BAB III

METODE PENELITIAN

A. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah juicer, timbangan

hewan uji, timbangan digital, gelas ukur, beker glass, labu takar, spuit

injeksi, spuit oral, mikroskop, deck glass, pipet leukosit ‘11’, kamar hitung,

kandang tikus.

2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah pir, udang

galah, aquadest, Cetirizin, larutan Giemsa, metil alkohol, H2SO4 pekat,

NaOH 0,1 N.

B. Prosedur Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Ekologi dan

Biosistematik Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Matematika Universitas

Diponegoro Semarang. Tujuan determinasi ini untuk menghindari kesalahan

dalam pengumpulan bahan utama penelitian dan mencegah kemungkinan

tercampur dengan bahan lain.

2. Pembuatan perasan buah pir

Buah pir dicuci dengan menggunakan air mengalir sampai bersih,

kemudian diangin-anginkan hingga tidak terdapat air bekas mencuci. Untuk

26

27

pembuatan perasan dapat dilakukan dengan memeras simplisia

menggunakan juicer. Ditimbang sebanyak 100 gram buah pir dan dijuicer

kemudian diambil sarinya dan dimasukkan di dalam beker glass.

Berdasarkan orientasi didapatkan perasan dengan kadar 100% dengan

volume murni 70 ml. Sediaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

perasan buah pir yang dibuat dengan kadar 7,5% v/v, 15% v/v, dan 22,5%

v/v.

Gambar 5. Skema Pembuatan Perasan Buah Pir

3. Dosis perasan buah pir

Menurut pemberian maksimal per oral pada tikus 100 gram adalah 5

ml (Mariana, 2009 cit Ritschel, 1947). Berat rata-rata tikus yang digunakan

adalah 200 gram, jadi 200/100 5 ml = 10 ml. volume pemberian per oral

adalah ½ dari pemberian maksimal, jadi ½ 10 ml = 5 ml (digunakan 2,5

Buah pir ditimbang sebanyak 100 gram

Dijuicer

Tampung perasannya

Perasan buah pir 100% v/v (70 ml)

Dibuat kadar 7,5% v/v, 15% v/v, 22,5% v/v

28

ml). Dari 100 gram buah pir didapat larutan stok perasan 100% dengan

volume 70 ml murni perasan buah pir. Berdasarkan penelitian yang

dilakukan Rr. Tryani W., (2014) tentang Efek Perasan Buah Apel (Malus

Domestica) Varietas Red Delicious Sebagai Anti Alergi Terhadap Respon

Anafilaksis Pada Tikus Jantan Galur Wistar Yang Diinduksi Ovalbumin,

menunjukkan bahwa perasan buah apel kadar 20% v/v memiliki efek anti alergi

terhadap respon anafilaksis pada tikus jantan galur Wistar, sehingga pada

penelitian ini perasan buah pir dibuat tiga kadar yaitu 7,5% v/v, 15% v/v,

dan 22,5% v/v.

Perhitungannya sebagai berikut:

100 g buah apel 7,6 mg quercetin

100 g buah pir 20,50 mg quercetin

Perhitungan kadar =

= 7,4% 7,5%

1) Kadar 7,5%

C1 V1 = C2 V2

100% V1 = 7,5% 20 ml

V1 = 1,5 ml perasan pear ad aquadest 20 ml

2) Kadar 15%

C1 V1 = C2 V2

29

100% V1 = 15% 20 ml

V1 = 3 ml perasan pear ad aquadest 20 ml

3) Kadar 22,5%

C1 V1 = C2 V2

100% V1 = 22,5% 20 ml

V1 = 4,5 ml perasan pear ad aquadest 20 ml

4. Pembuatan larutan alergen perasan udang

Udang dicuci bersih dengan air mengalir, ditimbang sebanyak 100

gram, kemudian dijuicer didapatkan berat bersih udang 90 gram. Diambil 50

gram perasan udang ditambah air 50 ml didapatkan konsentrasi 100% b/v

perasan udang.

5. Penentuan dosis alergen perasan udang

Dosis alergen yang digunakan mengacu berdasarkan orientasi yang

dilakukan menunujukkan bahwa perasan udang dengan kadar 100% dengan

dosis 2,5ml/200gr BB tikus secara per oral.

Berat rata-rata tikus yang digunakan adalah 200 gram jadi 200/100

5 ml = 10 ml. Volume pemberian per oral adalah ½ dari pemberian

maksimal, jadi ½ 10 ml = 5ml (digunakan 2,5 ml).

30

Perhitungan sebagai berikut:

Kadar alergen 100% b/v

Stok 100 ml/100ml

Dosis = S x Vp

= 100g/100ml x 2,5 ml

= 2,5 g/200gr BB

= 12,5 g/kg BB

6. Penentuan dosis Cetirizin

Dosis Cetirizin yang digunakan untuk reaksi alergi adalah 5-10

mg/hari. Dosis yang digunakan pada manusia dengan berat badan 50 kg

adalah 1 kali sehari 10 mg (Tjay dan Rahardja, 2007). Faktor konversi ke

tikus adalah 0,018.

Menurut pemberian maksimal per oral pada tikus 100 gram adalah 5

ml (Mariana, 2009 cit Ritschel, 1947). Berat rata-rata tikus yang digunakan

adalah 200 gram jadi 200/100 5 ml = 10 ml. Volume pemberian per oral

adalah ½ dari pemberian maksimal, jadi ½ 10 ml = 5ml (digunakan 2,5

ml).

Perhitungan sebagai berikut:

Untuk manusia 50 kg = 10 mg

Untuk manusia 70 kg =

31

= 14 mg

Untuk tikus 200 g = 0,018 14 mg

= 0,25 mg/200 g BB

= 1,25 mg/Kg BB

Stok yang akan dibuat =

=

= 0,1 mg/ml

= 5 mg/50 ml

Ditimbang 5 mg Cetirizin dan ditambahkan aquadest sampai 50 ml.

7. Identifikasi flavonoid

a. Sebanyak 1 ml sampel ditambah 3 tetes NaOH 0,1 N lalu diamati

warnanya. Flavonol akan memberikan warna kuning (Harborne, 1987).

b. Sebanyak 1 ml sampel ditambah 3 tetes H2SO4 pekat lalu diamati

warnanya. Flavonol memberikan warna jingga hingga krem (Harborne,

1987).

8. Pemilihan hewan uji

Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Wistar,

umur 2 bulan sampai 3 bulan dengan kondisi sehat. Untuk penelitian ini

digunakan tikus putih jantan sebanyak 30 ekor kemudian diadaptasikan dan

32

dibagi menjadi 5 kelompok secara random dimana tiap kelompok terdiri

dari 6 ekor tikus.

9. Pelaksanaan penelitian

a. Hewan uji diadaptasikan terlebih dahulu untuk membiasakan diri

terhadap lingkungan, perlakuan baru yang akan diberikan dan untuk

menghindari stres pada saat dilakukan penelitian.

b. Pada hari ke 1 semua tikus diinduksi allergen perasan udang 2,5 ml/200 g

BB secara peroral.

c. Dilakukan pengukuran diameter bentolan dan pengukuran suhu tubah

setelah reaksi hipersensitifitas muncul.

d. Diambil darahnya melalui sinus orbitalis sebanyak 0,5 cc dan dilakukan

pemeriksaan jumlah eosinofil (pre test).

e. Kemudian diberikan perlakuan pada masing-masing kelompok hingga

reaksi hipersensitifitas berkurang sebagai berikut:

Kelompok I : Kontrol negatif dengan pemberian aquadest per oral 2,5

ml/200 g BB tikus.

Kelompok II : Kontrol positif dengan pemberian Cetirizin 0,25 mg/200

g BB per oral p.c

Kelompok III : Diberikan perasan buah pir 7,5% (v/v) per oral p.c

sebanyak 2,5ml/200 g BB tikus.

Kelompok IV : Diberikan perasan buah pir 15% (v/v) per oral p.c

sebanyak 2,5ml/200 g BB tikus.

33

Kelompok V : Diberikan perasan buah pir 22,5% (v/v) per oral p.c

sebanyak 2,5ml/200 g BB tikus.

f. Dilakukan pengukuran diameter bentolan.

g. Diambil darahnya melalui sinus orbitalis sebanyak 0,5 cc dan dilakukan

pemeriksaan jumlah eosinofil (post test) dengan menggunakan hitung

jenis leukosit (defferential counting leukocyte) dengan pewarnaan

giemsa.

10. Pemeriksaan jumlah eosinofil

Pemeriksaan eosinofil dilakukan dengan memakai hitung jenis leukosit

(differential counting leukocyte) dengan pewarnaan giemsa. Pada hitung

jenis leukosit, eosinofil dihitung per 100 leukosit (Kartikawati, 2003).

a. Pembuatan sediaan hapus darah

1. Sediakan kaca objek yang kering, bebas debu, dan bebas lemak.

2. Teteskan 1 tetes kecil darah 0,5 cc menggunakan pipet sahli ke kaca

obyek.

3. Letakkan kaca obyek yang lain disebelah kiri tetes darah tadi dan

digerakkan ke kanan hingga mengenai tetes darah.

4. Tetes darah akan menyebar pada sisi kaca penggeser.

5. Segeralah geser ke kiri sambil memegang miring dengan sudut 30-

45º.

6. Biarkan sediaan mengering di udara.

b. Pewarnaan sediaan hapus darah

34

1. Sediaan hapus darah yang sudah mengering difiksasi dengan metil

alkohol dan dibiarkan selama 5 menit.

2. Dilakukan pengecatan dengan larutan Giemsa dan dibiarkan selama

20 menit.

3. Kemudian dibilas dengan air suling.

4. Diletakkan secara vertikal dan dibiarkan mengering di udara.

5. Dilakukan pengamatan menggunakan mikroskop.

c. Cara perhitungan eosinofil

Preparat darah hapus diperiksa dibawah mikroskop dengan pembesaran

100x untuk melihat bagian yang baik untuk diperiksa. Kemudian

mulailah dilakukan hitung jenis leukosit. Hitung jenis leukosit dilakukan

dalam 1 luas lapang pandang ke luas lapang pandang yang lain dan

dilihat secara zig zag bisa secara horizontal ataupun vertikal.

Hewan uji diadaptasikan selama 7 hari

Pada hari pertama setiap 4 jam semua tikus diinduksi allergen ml/200 g BB secara peroral

Dilakukan pengukuran diameter bentolan setelah reaksi hipersensitifitas muncul

Diambil darahnya melalui sinus orbitalis sebanyak 0,5 cc dan dilakukan pemeriksaan jumlah eosinophil (pre test)

Diberikan perlakuan hingga reaksi hipersensitifitas sembuh (1jam setelah pemaparan terakhir)

Kelompok I :

Kontrol negatif dengan

pemberian aquadest per

oral

Kelompok II:

Kontrol positif dengan

pemberian Cetirizin 0,25 mg/200 g BB per oral p.c

Kelompok III :

Diberikan perasan buah pir 7,5% (v/v)

per oral p.c

Dilakukan pengukuran diameter bentolan

1 jam setelah perlakuan diambil darahnya melalui sinus orbitalis sebanyak 0,5 cc dan dilakukan pemeriksaan jumlah eosinophil (post test)

Analisis data

Kelompok IV:

Diberikan perasan buah pir 15% (v/v) per oral p.c

Kelompok III :

Diberikan perasan buah

pir 22,5% (v/v) per oral

p.c

35

Gambar 6. Skema Pelaksanaan Penelitian

C. Analisis Data

Data yang diambil adalah diameter bentolan dan selisih jumlah

eosinofil sebelum dan setelah perlakuan yang diukur dengan ELISA. Untuk

membandingkan efek anti alergi terhadap respon anafilaksis antar kelompok,

data dianalisa secara statistic parametric atau nonparametric yang didasarkan

pada hasil normalitas dan homogenitas. Uji normalitas digunakan untuk

mengetahui apakah data yang ada terdistribusi normal atau tidak, jika nilai

signifikasinya < 0,05 maka data tidak terdistribusi normal, dan sebaliknya jika

nilai signifikasinya ≥ 0,05 maka data terdistribusi normal. Uji homogenitas

36

untuk mengetahui apakah data diperoleh dari populasi yang sama, jika

signifikasinya < 0.05 maka data berasal dari populasi yang mempunyai variasi

tidak sama, dan bila nilai signifikasinya ≥ 0,05 berarti data berasal dari

populasi yang mempunyai varian sama (Dahlan, 2012).

Jika data homogen dan terdistribusi normal, data dianalisa

menggunakan statistic parametric ANOVA satu jalan pada tarif kepercayaan

95% dengan program SPSS versi 19.0 for windows, dilanjutkan dengan LSD.

Apabila data tidak homogeny dan tidak terdistribusi normal, data dianalisa

dengan statistik non parametrik menggunakan uji Kruskal-Wallis, dilanjutkan

dengan uji Mann-Whitney.