17

BAB III

METODE KERJA

3.1 Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan selama penelitian adalah daun karuk (Balittro),

Jeruk nipis (Pasar modern, BSD), Staphylococcus aureus dan Pseudomonas

aeruginosa (ATCC IPB), madu (Sari Bunga Alam), Nutrient Agar (Merck), Blood

Agar Base (Oxoid), darah domba defibrinasi (Departemen Mikrobiologi UI),

etanol food grade, Dragendorff dan Mayer LP, HCL 2N, NaOH (Merck), Na2SO4

anhidrat (Merck), DMSO (Merck), H2SO4 (Merck), garam fisiologis (Merck)

kloroform, acetic anhydride, asam borat (Merck), Folin-Ciocalteau (Merck),

Na2CO3(Merck), FeCl3(Merck), asam gallat, aluminium klorida, potassium asetat,

quersetin, glutaraldehida 2%, alkohol, air minum (Aqua), dan air destilasi.

Alat yang digunakan selama penelitian adalah beaker glass, tabung reaksi,

water bath (Memmert), batang pengaduk, saringan, cawan petri (Gosseline),

spektrofotometer (Tuner SP-83), Scanning Electron Microscope (SEM),

mikroskop, termometer, pipet tetes, pipet volumetrik (pyrex), labu takar (pyrex),

Erlenmeyer (pyrex), penjepit kayu, ose, kaca preparat, kuvet, mikro pipet, tip,

gelas ukur (pyrex), laminar air flow, jangka sorong, dry blender (Panasonic

MXJ1G WSR), ayakan 35 mesh, autoklaf, heater (Barn Stead SP 46920-33),

bunsen, korek api, vortex (Thermo Scientific M37610-33), inkubator, timbangan

meja, oven (Memmert UM 400), rotary vapour, Neraca analitik (Mettler Tuledo),

buchner, rak tabung rekasi, pH meter (Metrohm), colony counter, tabung reaksi

(pyrex), tabung ulir (pyrex), dan bulp pump.

18

3.2 Metode Penelitian

Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental dua

tahap. Pada penelitian tahap I untuk menentukan lama maserasi daun karuk yang

dapat menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan P. aeruginosa penyebab

ISPA. Penelitian tahap II dengan melanjutkan penelitian pada tahap sebelumnya,

yaitu dikombinasikan dengan penambahan rasio sari jeruk nipis dan madu pada

dosis ekstrak daun karuk sehingga mendapatkan aktivitas antibakteri yang tepat

dalam menghambat bakteri S. aureus dan P. aeruginosa penyebab ISPA.

Penelitian tahap II dilakukan untuk membuat minuman fungsional ekstrak daun

karuk dari rasio sari jeruk nipis : madu dengan dosis ekstrak daun karuk.

3.2.1 Penelitian Tahap I

Tahap pertama dalam penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh

lama maserasi daun karuk yang dapat menghambat pertumbuhan S. aureus dan P.

aeruginosa. Parameter uji yang diamati adalah uji antimikroba, Minimum

Inhibitory Consentration (MIC) dan Minimum Bactercidal Consentration (MBC),

kadar air, rendemen, dan uji fitokimia.

3.2.1.1 Perlakuan dan Rancangan Percobaan Tahap I

Pada percobaan tahap pertama dipilih satu faktor dalam ekstrak daun karuk.

Faktor yang digunakan adalah lama maserasi, dengan empat level yang

digunakan. Daun karuk bubuk sebanyak 15 gram dimasukkan ke dalam 300 ml

etanol (food grade) dengan perbandingan 1:20. Lama maserasi yang digunakan 1

hari (A1), 3 hari (A2), dan 5 hari (A3), 7 hari (A4). Rancangan percobaan dilakukan

19

dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor dengan tiga kali

pengulangan dan duplo. Rancangan percobaan dapat dilihat pada Tabel 3.1

Tabel 3.1 Rancanan percobaan tahap I

Lama Maserasi (A) Ulangan

1 hari (A1) (A1)1

(A1)2

(A1)3

3 hari(A2) (A2)1

(A2)2

(A2)3

5 hari (A3) (A3)1

(A3)2

(A3)3

7 hari (A4) (A4)1

(A4)2 (A4)3

Uji statistik dilakukan dengan menggunakan program Statistical Package

for the Social Science (SPSS) 20. Model statistik rancangan percobaan sebagai

berikut:

Y ij = µ + Ai + єij

dimana,

Yij = variabel respon hasil pengamatan pada sampel

µ = nilai tengah populasi

Ai = lama maserasi yang digunakan

εij = pengaruh eror yang mempengaruhi Yij

Hipotesis yang digunakan selama penelitian:

H0 = tidak ada pengaruh signifikan lama maserasi terhadap uji aktivitas

antibakteri

H1 = terdapat pengaruh signifikan lama maserasi terhadap uji aktivitas antibakteri.

20

3.2.1.2 Prosedur Penelitian Tahap I

Pada penelitian tahap pertama dibagi menjadi dua, yaitu proses pengeringan

daun karuk dan proses ekstraksi daun karuk, uji toksisitas dan penentuan MIC dan

MBC.

A. Pengeringan Daun Karuk (Ugusman, et al., 2012; Satwase 2013 )

Proses pembuatannya dimulai dari tahap pencucian, pengecilan ukuran,

dan pengeringan. Proses pertama pembuatan diawali dengan sortasi pada daun

karuk. Sortasi dilakukan untuk membuang benda asing yang terikut dan

membuang daun karuk yang sudah rusak. Daun karuk yang telah disortasi

kemudian dicuci dengan menggunakan air mengalir agar daun karuk bersih dari

kotoran yang menempel pada daun. Setelah selesai dicuci, daun karuk ditiriskan

dan dikeringkan.

Tahap selanjutnya ialah pengecilan ukuran daun karuk. Daun karuk

dipotong dengan ukuran ± 2 cm, kemudian dimasukkan ke dalam oven untuk

dikeringkan dengan menggunakan suhu 70oC dalam waktu 5 jam. Setelah proses

pengeringan selesai, dilakukan proses maserasi. Proses pembuatan daun karuk

kering dapat dilihat pada Gambar 3.1.

Daun karuk segar

↓

Dicuci dan dipotong menjadi ukuran kecil (± 2 cm)

↓

Ditiriskan

↓

Dikeringkan (5 jam, suhu 70oC)

↓

Daun karuk kering

Gambar 3.1 Diagram alir proses pengeringan daun karuk.

Sumber: Ugusman, et al (2012); Satwase (2013)

21

B. Ekstraksi Daun Karuk (Chanudom, et al., 2014)

Daun karuk yang telah kering dihaluskan dengan menggunakan dry

blander, kemudian dilakukan pengayakan dengan menggunakan ayakan 35 mesh.

Dengan perbandingan 1:20, sebanyak 15 gram daun karuk bubuk dimasukkan ke

dalam 300 ml etanol (food grade).

Daun karuk kering

↓

Di dry blender

↓

Diayak (35 mesh)

↓

Daun karuk bubuk (15 gram)

↓

Diekstrak dengan Etanol (1:20) food grade

↓ Maserasi (1, 3, 5, dan 7 hari)

↓

Penyaringan –Vakum buchner

↓

Filtrat

↓

Evaporasi-rotary evaporator (suhu 50oC)

↓

Ekstrak Daun Karuk

Gambar 3.2 Diagram alir proses ekstraksi daun karuk.

Sumber: Chanudom, et al (2014).

C. Uji Aktivitas Antibakteri (Parhusip dan Sitanggang, 2011)

Penyegaran kultur dilakukan dengan cara mengambil 1 ose dari kultur

stok, dimasukkan ke dalam 10 ml Nutrient Broth (NB), kemudian diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 37oC. Kultur dari tabung penyegar akan diambil 1 ml

dan dimasukkan ke dalam tabung berisi 9 ml NB dan diinkubasi hingga fase

eksponensial yaitu diinkubasi selama 8 jam.

Pengujian antibakteri menggunakan metode difusi sumur, dengan

mengukur daya hambat masing-masing bakteri. Sebanyak 107 CFU/ml bakteri

yang akan diuji (S. aureus dan P. aeruginosa) 0.2% suspensi bakteri dimasukkan

ke dalam Nutrient Agar (NA) untuk P. aeruginosa dan Blood Agar Base (BAB)

22

untuk S. aureus kemudian dituangkan ke dalam cawan petri dan tunggu hingga

memadat. Agar yang telah memadat dibuat lubang-lubang atau sumur dengan

diameter ± 6mm. Setiap lubang yang telah dibuat dimasukkan sampel sebanyak

60 μL dengan berbagai konsentrasi (100-500 mg/ml (b/v)). Cawan diinkubasi

pada suhu 37oC selama 24 jam.

Bakteri akan tumbuh hanya pada area plate dimana memiliki konsentrasi

antibiotik yang terlalu rendah dan dapat mencegah pertumbuhan bakteri. Pada

tahap akhir inkubasi, dapat dilakukan pengukuran diameter hambat pertumbuhan

bakteri (dalam millimeter) pada zona bening yang berada disekitar lubang.

Pengukuran diameter hambat dilakukan dengan menggunakan jangka sorong

(Lee, 2009).

D. Pengujian Toksisitas terhadap Ekstrak (Juniarti et al., 2009)

Metode BSLT digunakan untuk melakukan pengujian toksisitas. Uji

toksisitas dilakukan pada sampel ekstrak yang terpilih pada tahap I. Larva udang

sebanyak 10-12 ekor disiapkan di dalam 100 μl air laut pada setiap perlakuannya.

Terdapat lima perlakuan yang dibuat untuk berdasarkan perbedaan konsentrasi

dari ekstrak. Konsentrasi yang digunakan adalah 10, 100, 200, 500, dan 1000

ppm. Sebanyak dua tetes DMSO dimasukkan ke dalam larva yang telah berisi

ekstrak dan diinkubasi selama 24 jam.

Proses pengujian selanjutnya dilakukan dengan menghitung larva yang

hidup dan yang mati pada setiap konsentrasi yang akan digunakan untuk

menghitung persentase mortalitas. Perhitungan persentase mortalitas dilakukan

23

dengan cara akumulasi dari larva mati dengan total dari larva mati dan hidup

sebagai pembagi, kemudian dikali 100%.

E. Penentuan Minimum Inhibitor Consentration (MIC) dan Minimum

Bacterial Consentration (MBC) (Bloomfield, 1991)

Sebanyak 5 buah sumur dibuat pada media padat, kemudian ekstrak daun

karuk sebanyak 60μL dimasukkan ke dalam masing-masing sumur berdiameter 6

mm. Ekstrak daun karuk dengan konsentrasi 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml,

400 mg/ml, dan 500 mg/ml dimasukkan ke dalam sumur yang telah dibuat.

Setelah semua sumur terisi, media akan diinkubasi selama 24 jam pada suhu

37oC. Hasil pengukuran ditunjukkan dengan adanya zona penghambatan bakteri

setelah inkubasi 24 jam.

MBC diperlukan untuk mengetahui konsentrasi minimal dalam

menghambat pertumbuhan mikroba. Penentuan MIC dan MBC menggunakan

kurva In Mo (Dosis ekstrak daun karuk). Pada kurva sumbu X menunjukan In Mo

dan sumbu Y menunjukan zona penghambatan yang dikuadratkan (Z2). Pada

kurva akan terbentuk titik potong sumbu X disebut juga Mt. Mt akan dihitung

dengan ln-1 sehingga mendapat perhitungan untuk nilai MBC. Nilai MIC dapat

diperoleh dengan perkalian MBC dengan 0.25.

3.2.1.3 Parameter Penelitian Tahap I

Parameter uji yang dilakukan pada tahap I terdiri dari uji aktivitas bakteri

(Suliantari, et al., 2008), penentuan MIC dan MBC (Bloomfield, 1991) terhadap

bakteri S. aureus dan P. aeruginosa, kadar air, rendemen, uji fitokimia dan uji

toksisitas.

24

3.2.2 Penelitian Tahap II

Penelitian tahap kedua bertujuan untuk menambahkan rasio sari jeruk

nipis : madu pada dosis ekstrak daun karuk dalam pembuatan minuman

fungsional dari ekstrak daun karuk sehingga lebih efektif dalam menghambat

bakteri penyebab ISPA. Penambahan rasio sari jeruk nipis dan madu ke dalam

dosis ekstrak MBC yang terpilih pada tahap I.

3.2.2.1 Perlakukan dan Rancangan Percobaan Penelitian Tahap II

Pada penelitian tahap II ini memiliki dua faktor rasio sari jeruk nipis dan

madu (B) dan dosis ekstrak berdasarkan nilai MBC (C). Empat level rasio sari

jeruk nipis : madu yang digunakan adalah B1 (1:1), B2 (1:2), B3 (1:3), dan B4

(1:4). Dosis ekstrak yang digunakan sebanyak empat level, yaitu:

C1 = 1 MBC (41 mg/ml)

C2 = 2 MBC (82 mg/ml)

C3 = 3 MBC (123 mg/ml)

C4 = 4 MBC (164 mg/ml)

Penambahan rasio sari jeruk nipis : madu dilakukan untuk melihat

aktivitas antibakteri daun karuk. Rancangan percobaan dilakukan dengan

Rancangan Acak Lengkap (RAL) dua faktor dengan tiga kali pengulangan.

Rancangan percobaan dapat dilihat pada Tabel 3.2.

25

Tabel 3.2 Rancangan percobaan tahap II

Rasio sari jeruk nipis :

madu (B)

Dosis ekstrak (C)

1 MBC (C1) 2 MBC (C2) 3 MBC (C3) 4 MBC (C4)

1:1 (B1) (B1C1)1 (B1C2)1 (B1C3)1 (B1C4)1

(B1C1)2 (B1C2)2 (B1C3)2 (B1C4)2

(B1C1)3 (B1C2)3 (B1C3)3 (B1C4)3

1:2 (B2) (B2C1)1 (B2C2)1 (B2C3)1 (B2C4)1

(B2C1)2 (B2C2)2 (B2C3)2 (B2C4)2

(B2C1)3 (B2C2)2 (B2C3)3 (B2C4)3

1:3 (B3) (B3C1)1 (B3C2)1 (B3C3)1 (B3C4)1

(B3C1)2 (B3C2)2 (B3C3)2 (B3C4)2

(B3C1)3 (B3C2)3 (B3C3)3 (B3C4)3

1:4 (B4) (B4C1)1 (B4C2)1 (B4C3)1 (B4C4)1

(B4C1)2 (B4C2)2 (B4C3)2 (B4C4)2 (B4C1)3 (B4C2)3 (B4C3)3 (B4C4)3

Uji statistik dilakukan dengan menggunakan program Statistical Package

for the Social Science (SPSS) 20. Model statistik rancangan percobaan sebagai

berikut:

Y ijk = µ + Bi + Cj + (BC)ij + єijk

dimana,

B = faktor rasio sari jeruk nipis : madu (pada perbandingan 1:1, 1:2, 1:3 dan

1:4)

C = faktor dosis ekstrak (1 MBC, 2 MBC, 3 MBC, dan 4 MBC)

I = banyaknya faktor rasio sari jeruk nipis : madu dalam percobaan yaitu 4

j = banyaknya faktor dosis ekstrak dalam percobaan yaitu 4

k = pengulangan yang dilakukan selama percobaan yaitu 3

Keterangan:

Yijk = variabel respon hasil pengamatan pada sampel

µ = nilai tengah populasi

Ai = pengaruh rasio sari jeruk nipis : madu ke i

Bj = pengaruh dosis ekstrak ke j

26

(AB)ij = pengaruh interaksi antara rasio sari jeruk nipis : madu dengan Dosis

ekstrak

εijk = pengaruh eror yang mempengaruhi Yijk

Hipotesis yang digunakan selama penelitian:

H0 = tidak ada pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap aktivitas

antimikroba .

H0 = tidak ada pengaruh signifikan dosis ekstrak terhadap aktivitas antimikroba.

H0 = tidak ada pengaruh signifikan interaksi antara rasio sari jeruk nipis : madu

dengan dosis ekstrak terhadap aktivitas antimikroba.

H0 = tidak ada pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap uji

organoleptik .

H0 = tidak ada pengaruh signifikan dosis ekstrak terhadap uji organoleptik.

H0 = tidak ada pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap uji

organoleptik .

H0 = tidak ada pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap total

fenolik produk .

H0 = tidak ada pengaruh signifikan dosis ekstrak terhadap total fenolik produk

H0 = tidak ada pengaruh signifikan interaksi antara rasio sari jeruk nipis : madu

dengan dosis ekstrak terhadap total fenolik.

H0 = tidak ada pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap total

flavonoid produk.

H0 = tidak ada pengaruh signifikan dosis ekstrak terhadap total flavonoid produk

27

H0 = tidak ada pengaruh signifikan interaksi antara rasio sari jeruk nipis : madu

dengan dosis ekstrak terhadap total flavonoid.

H1 = terdapat pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap aktivitas

antimikroba.

H1 = terdapat pengaruh signifikan dosis ekstrak terhadap aktivitas antimikroba.

H1 = terdapat pengaruh signifikan interaksi antara rasio sari jeruk nipis : madu

dengan dosis ekstrak terhadap aktivitas antimikroba.

H1 = terdapat pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap uji

organoleptik.

H1 = terdapat pengaruh signifikan dosis ekstrak terhadap uji organoleptik.

H1 = terdapat pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap uji

organoleptik.

H1 = terdapat pengaruh signifikan dosis ekstrak terhadap total fenolik produk

H1 = terdapat pengaruh signifikan interaksi antara rasio sari jeruk nipis : madu

dengan dosis ekstrak terhadap total fenolik.

H1 = terdapat pengaruh signifikan rasio sari jeruk nipis : madu terhadap total

flavonoid produk.

H1 = terdapat pengaruh signifikan dosis ekstrak terhadap total flavonoid produk

H1 = terdapat pengaruh signifikan interaksi antara rasio sari jeruk nipis : madu

dengan dosis ekstrak terhadap total flavonoid.

28

3.2.2.2 Prosedur Penelitian Tahap II

Pada tahap penelitian ke II dibagi menjadi dua yaitu proses pengambilan

sari jeruk nipis dan prosedur pembuatan minuman fungsional dengan penambahan

rasio sari jeruk nipis : madu ke dalam dosis ekstrak daun karuk.

A. Sari Jeruk Nipis

Jeruk nipis yang segar dicuci dan dibersihkan, kemudian dipotong menjadi

dua bagian. Diperas untuk dipisahkan sari dan kulit jeruk, kemudian disaring.

Dari hasil penyaringan, dibuat konsentrasi sari jeruk seperti yang telah ditetapkan.

Prosedur pengambilan sari jeruk dapat dilihat pada Gambar 3.2.

Jeruk nipis segar

↓

Dicuci pada air yang mengalir

↓

Dipotong menjadi dua bagian dan diambil sarinya

↓

Disaring dengan menggunakan penyaring teh

↓

Sari jeruk nipis siap digunakan untuk analisis selanjutnya

Gambar 3.3 Prosedur pengambilan sari jeruk nipis

B. Pembuatan Produk

Pembuatan produk minuman fungsional dari daun karuk dilakukan

berdasarkan penelitian Wiranti, et al (2008) dan Hastuti (2012) dengan

modifikasi. Pembuatan produk minuman fungsional berdasarkan level yang telah

ditetapkan. Pembuatan 100 ml minuman fungsional dari ekstrak daun karuk

menggunakan 50 ml larutan ekstrak daun karuk dengan masing-masing dosis

esktrak yang digunakan yaitu 1 MBC, 2 MBC, 3 MBC, dan 4 MBC, kemudian

dilakukan pengadukan. Pemanasan dilakukan pada suhu 70oC selama 1 jam

dengan menggunakan water bath. Sebanyak 50 ml campuran sari jeruk nipis dan

29

madu ditambahhkan sesuai dengan masing-masing rasio yang digunakan 1:1, 1:2,

1:3, dan 1:4, kemudian dilakukan pengadukan dan menghasilkan minuman

fungsional dari ekstrak daun karuk sebanyak 100 ml. Proses pembuatan minuman

fungsional dari ekstrak daun karuk dapat dilihat pada Gambar 3.4

50 ml larutan ekstrak daun karuk (1MBC, 2 MBC, 3 MBC, dan 4 MBC)

↓

Pengadukan

↓

Pemanasan dengan waterbath (suhu 70oC; 1 jam)

↓

Penambahan 50 ml campuran sari jeruk nipis : madu (1:1, 1:2, 1:3, dan 1:4)

↓

Pengadukan

↓ Minuman dari ekstrak daun karuk (100 ml)

Gambar 3.4 Prosedur Pembuatan Minuman Fungsional

Sumber : Fransisca (2013), Hastuti (2012), dan Wiranti, et al (2008) dengan modifikasi

3.2.2.3 Parameter Penelitian Tahap II

Parameter uji yang dilakukan pada tahap II terdiri dari uji aktivitas bakteri

(Suliantari, et al., 2008), uji total fenolik, uji total flavonoid, uji proksimat, dan uji

organoleptik scoring (warna, aroma, rasa pahit, rasa asam, dan aftertaste) uji

organoleptik hedonik (warna, aroma, rasa pahit, rasa asam, aftertaste, dan

penerimaan keseluruhan) dan Scanning Electron Microscope (SEM).

3.2.3 Prosedur Analisis Parameter

3.2.3.1 Uji Proksimat

Analisis proksimat dilakukan pada produk terbaik yang dihasilkan dari

tahap penelitian II. Uji proksimat dilakukan pada uji kadar air, uji kadar abu, uji

protein, uji lemak, dan uji karbohidrat.

30

A. Kadar Air (AOAC, 2005)

Metode pengukuran kadar air dilakukan dengan metode oven. Cawan

kosong ditimbang beratnya kemudian dimasukkan sampel sebanyak 2 gram untuk

dikeringkan dengan oven pada suhu 105oC selama 6 jam. Setelah 6 jam maka

cawan dikeluarkan dari oven dan ditimbang kembali hingga mendapatkan berat

tetap. Kadar air dihitung dengan membandingkan berat sampel sebelum

dikeringkan dengan berat yang hilang setelah dikeringkan dikali 100%.

Perhitungan dilakukan dengan rumus sebagai berikut :

berat sampel awal – berat sampel setelah dioven

Kadar air (%) = x 100%

Berat sampel awal

B. Kadar Abu (AOAC, 2005)

Metode dry ashing dilakukan untuk pengujian kadar abu. Sampel

sebanyak 2 gram diletakkan ke dalam cawan pengabuan yang telah konstan.

Cawan tersebut akan diabukan dengan menggunakan burner terlebih dahulu.

Pengabuan dihentikan jika asap berwarna putih telah dihasilkan pada burner.

Proses pengabuan dilanjutkan dengan memasukkan sampel ke dalam tanur pada

suhu 500-600oC hingga sampel berwarna putih. Cawan pengabuan yang telah

selesai ditanur, dimasukkan ke dalam desikator selama 15 menit dan ditimbang

berat konstan. Kadar abu dapat dihitung dengan menggunakan rumus :

Kadar abu (%berat basah) = wb-wa x 100%

wc-wa

Keterangan :

Wa = Berat cawan kosong (g)

Wb = Berat cawan dan sampel setelah pengabuan (g)

Wc = Berat cawan dan sampel sebelum pengabuan (g)

31

C. Uji Kadar Protein (AOAC, 2005)

Metode kjeldahl digunakan untuk pengujian protein. Sampel sebanyak 2

gram dimasukkan ke dalam tabung kjeldhal 100 ml, kemudian ditambahkan 5 mg

selenium, 7 gram K2SO4, 10 ml H2SO4 96% dan 10 ml H2O2 35%. Destruksi

sampel dilakukan pada suhu 420oC dengan menggunakan burner sampai larutan

berubah warna menjadi bening. Proses destilasi akan dilakukan setelah sampel

mengalami proses destruksi.

Aquades sebanyak 50 ml dan 50 ml NaOH35% ditambahkan pada saat

proses destilasi. Penambahan NaOH akan berlangsung selama proses destilasi

berlangsung. Hasil dari destilasi akan ditampung ke dalam Erlenmeyer dengan

ditambahkan 25 ml asam borat 4% dan mix indicator sebanyak 2-4 tetes. Titrasi

dilakukan dengan menggunakan HCl 0,2 N hingga warna berubah menjadi warna

merah muda. HCl yang telah digunakan dicatat untuk titrasi. Pembuatan blanko

dilakukan seperti proses diatas, tetapi tanpa penambahan sampel.

Cara perhitungan kadar protein:

% kadar nitrogen =(b-a) x N HCl x 14 x 100%

c

Kadar protein (%) = % kadar nitrogen x faktor konversi protein

Keterangan :

a = volume HCl 0,2 N yang digunakan untuk blanko (ml)

b = volume HCl 0,2 N yang digunakan untuk sampel (ml)

c = berat sampel (mg)

Ar Nitrogen = 14

Faktor konversi = 6,25

32

D. Uji Kadar Lemak (BSN, 1992)

Metode hidrolisis (Weibull) digunakan untuk pengujian kadar lemak.

Sampel yang akan diuji sebanyak 1 L dimasukkan ke dalam Erlenmeyer

kemudian ditambahkan 30 ml HCl 25%, akuades 20 ml, dan batu didih ke dalam

Erlenmeyer. Erlenmeyer yang telah berisi campuran tersebut dipanaskan selama

15 menit. Setelah selesai, saring larutan tersebut dalam keadaan panas dan dicuci

dengan menggunakan air panas sehingga tidak terjadi reaksi dengan asam lagi.

Kertas saring yang digunakan untuk menyaring dimasukkan ke dalam oven pada

suhu 100oC-105oC. Kertas saring tersebut kemudian dibungkus dengan

menggunakan kertas saring lainnya dan diekstrak dengan menggunakan heksana

selama 3 jam pada suhu 80oC. Larutan heksana kemudian dievaporasi dengan

menggunakan rotary vapor pada suhu 100oC-105oC. Labu lemak ditimbang

hingga mencapai berat yang konstan.

Cara perhitungan kadar lemak:

Kadar lemak = berat lemak terekstrak (g) x 100%

Berat awal sampel (g)

E. Uji Kadar Karbohidrat (AOAC, 2005)

Metode by difference digunakan untuk pengujian karbohidrat. Metode by

difference merupakan metode perhitungan karbohidrat dengan cara mengurangi

persen total dengan kadar air, kadar abu, kadar protein, dan kadar lemak.

Cara perhitungan kadar karbohidrat :

Kadar karbohidrat (%) = 100 – (%kadar air + %abu + %lemak + %protein)

33

3.2.3.2 Rendemen (AOAC, 2005)

Perhitungan rendemen dilakukan dengan menimbang hasil minuman

fungsional ekstrak daun karuk dengan berat daun karuk yang masih segar

kemudian dinyatakan dalam persen. Perhitungan dilakukan dengan rumus sebagai

berikut :

Rendemen (%) = berat setelah di ekstrak x 100%

berat sampel sebelum diekstrak

3.2.3.3 Uji Fitokimia

Uji fitokimia merupakan pengujian secara kualitatif untuk mengetahui

adanya hasil metabolit sekunder pada tanaman. Pengujian fitokimia dilakukan

pada golongan alkaloid, saponin, flavonoid, tannin, total fenolik dan total

flavonoid.

A. Uji Alkaloid (Padmasari, et al., 2012)

Sampel sebanyak 180 mg ditambahkan dengan 1 mL HCL 2N dan 9 ml

akuades. Campuran tersebut dipanaskan selama 2 menit diatas penangas air,

kemudian didinginkan dan disaring. Tambahkan 2 tetes Dragendorff dan Mayer

LP pada masing-masing filtrat. Pada Mayer LP akan terbentuk endapan putih atau

kuning yang larut dengan metanol menunjukan hasil positif pada alkaloid. Pada

Dragendorff akan terbentuk endapan berwarna coklat hingga hitam, menunjukan

hasil yang positif pada alkaloid.

B. Uji Saponin (Yusuf, et al., 2013)

Sampel sebanyak 0.5 g dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan dengan 10 ml air destilasi. Campuran tersebut dikocok selama 30

34

detik. Campuran tersebut didiamkan selama 30 menit. Terbentuknya buih

menandakan hasil yang positif pada saponin.

C. Uji Tanin (Baud, et al., 2014)

Sampel sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan 2 tetes FeCl3 10%, kemudian terjadi perubahan warna menjadi hijau

keabuan menandakan adanya hasil positif terhadap tanin.

D. Uji Flavonoid (Hossain, et al., 2013)

Sampel sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan dengan beberapa tetes larutan NaOH, kemudian terjadi perubahan

warna menjadi kuning. Warna kuning akan pudar saat ditambahkan dengan

larutan asam, menunjukan hasil positif terhadap flavonoid.

E. Uji Steroid (Mandal dan Bose, 2011)

Sampel ekstrak sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan sedikit kloroform. Campuran tersebut kemudian diteteskan dengan

menggunakan asetat anhidrat sebanyak 3-4 tetes dan ditambahkan 3 tetes asam

sulfat pekat. Perubahan warna dari ungu ke biru menunjukan hasil tersebut positif

terhadap steroid.

F. Uji Triterpenoid (Mandal dan Bose, 2011)

Sebanyak 5 ml ekstrak dilarutkan ke dalam kloroform 2 mL dan

ditambahkan dengan 3 ml H2SO4 pekat untuk membentuk lapisan. Campuran

35

tersebut akan terbentuk batasan keduanya yang berwarna coklat kemerahan

nenunjukan hasil positif terhadap triterpenoid.

G. Total Fenolik (Ugusman, et al., 2012)

Kandungan total fenolik ditentukan dengan menggunakan metode Folin-

Ciocalteau. Sejumlah 0,3 mL sampel ditambahkan dengan menggunakan larutan

Folin-Ciocalteau 1,5 mL. Campuran lalu ditambahkan dengan 1,2 mL (7,5%)

Na2CO3. Campuran didiamkan selama satu jam dalam ruang gelap dan penentuan

fenolik dilihat dengan menggunakan kolorimetri pada 750 nm.

Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan asam gallat pada

konsentrasi 10-100 ppm. Kandungan total fenolik dinyatakan dengan mg ekivalen

asam galat/L (mg GAE/L sampel).

H. Total Flavonoid (Ugusman, et al., 2012)

Metode spektrofotometri aluminium klorida digunakan untuk menentukan

kandungan total flavonoid. Sampel sejumlah 1 mL ditambahkan dengan 1 ml

aluminium klorida. Campuran yang telah ditambahkan disimpan disuhu ruang

selama 30 menit kemudian diukur dengan menggunakan spektrofotometri pada

panjang gelombang 415nm.

Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan quersetin dengan

konsentrasi 5 sampai 50 ppm. Total flavonoid dinyatakan dengan mg quersetin/L

(mg QE/L sampel).

36

3.2.3.4 Uji Organoleptik

Dalam penelitian ini, dilakukan uji organoleptik, yaitu uji hedonik dan uji

scoring. Uji skoring digunakan untuk menilai warna, aroma, rasa pahit, rasa asam,

dan after taste ekstrak daun karuk yang telah ditambahkan dengan rasio sari jeruk

nipis : madu. Uji hedonik dilakukan untuk melihat tingkat kesukaan panelis

terhadap produk minuman fungsional ekstrak daun karuk.

A. Uji Hedonik

Uji hedonik dilakukan pada 70 orang panelis. Uji ini menggunakan

penilaian dengan metode scoring. Penliaian diberikan dari angka 1 (sangat tidak

disukai) sampai 7 (sangat disukai).

B. Uji Scoring

Uji scoring dilakukan pada 70 orang panelis. Parameter yang dinilai

adalah warna, aroma, rasa pahit, rasa asam, dan after taste. Uji scoring dilakukan

dengan memberi penilaian dari angka 1 (sangat tidak berwarna coklat/ sangat

tidak beraroma daun/ sangat tidak terasa pahit/ sangat tidak terasa asam/ sangat

tidak terasa after taste) sampai 7 (sangat berwarna coklat/ sangat beraroma daun/

sangat terasa pahit/ sangat terasa asam/ sangat terasa after taste).

3.2.3.5 Uji Warna Produk Minuman Fungsional (Hutching, 1999)

Pengujian warna produk ekstrak dilakukan dengan menggunakan

Chromameter Minolta CR-310. Kali brasi dilakukan terlebih dahulu dengan

menggunakan pelat standar warna putih (L=97,51 ; a=5,35 ; b=-3,37). Sampel

37

akan dikonversikan ke dalam sistem Hunter yaitu L untuk menyatakan tingkat

kecerahan dari hitam (0) hingga putih (100), a menyatakan warna kromatik

campuran merah-hijau dengan nilai 0-100, warna merah bernilai 0 sampai -80

untuk warna hijau, dan b menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning

dengan nilai 0-70. Warna kuning bernilai 0 sampai -80 untuk warna biru. Nilai

oHue dapat dihitung dengan menggunakan nilai a dan b sehingga dapat

mengetahui kisaran warna sampel.

Cara perhitungan nilai oHue

Hue = tan-1 (b*/a*)

3.2.3.6 Prosedur Scanning Electron Microscope (SEM) (Bozzola dan Russel,

1999)

Analisis SEM dilakukan untuk melihat rusaknya dinding sel bakteri akibat

perlakukan yang diberikan. Prosedur uji SEM diawali dengan penyegaran kultur

bakteri dilakukan dengan cara, kultur bakteri dimasukkan ke dalam 9 mL NB dan

diinkubasi selama 8 jam pada suhu 37oC sampai bakteri mencapai fase

eksponensial. Penambahan 1 mL produk ke dalam kultur tersebut kemudian

homogenisasikan dengan menggunakan vorteks. Inkubasi kembali campuran

tersebut selama 16-24 jam pada suhu 37oC.

Sel bakteri dipisahkan satu dengan yang lainnya dengan cara sentrifugasi

selama 10 menit pada kecepatan 1550 rpm. Adanya endapan yang terbentuk

ditambahkan dengan 2% glutaraldehida. Sentrigugasi kembali suspensi bakteri

tersebut, dengan penambahan caccodylate buffer pada endapan yang terbentuk.

Endapan tersebut didiamkan selama 10 menit dan dilakukan pengulangan dua

kali. Sentrifugasi kembali campuran tersebut selama 10 menit, kemudian fase

38

bagian atas dibuang. Tambahkan osmium tetra oksida 1% kemudian didiamkan

selama satu jam dan disentrifugasi kembali. Fase bawah yang terbentuk diambil

dan ditambahkan dengan alkohol 50%, didiamkan selama 10 menit dan dilakukan

pengulangan sebanyak dua kali.

Penambahan alkohol 70%, alkohol 80%, dan alkohol 95% secara

berurutan ke dalam endapan selama 10 menit. Alkohol absolut ditambahkan dan

didiamkan selama 10 menit, kemudian dilakukan pengulangan sebanyak dua kali.

Pengulangan sudah selesai dilakukan, campuran kembali disentrifugasi kemudian

fase atas dibuang. T-butanol ditambahkan dan didiamkan selama 10 menit,

pengulangan dilakukan sebanyak dua kali. Endapan yang terbentu ditambahkan

dengan butanol dan pengolesan suspense dilakukan untuk membuat cover slip dan

kemudian dikeringkan dengan menggunakan freeze drier pada suhu 4oC.

pengamatan dilakukan dengan menggunakan SEM setelah sampel kering.