Para Target dari Ceramide Plasmalemmal untuk Mitokondria selama Apoptosis

Abstrak

Ceramide adalah mediator lipid kunci dari proses seluler seperti diferensiasi, penangkapan proliferasi, pertumbuhan dan apoptosis. Selama apoptosis, ceramide diproduksi dalam membran plasma. Meskipun data terbaru menunjukkan bahwa generasi ceramide intraseluler meningkatkan permeabilitas mitokondria, sumber ceramide mitokondria masih belum diketahui. Di sini, kita menentukan apakah kolam stres yang dimediasi plasmalemmal dari ceramide mungkin menjadi tersedia pada mitokondria sel apoptosis. Kami sebelumnya telah didirikan Annexin A1-anggota keluarga Ca2 + dan membran protein pengikat-menjadi penanda platform ceramide. Menggunakan A1 Annexin fluorescently tag, kami menunjukkan bahwa, pada saat generasi dalam membran plasma, ceramide diri rekan ke platform yang kemudian invaginate dan menyatu dengan mitokondria. Merupakan akumulasi dari ceramide dalam mitokondria sel apoptosis juga dikonfirmasi menggunakan antibodi ceramide-spesifik. Tomografi mikroskopis elektron menegaskan bahwa setelah pembentukan platform ceramide, daerah invaginated dari membran plasma memperpanjang jauh ke dalam sitoplasma membentuk kontak fisik langsung dengan membran luar mitokondria. Ceramide sehingga dapat langsung ditransfer dari membran plasma ke membran luar mitokondria. Bisa dibayangkan bahwa ini "ciuman-dari-kematian" meningkatkan permeabilitas membran luar mitokondria sehingga memicu apoptosis.

Sebuah peningkatan permeabilitas membran luar mitokondria terlibat dalam tahap awal apoptosis [1]. Pelepasan pro-apototic protein dari mitokondria dapat dimediasi oleh aktivasi Bax [2]. Data terakhir menunjukkan bahwa Bax preferentially memasukkan ke dalam mitokondria melalui ceramide yang diperkaya microdomains, bagaimanapun, rincian mekanisme penargetan belum terselesaikan [3] - [5]. Di sisi lain, peningkatan permeabilitas mitokondria telah dianggap berasal dari ceramide itu sendiri: Akumulasi ceramide mitokondria mungkin mempromosikan pembentukan saluran membran dan pelepasan selanjutnya protein proapoptotic dari ruang intermembrane mitokondria [6].

Mitokondria tidak berpartisipasi dalam perdagangan vesikuler interorganellar. Oleh karena itu, selama terjadinya apoptosis, ceramide harus baik diproduksi di tempat atau cepat diangkut ke mitokondria dari sumber lain. Sphingomyelinase tergantung hidrolisis sphingomyelin dan de novo sintesis adalah dua jalur utama dari biosintesis ceramide [7] - [9]. Produksi de novo dari ceramide hanya terbatas pada retikulum endoplasma, dan mekanisme dimana ceramide yang baru disintesis ditransfer ke mitokondria tidak diketahui. Sebuah penelitian baru telah memberikan bukti bagi keberadaan sebuah sphingomyelinase mitokondria terkait netral [10]. Dengan demikian kemungkinan bahwa sphingolipids mitokondria [11], [12] yang metabolik diubah menjadi ceramide di situ dan secara lokal dirakit menjadi saluran ceramide dalam membran luar mitokondria [13], [14]. Namun, terutama ceramide plasmalemmal, yang dihasilkan oleh aktivitas sphingomyelinase asam yang terlibat dalam induksi apoptosis [14]. Selain itu, transfer protein ceramide larut (CERT) telah dijelaskan [15], yang bisa mengangkut ceramide ke mitochodria dari aparat Golgi. Jadi, meskipun peningkatan ceramide mitokondria dalam menanggapi inisiasi apoptosis telah didokumentasikan [4], [16], sumber ceramide mitokondria dan mekanisme kerjanya masuk tidak diketahui.

Besar, kalsium-diaktifkan endositosis dari membran plasma tanpa keterlibatan protein endocytic klasik adalah fenomena baru-baru ini dijelaskan dan sangat erat kaitannya dengan pembentukan ceramide selama stres selular [17] - [20]. Kami telah menyelidiki kontak membran interorganellar selama proses ini.

Menggunakan mikroskop confocal dalam sel hidup dan tomografi mikroskopis elektron tidak tetap, tekanan tinggi sel beku, kami telah menunjukkan bahwa platform ceramide, awalnya terbentuk di dalam membran plasma sel apoptosis, diinternalisasikan dan bersentuhan erat dengan membran luar mitokondria. Bisa dibayangkan bahwa ceramide dipertukarkan pada titik-titik kontak, dan bahwa ini memicu pelepasan pro-apoptosis molekul.

Reagen dan antibodi

Antibodi poliklonal terhadap tikus ceramide [21] dibeli dari Glycobiotech GmbH (Kuekels, Jerman). Para Warna Hidup vektor protein Fluorescent peCFP-N1, peYFP-N1 dan pDsRed-Mito diperoleh dari Clontech Eropa (St Germain-en-Laye, Prancis), dan endonuklease restriksi itu, polimerase Taq dan ligase T4 DNA dari New England Biolabs (Bioconcept , Allschwil, Swiss). Reagen lainnya yang dibeli dari Sigma (Buchs, Swiss).Kultur sel dan transfections

Urutan pengkodean annexins A1 dan A6 diklon ke dalam vektor Hidup protein Fluorescent Warna kuning-fluorescent protein (YFP), protein fluorescent hijau (GFP) dan protein cyan neon (CFP), setelah amplifikasi PCR dari otot kandung kemih manusia halus cDNA [ 22].

Jurkat sel T dan garis sel manusia monosit (THP-1) dikultur dalam medium RPMI yang mengandung 5% serum anak sapi dan penisilin / streptomisin. Sel-sel ditumbuhkan dalam CO2 5% pada 37 ° C dalam inkubator dilembabkan. Mereka transiently transfected dengan plasmid dengan elektroporasi (Biorad) dan dianalisis setelah inkubasi pada 37 ° C selama 48 jam.Confocal pencitraan

Annexin A1-YFP, Annexin A1-GFP, Annexin A6 CFP dan dsRed-Mito yang transiently dinyatakan dalam Jurkat-sel T dan THP-1 sel. Sel-sel yang diizinkan untuk menetap di coverslips kaca, yang dipasang di ruang perfusi dalam larutan Tyrode ini (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 glukosa mM, HEPES mM 10, pH = 7.4) yang ditambahkan 2 mM CaCl2. Pada titik waktu nol, sel-sel ditantang baik dengan streptolysin O [SLO (100 ng / ml)] atau dengan ionomycin (5 pM). Sinyal fluoresensi direkam menggunakan × 100 lensa minyak imersi di mikroskop 200 M Axiovert dengan laser scanning modul LSM 510 META (Zeiss, Jerman).Immunofluorescence analisis

Immunofluorescence dilakukan sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya [22], [23], dengan modifikasi berikut untuk tidak patuh sel: Berikut sentrifugasi pada 100 g, Jurkat T pellet dan THP-1 sel suspendend dalam larutan Tyrode itu. Beberapa sel diobati dengan permeant sel, mitochondrium khusus pewarna [Mito-ID ™ Merah (Enzo Biologi, Lausen, Swiss)] sesuai dengan instruksi manufactorer, diikuti oleh SLO (100 ng / ml) atau ionomycin (5 pM) perawatan di suspensi dalam buffer Tyrode yang mengandung 2 mM Ca2 + selama 15 menit. Sel diizinkan untuk menetap di coverslips, kimia diperbaiki dengan paraformaldehyde 4% dalam larutan

Tyrode selama 5 menit dan akhirnya permeabilized dengan 0,5% Triton X-100 (dalam larutan Tyrode itu) selama 30 detik pada suhu kamar.

Para colocalization mitokondria dengan reporter protein ceramide Annexin A1-GFP setelah stimulasi sel dengan ionomycin dihitung dalam sel Jurkat dalam 4 percobaan independen dan dengan SLO dalam 2 percobaan independen. Rangsangan identik dilakukan di THP-1 sel dengan ionomycin (5 percobaan independen) dan dengan SLO (2 eksperimen independen). Persentase colocalization dari Annexin A1-GFP dengan Mito-ID ™ Merah di setiap sel didirikan dengan menghitung rasio pixel gabungan (merah / hijau) ke piksel total, menunjukkan intensitas fluoresen dengan salah satu saluran di atas latar belakang, dalam bidang pengamatan yang mengandung paling sedikit 30 sel.

Ca2 +-intraselular overload menginduksi akumulasi ceramide mitokondria

Ca2 +-overload adalah stimulus pro-apoptosis kuat [26], [27], yang menyebabkan hidrolisis sphingomyelin dan pembentukan ceramide pada membran plasma [18].

Pengamatan bahwa ceramide hadir dalam mitokondria selama tahap awal apoptosis [28] mendorong kita untuk menyelidiki potensi transportasi dari ceramide plasmalemma ke mitokondria.

Internalisasi platform ceramide plasmalemmal

Setelah Ca2 intraseluler gigih +-elevasi, Annexin A1 asosiasi dengan platform ceramide, sementara A6 Annexin delineates membran plasma karena sensitivitas lipid diferensial mereka mengikat membran

Real-time confocal mikroskop dari Jurkat-sel T, yang telah dua kali lipat transfected dengan Annexin A1-YFP dan A6-CFP Annexin menunjukkan bahwa peningkatan [Ca2 +] i menyebabkan translokasi baik annexins dari sitoplasma ke membran plasma ( Gambar. 3). Awalnya, homogen rekan didistribusikan, dua annexins mulai memisahkan sebagai pembentukan dan self-asosiasi ceramide berkembang (Gambar 3: 134s). Akumulasi dari ceramide / Annexin platform A1 diikuti oleh invaginasi luas dari plasmalemma (Gambar 3: 134-150-an) dan translokasi mereka dari membran plasma ke dalam sel (Gambar 3 & Film S1). A6 Annexin tidak berpartisipasi dalam pembentukan platform dan tidak diinternalisasi

Sebuah Ca2 +-intraseluler yang berlebihan diinduksi di Jurkat T-sel atau di THP-1 sel dengan memperlakukan mereka dengan SLO toksin pembentuk pori atau dengan ionomycin [18]. Mikroskop immunofluorescence sel permeabilized dengan SLO mengungkapkan colocalization sebagian penanda mitokondria dsRed-Mito dengan antibodi terhadap monospecific ceramide (Gambar 1). Ceramide tidak terdeteksi dalam waktu tidak distimulasi (kontrol) sel (Gambar 1).

Interaksi fisik antara membran plasma invaginated dan mitokondria divisualisasikan dengan tomografi mikroskopik elektron

Dalam mencari sebuah interaksi fisik potensial antara membran plasma invaginated dan mitokondria, proses invaginasi dipantau oleh mikroskop elektron. Karena lipid tidak bergerak karena fiksasi kimia, artefak persiapan dapat merusak lipid didorong perubahan kelengkungan membran. Untuk melestarikan ultrastruktur dari membran dalam keadaan hampir asli, molekul yang bergerak oleh tekanan tinggi pembekuan (210 MPa) dengan tingkat pendinginan yang mencegah pembentukan dan pertumbuhan kristal es intraseluler [24]. Proses ini diikuti oleh substitusi beku, yang, berbeda dengan fiksasi kimia dalam fase cair, menjaga kerangka 3D dari molekul penyusunnya dengan tidak adanya efek osmotik (Gambar 4). Metode-metode ini dikombinasikan kecepatan tinggi imobilisasi dan pelestarian struktur selular tanpa kimia cross-linking. Dengan demikian, pola ultra internalisasi "asli" membran dapat diselidiki. Konsisten dengan rendah resolusi gambar confocal (Gambar 3), beristirahat Jurkat T-sel (Gambar 4a) atau THP-1 sel (tidak ditampilkan) yang ditampilkan permukaan, uniformal plasmalemmal halus. Pada sel, yang telah terkena Ca2 +-overload, seperti tabung pelagica diamati, bercabang dari situs plasmalemmal banyak dan memperpanjang jauh ke dalam ruang intraseluler (Gambar 4b daerah kotak diperbesar pada d).

Inhibitor sphingomyelinase asam (desipramine; [30]), digunakan untuk mengurangi tingkat ceramide setelah [Ca2 +] i overload [18]. Sel diobati dengan desipramine 50 M selama 90 menit sebelum terkena SLO menunjukkan sitoplasma dan organel intraseluler clumpy membesar, tetapi tidak menampilkan infoldings plasmalemmal atau gangguan (Gambar 4c, lihat juga [18]).

Untuk memfasilitasi identifikasi struktur dari situs invaginasi membran, permukaan plasmalemmal adalah pra-label dengan horseradish peroksidase-tagged-kolera subunit toksin B. Beberapa, lobak-peroksidase-tagged tabung seperti struktur berasal dari membran plasma, diperpanjang jauh ke dalam sitoplasma (Gambar 4e, daerah kotak diperbesar pada 4f, mata panah) dan berakhir di sekitar mitochondrium (Gbr. 4f, panah). Tomografi mikroskopis elektron dari 250 nm tebal, bagian uncontrasted diizinkan rekonstruksi 3D-komponen plasmalemmal invaginated (Gbr. 5 mata panah) yang diamati untuk langsung menghubungi membran luar mitokondria (Gbr. 5 panah, film S2 dan S3). Pelagica Plasmalemmal ditemukan pada 37,5% (± STD 12%) sel Jurkat dimana Ca2 +-overload telah menimbulkan (n = 1800 dari 6 percobaan independen). Dekat dari plasmalemma dan mitokondria (jarak ≤ 0,2 pM antara plasmalemma dan membran mitokondria luar) diamati pada 4,1% (± STD 2,6%) sel Jurkat. Jarak 200 nm dipilih berdasarkan eksperimen tomografi micrographic yang menunjukkan bahwa jarak ini adalah sangat mungkin untuk menyebabkan kontak langsung dan aposisi fisik dari membran yang berbeda di bagian atas atau di bawah pesawat belah.

Apoptosis dapat dipicu oleh dimediasi reseptor, ekstrinsik atau oleh jalur intrinsik. Kedua jalur yang dianggap saling terkait dan berkumpul di mitokondria, yang luar membran menjadi semakin permeabel [31]. Akibatnya, protein bocor keluar dari ruang intermembranous mengaktifkan caspases sitosol dan DNAses, yang akhirnya menyebabkan kematian sel apoptosis [32]. Peningkatan permeabilitas membran luar mitokondria telah dianggap berasal dari protein dan lipid sama. Pertama, pelepasan pro-apototic protein dari mitokondria dapat dimediasi oleh Bax [1] yang translocates pada mitokondria dari sitosol [3], [4]. Kedua, peningkatan permeabilitas terjadi karena aksi lokal dari ceramide [6], [13], [33]. Namun, mekanisme yang ceramide muncul dalam membran mitokondria tidak tegas didirikan. Menariknya, ceramide yang

dihasilkan oleh aktivitas sphingomyelinase asam dalam membran plasma dianggap penting untuk pengaturan apoptosis yang dipicu oleh aktivasi reseptor kematian, obat sitotoksik dan rangsangan stres lingkungan [14], [34], [35]. Peran sentral dari kolam plasmalemmal dari ceramide (ceramide platform) dalam induksi apoptosis telah dibuktikan dalam asam sphingomyelinase-(ASM) sel kekurangan dan di ASM-tikus yang kekurangan [36] - [38]. Data baru mengidentifikasi platform ceramide sebagai situs nukleasi dan kendaraan impor untuk kationik sel-penetrasi peptida [39].

Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa produksi ceramide plasmalemmal, yang diri asosiasi untuk platform invaginasi membran dan platform / internalisasi sangat tergantung pada ketinggian Ca2 + intraseluler. Tidak ada pembentukan platform yang ceramide / invaginasi diamati di hadapan EGTA [18].

Di sini, kita dipastikan apakah kolam stres yang dimediasi plasmalemmal dari ceramide mungkin menjadi tersedia pada mitokondria sel apoptosis. Menggunakan mikroskop immunofluorescent kami telah mengkonfirmasikan akumulasi ceramide dalam mitokondria sel apoptosis tetap. Menggunakan Annexin A1 sebagai penanda untuk platform ceramide [18], kami meneliti perubahan struktural dalam membran plasma sel-sel hidup menjalani Ca2 +-overload-induced apoptosis. Internalisasi luas tentang platform A1/ceramide Annexin plasmalemmal diamati dan membran plasma invaginated membentuk kontak dengan membran luar mitokondria.

Bukti yang paling meyakinkan untuk pembentukan kontak langsung antara ceramide kaya pelagica plasmalemmal dan mitokondria berasal dari pengamatan di mikroskop elektron. Analisis struktur halus kompartemen membran dinamis secara teknis menantang. Pelestarian sel dengan tekanan tinggi pembekuan dan substitusi membekukan memungkinkan stabilisasi struktur sel transien [24], [25] yang tidak dapat dicapai dengan fiksasi kimia. Menggunakan teknik ini, telah menjadi mungkin untuk mengkarakterisasi lebih tepat tidak hanya struktur cytoskeletal utama, tetapi sistem juga membran dan hubungan dinamis [40]. Pelabelan dari permukaan plasmalemmal memungkinkan identifikasi dan visual penelusuran membran diinternalisasi. Analisis awal kami dari bagian individu, mengungkapkan sel apoptosis untuk menampilkan banyak, tertutup plasmalemma yang diturunkan vesikel. Generasi infoldings plasmalemmal dan vesiculation dicegah dengan inhibitor asam sphingomyelinase, desipramine. Tapi sepenuhnya dari pelagica tubular ini diungkapkan hanya dengan tomografi 3D mikroskopis elektron. Data kami menunjukkan bahwa vesikula terdiri dari jaringan komunikasi dari pelagica plasmalemmal yang cepat terbentuk dalam menanggapi Ca2 +-overload. Dan yang paling penting, struktur ini menjalin kontak fisik langsung dengan membran luar mitokondria.

Besar, kalsium-diaktifkan endositosis, yang tidak melibatkan cara-protein endocytic klasik (clathrin, dynamin, sitoskeleton aktin), baru-baru ini telah dijelaskan [17]. Jenis endositosis "berlebihan", yang mungkin mempengaruhi sampai 25% dari permukaan sel [17] mencerminkan pembentukan domain ceramide yang berkembang ke dalam lengkungan tinggi dan menjalani spontan pemula [41]. Fenomena ini mungkin analog dengan internalisasi platform ceramide divisualisasikan dalam pekerjaan kami sebelumnya [18]. Menyajikan data kami menyoroti konsekuensi fungsional yang potensial yang mungkin timbul dari seperti reorganisasi mendalam plasmalemma yang ditimbulkan oleh [Ca2 +] i overload.

Kedekatan dengan invaginasi plasmalemmal, sebagaimana ditentukan oleh elektron tomografi diamati untuk 4,1% dari mitokondria. Dan meskipun resolusi spasial dari teknik ini hampir tidak dapat melampaui, kami memilih untuk mengikuti proses yang dinamis dengan tingkat yang lebih tinggi presisi temporal yang tersedia di mikroskop confocal. Plasmalemmal kedekatannya mitokondria, sebagaimana ditentukan oleh colocalization penanda masing dalam mikroskop confocal, terjadi untuk ~ 30% dari mitokondria, terlepas dari jenis sel atau metode yang dipilih untuk menginduksi Ca2 + overload.

Permeabilization dari membran mitokondria luar mengarah ke rilis, kinetik invarian koordinat sitokrom c [42]. Namun, meskipun rilis ini dilaporkan akan selesai setelah dimulai, hal itu tidak terjadi secara bersamaan di semua mitokondria, tetapi tampaknya mempengaruhi kelompok yang berbeda pada waktu yang berbeda. Memang, pola yang digambarkan oleh Goldstein et al. [42] menunjukkan bahwa mitokondria, yang terletak di sekitar langsung dari membran plasma dipengaruhi lebih awal dari yang terpusat lokal lebih.

Para aposisi dekat membran heterolog telah diamati untuk berperan dalam pengangkutan molekul kecil [43], dan penanda molekuler untuk situs kontak saat ini sedang diidentifikasi [44] - [46]. Situs kontak khusus antara retikulum endoplasma (ER) atau aparatus Golgi dan mitokondria adalah penting dalam regulasi Ca2 +-homeostasis [47] - [50]. Transportasi intraselular lipid, yang tidak terjadi melalui rute vesikuler, tergantung juga pada yang sangat selektif mekanisme transfer. Dengan demikian, phosphatidylserine dipindahkan dari UGD ke mitokondria melalui spesifik, mitokondria terkait ER-membran situs [51]. Dalam kasus ceramide, baik angkutan vesikular dan non-vesikular antara ER dan aparat Golgi telah dijelaskan [52], [53]. Transportasi nonvesikular dimediasi oleh protein Transfer ceramide (CERT) dan tergantung pada integritas situs Golgi kontak [54]. Kontak langsung yang kami amati antara membran plasma dan mitokondria dijelaskan di sini menyoroti peran kontak interorganellar dalam transportasi molekul sinyal.

Sebuah sphingomyelinase mitokondria terkait murine netral baru-baru ini diidentifikasi [10]. Menariknya, enzim ini diaktifkan oleh phosphatidylserine [10], yang sangat berlimpah di leaflet bagian dalam membran plasma. Dengan demikian dapat dibayangkan bahwa - selain transfer langsung dari ceramide - aktivasi phosphatidylserine tergantung dari sphingomyelinase mitochondrially terkait mungkin memicu produksi lokal ceramide sehingga memungkinkan sebuah permeabilization efisien membran mitokondria luar.

Kesimpulannya, kita telah mengamati akumulasi ceramide dalam mitokondria sel apoptosis dan menunjukkan bahwa platform ceramide yang berasal dalam membran plasma sedang diinternalisasi dan datang ke dalam kontak dengan membran luar mitokondria. Bisa dibayangkan bahwa ceramide sedang ditukar di titik-titik kontak untuk memicu pelepasan pro-apoptosis molekul.

http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0023706