Analisis protein umumnya bertujuan untuk m engukur kadar protein dalam bahan makanan. Analisis protein dapat dilakukan antara lain dengan metode Kjeldahl, Lowry, Biuret, Bradford, turbidimetri dan titrasi f ormol (Sudarmadji dkk, 2007).a. Metode Kjeldahl

Metode Kjeldahl dilakukan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya (Winarno, 1986). Prinsip analisis Kjeldahl adalah sebagai berikut: bahan organik di didihkan dengan asam sulfat pekat sehingga unsur-unsur dapat terurai. Atom karbon menjadi CO2 dan nitrogen menjadi amonium sulfat. Larutan tersebut kemudian dibuat alkalis dengan menambahkan NaOH berle bihan sehingga ion amonium bebas menjadi amonia bebas. Amonia yang dipisahkan dengan cara distilasi kemudian dijerat dengan larutan asam borat. Garam borat yang terbentukdititrasi dengan HCl (Sudarmadji, 1996).Dari hasil titrasi dapat dihitung % N. Hasil % N tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan kadar protein kasarnya. Umumnya campuran protein murni terdiri dari 16% nitrogen. Apabila jumlah N dalam bahan telah diketahui, maka jumlah protein dihitung dengan mengalikan jumlah N dengan faktor konversi 6,25 (100/16). Besarnya faktor konversi (tabel 2.3) tergantung pada persentase nitrogen yang menyusun protein dalam bahan pangan. Pada protein tertentu yang telah diketahui komposisinya dengan tepat, maka faktor konversi yang lebih tepat lah yang dipakai. Tabel 2.3 Faktor konversi

Kekurangan metode Kjeldahl ialah bahwa purin, purimidin, vitamin-vitamin,asam amino besar, kreatin, dan kreatinin ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein (Winarno, 1986).b. Metode Bradford

Metode Bradford digunakan untuk menentukan konsentrasi protein dalam larutan. Prinsip metode ini berdasarkan pembentukan komplek antara Coomassie Brillant Blue (CBB) dengan larutan protein yang diukur pada pa njang gelombang 595 nm (gambar 2.4). Pembentukan komplek disebabkan adanya ikatan antara pewarna CBB dengan protein melalui interaksi ionik antara gugus asam sulfonat dengan muatan positif protein yaitu pada gugus amina .

Asam amino bebas, peptida dan protein dengan berat molekul kecil tidak menghasilkan warna biru dengan reagen ini. Umumnya berat molekul peptida atau protein harus lebih besar dari 3000 Da untuk menghasilkan warna biru dengan reagen ini. Banyaknya ligan yang berikatan dengan molekul protein sebanding dengan muatan positif protein, sehingga jumlah absorbansi sebanding dengan kadar protein dalam larutan (Pierce, 2005).c. Metode Dumas Termodifikasi

Akhir-akhir ini, teknik instrumen otomastis telah berkembang dengan kemampuan penentuan kadar protein dalam sampel dengan cepat. Teknik ini berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Dumas lebih dari 1,5 abad yang lalu, dan mulai berkompetisi dengan metode Kjeldahl sebagai metode standart penentuan kadar protein karena lebih cepat.

Prinsip Umum

Sampel dengan massa tertentu dipanaskan dalam tangas pada suhu tinggi (sekitar 900 oC) dengan adanya oksigen. Cara ini akan melepaskan CO2, H2O dan N2. Gas CO2 dan H2O dipisahkan dengan melewatkan gas pada kolom khusus untuk menyerapnya. Kandungan nitrogen kemudian dihitung dengan melewatkan sisa gas melalui kolom dengan detektor konduktivitas termal pada ujungnya. Kolom ini akan membantu memisahkan nitrogen dari sisa CO2 dan H2O. Alat dikalibrasi dengan senyawa analis yang murni dan telah diketahui jumlah nitrogennya, seperti EDTA (= 9,59 %N). Dengan demikian sinyal dari detektor dapat dikonversi menjadi kadar nitrogen. Dengan metode Kjeldahl diperlukan konversi nitrogen dalam sampel menjadi kadar protein, tergantung susunan asam amino protein.

- Keuntungan dan kerugian

a. Keuntungan :

Jauh lebih cepat dari pada metode Kjeldahl (di bawah 4 menit per pengukuran,

dibandingkan dengan 1-2 jam pada Kjeldahl).

Metode ini tidak menggunakan senyawa kimia atau katalis toksik.

Banyak sampel dapat diukur secara otomatis.

Mudah digunakan.

b. Kerugian :

Mahal.

Tidak memberikan ukuran protein sesungguhnya, karena tidak semua nitrogen dalam makanan berasal dari protein.

Protein yang berbeda membutuhkan faktor koreksi yang berbeda karena susunan asam amino yang berbeda.

Ukuran sampel yang kecil menyulitkan mendapatkan sampel yang representatif.

d. Metode LowryMetode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat, menghasilkanheteropoly-molybdenum blueakibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dantyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Lowry dkk 1951).Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin,xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferensi tersebut. Oleh karena itu dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein(Lowry dkk 1951).Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang. Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry dkk 1951).Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Reaksi yang terlibat adalah kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Sudarmanto 2008).e. Metode Biuret

Warna violet akan terbentuk bila ion cupri (Cu2+) berinteraksi dengan ikatan peptida dalam suasana basa. Reagen biuret, yang mengandung semua bahan kimia yang diperlukan untuk analisis sudah tersedia di pasaran. Reagen ini dicampurkan dengan larutan protein, didiamkan 15-30 menit, kemudian diukur serapannya pada 540 nm. Keuntungan utama dari teknik ini adalah tidak adanya gangguan dari senyawa yang menyerap pada panjang gelombang yang lebih rendah. Teknik ini kurang sensitif terhadap jenis protein karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida yang ada di semua protein, bukan pada gugus samping spesifik.Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yang ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet (Bintang, 2010).f. Metode Turbidimetri

Kekeruhan akan terbentuk dalam larutan yang mengandung protein apabila ditambahkan bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic (TCA), Kalium Ferri Cianida [K4Fe(CN)6] atau asam sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur dengan alat Turbudimeter. Cara ini hanya dipakai untuk bahan protein yang berupa larutan atau hasilnya, tetapi biasanya hasilnya kurang tepat (Sudarmadji, 1989).Molekul protein yang umumnya laruta dapat dibuat mengendap dengan penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat. Pengendapan protein menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan dengan mengukur derajat kekeruhan (turbiditas). Keuntungan dan kerugian

Keuntungan : Teknik UV-visible merupakan teknik yang cepat dan sederhana, serta sensitif terhap protein dengan konsentrasi rendah.

Kerugian : Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan larutan yang encer dan jernih, serta tidak mengandung senyawa kontaminan yang dapat mengabsorpsi atau memantulkan cahaya pada panjang gelombang di mana protein akan dianalisis. Karena diperlukan larutan jernih, maka makanan harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel sebelum dianalisis, seperti homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb. yang dapat menyita waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk secara kuantitatif mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu, terutama bila makanan tersebut telah mengalami proses dimana protein menjadi agregat atau terikat secara kovalen dengan senyawa lain. Kelemahan lain adalah, serapan tergantung pada jenis protein (karena protein yang berbeda mempunyai sekuens/urutan asam amino yang berbeda pula).Lowry , Rosenbrough , Farr, Randall. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. New York: Kluwer Academic Publishers.

Sudarmanto Arie. 2008. Penetapan kadar protein metode lowry. http://ariebs. Staff.ugm.ac.id/[10 oktober 2011]Sudarmadji, Slamet . 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Yogyakarta: Liberty

Yogyakarta.Pirie, NW. 1987. Leaf Protein and Its by-products in Human and Animal. 2nd Ed. Melborne: Combridge University Press.Khee, C. R. 2001. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley & Son 5, Inc.Winarno F, G. 1986. Kimia Pangan dan Gizi I. Jakarta: PT. Gramedia.