Artículo para Cartel 1

7/29/2019 Artculo para Cartel 1

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B i o c h e m . J . ( 1 9 7 3 ) 1 3 5 , 8 1 - 8 5P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

T h e K i n e t i c s o f t h e I n t e r c o n v e r s i o n o f I n t e r m e d i a t e s o f t h e R e a c t i o n o fP i g M u s c l e L a c t a t e D e h y d r o g e n a s e w i t h O x i d i z e d N i c o t i n a m i d e - A d e n i n eD i n u c l e o t i d e a n d L a c t a t e

By NIGEL G . BENNETT a n d HERBERT GUTFREUNDM o l e c u l a r E n z y m o l o g y L a b o r a t o r y , D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y ,U n i v e r s i t y o f B r i s t o l , B r i s t o l BS8 1 T D , U . K .( R e c e i v e d 1 F e b r u a r y 1 9 7 3 )

O x a m a t e c o m p e t e s w i t h p y r u v a t e f o r t h e s u b s t r a t e b i n d i n g s i t e o n t h e E N A D H c o m p l e x o fp i g s k e l e t a l m u s c l e l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e . When t h i s e n z y m e w a s m i x e d w i t h s a t u r a t i n gc o n c e n t r a t i o n s o f NAD+ a n d l a c t a t e i n a s t o p p e d - f l o w r a p i d - r e a c t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e rt h e r e w a s n o t r a n s i e n t a c c u m u l a t i o n o f e n z y m e c o m p l e x e s w i t h t h e r e d u c e d n u c l e o t i d e .T h e s t e a d y - s t a t e r a t e o f f o r m a t i o n o f f r e e NADH w a s r e a c h e d w i t h i n t h e d e a d - t i m e o f t h ei n s t r u m e n t ( 3 m s ) . When o x a m a t e w a s a d d e d t o i n h i b i t t h e s t e a d y s t a t e a n d t o u n c o u p l et h e e q u i l i b r a t i o n : N A D + = E , N A D H = E N A D H + p y r u v a t et h r o u g h t h e r a p i d f o r m a t i o n o f E A D m H t , t h e r a t e o f f o r m a t i o n o f E N A D H c o u l d b e m e a s u r e db y o b s e r v a t i o n o f t h e f i r s t t u r n o v e r . T h i s p H - d e p e n d e n t t r a n s i e n t i s c o n t r o l l e d b y t h e r a t eo f d i s s o c i a t i o n o f p y r u v a t e a n d t h e f r a c t i o n o f t h e e n z y m e i n t h e f o r m E P D v a t e .

S t i n s o n & G u t f r e u n d ( 1 9 7 1 ) c a r r i e d o u t a d e t a i l e dk i n e t i c s t u d y o f t h e r e a c t i o n s o f t h e M4 i s o e n z y m e o fp i g l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e . One o f t h e i r f i n d i n g s wast h a t m i x i n g t h e enzyme a n d NAD+ w i t h l a c t a t e a t pHv a l u e s a b o v e 8 r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f 1 m o l o fe n z y m e - b o u n d NADH/mol o f a c t i v e s i t e s w i t h i n2 m s . A t l o w e r pH v a l u e s p r o g r e s s i v e l y s m a l l e ramounts o f e n z y m e - b o u n d NADH were f o r m e d i nt h i s ' i n s t a n t a n e o u s ' p h a s e . S i n c e t h a t t i m e a s p l i t -beam s t o p p e d - f l o w r e a c t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r( G u t f r e u n d , 1 9 7 2 , p . 1 8 0 ) was d e v e l o p e d i n t h i sl a b o r a t o r y b y D . W. Y a t e s , G . H . McMurray &H . G u t f r e u n d ( u n p u b l i s he d w o r k ) . T hi s i n s t r u m e n tp r o v i d e s a r e c o r d o f t h e a b s o l u t e d i f f e r e n c e i n e x t i n c -t i o n b e t w e e n t h e s o l u t i o n s b e f o r e a n d a f t e r m i x i n g .S t u d i e s w i t h t h i s new m e t h o d s h o w e d t h a t a m i x t u r eo f enzyme a n d NAD+ w i t h o u t a d d e d l a c t a t e s l o w l yp r o d u c e d NADH. T h i s a r t i f a c t i s p r o b a b l y d u e t ob o u n d l a c t a t e a n d t h e amount o f NADH p r o d u c e da t e q u i l i b r i u m i n c r e a s e s w i t h i n c r e a s i n g p H . W i t h t h es p l i t - b e a m t e c h n i q u e t h e b a s e l i n e ( z e r o d i f f e r e n c e i ne x t i n c t i o n ) i s a u t o m a t i c a l l y p r o v i d e d a n d t h e enzymes o l u t i o n i s m i x e d w i t h a s o l u t i o n c o n t a i n i n g NAD+a n d l a c t a t e . I n f u r t h e r s t u d i e s , r e p o r t e d i n t h i s paper,i t was f o u n d t h a t w i t h t h e M4 i s o e n z y m e o f l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e a r a p i d t r a n s i e n t f o r m a t i o n o f1 m o l o f e n z y m e - b o u n d NADH/mol o f a c t i v e s i t e sc o u l d o n l y b e o b s e r v e d i f t h e s u b s t r a t e s o l u t i o n a l s oc o n t a i n e d oxamate t o i n h i b i t t h e s t e a d y - s t a t e r a t e .T h e r a t e o f i n t e r c o n v e r s i o n o f t h e t e r n a r y c o m p l e xc o u l d t h u s b e d e t e r m i n e d a n d f u r t h e r d e t a i l s o f t h em e c h a n i s m o f t h i s enzyme c o u l d b e a d d e d t o t h e pro-V o l . 1 3 5

p o s a l s o f S t i n s o n & G u t f r e u n d ( 1 9 7 1 ) . The u se o fi n h i b i t o r s i n t h e s t u d y o f t r a n s i e n t k i n e t i c s c an b ei l l u s t r a t e d w i t h e x p e r i m e n t s on l a c t a t e d e h y d r o -genase.

M e t h o d s a n d R e s u l t sT h e M4 i s o e n z y m e o f l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e wasp r e p a r e d f r o m p i g s k e l e t a l m u s c l e b y t h e m e t h o d o fS t i n s o n & G u t f r e u n d ( 1 9 7 1 ) a n d a l l o t h e r r e a g e n t s

were o b t a i n e d a n d p u r i f i e d as d e s c r i b e d i n t h i s p r e -v i o u s paper. T h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h i s t e t r a m e r i c en-zyme are g i v e n as u e q u i v . o f a c t i v e s i t e c o n c e n t r a t i o n s .T h e s p l i t - b e a m r e a c t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r was u s e dt o d e t e r m i n e r a p i d c h a n g e s i n t h e e x t i n c t i o n o fe n z y m e - s u b s t r a t e m i x t u r e s on a m i l l i s e c o n d t i m es c a l e . T h e i n s t r u m e n t was u s e d a n d i t s d e a d - t i m ed e t e r m i n e d as o u t l i n e d b y G u t f r e u n d ( 1 9 7 2 , p . 1 8 0 ) .F i g . 1 s h o w s t h e r e c o r d s o f r e a c t i o n s o f M4 l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e f o r t h e f i r s t 3 0 m s a f t e r m i x i n g t h eenzyme w i t h l a c t a t e a n d NAD+ i n t h e presence a n da b s e n c e o f o x a m a t e . I n t h e a b s e n c e o f o x a m a t e t h es t e a d y - s t a t e r a t e o f NADH p r o d u c t i o n was r e a c h e dw i t h i n t h e m i x i n g t i m e ( a p p r o x . 3 m s ) . I n t h e presenceo f oxamate t h e r e was a t r a n s i e n t f o r m a t i o n o f enzyme-bound NADH t h r o u g h t h e a c c u m u l a t i o n of amteas t h e m a j o r s t e a d y - s t a t e i n t e r m e d i a t e a n d a f t e r t h a tt h e r e i s a much i n h i b i t e d s t e a d y - s t a t e p r o d u c t i o n o fNADH. A t 340nm t h e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t so f NADH a n d i t s c o m p l e x e s w i t h l a c t a t e d e h y d r o -genase a n d l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e - o x a m a t e d i f f e r e d

8 1


2/5

N . G . BENNETT AND H . GUTFREUND

( a )

E 3 4 0 c m == 0 .4 0 = .

( b )

E 1 3 4 C O m = o M o 01 .

W .nsI O ms

I O m sF i g . 1 . R e c o r d s o f t h e r e a c t i o n s o f M4 l a c t a t e d e h y d r o -

g e n a s e w i t h l a c t a t e a n d NAD+( a ) R e c o r d s o f AE"m o b t a i n e d b y m i x i n g s o l u t i o n sc o n t a i n i n g 2 5 . 0 p M ( i n s i t e s ) , M4 l a c t a t e d e h y d r o g e n -a s e ( u p p e r t r a c e ) , 5 0 , M ( l o w e r t r a c e ) w i t h a s o l u t i o nc o n t a i n i n g 1 3 . 4 m M - N A D + a n d 6 6 m M - l i t h i u m - L -l a c t a t e i n 1 0 0 m M - s o d i u m - p o t a s s i u m p h o s p h a t e( 9 5 m M - N a 2 H P O 4 , 5 m M - K H 2 P O 4 ) , p H 8 , a t 2 3 C i n as p l i t - b e a m s t o p p e d - f l o w s p e c t r o p h o t o m e t e r . ( b )S h o w s a r e c o r d u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s f o r a s o l u -t i o n o f 2 5 t M e n z y m e m i x e d w i t h a s u b s t r a t e s o l u t i o na s a b o v e , w h i c h a l s o c o n t a i n s 8 m M - o x a m a t e . T h ef i r s t - o r d e r p l o t o f a p p r o a c h t o t h e s t e a d y s t a t e w a sd e r i v e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d i l l u s t r a t e d b yG u t f r e u n d ( 1 9 7 2 , p . 2 0 2 ) .

b y l e s s t h a n 5 % . O x a m a t e e x h i b i t s n o n - c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n f o r t h e r e a c t i o n :L a c t a t e + NAD+ - + p y r u v a t e + NADH

a n d c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n f o r t h e r e a c t i o n :P y r u v a t e +NADH - + l a c t a t e +NAD+

w h e n s t u d i e d b y s t e a d y - s t a t e k i n e t i c s ( s e e F i g . 2 ) .H e c k e t a l . ( 1 9 6 8 ) s h o w e d t h a t NADH w i l l n o t d i s -s o c i a t e f r o m t h e t e r n a r y c o m p l e x E x a a D t e i n t h e c a s eo f H4 l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e a n d H o l b r o o k & S t i n s o n

( 1 9 7 0 ) s h o w e d t h a t t h e a f f i n i t y o f NADH b i n d i n g t oM4 l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e i s a t l e a s t 1 0 0 - f o l d i n c r e a s e di n t h e p r e s e n c e o f o x a m a t e . T h e t r a n s i e n t a c c u m u l a -t i o n o f E ' A I 0 a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f NAD+,l a c t a t e a n d o x a m a t e m u s t b e r a t e - l i m i t e d b y s o m es t e p o f t h e r e a c t i o n :E N A D + t _ * ENADH + H+ + p y r u v a t eT h e p H - d e p e n d e n c e o f t h i s f i r s t - o r d e r p r o c e s s i ss h o w n i n T a b l e 1 t o g e t h e r w i t h t h e s t e a d y - s t a t e r a t e sa t s u b s t r a t e s a t u r a t i o n i n t h e a b s e n c e o f o x a m a t e .A t pH 8 t h e e f f e c t o f v a r y i n g t h e o x a m a t e c o n c e n t r a -t i o n i s m a i n l y t o i n c r e a s e t h e a m p l i t u d e o f t h e t r a n -s i e n t . A t pH6 t h e r e i s more c o m p e t i t i o n b e t w e e no x a m a t e a n d l a c t a t e a n d a c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e i nt h e t r a n s i e n t r a t e a t i n c r e a s i n g o x a m a t e c o n c e n t r a -t i o n s . T h e r a t e c o n s t a n t s g i v e n w e r e o b t a i n e d b ye x t r a p o l a t i o n t o z e r o o x a m a t e c o n c e n t r a t i o n . T h ef a c t t h a t s t e a d y - s t a t e k i n e t i c s t u d i e s s h o w e d o n l yn o n - c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n f o r l a c t a t e o x i d a t i o ni n d i c a t e s t h e i n s e n s i t i v i t y o f t h e s e m e a s u r e m e n t s t ot h e c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n o f l a c t a t e b i n d i n g , w h i c hc a n b e e s t i m a t e d f r o m t h e e f f e c t o f o x a m a t e on t h et r a n s i e n t r a t e s .A d d i t i o n o f p y r u v a t e t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e d e -c r e a s e d t h e a m p l i t u d e o f t h e t r a n s i e n t E N A D H p r o -d u c t i o n . T h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n p y r u v a t e a n do x a m a t e f o r b i n d i n g t o E N A D H i n t h i s p r o c e s s c a n b ec o m p a r e d w i t h t h e c o m p e t i t i o n o b t a i n e d i n s t e a d y -s t a t e m e a s u r e m e n t s . T h e e x p e r i m e n t s s h o w n i n F i g . 3r e p r e s e n t s t e a d y - s t a t e r a t e m e a s u r e m e n t s c a r r i e d o u ta t l o w a n d h i g h e n z y m e c o n c e n t r a t i o n s . T h e t h r e ee x p e r i m e n t s a t 1 5 , u e q u i v . o f a c t i v e s i t e s a n d 2 0 m M -l a c t a t e w e r e a l s o u s e d t o c o m p a r e t h e a m p l i t u d e o ft h e t r a n s i e n t E N A D H p r o d u c t i o n w i t h t h e s t e a d y r a t e .I t w a s f o u n d t h a t t h e s e q u a n t i t i e s w e r e d i r e c t l y p r o -p o r t i o n a l .D e u t e r i u m - l a b e l l e d l a c t a t e w a s p r e p a r e d b y a l k a -l i n e h y d r o l y s i s o f d i e t h y l 2 - b r o m o - 2 - m e t h y l m a l o n a t ei n w a t e r a n d s u b s e q u e n t a c i d - c a t a l y s e d d e c a r b o x y l a -t i o n i n 2 H 2 0 . T h e p r o d u c t w a s c h a r a c t e r i z e d b yp r o t o n m a g n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r o s c o p y . T h e r a t e o ft h e t r a n s i e n t w a s o n l y a b o u t 1 0 % l o w e r w h e n d e u t e r o -l a c t a t e w a s u s e d a s s u b s t r a t e . T h i s l o w e r r a t e c o u l dw e l l b e d u e t o i m p u r i t i e s i n t h e m a t e r i a l p r e p a r e d b yu s .D i s c u s s i o n

S c h e m e 1 w i l l b e u s e d t o d i s c u s s t h e r e s u l t s r e p o r t e di n t h i s p a p e r a s w e l l a s t h o s e o b t a i n e d b y S t i n s o n &G u t f r e u n d ( 1 9 7 1 ) . T h e r e s u l t s w i l l b e u s e d i n t u r n t os h o w t h a t t h e s t e p s i n t h i s s c h e m e a r e n e c e s s a r y a n ds u f f i c i e n t t o a c c o u n t f o r t h e s t e a d y - s t a t e a n d t r a n -s i e n t k i n e t i c b e h a v i o u r o f t h e r e a c t i o n s o f M4 l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e w i t h i t s s u b s t r a t e s .T h e t r a n s i e n t p r o d u c t i o n o f e n z y m e - b o u n d NADHa t h i g h s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n , w h i c h o c c u r s i n t h e1 9 7 3

8 2


3/5

PIG MUSCLE LACTATE DEHYDROGENASE KINETICS

1 / [ L a c t a t e ] ( m m - ' )

4 5 61 / [ P y r u v a t e ] ( m m - ' )F i g . 2 . I n h i b i t i o n b y o x a m a t e o f r e a c t i o n s o f M 4 l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e i n t h e s t e a d y s t a t e( a ) T h e i n h i b i t i o n o f NAD+ ( 2 . 5 m M ) r e d u c t i o n b y o x a m a t e i n 0 . 1 M - s o d i u m - p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( 9 5 m M -N a 2 H P O 4 , 5 m M - K H 2 P O 4 ) b u f f e r , pH 8 . T h e p o i n t s ( w i t h a r a n g e o f t h r e e m e a s u r e m e n t s ) a r e e x p e r i m e n t a l o b s e r -v a t i o n s a n d t h e l i n e s a r e t h o s e c a l c u l a t e d f o r Km l a c t a t e = 5 m M , K , o x a m a t e = 0 . 2 5 mm, k c a t . = 8 0 s - 1 . T h e o x a m a t ec o n c e n t r a t i o n s ( m M ) w e r e : c u r v e ( A ) , 0 . 5 ; c u r v e ( B ) , 0 . 3 ; c u r v e ( C ) , 0 . 1 ; c u r v e ( D ) , 0 . ( b ) T h e i n h i b i t i o n o f NADH( 0 . 2 m M ) o x i d a t i o n b y o x a m a t e i n 0 . 1 M - s o d i u m - p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 . T h e p o i n t s a r e e x p e r i m e n t a lo b s e r v a t i o n s a n d t h e l i n e s a r e t h o s e c a l c u l a t e d f o r K , . p y r u v a t e = 0 . 6 m M , K , o x a m a t e = 0 . 1 5 m M a n d k c a t . =4 5 0 s - 1 . T h e o x a m a t e c o n c e n t r a t i o n s ( m M ) w e r e : c u r v e ( A ) , 1 . 0 ; c u r v e ( B ) , 0 . 5 ; c u r v e ( C ) , 0 . 3 ; c u r v e ( D ) 0 . 1 ;c u r v e ( E ) , 0 .

T a b l e 1 . p H - d e p e n d e n c e o f s o m e r a t e - c o n s t a n t s d u r i n gl a c t a t e o x i d a t i o n b y M4 l a c t a t e d e h y d r o g e n a s eT h e r a t e o f t r a n s i e n t a p p r o a c h ( k t r a n s . ) t o t h e s t e a d y -s t a t e w a s m e a s u r e d i n t h e p r e s e n c e o f o x a m a t e b u te x t r a p o l a t e d b a c k t o z e r o o x a m a t e c o n c e n t r a t i o n ;k . f f i s t h e r a t e o f d i s s o c i a t i o n o f NADH f r o m i t s c o m -p l e x w i t h e n z y m e ( d a t a f r o m S t i n s o n & G u t f r e u n d ,1 9 7 1 ) .

pH k c a t ( s - 1 ) k t r a n s ( s - ' )6 9 1 6 57 3 0 2 2 08 8 3 3 0 0

V o l . 1 3 5

k o f f ( s - 1 )2 5 03 3 04 7 0

p r e s e n c e o f o x a m a t e , m u s t b e a m e a s u r e o f t h e r a t e o ff o r m a t i o n o f E N A D H o r E * N A D H f r o m t h e f i r s t t e r n a r yc o m p l e x , s i n c e t h e s e a r e t h e o n l y f o r m s o f t h e e n -z y m e w i t h a h i g h a f f i n i t y f o r o x a m a t e . A t pH8 t h er a t e o f f o r m a t i o n o f t h e E N A D H c o m p l e x e s i s 3 0 0 s - ' ,t h e r a t e o f d i s s o c i a t i o n o f NADH ( s t e p 1 1 ) i s 4 5 0 s - 1( S t i n s o n & G u t f r e u n d , 1 9 7 1 ) a n d t h e s t e a d y - s t a t er a t e o f NADH f o r m a t i o n i s 8 3 s - 1 . I n t h e a b s e n c e o fo x a m a t e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f a l l t h e i n t e r m e d i a t e so n t h e r i g h t - h a n d h a l f o f S c h e m e 1 ( w h i c h a b s o r b l i g h ta t 3 4 0 n m ) a r e v e r y l o w , y e t t h e f o r m a t i o n o f e n z y m e -b o u n d NADH ( i n t h e p r e s e n c e o f o x a m a t e ) i s n e a r l y4 t i m e s f a s t e r t h a n t h e s t e a d y - s t a t e r a t e o f NADHf o r m a t i o n . I t m u s t b e c o n c l u d e d t h a t o x a m a t e c a n

8 3


4/5

N . G . BENNETT AND H . GUTFREUND

- 0 . 2 - 0 . I 5 - 0 . 1 0 - 0 . 0 5 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 . 0 . 2I / [ L a c t a t e ] ( m m - ' )F i g . 3 . S t u d y o f t h e i n h i b i t i o n o f l a c t a t e o x i d a t i o n b y p y r u v a t e

T h e f o r m a t i o n o f NADH f r o m 2nM-NAD+ w a s f o l l o w e d d u r i n g l a c t a t e o x i d a t i o n i n 1 0 0 m M - s o d i u m - p o t a s s i u mp h o s p h a t e ( 9 5 m M - N a 2 H P O 4 , 5 m M - K H 2 P O 4 ) b u f f e r a t p H 8 . * , M e a s u r e m e n t s made i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 - 1 . O , u go f e n z y m e / m l ( i n a r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r ) ; o , m e a s u r e m e n t s made i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 6 m g e n z y m e / m l i na s t o p p e d - f l o w s p e c t r o p h o t o m e t e r . A l l v e l o c i t y m e a s u r e m e n t s w e r e n o r m a l i z e d t o u n i t e n z y m e c o n c e n t r a t i o n .T h e p o i n t s r e p r e s e n t e x p e r i m e n t a l m e a s u r e m e n t s a n d t h e l i n e s a r e c a l c u l a t e d f o r Km ( l a c t a t e ) = 5 m M , K , ( p y r u v a t e )= 0 . 3 5 m M a n d k c a t . = 8 0 s - ' . T h e p y r u v a t e c o n c e n t r a t i o n s ( m M ) w e r e a s f o l l o w s : c u r v e ( A ) , 0 . 6 ; c u r v e ( B ) , 0 . 3 ;c u r v e ( C ) , 0 .

p r e v e n t t h e r a p i d e q u i l i b r a t i o n o f t h e o x i d a t i o n /r e d u c t i o n o f e n z y m e - b o u n d n u c l e o t i d e s , w i t h t h ee q u i l i b r i u m o f t h e t e r n a r y c o m p l e x e s b e i n g e s s e n t i a l l yc o m p l e t e l y o n t h e s i d e o f o x i d i z e d n u c l e o t i d e . T h et r a n s i e n t o f t h e f o r m a t i o n o f e n z y m e - b o u n d NADHi n t h e p r e s e n c e o f o x a m a t e c a n b e r e p r e s e n t e d b y as i n g l e e x p o n e n t i a l . T h i s c o n f i r m s t h e e q u i l i b r i u mp o s i t i o n o f t h e t e r n a r y c o m p l e x e s a n d t h e c o n c l u s i o no f S t i n s o n & G u t f r e u n d ( 1 9 7 1 ) t h a t t h e f o u r s i t e s o ft h i s t e t r a m e r i c e n z y m e a r e e q u i v a l e n t . N . G . B e n n e t t& H . G u t f r e u n d ( u n p u b l i s h e d w o r k ) f o u n d t h a t i nt h e c a s e o f H4 l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e t h e f o u r s i t e sa r e a l s o k i n e t i c a l l y e q u i v a l e n t , b u t t h e e n v i r o n m e n ti n t h e e n z y m e c o m p l e x e s i s s u c h a s t o g i v e p H - d e p e n -d e n t b u t o b s e r v a b l e e q u i l i b r i a b e t w e e n t h e t e r n a r yc o m p l e x e s w i t h o x i d i z e d a n d r e d u c e d n u c l e o t i d e s .S t i n s o n & H o l b r o o k ( 1 9 7 3 ) h a v e s h o w n t h a t t h ef o u r NADH b i n d i n g s i t e s o n H 4 a n d M4 l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e a r e i d e n t i c a l a n d i n d e p e n d e n t .S t i n s o n & G u t f r e u n d ( 1 9 7 1 ) r e p o r t e d t h a t t h e r a t eo f o x i d a t i o n o f t h e enzyme-NADH c o m p l e x c a u s e db y t h e a d d i t i o n o f a l a r g e e x c e s s o f p y r u v a t e w a s n o ts i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d b y t h e s u b s t i t u t i o n o f s p e c i f i c -a l l y d e u t e r a t e d NAD2H f o r NADH. I t w a s c o n c l u d e dt h a t t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p f o r t h e i n t e r c o n v e r s i o n o ft h e t e r n a r y c o m p l e x w a s a n i s o m e r i z a t i o n a f t e r p y r u -v a t e b i n d s t o E N A D H , a n d t h e c h e m i c a l r e a c t i o n :E * N A D H E*NADE P y r u v a t e Lactatew a s v e r y f a s t . We h a v e now s h o w n t h a t i n t h e r e v e r s er e a c t i o n t h e a b s e n c e o f a d e u t e r i u m i s o t o p e - e f f e c t a l s o

s u g g e s t s a r a t e - l i m i t i n g s t e p d i s t i n c t f r o m t h e f a s tc h e m i c a l r e a c t i o n o f t h e i n t e r c o n v e r s i o n o f t h e t e r -n a r y c o m p l e x . I t i s a r g u e d b e l o w t h a t t h e r a t e o f t h et r a n s i e n t i s p r o b a b l y c o n t r o l l e d b y t h e d i s s o c i a t i o n o fp y r u v a t e .T h e a d d i t i o n o f i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f p y r u -v a t e , t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e s u s e d f o r t h e s t u d y o f t h et r a n s i e n t f o r m a t i o n o f E N A ' C , p r o v i d e s i n f o r m a t i o na b o u t t h e a f f i n i t y o f E * N A D H f o r p y r u v a t e a s c o m -p a r e d w i t h o x a m a t e . S i n c e , h o w e v e r , t h e r e w i l l b es o m e E N A D H p r e s e n t t h e K , = 0 . 3 5 m M ( F i g . 3 ) o n l yg i v e s a n u p p e r l i m i t f o r t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t :

NADH *NADH+pyruvateT h e K m f o r p y r u v a t e i n t h e r e a c t i o n :

P y r u v a t e + E N A D H -E t a t( s i n g l e - t u r n o v e r e x p e r i m e n t s o f S t i n s o n & G u t f r e u n d ,1 9 7 1 ) i s a p p r o x i m a t e l y 1 mm a t p H 8 . A c c o r d i n g t ot h e m e c h a n i s m p r o p o s e d b y S t i n s o n & G u t f r e u n d( 1 9 7 1 ) a n d e l a b o r a t e d h e r e , t h i s K m s h o u l d c o r r e -s p o n d t o t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t :E N A D H t e = E N A D H + p y r u v a t e

T h e a m p l i t u d e o f t h e t r a n s i e n t p r o d u c t i o n o fE N A a D m H , c a n b e u s e d t o e s t i m a t e t h e p r o p o r t i o n o f t h ee n z y m e s i t e s t h a t a r e c o n v e r t e d i n t o t h i s f o r m d u r i n gt h e a p p r o a c h t o t h e i n h i b i t e d s t e a d y s t a t e . T h e t o t a lo p t i c a l d e n s i t y c h a n g e f r o m t h e b a s e - l i n e t o t h e i n t e r -c e p t o f t h e s t e a d y - s t a t e r a t e e x t r a p o l a t e d b a c k t ot h e z e r o - t i m e a x i s c o r r e s p o n d s t o 0 . 9 e q u i v . o f1 9 7 3

8 4


5/5

PIG MUSCLE LACTATE DEHYDROGENASE KINETICS 8 5

ENAD+ E N A D HL a c t a t e P y r u v a t e

ENADactaENAD+ ENADH ENADH

ENAD+ ENADH

ES c h e m e 1 . A r e p r e s e n t a t i o n o f t h e s t e p s i n t h e r e a c t i o n o f M4 l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e w i t h i t s s u b s t r a t e s

T h e n u m b e r o f s t e p s i n c l u d e d i n t h i s s c h e m e a r e n e c e s s a r y a n d s u f f i c i e n t t o a c c o m m o d a t e t h e o b s e r v a t i o n s f r o mt h e t r a n s i e n t k i n e t i c e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d .

NADH p e r e n z y m e s i t e i n s o l u t i o n a t h i g h o x a m a t ec o n c e n t r a t i o n s . T h i s i n d i c a t e s f u l l o c c u p a n c y o f e n -z y m e s i t e s w i t h NADH i n t h e s t e a d y - s t a t e ( G u t f r e u n d ,1 9 6 5 , p . 6 1 , 1 9 7 1 , 1 9 7 2 , p . 2 0 0 ) . T h e w h o l e o f t h et r a n s i e n t i s d e s c r i b e d b y a s i n g l e e x p o n e n t i a l . T h i si n d i c a t e s t h a t t h e f o u r s i t e s o f t h e t e t r a m e r i c e n z y m e sa r e k i n e t i c a l l y i n d e p e n d e n t a n d i d e n t i c a l .I n h i b i t o r s t h a t c o m p e t e f o r t h e p r o d u c t - b i n d i n gs i t e b u t c o m p e t e o n l y s l i g h t l y o r n o t a l l f o r t h e s u b -s t r a t e b i n d i n g s i t e p r o v i d e a u s e f u l t o o l f o r t h e i s o l a -t i o n a n d k i n e t i c i n v e s t i g a t i o n o f i n d i v i d u a l s t e p s . T h i sp h e n o m e n o n c a n o c c u r f o r t w o r e a s o n s i n NAD+-l i n k e d d e h y d r o g e n a s e s . F i r s t , i f t h e r a t e o f f o r m a t i o no f e n z y m e - b o u n d NADH i s s l o w e r t h a n t h e d i s s o c i a -t i o n o f NADH f r o m t h e c o m p l e x , n o t r a n s i e n t f o r m a -t i o n o f e n z y m e - b o u n d NADH c a n b e o b s e r v e d . I f ,h o w e v e r , t h e d i s s o c i a t i o n o f NADH c a n b e s l o w e ddown b y t h e a d d i t i o n o f a n i n h i b i t o r t h e t r a n s i e n t r a t ec a n b e m e a s u r e d . T h e s e c o n d c o n d i t i o n u n d e r w h i c ha n i n h i b i t o r c a n i s o l a t e a t r a n s i e n t i s t h e o n e a p p l i c -a b l e t o t h e M4 l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e s y s t e md e s c r i b e d h e r e . T h e e q u i l i b r a t i o n :E*NAD+ E C = E*NADH+pyruvatec a n b e u n c o u p l e d b y t h e a d d i t i o n o f o x a m a t e t of o r m E I A D H . T h e p H - d e p e n d e n t t r a n s i e n t r a t e s

l i s t e d i n T a b l e 1 c a n b e d u e e i t h e r t o t h e i s o m e r i z a t i o nt o f o r m t h e r e a c t i v e t e r n a r y c o m p l e x :NA ENAE L a c t a t e L a c t a t e

o r d u e t o t h e r a t e o f d i s s o c i a t i o n o f p y r u v a t e f r o mE r u A v a t e w h i c h o c c u r s a t l o w e q u i l i b r i u m c o n c e n t r a -t i o n . I n s u c h a c a s e t h e o b s e r v e d f i r s t - o r d e r r a t e -c o n s t a n t f o r t h e d i s s o c i a t i o n o f p y r u v a t e w o u l d b et h e t r u e r a t e c o n s t a n t t i m e s t h e f r a c t i o n o f t h e t o t a le n z y m e i n t h e f o r m b e f o r e p y r u v a t e d i s s o c i a t i o n .B o t h t h e s e a l t e r n a t i v e s w o u l d a c c o u n t f o r t h e a b s e n c eo f a d e u t e r i u m i s o t o p e - e f f e c t .R e f e r e n c e sG u t f r e u n d , H . ( 1 9 6 5 ) An I n t r o d u c t i o n t o t h e S t u d y o fE n z y m e s , B l a c k w e l l S c i e n t i f i c P u b l i c a t i o n s , O x f o r dG u t f r e u n d , H . ( 1 9 7 1 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 4 0 , 3 1 5 - 3 4 4G u t f r e u n d , H . ( 1 9 7 2 ) E n z y m e s : P h y s i c a l P r i n c i p l e s ,W i l e y I n t e r s c i e n c e , L o n d o n a n d New Y o r kH e c k , H . d ' A , M c M u r r a y , C . H . , & G u t f r e u n d , H . ( 1 9 6 8 )

B i o c h e m . J . 1 0 8 , 7 9 3 - 7 9 6S t i n s o n , R . A . & G u t f r e u n d , H . ( 1 9 7 1 ) B i o c h e m . J . 1 2 1 ,2 3 5 - 2 4 0S t i n s o n , R . A . & H o l b r o o k , J . J . ( 1 9 7 3 ) B i o c h e m . J .1 3 1 , 7 1 9 - 7 2 8

V o l . 1 3 5

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