8/17/2019 artikel9E05F9CCB871F95B2369F808831A02C2

1/5

8/17/2019 artikel9E05F9CCB871F95B2369F808831A02C2

2/5

Beberapa penelitian terdahulu melaporkan keberhasilan isolasi DNA

Gracilaria menggunakan metode konvensional yakni metode isolasi

menggunakan bufer-bufer tertentu yang disusun berdasarkan laporan penelitian

terdahulu (Sahu et al., 2012; Saptasari, 2012; Shivji et al., 1992; Sui et al., 2002).

Saptasari (2012) melaporkan bahwa penggunaan metode CTAB yang

dimodifikasi menunjukkan hasil isolat DNA Gracilaria verrucosa yang memiliki

kualitas dan kuantitas yang baik yang dapat digunakan untuk PCR.

Selain menggunakan metode konvensional, isolasi DNA total Gracilaria

verrucosa juga dapat dilakukan menggunakan kit komersial dengan takaran bufer

sesuai dengan protokol yang tercantum dalam kit tersebut. Terdapat beberapa kit

komersial yang dapat mengisolasi DNA total tumbuhan dengan kualitas dan

kuantitas yang baik (Sahu et al., 2012). Optimasi isolasi DNA diperlukan untuk

mengetahui protokol yang efektif dan efisien digunakan dalam isolasi DNA

Gracilaria verrucosa .

METODE

Penelitian yang dilakukan bersifat deskriptif analitik untuk mengetahui

hasil optimasi isolasi DNA Gracilaria verrucosa yang dilakukan berdasarkan

protokol asli dan protokol modifikasi kit komersial yang digunakan. Sampel yang

digunakan dalam penelitian ini adalah Gracilaria verrucosa kering. Isolasi DNA

sampel dilakukan dengan 5 protokol asli dan 5 protokol modifikasi dari ketiga kityang digunakan, yaitu kit Geneaid Genomic DNA Mini Kit (Plant), kit Macherey

Nagel NucleoSpin Plant II, dan kit Vivantis GF-1 Plant DNA Extraction. Protokol

asli merupakan protokol yang dirujuk dari petunjuk penggunaan masing-masing

kit, sedangkan protokol modifikasi disusun berdasarkan hasil yang diperoleh pada

setiap tahap yang dilakukan pada uji pendahuluan dengan protokol asli.

Kesepuluh protokol isolasi DNA total yang digunakan terdiri dari beberapa tahap

secara berurutan sebagai berikut: preparasi dan lisis mekanik, lisis kimiawi,

pemisahan debris sel, presipitasi, pencucian, dan elusi. Analisis data dilakukan

secara deskriptif dengan membandingkan hasil yang diperoleh pada tiap tahap

isolasi serta hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian isolat DNA

menggunakan spektrofotometer Thermo-Scientific NanoDrop 2000 dengan

metode rasio A 260 / A 280 dan A260 / A 230 .

HASIL DAN PEMBAHASAN

8/17/2019 artikel9E05F9CCB871F95B2369F808831A02C2

3/5

Masing-masing protokol isolasi DNA menunjukkan hasil yang berbeda

pada setiap tahapnya. Secara umum, kendala yang terjadi pada isolasi DNA

Gracilaria verrucosa menggunakan protokol asli ada pada tahap lisis dan

pemisahan debris sel, dan pencucian. Kendala yang terjadi diantaranya adalah

sampel yang sulit tergerus, sampel yang menggumpal walaupun sudah diberi

bufer lisis dan diinkubasi, pemisahan debris sel yang tidak sempurna, dan adanya

residu di tepi membran column yang digunakan pada tahap pencucian. Kendala-

kendala tersebut menyebabkan hasil kuantifikasi yang rendah pada protokol asli.

Modifikasi dilakukan pada semua tahap isolasi DNA yang meliputi

preparasi dan lisis mekanik, lisis kimiawi, pemisahan debris sel, presipitasi,

pencucian, dan elusi (Gambar 1). Hasil penelitian menunjukkan bahwa protokol

modifikasi dari kit Geneaid Genomic DNA Mini Kit (Plant) merupakan protokol

yang paling efektif dan efisien untuk mengisolasi DNA total Gracilaria verrucosa

daripada sembilan protokol lain .

Keterangan:= Tahap preparasi dan lisis mekanik = Tahap presipitasi= Tahap lisis kimiawi = Tahap pencucian= Tahap pemisahan debris sel = Tahap elusi

Gambar 1 Isolasi DNA Gracilaria ver r ucosa Menggunakan Protokol Modifikasi Kit Geneaid

Genomic DNA Mini Kit (Plant)

Perlakuan:Sampel yang akan digunakandirendam dalam etanol 10% dandisimpan dalam refrigerator

bersuhu 4 oC selama 21 harikemudian dicuci dengan aquadessteril dan ditimbang sebanyak 250mg. Sampel kemudian digerushingga halus dalam nitrogen cair.Hasil:

Sampel tergerus dengan baik.Setelah digerus sampel berbentuk pasta padat.

Perlakuan:Sampel yang telah digerusdiletakkan dalam mikrotube dandisimpan dalam refrigerator

bersuhu -60 oC selama semalam.Sampel kemudian diberi 1125 µl

buffer GPX1+ 11,25 µl β -mercapto ethanol + 25 µl RNaseA kemudian diinkubasi dalamwater bath bersuhu 60 oC selama30 menit. Selama inkubasi,sampel dibolak-balik setiap 5menit.Sampel diberi 250 µL Buffer GP2kemudian diinkubasi dalam esselama 3 menit.Hasil:Setelah penambahan GP2, warnasampel tetap jernih.

Perlakuan:Sentrifugasi dengan kecepatan1000 x g selama 2 menit.Hasil:Supernatan jernih dan tersaringsemua. Di atas filter hanya adadebris sel yang tersaring.

Perlakuan:Sampel diberi 1,5 volume BufferGP3, divortex, kemudiandipindahkan ke GD Column dandisentrifugasi 16000 x g selama 2menit. Flow through dibuang.Hasil:Supernatan terpisah menjadi 2fase cair setelah penambahanGP3. Kedua fase cair tersebuttercampur setelah vortex. Warnahasil vortex bening.

Perlakuan:Sampel diberi 400 µL Buffer W1kemudian disentrifugasi 16000 x gselama 1 menit, flow through dibuang. Sampel diberi 600 µLWashing Buffer kemudiandisentrifugasi 16000 x g selama 1menit, flow through dibuang.Tahap pencucian dengan WashBuffer diulangi sebanyak tiga kali.Sampel disentrifugasi 16000 x gselama 3 menit untukmengeringkan column. Hasil:Tidak ada residu berwarna coklatdi tepi membran column .

Perlakuan:Sampel diberi 50 µL ElutionBuffer, kemudian didiamkanselama 10 menit. Sampeldisentrifugasi 16000 x g selama 1menit untuk mengelusi DNAmurni. mengulangi tahap elusisebanyak satu kali. Hasil elusidipindahkan ke mikrotube baru .Hasil:Isolat DNA hasil elusi bersih,tidak ada residu yang tampak.Konsentrasi DNA 30,1 ng/µLdengan kemurnian 1,89 (A 260/A280) dan 0,87 (A 260/ A 230).

8/17/2019 artikel9E05F9CCB871F95B2369F808831A02C2

4/5

Modifikasi tahap preparasi dan lisis mekanik dilakukan dengan

penambahan jumlah sampel menjadi 250 mg untuk meningkatkan konsentrasi

isolat DNA. Modifikasi tahap lisis kimiawi dilakukan pada dengan penambahan

jumlah bufer lisis yang digunakan menjadi 1125 µL , penambahan β -

mercaptoethanol pada bufer lisis sebanyak 11,25 µL, dan penambahan durasi

inkubasi menjadi 30 menit. Penambahan jumlah bufer lisis dan durasi inkubasi

dilakukan untuk memaksimalkan terjadinya lisis sel pada sampel Gracilaria

verrucosa . Penambahan β -mercaptoethanol bertujuan untuk mengurangi

kontaminasi polifenol pada isolat DNA (Sahu et al. , 2012). Modifikasi tahap

pencucian dilakukan dengan mengulangi tahap tersebut sebanyak tiga kali.

Pencucian berulang dilakukan untuk meminimalkan jumlah residu reagen pada

isolat DNA. Modifikasi tahap elusi dilakukan dengan mengurangi jumlah total

Elution Buffer yang digunakan menjadi 100 µL pada setiap sampel dan

mendiamkan sampel yang sudah diberi Elution Buffer selama 10 menit sebelumsentrifugasi. Pengurangan jumlah Elution Buffer dilakukan untuk meningkatkan

konsentrasi DNA pada tiap µL isolat.

PENUTUP

Kesimpulan

Isolasi DNA Gracilaria verrucosa dengan kit komersial paling efektif

dilakukan dengan jumlah sampel 250 mg, perendaman sampel dalam etanol 10% pada suhu 4 oC selama 21 hari, penyimpanan sampel yang telah digerus pada suhu

-60 oC selama semalam, penambahan β -mercaptoethanol pada bufer lisis,

penambahan waktu inkubasi, pengulangan tahap pencucian sebanyak tiga kali,

dan pengurangan jumlah bufer elusi menjadi 100 µL. Hasil yang diperoleh dari

penelitian ini belum optimal untuk keperluan penelitian tahap selanjutnya.

Saran

Berdasarkan kesimpulan, optimasi isolasi DNA lebih lanjut masih

diperlukan untuk memperoleh isolat DNA dengan konsentrasi dan kemurnian

lebih tinggi yang dapat digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya.

DAFTAR RUJUKAN

Darsono, P. 1999. Pemanfaatan Sumber Daya Laut dan Implikasinya BagiMasyarakat Nelayan. Oseana , 24(4): 1-9.

De Almeida, C. L., Falcao, H. S., Lima, G. R. M., Montenegro, C. A., Lira, N. S.,De Athayde-Filho, P. F., Rodrigues, L. C., de Souza, M. F. V., Barbosa-Filho, J. M. & Batista, L. M. 2011. Bioactivities from Marine Algae of the

8/17/2019 artikel9E05F9CCB871F95B2369F808831A02C2

5/5

Genus Gracilaria . International Journal of Molecular Sciences , 12: 4550-4553.

Dharmawan, A., Setiawati, F. K. & Gofur, A. 2014. Pemanfaatan Rumput Laut(Gracilaria verrucosa Kualitas Rendah) dan Biota Hama sebagai PakanTernak dan Ikan . LP2M & Balitbang Provinsi Jatim.

Sahu, S. K., Thangaraj, M. & Kathiresan, K. 2012. DNA Extraction Protocol forPlants with High Levels of Secondary Metabolites and Polysaccharideswithout Using Liquid Nitrogen and Phenol. International Scholarly

Research Network Molecular Biology , 2012: 1-6.

Saptasari, M. 2012. Analisis Variasi Genetik dan Hubungan Kekerabatan VarianGracilaria verucosa (Huds) Papenfus di Jawa Timur Berdasarkan

Penanda Morfologi dan Molekuler Mikrosatelit sebagai Penyusun Buku Belajar Sistematik pada Makroalga Berbasis Molekuler. Disertasi tidakditerbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang.

Sui, Z. H., Zhang, X. C. & Cheng, X. J. 2002. Comparison of Phycobiliproteinsfrom Gracilaria Lemaneiformis and Its Pigment Mutants in Spectral andMolecular Respects. Acta Botanica Sinica , 44 (5): 557-561.

Shivji, M. S., Rogers, S. O. & Stanhope, M. J. 1992. Rapid Isolation of HighMolecular Weight DNA from Marine Microalgae. Marine Ecology

Progress Series , 84: 197-203.