadar abu,

kadar lemak, kadar serat, kadar nitrogen, dan kadar karbon. Prosedur

analisis tercantum pada Lampiran 1.

19

b. Penyiapan Inokulum Bacillus thuringiensis subsp. aizawai

Inokulum (kultur bibit) kultivasi disiapkan secara bertahap mengikuti

metode Vandekar dan Dulmage (1982). Diagram alir persiapan inokulum

disajikan pada Gambar 6.

Gambar 6. Diagram Alir Pembiakan Inokulum

2. Penelitian Utama

a. Penyiapan Media Kultivasi

Susunan medium kultivasi yang akan dibuat dalam penelitian ini dapat

dilihat pada Tabel 4 yang dibuat dua kali ulangan.

Tabel 4. Perbandingan Medium Kultivasi

Sandi Medium Perbandingan Medium

A Ampas Tahu 20% : Limbah cair tahu 80%

B Ampas Tahu 30% : Limbah cair tahu 70%

C Ampas Tahu 40% : Limbah cair tahu 60%

Inokulum / Starter

Inkubasi dalam rotary shaking incubator

30 0C ; 180 rpm ; 12 jam

Satu loop biakan Bt subsp. aizawai

Inokulasi dalam 50 ml medium NB (labu pembibitan 1)

Inkubasi dalam rotary shaking incubator

30 0C ; 180 rpm ; 12 jam

Kultur digunakan untuk menginokulasi labu pembibitan II

(5 % dari volume media kedua)

20

Jenis dan jumlah mineral yang digunakan dalam penelitian ini sesuai

dengan yang digunakan oleh Dulmage dan Rhodes (1971), yaitu 0,3 g/l

MgSO4.7H2O, 0,02 g/l MnSO4. H2O, 0,02 g/l ZnSO4.7 H2O, 0,02 g/l

FeSO4.7 H2O, dan 1,0 g/l CaCO3.

Pembuatan media kultivasi yang dilakukan adalah sebagai berikut :

ampas tahu dan CaCO3 disterilkan secara terpisah dari urea, limbah cair

tahu, dan trace alement. Bahan-bahan medium yang lain dicampur diatas

pemanas berpengaduk. Setelah itu didinginkan sampai 50 0C dan pH

diatur hingga 7,2. Kemudian medium dibagi-bagi dalam beberapa labu

erlenmeyer. Ampas tahu + CaCO3 dan limbah cair tahu disterilkan dalam

autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. Setelah steril dan dingin, ampas

tahu + CaCO3 dan limbah cair tahu dicampurkan menjadi satu sesuai

formulasi yang ditentukan kemudian ditambahkan bahan-bahan lain secara

aseptik.

b. Kultivasi

Kultivasi Bt subsp. aizawai dilakukan secara curah dengan kondisi

kultivasi sebagai berikut : kultivasi dilakukan dalam labu erlenmeyer 250 ml

pada suhu 28 32 0C, pH awal medium diatur pada 6,5 7,5, volume

medium fermenntasi 50 ml, diinkubasi menggunakan rotary shaking

incubator dengan kecepatan 180 rpm, dan dipanen pada waktu inkubasi 30

jam dan 48 jam. Kultivasi dilakukan dua kali ulangan dengan kondisi

kultivasi yang sama antara ulangan I dan ulangan II.

Tabel 5. Perlakuan pada kultivasi Bta

Sandi

Medium

Sandi Medium

Kultivasi

Jumlah Stater yang

Ditambahkan

A

A1 A2

A3

10 % (v/w)

15 % (v/w)

20 % (v/w)

B

B1

B2

B3

10 % (v/w)

15 % (v/w)

20 % (v/w)

C

C1

C2

C3

10 % (v/w)

15 % (v/w)

20 % (v/w)

21

c. Pemanenan

Pemanenan (recovery) hasil kultivasi dilakukan pada waktu akhir

inkubasi, yaitu pada jam ke-30 dan jam ke-48. Kemudian dilakukan analisis

pH, total mikroba, jumlah spora hidup, total gula sisa, dan toksisitas.

Prosedur analisa dapat dilihat pada Lampiran 1.

Gambar 7. Diagram alir proses produksi bioinsektisida

d. Penentuan Toksisitas Produk (Bioassay)

Penentuan jumlah spora hidup yang terkandung dalam produk

bioinsekktisida atau campuran spora-kristal hasil kultivasi dan pengujian

toksisitasnya terhadap larva Croccidolomia binotalis yang dinyatakan dalam

LC50 dengan metode bioassay. LC50 dapat ditentukan dengan menggunakan

analisis probit program Probit Quant (software dari Steve Maund,

University of Wales, College of Cardiff, Inggris).

3. Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Rancangan Acak Lengkap Pola Faktorial dengan dua kali ulangan. Rancangan

Acak Lengkap Pola Faktorial adalah rancangan acak lengkap yang terdiri dari

dua peubah bebas (Faktor) dalam klasifikasi silang yaitu faktor A (konsentrasi

ampas tahu dan limbah cair tahu sebagai substrat) yang terdiri dari 3 taraf dan

22

faktor B (konsentrasi starter yang digunakan) yang terdiri dari 3 taraf dan

kedua faktor tersebut diduga saling berinteraksi. Saling berinteraksi

dimaksudkan bahwa pengaruh suatu faktor tergantung dari taraf faktor yang

lain, dan sebaliknya jika tidak terjadi interaksi berarti berarti pengaruh suatu

faktor tetap pada setiap taraf faktor yang lain. Jadi bila tidak terjadi interaksi

antar taraf-taraf suatu faktor saling sejajar satu sama lainnya, sebaliknya bila

ada interaksi tidak saling sejajar

Model rancangan percobaan pada penelitian utama menggunakan dua

faktor yaitu faktor konsentrasi substrat yang terdiri dari 3 taraf, yaitu

perbandingan ampas tahu dan limbah cair tahu 20 : 80, 30 : 70, dan 40 : 60

serta faktor konsentrasi starter yang terdiri dari 3 taraf, yaitu 10, 15, 20 % (v/v)

dan kedua faktor tersebut diduga saling berinteraksi. Model yang digunakan

adalah sebagai berikut :

Yij = + i + j + i j + ij (Hanafiah, 2005)

Keterangan :

Yij = Variabel respon karena pengaruh faktor konsentrasi gula taraf

ke i dan faktor konsentrasi starter taraf ke j

= Efek rata-rata yang sebenarnya

i = Efek dari taraf ke i konsentrasi gula

j = Efek dari taraf ke j konsentrasi starter

ij = Efek dari interaksi antara taraf ke i konsentrasi gula dan taraf

ke j konsentrasi starter

Data yang diperoleh dari pengukuran parameter, masing-masing

dianalisis menggunakan analisis ragam uji F. Apabila hasilnya menunjukkan

perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil

(LSD).