BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik. Subjek pada

kelompok kontrol dan kelompok perlakuan ditentukan secara random. Sebanyak 25

ekor mencit putih (Mus musculus) jantan dewasa berumur 2-3 bulan yang dipilih

secara random yang dibagi menjadi 5 kelompok, dengan pengulangan sebanyak 5

kali, akan digunakan sebagai subjek penelitian.

3.2. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner

(BPPV) Bandar Lampung sedangkan pembuatan preparat dan pengamatannya akan

dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. H. Abdoel Moeloek.

Waktu penelitian akan dilakukan pada bulan Januari 2013 sampai Februari 2013

selama 28 hari.

3.3. Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan rancangan Post

Test Only Controlled Group Design, yaitu jenis penelitian yang melakukan

pengamatan terhadap kelompok kontrol dan perlakuan setelah diberi suatu

tindakan. Dalam rancangan ini subjek dibagi menjadi 5 kelompok secara random.

Perlakuan pemberian etanol saja diberikan kepada satu kelompok, 3 kelompok

39

40

lain diberi perlakuan pemberian ekstrak buah delima dengan dosis yang berbeda

dengan diinduksi etanol, dan perlakuan lain sebagai kontrol. Setelah waktu yang

ditentukan, semua kelompok diobservasi dan dilakukan pengukuran terhadap efek

yang diteliti.

K ( - )

K ( + )

P 1

P 2

P 3

Gambar 3.1 : Rancangan penelitian

Keterangan:

K(-) adalah Kelompok kontrol negatif: mencit tanpa diberi perlakuan pemberian

etanol dan tanpa pemberian ekstrak buah delima merah

K(+) adalah kelompok kontrol positif: mencit dengan perlakuan pemberian etanol

50 % 0,014 ml/grBB/hari dan tanpa pemberian ekstrak buah delima merah selama

14 hari.

P1 adalah kelompok perlakuan 1: mencit dengan perlakuan pemberian ekstrak

buah delima merah dosis I per oral 0,07 mg/grBB/hari lalu setelah 1,5 jam,

dilakukan pemberian etanol 50% 0,014 ml/grBB/hari selama 14 hari.

P2 adalah kelompok perlakuan 2: mencit dengan perlakuan pemberian ekstrak

buah delima merah dosis II per oral 0,21 mg/grBB/hari lalu setelah 1,5 jam,

dilakukan pemberian etanol 50% 0,014 ml/grBB/hari selama 14 hari

Sampel mencit 25 ekor

41

P3 adalah kelompok perlakuan 3: mencit dengan perlakuan pemberian ekstrak

buah delima merah dosis III per oral 0,63 mg/grBB/hari lalu setelah 1,5 jam,

dilakukan pemberian etanol 50% 0,014 ml/grBB/hari selama 14 hari.

3.4. Subjek penelitian

1. Populasi

Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih (Mus

musculus Linn) jantan dewasa berumur 2-3 bulan dengan berat 20-25 gr

2. Sampel

Sampel penelitian yang digunakan sebanyak 25 ekor mencit putih (Mus

musculus Linn) jantan berusia 2-3 bulan dengan berat badan 20-25 gr yang

dipilih secara acak dan dibagi dalam 5 kelompok dengan pengulangan

sebanyak 5 kali, sesuai dengan rumus Federer

Menurut Federer, rumus penentuan sampel untuk uji eksperimental adalah :

(t-1)(n-1) ≥15

Dimana t merupakan jumlah kelompok percobaan dan n merupakan jumlah

pengulangan atau jumlah sampel tiap kelompok. Penelitian ini akan

menggunakan 5 kelompok perlakuan sehingga perhitungan sampel

menjadi :

42

(5-1)(n-1) ≥ 15

4(n-1) ≥ 15

4n ≥ 15 +4

n ≥ 4,75

≈ 5

Jadi sampel yang digunakan tiap kelompok percobaan sebanyak 5 ekor

dan jumlah kelompok yang akan digunakan adalah 5 kelompok sehingga

penelitian ini akan menggunakan 25 ekor mencit putih dari populasi yang

ada.

3. Cara pengambilan sampel

Sampel penelitian diambil secara acak (random) dari populasi dengan

kriteria sebagai berikut:

Kriteria inklusi :

a. Sehat (tidak tampak penampakan rambut kusam, rontok, dan aktif)

b. Memiliki berat badan sekitar 20-25 gram

c. Berjenis kelamin jantan

d. Berusia sekitar 2-3 bulan

Kriteria eksklusi :

a. Terdapat penurunan berat badan lebih dari 10% setelah masa

adaptasi di laboratorium

b. Mati selama masa pemberian perlakuan

43

3.5. Variabel Penelitian

1. Variabel Independen

Variabel independen adalah dosis pemberian ekstrak buah delima merah pada

mencit putih jantan yang diinduksi etanol

2. Variabel dependen

Variabel dependen adalah gambaran histopatologi kerusakan hepar mencit

putih jantan

3.6. Definisi Operasional

1. Antioksidan pada buah delima merah

Antioksidan adalah zat yang memiliki mekanisme protektif untuk mencegah

pembentukan ROS atau untuk mendetoksifikasi ROS agar tidak terjadi stres

oksidatif. Pada buah delima antioksidan yang terkandung diantaranya adalah

Antosionin, flavoniod, polifenol, tanin.

2. Kerusakan hepar

Kerusakan hepar adalah terjadi perubahan abnormal pada gambaran histologis

sel-sel hepar. Kerusakan yang diamati berupa kerusakan sel hepar dan

degenerasi lemak yang terjadi pada hepatosit. Kriteria penelitiannya adalah :36

0 = tidak ada kerusakan sel hepar

1 = <10% sel hepar mengalami kerusakan

2 = 10%-25% sel hepar mengalami kerusakan

3 = 26%-50% sel hepar mengalami kerusakan

4 = >50%-100% sel hepar mengalami kerusakan

44

3. Etanol sebagai oksidan

Etanol (etil alkohol/C2H5OH) adalah alkohol primer yang berwujud cairan

jernih, tidak berwarna, mudah menguap, dan mudah terbakar, yang dibentuk dari

peragian karbohidrat oleh mikroba atau melalui sintesis dari etilen. Konsumsi

etanol terus menerus menyebabkan etanol sebagai oksidan atau perusak dalam

tubuh, karena etanol dalam tubuh menjadi radikal bebas dan menyebabkan

terjadinya reactive oxygen spesies (ROS) yang menimbulkan stres oksidatif.

3.7. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat penelitian

Alat penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah :

1) Timbangan Mettler Toledo untuk menimbang mencit

2) Spuit oral 1cc untuk mencekoki etanol 50 % dan ekstrak buah delima

pada mencit

3) Gunting minor set untuk membedah perut mencit

4) Kapas dan alkohol

5) Alat untuk pembuatan preparat histopatologi lambung yaitu mikrotom,

cover glass, dan object glass.

6) Miksroskop

7) Kandang mencit

45

2. Bahan Penelitian

Etanol 50%, ekstrak buah delima merah dengan dosis 0,07 ml/grBB, 0,21

ml/grBB, dan 0,63 ml/grBB, mencit putih jantan, pelet ayam sebagai pakan

mencit.

Bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan sediaan histopatologi lambung

mencit meliputi: larutan formalin 10% , alkohol 80%, alkohol 95%, alkohol

absolut, etanol, xylol, paraffin, aquadest, pewarna preparat Hematoksilin dan

Eosin.

3.8. Prosedur Penelitian

1. Pemeliharaan mencit percobaan

Mencit dipelihara dalam ruangan yang berventilasi cukup, dikandangkan secara

individual. Suhu ruangan berkisar 28 – 320C. Makanan dan minuman diberikan

dalam bentuk pelet, setiap 2 kali seminggu dilakukan pembersihan kandang.

Selama penelitian dilakukan mencit tidak ada yang mati. Untuk mengantisipasi

bila ada yang mati maka tiap-tiap kelompok perlakuan jumlah sampel ditambah

kurang lebih 10%.

2. Persiapan mencit

Mencit diadaptasikan selama tujuh hari di Laboratorium.. Sesudah adaptasi,

keesokan harinya dilakukan penimbangan untuk menentukan dosis dan

dilakukan perlakuan.

3. Prodesur pemberian dosis etanol

Dosis etanol yang akan digunakan dalam penelitian ini berdasarkan penelitian

sebelumnya mengenai pemberian etanol pada tikus. Dosis etanol yang diberikan

46

pada tikus berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh ROC and S. Karger AG

(2002) yaitu 10 ml/KgBB. Faktor konversi tikus putih dengan berat 200 g ke

mencit dengan berat badan 20 g adalah 0,14.

Jadi, setiap mencit diberikan etanol 50% sebanyak 0,014 ml/grBB selama 14

hari 1,5 jam setelah pemberian ekstrak buah delima merah. Pemberian etanol

1,5 jam setelah pemberian ekstrak buah delima merah agar lambung mencit telah

kosong sehingga mempercepat absorbsi etanol.

4. Dosis ekstrak buah delima

Dosis ekstrak buah delima merah ditentukan berdasarkan hasil konversi dari

tikus putih ke mencit.

Dosis I ekstrak buah delima merah

Dosis yang digunakan pada tikus adalah 150 mg/KgBB, faktor konversi dari

tikus putih ke mencit adalah 0,14.

Dosis ekstrak etanol buah delima merah 0,21 merupakan dosis ekstrak buah

delima merah kedua. Dosis ekstrak buah delima merah pertama dan ketiga

Dosis untuk mencit = 2 ml x 0,14 / 20 g mencit

= 0,28 / 20 g mencit

= 0,014 ml/grBB

Dosis mencit = 30 mg x 0,14 /20 g mencit

= 4,2 mg / 20 g mencit

= 0,21 mg/grBB

47

ditentukan berdasarkan standar pengobatan herbal ASEAN, yaitu dosis paling

rendah adalah 1/3 kali dosis dan dosis paling tinggi adalah 3 kali dosis.3

Untuk kelompok perlakuan I : 1/3 x 0,21 mg/grBB = 0,07 mg/grBB

Untuk kelompok perlakuan II : 0,21 mg/grBB

Untuk kelompok perlakuan III: 3 x 0,21 mg/grBB = 0,63 mg/grBB

5. Cara kerja

a. Mencit sebanyak 25 ekor, dikelompokkan dalam 5 kelompok. Kelompok

I sebagai kontrol normal (negatif), dimana hanya akan diberi air ad

libitum. Kelompok II sebagai kontrol patologis (positif), dimana akan

diberikan etanol 50% 0,014 ml/grBB. Kelompok III adalah kelompok

perlakuan dengan pemberian etanol 50% 0,014 ml/grBB ditambah

ekstrak buah delima dosis 0,07 mg /grBB, kelompok IV dengan dosis

ekstrak buah delima sebanyak 0,21 mg/grBB, dan kelompok V dengan

dosis ekstrak buah delima sebanyak 0,63 mg/grBB, dimana ekstrak buah

delima dan etanol 50% tersebut akan diberikan sebanyak 1 kali/hari.

Masing-masing diberikan secara per oral selama 14 hari. Selama satu

minggu setiap kelompok mencit diadaptasikan sebelum diberi perlakuan.

b. Mengukur berat badan mencit sebelum perlakuan

c. Mencekoki mencit dengan ekstrak buah delima merah dan etanol 50%

selama 14 hari.Mencit tetap diberi makan dan minum ad libitum

48

d. Setelah 14 hari, pemberian larutan ekstrak buah delima merah dan

pemberian etanol 50% diberhentikan.

e. Lima mencit jantan dari tiap kelompok perlakuan kemudian dinarkosis

dengan kloroform.

f. Lalu dilakukan laparotomi, diambil hepar mencit untuk dibuat sediaan

mikroskopis. Pembuatan sediaan mikroskopis dilakukan dengan metode

paraffin dan pewarnaan Hematoksilin Eosin.

Hematoksilin memiliki sifat pewarna basa, yaitu memulas unsur jaringan

yang basofilik, sedangkan eosin memulas unsur jaringan yang bersifat

asidofilik. Kombinasi ini yang paling banyak digunakan.16

g. Sampel hepar ini lalu difiksasi dengan formalin 10%. Selanjutnya,

sampel ini dikirim ke laboratorium untuk pembuatan sediaaan

mikroskopis jaringan hepar.

6. Prosedur Pembuatan Preparat Histopatologi

Adapun prosedur pembuatan preparat histopatologi, yaitu :37

a. Fiksasi

Larutkan fiksasi yang digunakan adalah fosfat buffer formalin,

formulanya sebagai berikut:

Formalin 10 cc

Acid sodium phosphate monohydrate 0,4 gr

Anhydrous disodium phosphate 0,65 gr

Aquades sampai 100cc

49

b. Dehidrasi

Memakai alkohol dengan yang makin pekat dari alkohol 70 %, 95 %,

hingga akohol absolut.

1. Alkohol 75 % selama 30 menit.

2. Alkohol 95 % selama 30 menit 3 – 4x.

3. Alkohol 100 % selama 30 menit, diganti selama 4x.

c. Clearing

Memakai xylol I dan xylol II masing – masing selama 30 menit.

Impregnasi/embedding

Pembenaman dilakukan dengan paraffin cair 50 – 60oC selama 1 jam 2x.

d. Pengecoran (pembuatan paraffin block)

e. Pengirisan jaringan

Pengirisan jaringan setebal 4-5 mikron.

f. Pewarnaan

Pewarnaan yang dipakai dengan menggunakan hematoksilin eosin,

dengan cara memulas:

1. Memasukkan preparat ke dalam xylol I 3-5 menit.

2. Pindahkan ke xylol II selama 3-5 menit.

3. Masukkan berturut-turut kedalam alkohol 100 %, 95%,

70% masing–masing selama 3 menit.

4. Celupkan aquades sebanyak 7 celup.

5. Masukkan hematoksilin selama 5-10 menit.

6. Air mengalir 5 menit.

50

7. Masukkan ke HCL 1% selama 15-60 menit.

8. Dibilas dengan air.

9. Masukkan ke eosin 1% selama 15-60 menit.

10. Pindahkan berturut-turut ke alkohol 70 %, 95 %, dan 100 %

masing-masing 7 celup.

25 ekor mencit putih jantan umur 2-3 bulan berat badan 20-25 gr

Mencit diadaptasi selama 1 minggu

Mencit diberi perlakuan selama 14 hari

5 ekor mencit diberi aquadest sebagai kontrol negatif ( - )

5 ekor mencit diberi etanol tanpa diberi ekstrak buah delima merah sebagai kontrol positif ( + )

5 ekor mencit diberi ekstrak delima merah 0,07 mg/grBB 1x/hari sebagai KP 1

5 ekor mencit diberi ekstrak delima merah 0,21 mg/grBB 1x/hari sebagai KP 2

5 ekor mencit diberi ekstrak delima merah 0,63 mg/grBB 1x/hari sebagai KP 3

Setelah 1,5 jam

Beri etanol 0,014 mg/grBB

Beri etanol 0,014 mg/grBB

Beri etanol 0,014 mg/grBB

Setelah 14 hari, tikus dinarkosis dengan kloroform

Dilakukan laparotomi lalu hepar mencit diambil

Sampel hepar dikirim ke Laboratorium untuk pembuatan sediaan histopatologi

Pengamatan sediaan histopatologi dengan mikroskop

Sampel hepar difiksasi dengan formalin 10 %

Interpretasi hasil pengamatan

51

3.9. Alur penelitian

Gambar 3.2.Diagram Alur penelitian

52

3.10. Analisa Data

Data yang diperoleh dari hasil pengamatan histopatologi dibawah mikroskop

dilakukan uji analisis statistik menggunakan program SPSS 17.0. Hasil penelitian

dianalisis secara statistik dengan uji normalitas Shapiro Wilk dan homogenitas

Levene. Jika varian data normal serta homogen maka dilanjutkan dengan metode

One Way ANOVA. Hipotesis akan dianggap bermakna bila p < 0,05. Jika pada uji

ANOVA atau Kruskal-Wallis menghasilkan nilai p < 0,05 maka akan dilanjutkan

dengan melakukan analisis post hoc LSD untuk melihat perbedaan antar

kelompok perlakuan.