BAB 15BAB 15Penentuan dari Penentuan dari Integritas dan Integritas dan Kelangsungan Hidup Kelangsungan Hidup MembranMembranOleh:Oleh:

Suzanna P. MonganSuzanna P. Mongan

Struktur Membran Plasma Struktur Membran Plasma SpermaSperma

Terdiri dari 3 bagian:Terdiri dari 3 bagian:1.1. Glikokaliks eksternal Glikokaliks eksternal glikolipid yg telah glikolipid yg telah

diisi & residu glikoprotein dng rantai diisi & residu glikoprotein dng rantai oligosakarida yg meluas dari permukaan seloligosakarida yg meluas dari permukaan sel

2.2. Bahan membran dalamBahan membran dalamprotein yg melekat protein yg melekat dalam 2 lapisan lemak dalam 2 lapisan lemak ujung hidrofilik menuju ke luarujung hidrofilik menuju ke luar ujung hidrofobik menuju ke dalamujung hidrofobik menuju ke dalam

3. Sistem sitofibrilar submembran dari mikrotubul 3. Sistem sitofibrilar submembran dari mikrotubul (elemen sitoskeletal) & mikrofilamen (elemen (elemen sitoskeletal) & mikrofilamen (elemen kontraktil)kontraktil)

Fospolipid mewakili sekitar 70% dari lemak total. Fospolipid mewakili sekitar 70% dari lemak total. Sterik ke-2 terbanyak.Sterik ke-2 terbanyak.

Kolesterol Kolesterol terdapat banyak dlm spermatozoa terdapat banyak dlm spermatozoa manusia manusia bagian dari steroid yg dikonjugasi oleh bagian dari steroid yg dikonjugasi oleh sulfasulfa

Kolesterol/fosfolipid Kolesterol/fosfolipid sebanding 0,99 sebanding 0,99 As. Lemak terpolisaturasi/tersaturasi As. Lemak terpolisaturasi/tersaturasi sebanding 1 sebanding 1 Kolesterol Kolesterol terdapat pada 2 lapis fosfolipid terdapat pada 2 lapis fosfolipid

satu rantai tersaturasisatu rantai tersaturasi satu tidak tersaturasi satu tidak tersaturasi mengurangi permeabilitas mengurangi permeabilitas membranmembran

Protein dalam lemak Protein dalam lemak intrinsik & ekstrinsik intrinsik & ekstrinsik Permukaan sperma dapat dibagi:Permukaan sperma dapat dibagi:

- kepala anterior (segmen akrosomal)- kepala anterior (segmen akrosomal)

- segmen ekuator- segmen ekuator

- Kepala posterior (segmen pasca - Kepala posterior (segmen pasca

akrosomal)akrosomal)

- bagian tengah- bagian tengah

- bagian utama- bagian utama

Metode fraktur bekuMetode fraktur bekuPermukaan akrosomPermukaan akrosomkelompok partikel kelompok partikel

halus yg tercampur dengan daerah halus halus yg tercampur dengan daerah halus yang tidak memiliki elemen khususyang tidak memiliki elemen khusus

Daerah pasca akrosomDaerah pasca akrosomstriase paralel striase paralel & segmen ekuator& segmen ekuatortampak pada garis tampak pada garis yg dalam dng depresi paralel yg menuju yg dalam dng depresi paralel yg menuju ke daerah pasca akrosomke daerah pasca akrosom

Hubungan antara daerah membran yg jelas Hubungan antara daerah membran yg jelas dng komponen protein yg berbeda dng komponen protein yg berbeda ditunjukkan dengan petanda membran ditunjukkan dengan petanda membran lektin lektin

Lektin Lektin afinitas relatif spesifik terhadap molekul afinitas relatif spesifik terhadap molekul sakaridasakarida sering multimerik & dpt terikat secara sering multimerik & dpt terikat secara simultan dng lebih dari 1 ligan sakarida pada simultan dng lebih dari 1 ligan sakarida pada sel yang diberikan atau dapat menyebabkan sel yang diberikan atau dapat menyebabkan aglutinasi dng sel tetangga yg terkait.aglutinasi dng sel tetangga yg terkait.

3 mekanisme untuk mempertahankan 3 mekanisme untuk mempertahankan integritas kandungan dari membran:integritas kandungan dari membran:

- Perlekatan glikokaliseal ekstraselulerPerlekatan glikokaliseal ekstraseluler

- Parameter difusi fase lemak Parameter difusi fase lemak intramembranintramembran

- Perlekatan sitoskeletal intraselulerPerlekatan sitoskeletal intraseluler

Perubahan pada isi permukaan, ikatan lektin, Perubahan pada isi permukaan, ikatan lektin, distribusi partikel intramembran, keenceran distribusi partikel intramembran, keenceran membran, kandungan lemak & protein, dan membran, kandungan lemak & protein, dan ikatan antibodi telah dilaporkan sebagai ikatan antibodi telah dilaporkan sebagai angkutan bagi sperma sepanjang epididimisangkutan bagi sperma sepanjang epididimis

Perubahan lainPerubahan laindapat terjadi setelah ejakulasi:dapat terjadi setelah ejakulasi:- perubahan isi permukaan- perubahan isi permukaan- ikatan lektin- ikatan lektin- perubahan kandungan lemak- perubahan kandungan lemak- penyerapan antigen darah, antigen - penyerapan antigen darah, antigen histokompatibilitas & faktor imunosupresihistokompatibilitas & faktor imunosupresi

MetodologiMetodologi

Teknik supravitalTeknik supravital

Integritas & aktivaitas fungsional dari membran Integritas & aktivaitas fungsional dari membran sperma penting sperma penting kelangsungan hidup & kelangsungan hidup & perubahan fisiologis yg terjadi pada perubahan fisiologis yg terjadi pada permukaan sperma selama proses pembuahanpermukaan sperma selama proses pembuahan

Thn 1930 Moench Thn 1930 Moench pengecatan supravital pengecatan supravital menentukan persentase dari spermatozoa menentukan persentase dari spermatozoa yang hidupyang hidup

Thn 1942 MacLeod Thn 1942 MacLeod hasil tidak memuaskan hasil tidak memuaskan

Kemampuan membedakan pada cat supravital Kemampuan membedakan pada cat supravital bergantung pada bergantung pada kemampuan dari kemampuan dari membran yg intak secara fungsional untuk membran yg intak secara fungsional untuk menyingkirkan kromofor eosin dari menyingkirkan kromofor eosin dari kompartemen inti pada spermatozoa.kompartemen inti pada spermatozoa.

Teknik supravital Teknik supravital

pedoman bagi ketepatan evaluasi motilitaspedoman bagi ketepatan evaluasi motilitas

memampukan diagnosis definitif memampukan diagnosis definitif nekrozoospermia sejatinekrozoospermia sejati

Metode gabungan yg meliputi penilaian Metode gabungan yg meliputi penilaian kelangsungan hidup spermakelangsungan hidup sperma

Pengecatan telah digunakan untuk Pengecatan telah digunakan untuk menentukan kelangsungan hidp sperma menentukan kelangsungan hidp sperma dalam larutan hipoosmotikdalam larutan hipoosmotik sifat membran plasma sperma sifat membran plasma sperma dianalisis dengan menggunakan dianalisis dengan menggunakan gabungan dari tes pembengkakan gabungan dari tes pembengkakan hipoosmotik (HOS) dan tes eosin.hipoosmotik (HOS) dan tes eosin.

Evaluasi dari status akrosom Evaluasi dari status akrosom teknik teknik pengecatan tripel pengecatan tripel pengecatan akrosom dan pengecatan akrosom dan pengecatan supravital sebelum fiksasi pengecatan supravital sebelum fiksasi menandai semua spermatozoa mati.menandai semua spermatozoa mati.

Prosedur pengecatan ganda Prosedur pengecatan ganda mempelajari mempelajari kelangsungan hidup spermatozoa & status kelangsungan hidup spermatozoa & status akrosomalakrosomal

Metode pengecatan praktis Metode pengecatan praktis utk mengenali utk mengenali kelangsungan hidup & status akrosomal dari kelangsungan hidup & status akrosomal dari spermatozoa mamaliaspermatozoa mamalia

Pengecatan I Pengecatan I tripan biru atau merah tripan biru atau merah kongokongocepat & menghindari artefakcepat & menghindari artefak

diserap oleh merah netral & memberikan diserap oleh merah netral & memberikan penutupan warna dng kontras yg tinggi penutupan warna dng kontras yg tinggi

utk mengenali spermatozoa hidup atau utk mengenali spermatozoa hidup atau mati dng akrosom intak, sama baiknya dng mati dng akrosom intak, sama baiknya dng kerusakan atau tidak adanya akrosomkerusakan atau tidak adanya akrosom

Langkah sentrifugasi Langkah sentrifugasi mengurangi keperluan mengurangi keperluan spermatozoa utk preparasi hapusanspermatozoa utk preparasi hapusan

Titik akhir dari kematian sel Titik akhir dari kematian sel ditentukan oleh ditentukan oleh penggabungan dri pewarnaan fluoresin diasetat penggabungan dri pewarnaan fluoresin diasetat fluoresens & etidium bromidafluoresens & etidium bromida

3 populasi dari sperma yg dpt dilihat dng 3 populasi dari sperma yg dpt dilihat dng mikroskop:mikroskop:- spermatozoa yg bertahan hidup- spermatozoa yg bertahan hidup- spermatozoa yg sekarat- spermatozoa yg sekarat- sel yg mati- sel yg mati dihitung dengan analisis sitometrik alirdihitung dengan analisis sitometrik alir

Cross et al Cross et al menggunakan bisbenzamida menggunakan bisbenzamida (Hoeschest N 33258) utk menandai sperma.(Hoeschest N 33258) utk menandai sperma.

Studi lain: Studi lain: tes HOS dng pengecatan fluoresens supravital tes HOS dng pengecatan fluoresens supravital

H 258 H 258 menentukan sifat motilitas & menentukan sifat motilitas & integritas membran sperma yg disimpan bekuintegritas membran sperma yg disimpan beku

Menggunakan mikroskop fluoresensi Menggunakan mikroskop fluoresensi menentkan kelangsungan hidup dan status menentkan kelangsungan hidup dan status akrosom dari sperma segar & yg dicairkan akrosom dari sperma segar & yg dicairkan setelah dibekukansetelah dibekukan

Metode lain :Metode lain :- Tes air Tes air analisis semen rutin dng pengecatan eosin Y analisis semen rutin dng pengecatan eosin Y

Tes pembengkakan hipo-osmotikTes pembengkakan hipo-osmotikPermeabilitas air Permeabilitas air menunjukkan nilai yg tdk serupa di menunjukkan nilai yg tdk serupa di

antara sel yg berbedaantara sel yg berbeda sperma manusia sperma manusia membran plasma tidak memiliki membran plasma tidak memiliki mikrovili mikrovili akan membengkak bila ditempatkan pada akan membengkak bila ditempatkan pada konsentrasi rendah larutan yg tidak permeabelkonsentrasi rendah larutan yg tidak permeabel

Pembengkakan melebihi volume kritis Pembengkakan melebihi volume kritis pecah pecah

Jeyendran et al Jeyendran et al tes pembengkakan hipo- tes pembengkakan hipo-osmotik osmotik menentukan integritas fungsional menentukan integritas fungsional dari membran splasma spermadari membran splasma sperma

Bila membran plasma membengkak pada Bila membran plasma membengkak pada keadaan hipo-osmotik keadaan hipo-osmotik pembentkokan serat pembentkokan serat ekor dapat terjadi dalam membran plasmaekor dapat terjadi dalam membran plasma

sperma yg tidak bertahan hidup / membran sperma yg tidak bertahan hidup / membran tidak berfungsi tidak berfungsi tidak membengkak tidak membengkak

Riedel et al Riedel et al bila penetrasi > 40% terjadi pada bila penetrasi > 40% terjadi pada SPA & > 65% sperma berekasi dlm tes HOS SPA & > 65% sperma berekasi dlm tes HOS ejakulat disebut subur utk IVDejakulat disebut subur utk IVD

Tes peroksidasi lemakTes peroksidasi lemakKeberadaan lemak tidak tersaturasi pada sel Keberadaan lemak tidak tersaturasi pada sel

encaman potensial karena labilitas yg ekstrim encaman potensial karena labilitas yg ekstrim dari lemak pada keberadaan oksigen & dari lemak pada keberadaan oksigen & distribusi penyebarannya dlm membran seldistribusi penyebarannya dlm membran sel

Parameter yg berhubungan dng struktur & fungsi dari Parameter yg berhubungan dng struktur & fungsi dari membran plasma telah terbukti menjadi petanda yg membran plasma telah terbukti menjadi petanda yg popular utk cedera selular yg diperantarai oleh radikal.popular utk cedera selular yg diperantarai oleh radikal.

Dlm domain lemak, peroksidase menyebabkan:Dlm domain lemak, peroksidase menyebabkan:- peningkatan sesuai viskositas dari 2 lapisan membran- peningkatan sesuai viskositas dari 2 lapisan membran- perubahan pada kelakuan fase termotropikperubahan pada kelakuan fase termotropik- penurunan resistensi elektrispenurunan resistensi elektris- membantu pertukaran fosfolipid antara 2 lapisan membantu pertukaran fosfolipid antara 2 lapisan

tunggaltunggal

Bukti bhw sperma menderita kerusakan Bukti bhw sperma menderita kerusakan ireversibel akibat peroksidase lemak ireversibel akibat peroksidase lemak meningkatkan kemungkinan bhw reaksi serupa meningkatkan kemungkinan bhw reaksi serupa terjadi sbg bagian dari pelapukan struktur terjadi sbg bagian dari pelapukan struktur natural, mengurangi motilita & menurunkan natural, mengurangi motilita & menurunkan aktivitas dalam sperma yg menuaaktivitas dalam sperma yg menua

Pengukuran dari kemampuan peroksida lemak Pengukuran dari kemampuan peroksida lemak (LPOp) (LPOp) alat yg bernilai dalam menilai alat yg bernilai dalam menilai integritas struktural dari spermatozoa manusiaintegritas struktural dari spermatozoa manusia