BAB IIIMETODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat PercobaanAdapun alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator, ekstraktor Soxhlet, gelas beker, bejana pengembang dan pipa kapiler, melting point apparatus, dan spektrofotometer UV-Vis.

3.2 Bahan PercobaanAdapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kunyit (Curcuma domestica Val.), toluena, etanol 96%, kloroform dan kertas saring.3.3 Prosedur Kerja3.3.1 Preparasi sampelKunyit yang akan digunakan dicuci dengan air sampai bersih, kemudian dikeringkan dengan dijemur dibawah sinar matahari sampai kering. Kemudian kunyit yang telah kering dipotong tipis kecil-kecil. Potongan kunyit lalu diblender sampai membentuk serbuk kasar. Tujuan penghalusan kunyit adalah agar zat-zat yang terkandung di dalam kunyit mudah melarut dalam pelarut yang digunakan.3.3.2 Skrining fitokimiaSkrining fitokimia dilakukan untuk memastikan bahwa senyawa target terdapat dalam simplisia. Pengujian dilakukan dengan melakukan uji kualitatif dengan menambahkan beberapa pereaksi dimana pereaksi tersebut dapat memberikan perubahan warna yang spesifik dengan senyawa target.Simplisia kering yang telah dihaluskan di larutkan dalam pelarut etanol, kemudian ambil etanol tersebut dipisahkan kedalam cawan dan ditambahkan dengan asam borat. Apabila reaksi menunjukan hasil positif senyawa kurkumin maka akan terbentuk warna merah.3.3.3 Ekstraksi sampelMetode: MaserasiPelarut: Etanol 96%Waktu : 24 jam sebanyak 3x pengulanganProses ekstraksi digunakan metode maserasi dengan cara serbuk kunyit dimasukan ke dalam maserator kemudian dilarutkan dengan bantuan pelarut etanol 96%, alasannya selain etanol 96% sebagai pelarut yang cocok untuk melarutkan senyawa senyawa bahan alam termasuk kurkumin, etanol juga merupakan pelarut universal yang banyak digunakan pada proses ekstraksi, etanol 96% juga digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri selama proses maserasi, dan kenapa digunakan yang 96% agar kandungan air nya sedikit, karena air merupakan media pertumbuhan bakteri. Setelah dilarutkan dengan etanol 96% kemudian direndam selama 6 jam sambil diaduk-aduk dan di diamkan selama 24 jam. Selanjutnya, maserat dipisahkan, dan proses diulangi 2 kali (remaserasi) dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Setelah didapat ekstrak etanol kemudian di saring dan diuapkan dengan menggunakan evaporator sampai pekat, untuk menghilangkan pelarut etanolnya.3.3.4 Pemantauan ekstrak (KLT)Fase gerak: kloroform:heksan (4:6)Fase diam : Silika gel 60 F254Larutan Uji : 5% dalam etanol PLarutan pembanding: Kurkumin 0,1% dalam etanol PVolume penotolan:Totolkan masing-masing 2 larutan uji dan larutan pembanding.Deteksi: UV366Pemantauan Ekstrak dilakukan dengan membandingkan nilai Rf kurkumin dari ekstrak dengan pembandingnya yang berasal dari literatur hasil penelitian. Sampel kurkumin yang akan diujikan di totolkan kedalam fase diam yaitu silika gel, kemudian masukan silika gel ke dalam chamber yang telah berisi fase geraknya yaitu kloroform dan etanol. Perlahan eluen atau fase geraknya akan naik dan memberikan hasil berupa spot. Metode pemantauannya dengan menggunakan KLT yang menggunakan fase diam silica gel dan fase geraknya kloroform:heksan (4:6).3.3.5 FraksinasiMetode: ECC (Corong pisah)Pelarut: Methanol : Etil asetat (1:1)Waktu : 3x pengulanganPada fraksinasi pertama ini digunakan metode Ekstraksi Cair-cair untuk memisahkan senyawa-senyawa lain yang masih ada dalam ekstrak dengan bantuan pelarut campur methanol:etil asetat (1:1), sehingga terbentuk 2 fase, fase pertama yang diatas adalah methanol karena Bj nya (0,791 g/ml) lebih kecil dari pada etil asetat (0.894 g/ml). Dari proses ini kurkumin berada pada fase etil asetat. Kemudian fraksi-fraksi yang di dapat dianalisis dengan metode kromatrografi lapis tipis.Masing-masing fraksi dipantau dengan KLT yaitu dengan pelarut campur methanol:etil asetat (1:1). Bercak yang dihasilkan dapat dilihat dengan sinar UV. 3.3.6 Pemantauan fraksiFase gerak: Kloroform P-metanol P (95:5)Fase diam : Silika gel 60 F254Larutan Uji : 5% dalam etanol PLarutan pembanding: Kurkumin 0,1% dalam etanol PVolume penotolan: Totolkan masing-masing 2 larutan uji dan larutan pembanding.Deteksi: UV366Pemantauan Ekstrak dilakukan dengan membandingkan nilai Rf kurkumin dari ekstrak dengan pembandingnya yang berasal dari literatur hasil penelitian. Metode pemantauannya dengan menggunakan KLT yang menggunakan fase diam silica gel dan fase geraknya Kloroform P-metanol P (95:5)3.3.7 Subfraksinasi (KK)Metode : Kromatografi KolomFase diam : Silika GelFase Gerak : Benzena : Kloroform dengan perbandingan (0 : 10), (1 : 9), (2 : 8), (3 : 7), (4 : 6), (5 : 5), (6 : 4), (7 : 3), (8 : 2) dan (9 : 1)Pada fraksinasi kedua ini digunakan metode kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen kurkumin dari campurannya. Pada kromatografi kolom digunakan kolom dengan adsorben silika gel karna kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal. Setiap fraksi di totolkan kedalam plat KLT dengan fasa diam plat silika gel G 60 F254 dan eluen Kloroform P : metanol P (5:5). Di dalam plat senyawa akan memberikan spot atau bercak sehingga bercak dideteksi dengan sinar UV366. Jika fraksi tersebut menunjukan noda tunggal pada plat silika gel maka diperoleh isolat yang diinginkan.Silika gel ada 2 macam : GF245, dengan G melambangkan gypsum (CaSO4), F melambangkan floroscene, dan angka 245 menunjukan besarnya panjang gelombang yaitu 245 nm. Silika jenis ini sering digunakan pada kromatografi lapis tipis (TLC). Dengan tanpa adanya gypsum dan floroscene. Silika jenis ini biasa figunakan pada kromatografi kolom.Silika gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karna pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karnanya, silika gel sifatnya sangat polar. Sementara itu, fasa gerak yang digunakan : Benzena : Kloroform dengan perbandingan (0 : 10), (1 : 9), (2 : 8), (3 : 7), (4 : 6), (5 : 5), (6 : 4), (7 : 3), (8 : 2) dan (9 : 1) sifatnya non polar. Maka pada saat campuran dimasukan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan difasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak kurang polar akan terbawa keluar kolom lebih cepatKromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan :a. Kromatografi fase normalKromatografi dengan kolom konvesional dimana fase diamnya normal bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fasa geraknya bersifat non polar.b. Kromatografi fase terbalikKromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar, kebalikannya dari fase normal.Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karna, jika dibiarkan kering kolom yang terbentuk dari silika gel bisa reta, sehinga proses pemisahan zat tidak tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom.Senyawa kurkumin dapat mengalami penurunan dengan lepasnya gugus OCH3 dalam setiap penurunan. Kurkumin akan mengalami 2 kali penurunan, dimana turunan pertamanya adalah demetoksi kurkumin dan turunan keduannya adalah bis-dimetoksi kurkumin. Kurkumin akan terelusi paling akhir (berada paling bawah) karna sifatnya yang polar. Perlu diingat bahwa penurunan ini tak mungkin terjadi dengan hanya melakukan kromatografi, tapi ada perlakuan khususnya. Ketika senyawa kurkumin telah mengalami degradasi, akan menjadi senyawa demetoksi kurkumin (terdapat pada bagian tengah) yang lebih polar dari kurkumin. Karna telah kehilangan sebuah gugus OCH3. Senyawa inimerupakan turunan kedua dari senyawa kurkumin. Karna tidak lagi mengandung gugus OCH3, maka senyawa ini merupakan senyawa yang bersifat paling polar dari antara ketiga jenis senyawa kurkumin. Dengan begitu, senyawa ini akan terelusi terlebih dahulu (berada pada lapisan yang paling atas) karna fasa diam yang digunakan (silika gel) bersifat polar.

3.3.8 Pemantauan subfraksiFase gerak: Kloroform P-metanol P (95:5)Fase diam : Silika gel 60 F254Larutan Uji : 5% dalam etanol PLarutan pembanding: Kurkumin 0,1% dalam etanol PVolume penotolan: Totolkan masing-masing 2 larutan uji dan larutan pembanding.Deteksi: UV366Pemantauan Ekstrak dilakukan dengan membandingkan nilai Rf kurkumin dari ekstrak dengan pembandingnya yang berasal dari literatur hasil penelitian. Metode pemantauannya dengan menggunakan KLT yang menggunakan fase diam silica gel dan fase geraknya Kloroform P-metanol P (95:5) Tetapi jika noda yang diperoleh lebih dari satu maka isolat tersebut dilakukan KLT preparatif. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan dicentrifuge.3.3.9 KLT preparative (Pemurnian)Kemurnian senyawa hasil isolasi diuji dengan KLT. Senyawa isolasi dikatakan murni jika memperlihatkan satu noda pada pola KLT yang sama dengan literature dengan berbagai variasi campuran eluen sebelumnya.3.3.10 Uji kemurnianDilakukan dengan menggunakan KLT 2 dimensi dengan menggunakan 2 perbandingan eluen yang berbeda. Eluen pertama yang digunakan campuran Kloroform P : Metanol (95 : 5). Kemudian diamati hasil KLT dengan pengembang yang pertama dibawah sinar UV 366 nm. Jika pada saat dilihat dibawah UV 366 nm terdapat hanya satu spot saja maka KLT dilanjutkan kembali, plat silica diputar 90o. Lalu dicelupkan ke dalam chamber yang telah berisi eluen kedua dengan kepolaran yang lebih polar yaitu n-heksana : etil asetat (40 : 60). Kemudian dilakukan karakterisasi dengan menggunakan spektrofotometri UV.

DAFTAR PUSTAKAFessenden and Fessenden. 1982.Kimia Organik Jilid I. Jakarta : Erlangga.Fessenden and Fessenden. 1991. Kimia Organik Jilid II. Jakarta : Erlangga.Kusmiyati, dkk. 2011. ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ZAT AKTIF EKSTRAK METANOL RIMPANG KUNYIT PUTIH (Curcuma mangga Val) FRAKSI ETIL ASETAT. Jurnal Ilmiah Kefarmasian, Vol. 1, No. 2, 2011 : 1 10Elly Natalina, dkk. 2009. Fotoproteksi Kurkumin terhadap -Karoten pada Berbagai Nisbah Molar serta Aktivitas Antioksidannya. Jurnal Natur Indonesia 12(1), Oktober 2009: 1-8 ISSN 1410-9379